Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro
На правах рукописи
ШМЕЛЬКОВА Татьяна Петровна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЧУМНОГО МИКРОБА И ЕГО АНТИГЕНОВ С КЛЕТКАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO 03.00.07 – микробиология 14.00.36 – аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Саратов - 2008
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители:
доктор биологических наук Кравцов Александр Леонидович доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Щуковская Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Игнатов Олег Владимирович доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Саяпина Лидия Васильевна
Ведущая организация:
ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Защита состоится « » _ 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.078.01 при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».
Автореферат разослан _2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Чума по-прежнему представляет реальную угрозу для мирового сообщества в связи с существованием природных очагов и потенциальной возможностью использования чумного микроба в качестве агента биотерроризма (Грижебовский Г.М., 2006;
Топорков В.П. с соавт., 2007;
Richard J.L., Grimes D.E., 2008;
Smiley S.T., 2008). В этой связи особую значимость приобретает разработка вакцин нового поколения на основе дальнейшего изучения взаимодействия чумного микроба и его антигенов с клетками иммунной системы организма хозяина, внедрение более информативных и адекватных показателей, характеризующих иммунологическую эффективность средств экстренной и специфической профилактики чумы на клеточном уровне (DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005;
Bashaw J. et al., 2007;
Parrino J. et al., 2007;
Urban C.F. et al., 2008).
Анализ литературы за последнее десятилетие свидетельствует, что исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета организма хозяина уже не может рассматриваться лишь с позиций определения показателей завершенности или незавершенности лейкоцитарного фагоцитоза. В расщеплении факторов вирулентности и обезвреживании иерсиний (при подкожном заражении возбудителями чумы и псевдотуберкулеза) важную роль играет феномен внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов (Исачкова Л.М., Плехова Н.Г., 2002;
Weinrauch Y. et al., 2002;
Egges C. et al., 2004). Однако, возбудитель чумы эффективно подавляет функциональную активацию (секреторную дегрануляцию, хемотаксис, гибель и лизис) нейтрофилов на начальной стадии развития инфекционного процесса (Urban C.F. et al., 2008).
Массовую гибель клеток иммунной системы (фагоцитов и лимфоцитов) по типу апоптоза чумные микробы вызывают с помощью несвязанного c фагоцитозом механизма цитотоксичности (Marketon M. et al., 2005;
DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005), что лежит в основе современной гипотезы о причине длительной задержки воспалительного ответа организма хозяина при первичной легочной чуме.
Аэрогенное заражение устойчивыми к фагоцитозу чумными микробами представляет огромную эпидемическую опасность, поскольку бактерии интенсивно размножаются in vivo без проявления своих реактогенных свойств в течение 48 ч. Характерный для сепсиса системный воспалительный ответ неожиданно развивается на стадии, предшествующей быстрой гибели организма от легочной чумной инфекции, когда концентрация живых бактерий превышает 10 м.к./г печени и на 1 мл периферической крови (Bubeck S. et al., 2007).
Иммунологическая эффективность противочумных вакцин, поэтому, оценивается в последние годы по способности вакцинации (специфических антител к V-антигену и другим белкам Yop-вирулона чумного микроба) предотвращать цитотоксический эффект устойчивых к фагоцитозу чумных микробов на клетки иммунной системы лабораторных животных в условиях in vivo и/или in vitro. Адекватность сравнительной оценки интенсивности повреждения клеток привитого и не привитого против чумы организма обеспечивается за счет использования метода импульсной проточной цитофлуориметрии, который позволяет быстро регистрировать распределение большой статистической выборки отдельных лейкоцитов по клеточному циклу и определять в гетерогенной лейкоцитарной популяции долю апоптотических клеток, несущих молекулу ДНК на стадии деградации (Bashaw J. et al., 2007;
Zauberman A. et al., 2008).
Поскольку люди по устройству и функционированию клеточных механизмов врожденной антибактериальной защиты существенно отличаются от лабораторных животных, необходим переход к детальному изучению антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба в различных экспериментальных системах его взаимодействия in vitro с лейкоцитами крови именно человека. Без проведения таких исследований невозможно успешное решение актуальной проблемы оценки у людей напряженности приобретенного противочумного иммунитета (DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005).
Однако, цитотоксический эффект чумного микроба на лейкоциты крови человека методом проточной цитофлуориметрии не изучался. При моделировании in vitro чумной бактериемии не исследовалась зависимость интенсивности и динамики повреждения лейкоцитов в образцах цельной крови человека от исходной микробной концентрации, от условий выращивания бактериальной культуры и показателей степени неоднородности клеток микробной популяции, от уровня устойчивости бактерий к поглощению фагоцитами и реактивности бактерицидных гранул клеток врожденного иммунитета, а также от степени патогенности (вирулентности) штаммов чумного микроба для лабораторных животных. Современными методами автоматического цитологического анализа не изучалось влияние вакцинации людей живой чумной вакциной на функциональную активность и интенсивность повреждения лейкоцитов крови в экспериментальной системе их взаимодействия с клетками и антигенами чумного микроба.
Цель исследования - разработка экспериментальной системы для изучения взаимодействия чумного микроба с лейкоцитами цельной крови человека и оценки клеточного противочумного иммунитета у лиц, привитых живой чумной вакциной.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние условий культивирования на синтез в клетках Yersinia pestis ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов. Определить характер распределений отдельных бактерий по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в культурах вирулентного, вакцинного и авирулентного штаммов чумного микроба, выращенных при температурах 28 о и 37 оС.
2. Изучить антифагоцитарные и цитотоксические свойства клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 о и 37 оС, в экспериментальной системе их взаимодействия in vitro c лейкоцитами цельной крови человека, а также динамику размножения чумных микробов с различными о антифагоцитарными свойствами в крови с температурой 37 С.
3. Оценить эффективность опсонизации живых клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 о и 37 оС, термолабильным комплементом и термостабильными Ig G сыворотки крови по изменению показателей фагоцитарной активности, секреторной дегрануляции и раннего апоптоза клеток врожденного иммунитета человека.
4. Выявить различия в цитотоксическом эффекте клеток вакцинного EV НИИЭГ (Pgm-;
pFra+;
pCad+;
pPst+), вирулентного 231 (Pgm+;
pFra+;
pCad+;
pPst+) и авирулентного КМ 260(12) (Pgm+;
pFra-;
pCad-;
pPst-) штаммов Y. pestis на лейкоциты крови человека.
5. Изучить убитые чумные микробы и их отдельные антигены как индукторы развития процессов дегрануляции и гибели лейкоцитов в крови привитых и не привитых против чумы людей.
Научная новизна. Впервые разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать процесс фагоцитоза, а также процессы секреторной дегрануляции и апоптоза лейкоцитов при непосредственном введении чумного микроба или его очищенных антигенов в образцы цельной крови человека, основанная на измерении методом проточной цитофлуориметрии относительного содержания ДНК и лизосомальных гранул в отдельных лейкоцитах. Показано, что применение разработанной системы позволяет идентифицировать и дифференцировать в крови человека клетки врожденного иммунитета (моноциты и гранулоциты) по внутриклеточному содержанию бактерицидных веществ, локализованных в первичных (азурофильных) гранулах, регистрировать поглощение бактерий (бактериальной ДНК) активными фагоцитами, оценивать функциональную активацию в фагоцитах протеолитических и бактерицидных систем (дегрануляцию), а также определять характер индуцируемой бактериями гибели (фрагментации ДНК) лейкоцитов в экспериментальных условиях, исключающих влияние различных факторов, связанных с выделением клеточных популяций и неспецифической клеточной активацией.
С использованием разработанной системы впервые изучено взаимодействие с лейкоцитами цельной крови человека чумных микробов, выращенных при температурах 28 о и 37 оС. Получены новые данные о влиянии условий культивирования на степень устойчивости опсонизированных клеток Y. pestis к лейкоцитарному фагоцитозу, о способности размножающихся в крови чумных микробов подавлять, в отличие от золотистого стафилококка, секреторную дегрануляцию фагоцитов и их гибель по типу апоптоза на ранней стадии (в течение первых 6-8 ч) взаимодействия с клетками иммунной системы организма хозяина.
Впервые с использованием метода проточной цитометрии исследован эффект сывороточных опсонинов на исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета человека. Установлено, что развитие в моноцитах и гранулоцитах крови лиц, не привитых чумной вакциной, процессов секреторной дегрануляции и раннего апоптоза зависит от опсонизации живых чумных микробов, выращенных при температуре 28 оС, сывороточным комплементом и не зависит от термостабильных сывороточных опсонинов (Ig G).
Получена информация об устойчивости живых клеток Y. pestis, выращенных при температуре 37 оС, к опсонизации комплементом, подтверждающая на модели клеток крови человека способность факторов вирулентности чумного микроба инактивировать белки сывороточного комплемента.
Впервые изучена динамика гибели лейкоцитов при размножении в крови человека чумных микробов с различными биологическими свойствами, зависимость интенсивности этого процесса от длительности срока инкубации и исходной микробной концентрации. Установлено, что устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови с длительной задержкой по времени (в интервале от 24 до 48 ч инкубации), характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). В отличие от бактерий, выращенных при температуре 28 оС, они не могут вызвать гибели фагоцитов на ранней стадии взаимодействия с клетками крови человека (в течение первых 6-8 ч инкубации).
Новой является информация о различном характере реакции in vitro лизосомального аппарата и ядерного хроматина клеток врожденного иммунитета лиц, привитых и не привитых живой чумной вакциной, на контакт с убитыми клетками, липополисахаридом и капсульным антигеном чумного микроба.
Впервые показано, что противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание специфических антигенов Y. pestis в периферической крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер гибели клеток иммунной системы по типу индуцированного апоптоза.
Практическая значимость работы заключается в создании экспериментальной основы для изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба с использованием современного метода цитологического анализа, учитывающего функциональные параметры большого числа индивидуальных клеток в гетерогенных популяциях. Методические приемы, разработанные в процессе выполнения диссертации, нашли применение в научных исследованиях сотрудников РосНИПЧИ «Микроб» и Саратовского Государственного медицинского университета: для сравнительной оценки устойчивости бактерий к лейкоцитарному фагоцитозу и киллингу полиморфноядерными лейкоцитами крови человека;
для изучения факторов, влияющих на развитие апоптоза лейкоцитов в крови человека и лабораторных животных;
для прогнозирования осложнений у инфицированных новорожденных в клинических условиях по показателям интенсивности дегрануляции лейкоцитов периферической крови и лейкоцитарного апоптоза.
Полученные в работе экспериментальные данные могут служить основой для дальнейших исследований, направленных на дифференцирование штаммов Y.
pestis по степени их патогенности и эпидемической опасности для человека, а также на разработку эффективного теста оценки in vitro напряженности приобретенного клеточного иммунитета у лиц, привитых чумной вакциной.
По материалам диссертационной работы составлены:
1) методические рекомендации «Экспресс – метод выделения лейкоцитов из цельной крови человека и экспериментальных животных», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 9 от 01.10.99 г. и утверждены директором института «Микроб»;
2) методические рекомендации «Оценка уровня азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека с использованием проточной цитометрии», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 6 от 06.07.01 г. и утверждены директором института «Микроб»;
3) методические рекомендации «Организация работы и обеззараживание материала, содержащего возбудителя чумы при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии», одобрены Ученым советом ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, протокол № 6 от 12.12.08 г. и утверждены директором института «Микроб».
Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб».
Апробация работы. Результаты экспериментальной работы были доложены на 2-ой Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998);
юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология и ветеринария» (Киров, 1998);
научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999);
юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 1999);
VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (Санкт-Петербург, 2000);
международной конференции Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II (Saratov, 2000);
международной конференции Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III (Saratov, 2001);
научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Н. Новгород, 2004);
IX съезде Всероссийского научно практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007);
VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ (Саратов, 2007);
IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 2008);
Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008), а также на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2000, 2003, 2005, 2006, 2008 гг.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Информация об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба может быть получена в экспериментальной системе, основанной на введении живых бактерий в цельную кровь человека и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных (азурофильных) гранул.
2. Взаимодействие чумных микробов с лейкоцитами крови лиц, не привитых чумной вакциной, носит характер незавершенного фагоцитоза: с низкой эффективностью распознавания и поглощения бактерий фагоцитами;
с подавлением развития в фагоцитах процесса секреторной дегрануляции;
с нарушением защитного механизма быстрой гибели нейтрофилов по типу раннего апоптоза.
3. Интенсивность подавления защитной реакции клеток врожденного иммунитета человека факторами вирулентности Y. pestis и, как следствие, скорость размножения бактерий в крови с температурой 37 оС зависят от условий выращивания исходной бактериальной культуры (температура 28 о или 37 оС), от степени неоднородности клеток микробной популяции по содержанию ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов.
4. Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы индуцируют гибель лейкоцитов в цельной крови человека по типу позднего апоптоза – с длительной отсрочкой по времени, типичной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y. pestis EV НИИЭГ, 231 и КМ 260(12), относящиеся к различным группам патогенности (опасности), отличаются по способности и характеру индукции в крови позднего цитотоксического эффекта.
5. Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба в крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер развития индуцированного бактериями апоптоза.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 22 научных работы, в том числе 8 статей (2 из которых опубликовано в изданиях по “Перечню ведущих журналов и изданий” ВАК РФ).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 91 отечественный и 173 зарубежных источников. Текст иллюстрирован 23 рисунками и 7 таблицами. Общий объем диссертации составляет 157 страниц.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов: вакцинный штамм Y. pestis ЕV линии НИИЭГ (Pgm-, pFra+, pCad+, pPst+);
высоковирулентный штамм Y. pestis 231 (Pgm+, pFra+, pCad+, pPst+);
авирулентный штамм Y. pestis КМ 260(12) [231] (Pgm+, pFra-, pCad-, pPst-), являющейся изогенной бесплазмидной производной вирулентного штамма 231;
штамм Staphylococcus aureus 209P, применяемый в унифицированных методах исследования фагоцитарной и бактерицидной активности лейкоцитов при оценке иммунного статуса пациентов в клинических условиях (Меньшиков В.В., 1987;
Мед. лаб. технологии, 2002). А также антигены чумного микроба: липополисахарид и капсульный антиген (Ф1), любезно предоставленные профессором Т.М. Тараненко, ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
В опытах in vitro использовали периферическую кровь, выделенную из локтевой вены лиц, привитых и не привитых живой чумной вакциной (мужчин и женщин в возрасте от 23 до 50 лет).
Микробиологические методы. Клетки исследуемых штаммов Y. pestis выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) в течение 48 ч при температуре 28 oС (исходные стационарные культуры). Объектом исследования являлись также субкультуры штаммов Y. pestis, полученные путем высева исходных культур на бульон Хоттингера (рН 7,2) в концентрации 107 м.к./мл с последующим их культивированием в условиях аэрации при температуре 37 oС в течение 3, 6, 12, 18, 24 и 48 ч. Суточные культуры S. aureus выращивали на агаре Хоттингера (рH 7,2) при температуре 37 oС. Взвеси с различной концентрацией бактерий от 104 до 109 м.к./мл в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) готовили по стандартному образцу мутности ОСО-42-28-86П с использованием метода последовательных разведений. Убитые клетки Y. pestis EV НИИЭГ получали посредством нагревания бактериальных взвесей в течение 30 мин при температуре 100 oС, согласно СП 1.3.1285-03. Для контроля специфической стерильности 0,1 мл взвеси высевали на агаровые пластинки и бульон Хоттингера (рН 7,2) с последующей инкубацией при температуре 28 oС до 5 сут. Жизнеспособность бактерий, а также динамику размножения/гибели в крови клеток Y. pestis EV НИИЭГ определяли путем высева различных разведений обсемененной микробами крови на чашки Петри с агаром Хоттингера (рН 7,2) и подсчета числа колоний (КОЕ), соответствующих жизнеспособным бактериям. Результаты учитывали через 3, 8, 24 и 48 ч инкубации образцов крови при температуре 37 oС.
Выявление и морфологическую характеристику микробов осуществляли в окрашенных по Граму мазках крови человека с помощью световой микроскопии.
Сравнительная характеристика клеток Y. pestis в культурах, выращенных при температурах 28 o и 37 oС, включала в себя: определение электрофоретического профиля белков во фракциях общих мембран и периплазмы бактерий в полиакриламидном геле с 0,1% SDS по методу U.K. Laemmli (1970);
иммунофлуоресцентный анализ бактерий, окрашенных иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими чумными адсорбированными лошадиными сухими производства РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов), с помощью люминесцентной микроскопии (Титенко М.М. с соавт., 1984) и проточной цитофлуориметрии (Кравцов А.Л., 1997) для подтверждения изменений в их антигенных свойствах;
определение наличия капсулы на поверхности клеток чумного микроба методом электронной микроскопии (Коннов Н.П.с соавт., 1975).
Специфическую окраску ДНК в микробных клетках осуществляли смесью этидиум бромида и митрамицина по методу Steen H.B. et al. (1981), а суммарного белка флуоресцеинизотиоцианатом по методу Hutter K.J. & Eipel H.E. (1978). С помощью проточной цитометрии в исследуемых бактериальных культурах определяли характер распределения большой статистической выборки отдельных чумных микробов по клеточному циклу (по содержанию ДНК и белка на клетку), а также оценивали степень неоднородности бактериальных культур по данным показателям в различные сроки роста клеток гетерогенной микробной популяции при температуре 37 оС (Кравцов А.Л., 1997). Из частотных распределений отдельных бактерий по клеточному циклу получали информацию о процессах репликации ДНК и деления клеток в бактериальных культурах с различными биологическими свойствами (Steen H.B. et al., 1982;
Kell D. et al., 1991;
Аllman R. et al., 1993;
Lebaron P., Joux F.,1994).
Иммунологические методы. Кровь (15-20 мл) дефибринировали посредством встряхивания со стеклянными бусами в стерильном флаконе в течение 15 мин. Лейкоциты выделяли из крови общепринятым методом, абсолютное количество клеток в 1 мл подсчитывали в камере Горяева (Мед. лаб. технологии, 2002). Для проточно-цитофлуориметрических исследований применяли также экспресс-метод выделения лейкоцитов из микрообъема цельной крови человека (100 мкл), основанный на гипотоническом лизисе эритроцитов с последующим восстановлением осмотического баланса (Kravtsov A.L. et al., 2000).
Дифференциальный подсчет в цельной крови или в выделенных лейкоцитарных взвесях лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов проводили как унифицированным методом морфологического анализа мазков, так и с помощью быстрого цитохимического метода M.R. Melamed et al. (1972). В сыворотках крови привитых против чумы людей в реакциях РНГА и РТНГА с использованием диагностикума эритроцитарного чумного антигенного производства НИИМ МО РФ (г. Киров) определяли титр специфических антител к капсульному антигену чумного микроба (Самойлова Л.В. с соавт., 1998). Инактивацию сывороточного комплемента проводили путем нагревания нормальной сыворотки крови при температуре 56 oС в течение 30 мин на водяной бане. Осадок клеток (лейкоцитов и эритроцитов) трижды отмывали от сыворотки ЗФР (рН 7,4), а затем смешивали с инактивированной сывороткой для получения крови с инактивированным комплементом (Бобылева Е.В., 2004;
Вassoe C.-F., Bjerknes R., 1984).
Проточно-цитофлуориметрическое исследование лейкоцитов включало: 1) анализ распределений выделенных, фиксированных спиртом и окрашенных смесью митрамицина и этидиум бромида лейкоцитов по клеточному циклу (Barlogie B. et al., 1976);
2) детекцию и определение относительного содержания в крови диплоидных лейкоцитов (активных фагоцитов), несущих собственную ДНК плюс ДНК всех поглощенных бактерий (Кравцов А.Л. с соавт., 1994);
3) анализ лейкоцитов, суправитально окрашенных акридиновым оранжевым, для оценки состояния в отдельных клетках ядерного хроматина и бактерицидных гранул (Мelamed M.R. et al., 1972-1974);
4) определение относительного количества в крови апоптотических клеток (в %), несущих молекулу ДНК на стадии деградации (Telford W. et al., 1994;
Козинец Г.И. с соавт., 2002);
5) оценку интенсивности секреторной дегрануляции клеток врожденного иммунитета (фагоцитов крови) по методу Abrams W.R. et al. (1983) непосредственно в образцах цельной крови человека (Kravtsov A.L. et al., 2001;
Бобылева Е.В., 2004).
Для учета результатов автоматического цитофлуориметрического анализа использовали 2048 канальный анализатор импульсов ORTHO INSTRUMENTS (USA). Относительное содержание в клетках ДНК, белка, бактерицидных гранул и специфических поверхностных антигенов выражали в условных единицах специфической флуоресценции – каналах от 0 до 2048. Долю клеток с определенным содержанием биологически активного вещества на клетку рассчитывали с использованием курсора и специального интегрирующего устройства анализатора как отношение площади соответствующего пика к общей площади гистограммы (Кравцов А.Л., 1997). Коэффициенты вариации (КВ) частотных распределений бактерий или лейкоцитов по содержанию на клетку измеряемых параметров вычисляли из профилей соответствующих гистограмм по формуле M.J. McCutcheon, R.G. Miller (1979).
Статистическую обработку результатов анализа в группах повторных экспериментов проводили с использованием критерия t Стьюдента. Данные представляли в виде средней арифметической величины (М) и ошибки средней арифметической (±m). Различия считали достоверными при р0,05.
Результаты исследований и их обсуждение В процессе роста бактериальной культуры происходит перераспределение клеток по клеточному циклу, что позволяет за счет измерения содержания ДНК в отдельных бактериях получать информацию об интенсивности процессов репликации ДНК и клеточного деления на разных стадиях роста гетерогенной микробной популяции (Кell D. et al., 1991;
Lebaron P., Joux F., 1994). Характер распределения отдельных клеток по клеточному циклу различается в стационарных культурах вирулентных и авирулентных штаммов патогенных бактерий (Tyndall R.
et al., 1985;
Прозоров А.А., 1995), но сравнительная характеристика штаммов чумного микроба с различными биологическими свойствами по данному показателю не проводилась.
Путем измерения относительного содержания ДНК в больших статистических выборках отдельных бактерий (около 50 000 м.к.) нами впервые был проведен сравнительный анализ частотных распределений их по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в двухсуточных культурах вирулентного, вакцинного и авирулентного (бесплазмидного) штаммов чумного микроба, выращенных при температуре 28 оС, а также в субкультурах этих штаммов, находящихся на различных стадиях роста при аэрации на жидкой питательной среде с температурой 37 оС.
Было установлено, что в стационарных двухсуточных культурах трех исследуемых штаммов чумного микроба, выращенных при температуре 28 оС, присутствует около 90% бактерий с одинаково низким относительным содержанием ДНК на клетку. После высева таких бактерий из оптически плотных миллиардных взвесей на 100 мл жидкой питательной среды, получали бактериальные популяции с пониженной исходной концентрацией 107 м.к./мл, в которых к 6 ч культивирования резко увеличивалась доля синтезирующих ДНК клеток (в среднем с 10% до 50-70%, р0,001). В этот период времени устанавливался максимальный уровень неоднородности по относительному содержанию ДНК на клетку в культурах трех исследуемых штаммов чумного микроба, растущих в условиях аэрации при температуре 37 оС. При дальнейшем культивировании эта неоднородность полностью исчезала к 48 ч роста в культурах клеток вирулентного штамма 231 и в большей степени сохранялась в двухсуточных культурах клеток авирулентного штамма КМ 260(12), чем в культурах клеток вакцинного штамма ЕV (р0,01) чумного микроба (рисунок 1).
Это свидетельствовало о различной регуляции процесса клеточного деления в исследуемых гетерогенных микробных популяциях (Steen H.B. et al., 1982;
Kell D.
et al., 1991;
Lebaron P., Joux F., 1994;
Alvarez-Barrientos A. et al., 2000), о более быстром (вероятно, синхронном) делении клеток вирулентного штамма Y. pestis на поздней стадии его роста при температуре 37 оС.
Поскольку при делении грамотрицательных бактерий высвобождаются эндотоксины (мультимолекулярные комплексы липополисахарида с мембранными белками), обладающие в крови человека и животных выраженными цитотоксическими свойствами (Hellman J. et al., 2000;
Винокуров М.Г. с соавт., 2006), нами был изучен цитотоксический эффект трех исследуемых штаммов Y.
pestis с различными биологическими свойствами на начальной и поздней стадиях размножения бактерий в образцах цельной крови человека с температурой 37 оС.
Интенсивность цитотоксического эффекта клеток чумного микроба впервые оценивали в экспериментальной системе in vitro по изменению относительного содержания в крови погибших и поврежденных лейкоцитов (в апоптозе) методом проточной цитофлуориметрии. Проведенные сравнительные исследования показали, что вирулентный штамм чумного микроба, размножаясь в образцах крови человека с температурой 37 оС, вызывает в интервале времени от 24 до 48 ч гибель от 70 до 95% лейкоцитов независимо от исходной микробной концентрации. В тех же условиях наблюдали сравнительно слабый цитотоксический эффект клеток авирулентного штамма КМ 260(12) (р0,001).
Обладающий остаточной вирулентностью вакцинный штамм ЕV НИИЭГ повреждал лейкоциты только при высокой исходной микробной нагрузке. Его цитотоксический эффект развивался в интервале времени от 8 до 48 ч инкубации постепенно, в отличие от быстро развивающегося эффекта клеток высоковирулентного штамма 231. На начальной стадии размножения в образцах крови человека (через 8 ч инкубации) вирулентный штамм чумного микроба повреждал при высокой исходной микробной нагрузке 5.108 м.к./мл крови (или около 100 м.к. на лейкоцит) в 5 раз меньше лейкоцитов (р0,001), чем клетки золотистого стафилококка (таблица 1).
80 51,4±3, 40,3±2, 39,6±1, содержанием ДНК на клетку, % 25,1±0, Доля бактерий с высоким штамм Y. pestis 40 штамм Y. pestis КМ 18,0±0, 260(12) 12,0±0, 13,8±0, 14,3±0, штамм Y.pestis EV 9,0±0, НИИЭГ 0 6 Время культивирования при температуре 37 С, ч 0 ч культивирования – показатели, характерные для исходных культур, выращенных при температуре 28 С в течение 2-х сут. Цифры сверху – это значения КВ ДНК- гистограмм, %.
Рисунок 1. Распределение бактерий по клеточному циклу в культурах вирулентного 231, авирулентного КМ 260(12) и вакцинного EV НИИЭГ штаммов Y. pestis, выращенных при температурах 28 и 37 С.
Таким образом, в опытах с клетками цельной крови человека впервые была получена информация, подтверждающая современные представления о различной динамике гибели лейкоцитов при чумной и стафилококковой инфекциях.
Считается, что стафилококки активируют, а чумные микробы, наоборот, эффективно подавляют апоптоз клеток врожденного иммунитета на начальной стадии развития инфекционного процесса. Массовую гибель клеток иммунной системы по типу апоптоза (фагоцитов и лимфоцитов) клетки Y. pestis запускают на стадии, предшествующей гибели организма хозяина от чумной инфекции, с помощью несвязанного с фагоцитозом механизма цитотоксичности (Зигангирова Н.А., Гинцбург А.Л., 2004;
Marketon M. et al., 2005;
Bashaw J. et al., 2007;
Bubeck S.
et al., 2007;
Urban F. et al., 2008).
Таблица 1. Интенсивность апоптоза лейкоцитов крови человека in vitro в ответ на клетки вирулентного, авирулентного и вакцинного штаммов чумного микроба Относительное содержание Содержание гиподиплоидных лейкоцитов Индуктор апоптоза микробных в различные сроки клеток в мл инкубации крови с индуктором крови апоптоза при 37 С, (%) (0 ч инкубации) 8ч 24 ч 48 ч (M±m) (M±m) (M±m) 5х108 28,3±1,4 36,6±0,9 73,4±0, Y. pestis EV 5х108 14,4±0,2 15,0±0,6 23,4±1, Y. pestis KМ 260(12) 5х108 12,0±0,1 83,5±1,3 95,1±1, Y. pestis 5х108 51,6±3,2 62,3±2,1 66,2±4, S. aureus 5х104 6,3±0,5 10,6±0,8 9,4±1, Y. pestis EV 5х Y. pestis КМ 260(12) 6,5±0,1 8,6±0,4 13,0±0, 5х104 7,4±0,2 10,5±0,3 73,8±1, Y. pestis 5х104 6,0±0,6 9,2±1,0 8,9±0, S. aureus Спонтанный апоптоз 5,6±0,21 9,7±0, - 12,3±2, (контроль) Примечание - n = Для доказательства, что способность клеток Y. pestis выживать и размножаться в крови человека зависит от условий выращивания исходной бактериальной культуры и, как следствие, от уровня активации в микробных клетках процессов синтеза ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов, мы использовали при моделировании чумной бактериемии две исходные культуры вакцинного штамма ЕV чумного микроба, в которых клетки существенно различались по данным показателям - стационарную, выращенную при о температуре 28 С, и экспоненциальную 18-и часовую культуру, выращенную в условиях аэрации при температуре 37 оС (рисунки 1 и рисунок 2). Далее по тексту мы обозначаем клетки этих двух исследуемых культур соответственно как Y.
pestis (28) и Y. pestis (37).
С помощью электронной микроскопии подтверждали образование капсулы на поверхности клеток Y. pestis (37). Активация синтеза белка в бактериях, растущих при данной температуре, приводила к повышению интенсивности их специфической иммунофлуоресценции после окраски диагностическими чумными флуоресцирующими иммуноглобулинами. Доля бактерий с высоким уровнем содержания на клетку специфических поверхностных антигенов в культурах Y. pestis (37) в 6 раз превышала (р0,001), по данным метода проточной цитофлуориметрии, относительное содержание таких бактерий в культурах Y. pestis (28).
67 кДа 45 кДа 25 кДа 17 кДа 12 кДа Бп Ап Бм Ам М Ам - фракция общих мембран клеток, выращенных при температуре 28 С;
Ап - фракция периплазмы клеток, выращенных при температуре 28 С;
Бм - фракция общих мембран клеток, выращенных при температуре 37 С;
Бп - фракция периплазмы клеток, выращенных при температуре 37 С;
М – маркеры молекулярной массы (кДа).
Рисунок 2. Электрофоретический профиль белков во фракциях общих мембран и периплазмы Y. pestis EV НИИЭГ в зависимости от условий культивирования.
Путем подсчета в крови числа жизнеспособных бактерий (КОЕ) было установлено, что при низкой исходной микробной концентрации 10 4 м.к./мл клетки Y. pestis (28) погибают в образцах крови человека, в отличие от клеток Y. pestis (37). При исходной концентрации 108 м.к./мл клетки Y. pestis (28) интенсивно размножались в крови только после 8-и часового инкубационного периода, в то время как рост клеток Y. pestis (37) начинался сразу после их добавления в кровь с температурой 37 оС (рисунок 3). Исходя из результатов проведенных микробиологических исследований, мы предположили, что клетки этих двух исследуемых бактериальных культур обладают различными антифагоцитарными свойствами и, видимо, с различной эффективностью подавляют на начальной стадии размножения антибактериальное реагирование бактерицидных систем клеток врожденного иммунитета человека в условиях in vitro.
Экспериментальное подтверждение этого предположения было получено путем измерения в отдельных лейкоцитах содержания бактерицидных гранул с эластазной и миелопероксидазной активностью. Кровь делили по объему на четыре равные части: один образец инкубировали в отсутствии бактерий (отрицательный контроль);
другой с клетками золотистого стафилококка (положительный контроль адекватности антибактериального реагирования бактерицидных систем фагоцитов);
а в два оставшихся образца добавляли, соответственно, клетки Y. pestis (28) и Y. pestis (37), обладающие различной способностью к выживанию и размножению в цельной крови человека. Реакцию бактерицидных систем клеток врожденного иммунитета в образцах крови, обсемененных живыми чумными микробами, оценивали по интенсивности секреторной дегрануляции фагоцитов через каждый час инкубации в течение первых 6 ч, а также через 24 ч. Результаты сравнительного анализа, представленные в виде 32-х характерных гистограмм на рисунке 4, наглядно демонстрируют зависимость антибактериального реагирования бактерицидных систем клеток врожденного иммунитета от вида возбудителя, а также от антифагоцитарных свойств клеток Y. pestis.
n· КОЕ/мл А Время инкубации, ч n·108 КОЕ/мл 0 время инкубации,чч Время инкубации, Б А – исходная концентрация Y. pestis EV 104 м.к./мл крови;
Б – исходная концентрация Y. pestis EV 108 м.к./мл крови.
- клетки Y. pestis EV, выращенные при температуре 28 С;
- клетки Y. pestis EV, выращенные при температуре 37 С.
Рисунок 3. Влияние условий культивирования и исходной концентрации клеток Y. pestis EV НИИЭГ на их способность к размножению в крови человека in vitro.
Контроль S. aureus Y. pestis (28) Y. pestis (37) 0ч 1ч 2ч 3ч 4ч 5ч 6ч 24 ч На каждой из 32-х гистограмм по оси абсцисс – содержание бактерицидных гранул на клетку в условных единицах красной флуоресценции (каналах от 0 до 512), а по оси ординат количество клеток (от 0 до 1000). Результаты сравнительного анализа лейкоцитов представлены в различные сроки инкубации обсемененной бактериями крови при температуре 37 оС. Исходная микробная нагрузка около 100 м.к./лейкоцит.
Рисунок 4. Различный характер подавления секреции бактерицидных веществ из гранул фагоцитов крови человека клетками Y. pestis EV НИИЭГ, выращенными при температурах 28 о и 37 оС.
В интервале времени от 3 до 4 ч инкубации клетки S. aureus вызывали при исходных микробных нагрузках более 1 м.к./фагоцит (более 107 м.к./мл крови) полную дегрануляцию около 100% фагоцитов, что свидетельствовало о высокой эффективности киллинга стафилококка в крови человека (Козинец Г.И. с соавт., 2001;
Плехова Н.Г., 2006;
Fuchs T.A. et al., 2007). Однако, в ответ на клетки Y. pestis (28) дегрануляция развивалась к 4 ч инкубации при тех же исходных микробных нагрузках только в половине клеток врожденного иммунитета. В интервале времени от 4 до 24 ч ситуация не изменялась. Это свидетельствовало о том, что, размножаясь в крови с температурой 37 оС, клетки Y. pestis EV (28) приобретают через 4 ч способность к полному подавлению процесса секреции бактерицидных веществ из гранул фагоцитов крови человека. Такой характер развития дегрануляции наблюдается, как известно, при незавершенном фагоцитозе и неэффективном киллинге в крови человека клеток Y. pseudotuberculosis (Исачкова Л.М., Плехова Н.Г., 2002), а также при незавершенном фагоцитозе и неэффективном киллинге S. aureus в образцах крови новорожденных или взрослых людей с иммунодефицитными состояниями (Бобылева Е.В., 2004).
Поскольку в наших исследованиях у доноров наблюдалась адекватная реакция бактерицидных систем фагоцитов в ответ на клетки золотистого стафилококка, неспособность фагоцитов крови тех же доноров адекватно отвечать секреторной дегрануляцией на клетки Y. pestis (28) являлась важным показателем, характеризующим антифагоцитарные свойства чумного микроба. Гистограммы, представленные на рисунке 4, свидетельствуют, что бактерицидные гранулы фагоцитов не реагируют на внедрение клеток Y. pestis (37) в цельную кровь человека. Процесс секреции бактерицидных веществ из клеток врожденного иммунитета подавлялся в этом случае не через 4 ч инкубации, а с момента попадания бактерий в образцы крови, что в состоянии объяснить более высокую жизнеспособность и скорость размножения в крови клеток Y. pestis (37).
Экспериментальные данные, полученные при изучении антифагоцитарных свойств клеток Y. pestis (37), согласуются с современными представлениями о стратегии, используемой чумными микробами для защиты от бактерицидного эффекта самой многочисленной популяции клеток врожденного иммунитета, ответственной за нейтрализацию факторов вирулентности иерсиний. Ее уникальность состоит не в том, что возбудитель чумы приобретает устойчивость к поглощению и внутриклеточному перевариванию нейтрофилами (такую стратегию используют многие возбудители). При аэрогенном заражении клетками Y. pestis (37) полностью подавляется механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов, необходимый для эффективного киллинга бактерий и развития местного воспаления. В кровь и ткани организма (во внеклеточное пространство) не высвобождаются бактерицидные вещества (extracellular traps), образуемые при секреторной дегрануляции (функциональной активации) и гибели (фрагментации ядерного хроматина) нейтрофилов (Urban C.F. et al., 2008).
Экспериментальная система, разработанная нами для характеристики антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба, основана на добавлении бактерий в цельную кровь человека и измерении в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания на клетку ДНК и бактерицидных гранул. При использовании этой системы для сравнительной характеристики Y. pestis (28) и Y. pestis (37) было установлено, что процесс гибели (фрагментации ДНК) клеток врожденного иммунитета человека на начальной стадии их взаимодействия с чумными микробами тесно связан с процессом поглощения бактерий активными фагоцитами, а также с развитием в активных фагоцитах процесса дегрануляции. Из 32-х ДНК-гистограмм представленных на рисунке 5 видно, что к 6 ч инкубации в крови погибают только активные фагоциты, в которых через 1 и 2 ч инкубации в результате поглощения бактерий (бактериальной ДНК) повышается относительное содержание ДНК на клетку. Процесс фрагментации ДНК клеток врожденного иммунитета (гибели активных фагоцитов по типу раннего апоптоза) запускался, таким образом, через 2 ч после завершения в этих клетках процесса секреторной азурофильной дегрануляции. Поскольку в поглощении и киллинге клеток Y. pestis (28) участвовало вдвое меньше клеток врожденного иммунитета человека, чем в поглощении и киллинге клеток S. aureus (соответственно 44,5±2,5% и 93,0±1,4%, р0,001), доля погибших фагоцитов в образцах крови, обсемененных клетками чумного микроба и стафилококка, была соответственно около 50% и 100%. Клетки Y. pestis (37), которые не поглощались фагоцитами и не вызывали развития в фагоцитах процесса дегрануляции, не повреждали лейкоциты крови человека в течение суток независимо от исходной микробной концентрации.
Контроль S. aureus Y. pestis (28 ) Y. pestis (37) 0ч 1ч 2ч 3ч 4ч 5ч 6ч 24 ч На каждой из 32-х ДНК гистограмм по оси абсцисс – относительное содержание ДНК на клетку в условных единицах (каналах от 0 до 512), а по оси ординат - количество клеток (импульсов) на единицу измерения (канал). Результаты получены в различные сроки инкубации обсемененной бактериями крови при температуре 37 оС. Поглощение клеток Y. pestis (28) и S. aureus (бактериальной ДНК) вызывает повышение содержания ДНК в активных фагоцитах, а затем фрагментацию ДНК (гибель) активных фагоцитов.
Клетки Y. pestis (37) не поглощаются фагоцитами и в течение суток не обладают цитотоксическими свойствами.
Рисунок 5. Различия в антифагоцитарных и цитотоксических свойствах клеток Y.
pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 о и 37 оС, на фоне адекватной реакции фагоцитов крови человека на клетки S. aureus.
Для доказательства, что разработанная нами экспериментальная система позволяет регистрировать присутствие бактериальной ДНК внутри активных фагоцитов и оценивать фагоцитарную активность клеток врожденного иммунитета человека по отношению к чумному микробу, были проведены исследования с при температуре 56 оС образцами крови, в которых путем нагревания предварительно инактивировали белки сывороточного комплемента (термолабильные опсонины). Кроме того, для создания условий, при которых процесс поглощения бактерий (бактериальной ДНК) невозможен, в образцы цельной крови добавляли одновременно с микробными клетками известный ингибитор лейкоцитарного фагоцитоза 0,02% ЭДТА (отрицательный контроль).
Положительным контролем служили результаты опытов с клетками золотистого стафилококка, поскольку фагоцитарная активность гранулоцитов крови людей с нормальными показателями иммунного статуса по отношению к этому микроорганизму, опсонизированному инактивированной сывороткой, вдвое ниже, чем в крови с активным комплементом, и составляет около50% (Bassoe C.-F., Bjerknes С.O., 1984).
При добавлении в кровь 0,02% ЭДТА фагоциты не поглощали бактерии (бактериальную ДНК) и мы не наблюдали характерного повышения уровня содержания ДНК в фагоцитах через 1 и 2 ч инкубации, независимо от того какие микробы (S. aureus или Y. pestis) присутствовали в высокой концентрации 5.108 м.к./мл в образцах цельной крови. В крови с инактивированным сывороточным комплементом фагоцитарная активность гранулоцитов крови по отношению к S. aureus была двое ниже нормы (снижалась с 93,0±1,4 до 47,8±4,9%, р0,001), в то время как клетки Y. pestis (28), опсонизированные инактивированной сывороткой крови человека, не поглощались фагоцитами и не вызывали развития в фагоцитах процесса секреторной дегрануляции. Это свидетельствовало о том, что в крови лиц, не привитых живой чумной вакциной, нет активных при фагоцитозе специфических антител (термостабильных IgG) к антигенам чумного микроба, но есть специфические антитела к антигенам золотистого стафилококка (Bassoe C.-F., Bjerknes С.O., 1984). Видимо, вследствие отсутствия специфических антител, фагоцитарная активность гранулоцитов крови человека по отношению к клеткам Y. pestis (28) в крови с нормальной сывороткой была вдвое ниже, чем по отношению к золотистому стафилококку. Клетки Y. pestis (37) обладали устойчивостью к поглощению фагоцитами как в крови с нормальной, так и в крови с инактивированной сывороткой. Они обладали, в отличие от клеток Y. pestis (28), способностью инактивировать сывороточный комплемент, что подтверждается литературными данными (Du Y. et al., 2002;
Korhonen T.K., 2004).
Клетки Y. pestis (37), в отличие от клеток Y. pestis (28), не обладали в используемой нами экспериментальной системе цитотоксическими свойствами в течение суток. Причем, независимо от их исходной концентрации в образцах крови человека. Они повреждали лейкоциты крови (фагоциты и лимфоциты) в интервале времени от 24 до 48 ч – с длительной задержкой, характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). От дозы зависела интенсивность гибели лейкоцитов в крови через 48 ч инкубации по типу позднего апоптоза. Доля поврежденных клеток при увеличении концентрации бактерий с 104 до 108 м.к./мл крови повышалась с 10,6±0,8 до 88,3±2,3%. Полученная нами информация, подтверждается литературными данными о динамике гибели лейкоцитов в организме зараженных чумой лабораторных животных. В условиях in vivo возбудитель чумы вызывает при аэрогенном заражении гибель клеток иммунной системы по типу апоптоза, как известно, не ранее 48 ч, что лежит в основе современных представлений о причине длительной задержки воспалительного ответа организма хозяина при первичной легочной чуме (Bubeck S. et al., 2007).
На заключительном этапе выполнения диссертационной работы экспериментальная система, основанная на количественной цитофлуориметрии в отдельных клетках крови относительного содержания ДНК и бактерицидных гранул, была использована нами для оценки влияния противочумной вакцинации на функциональную активность и интенсивность повреждения лейкоцитов человека при их взаимодействии in vitro c клетками и антигенами чумного микроба.
В образцы цельной крови лиц, привитых и не привитых живой чумной вакциной (ЖЧВ), добавляли живые или убитые нагреванием клетки Y. pestis (28) и Y. pestis (37) в дозе 5.108 м.к./мл, а также липополисахарид (ЛПС) или капсульный антиген чумного микроба в концентрациях 100, 500 и 1000 мкг/мл.
Функциональную активность и интенсивность повреждения клеток врожденного иммунитета оценивали методом проточной цитофлуориметрии по показателям интенсивности дегрануляции и апоптоза через 2 ч инкубации образцов крови при температуре 37 оС. Кроме того, мы учитывали результаты анализа через 6 ч инкубации, то есть в период, когда у всех не привитых против чумы людей наблюдаются, по данным проточной цитофлуориметрии, выраженные различия в степени реактивности бактерицидных гранул и ядерного хроматина лейкоцитов крови на живые чумные микробы, выращенные при температурах 28 о и 37 оС.
Гранулоциты крови привитых против чумы людей обладали способностью к более эффективному распознаванию специфических антигенов чумного микроба в условиях in vitro. Они отвечали более интенсивной секреторной дегрануляцией на живые, убитые клетки Y. pestis (28), а также на низкую дозу ЛПС чумного микроба. При использовании в качестве антигена убитых клеток Y. pestis (28) дегрануляцию большого числа клеток врожденного иммунитета регистрировали к 2 ч инкубации в образцах крови только лиц, привитых ЖЧВ. Дегенеративные изменения, развивающиеся в лейкоцитах по этому показателю, были более информативны, чем изменения в состоянии ядерного хроматина. Изменения в ядерном хроматине лейкоцитов зависели от срока прошедшего после прививки ЖЧВ, а также от индивидуальных особенностей организма человека. В подгруппе со сроком после прививки от 1 до 4 месяцев они наблюдались лишь у половины обследованных и отсутствовали в ответ на убитые чумные микробы в подгруппе со сроком от 12 до 18 месяцев (таблица 2).
При изучении взаимодействия живых клеток вакцинного штамма чумного микроба in vitro c лейкоцитами крови привитых против чумы людей мы оценивали не только способность противочумной вакцинации активировать апоптоз лейкоцитов на ранней стадии взаимодействия (через 2 и 6 ч инкубации), но и предотвращать поздний цитотоксический эффект устойчивых к фагоцитозу чумных микробов, развивающийся в интервале времени от 24 до 48 ч инкубации.
Интенсивность позднего цитотоксического эффекта чумных микробов в образцах крови привитых против чумы людей была достоверно ниже (рисунок 6) при титрах специфических антител к капсульному антигену чумного микроба 1:10–1:15.
Таблица 2. Реактивность лейкоцитов крови на убитые клетки Y. pestis EV НИИЭГ у различных людей в зависимости от срока, прошедшего после прививки ЖЧВ Количество Количество лейкоцитов лейкоцитов с Образцы крови людей № образца в состоянии поврежденным дегрануляции, % ядерным хроматином, % 1 65,0 95, 2 44,5 92, 3 35,4 8, Через 1 – 4 мес 4 50,1 9, после прививки ЖЧВ 5 55,2 25, ( n = 7) 6 42,6 10, 7 51,8 9, M±m 49,2±3,6** 35,9±15, 8 33,0 8, 9 7,5 6, Через 12 – 18 мес 10 27,9 7, после прививки ЖЧВ 11 9,7 7, (n = 5) 12 23,3 6, M±m 20,3±5,9* 7,3±0, 13 4,5 6, 14 2,5 10, Невакцинированных 15 1,0 5, ( n = 5) 16 5,1 11, 17 0,3 3, M±m 2,7±1,1 7,2±1, Примечание 1. Результаты учитывали через 2 ч инкубации образцов крови при температуре 37 С.
2. Достоверность различий с группой невакцинированных р0,001 (**) и р0,05 (*).
Количество клеток в апоптозе, % Невакцинированные 30 Вакцинированные 6 24 48 Время инкубации, ч Рисунок 6. Влияние противочумной вакцинации на апоптоз лейкоцитов, индуцируемый живыми чумными микробами в крови человека in vitro.
Таким образом, вакцинация активировала клетки врожденного иммунитета (их дегрануляцию, гибель и лизис) на начальной стадии взаимодействия с чумными микробами и снижала интенсивность позднего цитотоксический эффекта бактерий на лейкоциты крови человека.
Выводы 1. Разработана экспериментальная система для получения информации об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба, основанная на введении живых бактерий в цельную кровь человека in vitro и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных гранул.
2. В двухсуточных культурах вирулентного штамма Y. pestis 231, выращенных на жидкой питательной среде с температурой 37 оС, доля бактерий с относительно низким содержанием ДНК на клетку на 40% выше, чем в культурах авирулентного штамма КМ 260(12), и на 20% выше, чем в культурах вакцинного штамма ЕV НИИЭГ. Это свидетельствует о более быстром делении клеток вирулентного штамма в растущей гетерогенной микробной популяции и сопровождается наиболее интенсивным цитотоксическим эффектом этого штамма на лейкоциты крови человека.
3. Способность вакцинного штамма ЕV НИИЭГ чумного микроба к размножению в образцах цельной крови человека зависит от температурного режима, стадии роста исходной бактериальной культуры и исходной микробной концентрации. При низкой микробной нагрузке 104 м.к./мл в крови погибают к 8-и ч инкубации клетки стационарной двухсуточной культуры этого штамма, выращенной при температуре 28 оС, и интенсивно размножаются клетки экспоненциальной (18-и часовой) бактериальной культуры, выращенной на жидкой питательной среде с температурой 37 оС.
4. Из-за отсутствия специфических антител (активных термостабильных опсонинов) в крови не привитых против чумы людей, фагоцитарная активность гранулоцитов по отношению к чумным микробам, выращенным при температуре 28 оС, вдвое ниже, чем по отношению к золотистому стафилококку.
Цитотоксический эффект таких чумных микробов развивается в два этапа – сначала по типу связанного с фагоцитозом раннего апоптоза (через 6 ч инкубации), а затем по типу позднего апоптоза (в интервале времени от 24 до 48 ч).
5. Устойчивая к фагоцитозу популяция клеток чумного микроба может быть получена путем высева клеток двухсуточной культуры Y. pestis ЕV НИИЭГ, выращенных при температуре 28 оС, на жидкую питательную среду с о температурой 37 С, где бактерии размножаются при аэрации от 6 до 18 ч.
Микробная популяция приобретает устойчивость к поглощению фагоцитами крови, утрачивает способность к активации клеток врожденного иммунитета и быстрому повреждению лейкоцитов крови человека, когда становится высоко неоднородной с точки зрения содержания ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов на клетку.
6. Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови по типу позднего апоптоза – с длительной задержкой по времени, характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y.
pestis ЕV НИИЭГ, 231 и КМ 260(12), относящиеся к различным группам патогенности (опасности), различаются по интенсивности цитотоксический эффекта на лейкоциты человека в интервале времени от 24 до 48 ч инкубации образцов крови при температуре 37 оС.
7. Секреторную дегрануляцию и ранний апоптоз клеток врожденного иммунитета человека запускают в образцах цельной крови человека убитые клетки чумного микроба, выращенные при температуре 28 оС, а также препараты липополисахарида и капсульного антигена чумного микроба. У всех лиц, не привитых живой чумной вакциной, наблюдается слабая реакция нейтрофилов периферической крови по данным показателям.
8. Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета человека, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба, и оказывает модулирующее воздействие на характер развития в крови индуцируемого чумными микробами апоптоза. Интенсивность дегенеративных изменений, развивающихся в лизосомальном аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов крови привитых против чумы людей при контакте in vitro c клетками или антигенами чумного микроба, зависит от срока, прошедшего после прививки живой чумной вакциной.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Кравцов А.Л., Гребенюкова Т.П.*, Тараненко Т. М., Наумов А.В. Разрушение азурофильных гранул с эластазной активностью в нейтрофилах человека под влиянием эндотоксина Yersinia pestis // Гомеостаз и инфекционный процесс: Матер.
2 Всерос. конф. - Саратов, 1998. - С. 37.
2. Кравцов А.Л., Киреев М.Н., Гребенюкова Т.П.*, Храмченкова Т.А., Кузьмиченко И.А. Оценка состояния генетического аппарата лейкоцитов крови человека в культурах с клетками непатогенных бактериальных штаммов // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология и ветеринария: Матер. Юбил. науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиол. МО РФ. - Киров, 1998.- С. 124.
3. Кравцов А.Л., Гребенюкова Т.П.*, Наумов А.В. Проточно-цитометрический мониторинг азурофильной дегрануляции полиморфоядерных лейкоцитов в цельной крови человека в ответ на клетки Staphylococcus aureus и Yersinia pestis // Scient. J. 1999. - № 7. - P. 250-252.
4. Кравцов А.Л., Гребенюкова Т.П.*, Наумов А.В. Проточно-цитометрический мониторинг азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека в ответ на клетки Staphylococcus aureus и Yersinia pestis // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Сб. тез. докл. Юбилейн. научн. конф., посв. 25-лет.
ГНЦ прикл. микробиол. - Оболенск, 1999.- С. 82.
5. Кравцов А.Л., Гребенюкова Т.П.*, Тараненко Т. М., Кузнецов О.С., Храмченкова Т.А., Наумов А.В. Проточно-цитофлуориметрический мониторинг за развитием азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека в ответ на эндотоксин Yersinia pestis // Проблемы особо опасных инфекций. - 1999.- № 79.- С.
81-89.
6. Кравцов А.Л., Ляпин М.Н., Гребенюкова Т.П.*, Наумов А.В., Головко Е.М., Малюкова Т.А., Костюкова Т.А., Ежов И.Н. Цитофлуориметрический анализ ДНК некоторых штаммов Vibrio cholera и Yersinia pestis // Проблемы биологической и экологической безопасности: межд. конф. - Оболенск, 2000. - С. 54-55.
7. Гребенюкова Т.П.*, Бобылева Е.В., Кравцов А.Л. Азурофильная дегрануляция как эффектор деградации ДНК апоптозных нейтрофилов // Инфекционные болезни:
диагностика, лечение, профилактика: Матер. VI Российско-Итальян. науч. конф. Санкт-Петербург, 2000.- С. 66-67.
8. Кравцов А.Л., Киреев М.Н., Куляш Ю.В., Шмелькова Т.П., Бобылева Е.В., Наумов А.В. Роль лейкоцитарной эластазы в антибактериальной защите и развитии патологических процессов при инфекциях // Актуальные вопросы патогенеза, клиники, лечения в инфекционной патологии и организация помощи инфекционным больным. Сб. науч. тр., посвящ. 75-лет. со дня рожд. проф. Н.Р.
Иванова. - Саратов, 2000. - С 63-66.
9. Кravtsov A.L., Grebenyukova T.P.*, Bobyleva E.V., Golovko Е.М., Malyukova T.A., Lyapin M. N., Кostyukova T.A., Yezhov I.N., Кuznetsov O.S. Flow cytofluorometric assay of human whole blood leukocyte DNA degradation in response to Yersinia pestis и Staphylococcus aureus // Proc. SPIE. - 2001. - V.4241. - P. 260-267.
10. Кравцов А.Л., Бобылева Е.В., Шмелькова Т.П., Куляш Ю.В. Развитие азурофильной дегрануляции нейтрофилов в крови человека, инфицированной in vitro стафилококком: эффект микробной нагрузки по данным проточной цитофлуорометрии // Актуальные проблемы патологии. Сб. науч. тр., посвящ. 90 летию кафедры патологической физиологии СГМУ. - Саратов, 2001. - С. 102-107.
11. Кravtsov A.L., Bobyleva E.V., Grebenyukova T.P.*, Кuznetsov O.S., Kulyash Y.V.
Flow microfluorometric analysis of phagocyte degranulation in bacteria infected whole human blood cell cultures // Proc. SPIE. - 2002. - V.4707. - P. 395-402.
12. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Бобылева Е.В., Кузнецов О.С. Оценка уровня азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека с использованием проточной цитометрии // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. Саратов, 2002. - С. 14-15.
13. Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Кутырев В.В.
Проточная цитометрия как новая технология современной клинической микробиологии // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всерос. научно практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 125-126.
14. Шмелькова Т.П., Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Видяева Н.А., Гаева А.В., Коннов Н.П., Кузнецов О.С., Волков Ю.П., Киреев М.Н. Фагоцитарная активность лейкоцитов крови человека по отношению к клеткам Yersinia pestis ЕV: оценка in vitro методом проточной цитофлуориметрии // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний: Матер. научн.
конф., посвящ.75-летию Нижегор. НИИЭМ. - Н. Новгород, 2004. - С. 178-183.
15. Шмелькова Т.П., Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Ляпин М.Н., Костюкова Т.А., Малюкова Т.А., Головко Е.М., Видяева Н.А., Коннов Н.П. Влияние биологических свойств чумного микроба на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека в системе in vitro // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - № 93. - С. 85-89.
16. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Лоцманова Е.Ю., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н.
Феномен внеклеточной бактерицидности нейтрофилов и механизмы защиты бактерий от действия лейкоцитарной эластазы // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. - № 1. - С. 49-52.
17. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Задумина С.Ю., Бугоркова С.А., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Азурофильная дегрануляция нейтрофилов крови in vitro у лиц, привитых живой чумной вакциной // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации: Матер. IX съезда Всерос. научно-практ. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол.: В 3 Т. Т.1. Москва, 2007. - С. 71- 72.
18. Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Лоцманова Е.Ю., Кутырев В.В. Роль апоптоза в иммунопатогенезе особо опасных инфекций // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации: Матер. IX съезда Всерос. научно-практ. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол.: В 3 Т. Т.1. - Москва, 2007. - С. 118-119.
19. Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н.
Экспериментальная система для изучения антифагоцитарных свойств возбудителей особо опасных инфекций // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. научно-практ. конф. госуд. – участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 232-234.
20. Шмелькова Т.П., Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н. Задержка дегрануляции и гибели лейкоцитов крови человека в экспериментальной системе их взаимодействия с устойчивыми к фагоцитозу чумными микробами // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Матер. IX Межгос.
научно-практ. конф. госуд. - участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С. 152-154.
21. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Влияние противочумной вакцинации на апоптоз лейкоцитов крови человека // Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Матер. Всерос. научно-практ.
конф. - Москва, 2008. - С.67.
22. Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н. Изучение взаимодействия чумного микроба с клетками крови в модельных системах in vitro // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2008. - С.43.
* - фамилия автора Гребенюкова Т.П. изменена на Шмелькова Т.П.