Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно – генетических методов
На правах рукописи
АЛЕКСЕЕВА Светлана Викторовна Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно – генетических методов 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2011 2
Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» Научные руководители: Лауреат премии Совета Министров СССР, доктор ветеринарных наук, профессор Сидорчук Александр Андреевич доктор биологических наук, профессор Забережный Алексей Дмитриевич
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, доцент Гнездилова Лариса Александровна кандидат биологических наук Шмаров Максим Михайлович
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»
Защита состоится «_» 2011 г. в «_» часов на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул.
Академика Скрябина, 23.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина»
Автореферат разослан «_» 2011 г. и размещен на сайте http://mgavm.ru
Ученый секретарь диссертационного совета, профессор Т.Н. Грязнева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Копытная гниль овец – это известная с 18-го столетия инфекционная болезнь, которая с тех времен и по сей день продолжает наносить ущерб овцеводческой отрасли во всм мире (Abbott K.A., 2005;
Buller P., 2010).
Из-за культуральных особенностей Dichelobacter nodosus стандартная бактериологическая методика идентификации возбудителя представляет собой трудный, длительный и не всегда эффективный процесс. В австралийских лабораториях процент проб патологического материала из которых удается выделить первичные культуры D.nodosus, составляет всего 25-65% (Graham B., 2003).
Развитие молекулярных методик существенно облегчило и ускорило (с 3 - 4 недель до одного дня) лабораторную диагностику D.nodosus.
Выявление и идентификацию D.nodosus проводят по гену 16S рРНК. (La Fontaine S., 1993). Главное преимущество молекулярных методик, в том числе ПЦР - чувствительность, специфичность, устранение от трудоемких, длительных и не всегда успешных процедур выделения возбудителя (Petti C.A., 2006;
Woo P.C., 2008).
В настоящее время, все 10 известных серологических групп возбудителя можно идентифицировать с помощью ПЦР – амплификации гена фимбриальной субъединицы FimA (Dhungyel O.P., 2002;
Wani S.A., 2006;
Zhou H., 2001).
Для России актуальность разработки молекулярно-генетических методик несомненна. Российские лаборатории не обладают возможностями для проведения бактериологического и серологического исследования болезнь часто проходит под диагнозом некробактериоз.
D.nodosus, Современных методов диагностики копытной гнили овец в нашей стране нет.
Таким образом, усовершенствование диагностики копытной гнили овец с использованием молекулярно-генетических методов является своевременным и необходимым.
Цель работы: биологическая и молекулярно генетическая характеристика штаммов D.nodosus и разработка методик ПЦР для осуществления видовой идентификации и типирования возбудителя копытной гнили овец.
Задачи исследований:
1. Разработать методику ПЦР – анализа на основе амплификации гена 16S рРНК Dichelobacter nodosus для видовой идентификации возбудителя из культуры.
2. Разработать методику ПЦР – анализа на основе амплификации гена fimA для типирования штаммов возбудителя.
3. Охарактеризовать молекулярно - генетически штаммы Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко в сравнении с основными биологическими свойствами этих культур.
4. Разработать способы подготовки проб патологического материала для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.
5. Оценить корреляцию данных филогенетического анализа Dichelobacter по гену и серологического метода РА (реакция nodosus fimA агглютинации).
Научная новизна.
Охарактеризованы биологические и молекулярно - генетические свойства 17 штаммов Dichelobacter nodosus.
Проведена видовая идентификация реактивированных штаммов Dichelobacter nodosus по гену 16S рРНК и их типирование по гену fimA.
Разработана новая методика пробоподготовки патологического материала, позволяющая выявлять и идентифицировать Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований на основе ПЦР амплификации фрагмента гена 16S рРНК.
Предложен новый фрагмент гена fimA, на основе которого проведен филогенетический анализ 15–ти штаммов и обнаружена D.nodosus корреляция генотипов с серотипами возбудителя.
Практическая значимость.
Охарактеризован молекулярно - генетически производственный штамм ПП 82/90 Dichelobacter nodosus, применяемый для производства вакцины «Овикон».
Проведена реактивация штаммов D.nodosus после 20-ти летнего хранения в лиофилизированном виде, изучена их жизнеспособность, сохранение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств.
Разработана методика ПЦР, позволяющая с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять видовую идентификацию возбудителя в - D.nodosus лабораторных условиях без предварительного культивирования.
Разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификациии фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР», утвержденные Научно - методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г. и предназначенные для использования в научно исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению D.nodosus и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий.
Личный вклад соискателя.
Личный вклад соискателя заключается в организации и проведении бактериологических, молекулярно-генетических исследований, а также анализе и обобщении результатов работы.
Апробация работы.
Материалы работы доложены на Международной научно практической конференции по современным методам диагностики, профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных (г.
Ставрополь, 2009 г.), Международной научно - практической конференции, посвященной 90-летию МГАВМиБ (г. Москва, 2009 г.) Результаты работы включены в годовые отчеты по НИР кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней МГАВМиБ в 2008-2010 гг.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе в 3-х изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка использованной литературы, включающего 228 источников (в т.ч. 188 иностранных). Работа содержит таблиц и 23 рисунка.
Основные положения выносимые на защиту:
1. Методика видовой идентификации Dichelobacter nodosus с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР в культуре или патологическом материале.
2. Методика типирования штаммов Dichelobacter nodosus с помощью амплификациии фрагмента гена fimA.
3. Реактивация и исследование биологических и молекулярно генетических свойств штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко.
4. Разработка способа подготовки проб патологического материала для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.
5. Филогенетический анализ штаммов Dichelobacter nodosus на основе нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена fimA и сравнение с результатами серологического метода РА.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и инфекционных болезней Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина», ПЦР и секвенирование проводились в лаборатории молекулярной диагностики Государственного учреждения "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского», а реактивация коллекции штаммов D.nodosus – в лаборатории микробиологии Всероссийского научно исследовательского института экспериментальной ветеринарии им.
Я.Р.Коваленко (ВИЭВ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Бактерии. В работе использовались 27 штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции бактерий лаборатории инфекционных болезней овец ВИЭВ им.
Я.И.Коваленко, выделенных в 1970-80-е гг. на территории бывшего СССР (И.Н. Семенова, А.А. Сидорчук, А.М. Бектемиров). Также в исследованиях применяли производственный штамм ПП 82/90, использующийся на Ставропольской биофабрике для изготовления вакцины «Овикон» (депонированный во ВГНКИ). Все исследуемые штаммы хранились в лиофилизированном виде в запаянных (под вакуумом) ампулах.
Для определения специфичности ПЦР применялись 10 штаммов различных видов бактерий (E.coli, S.aureus, B.subtilis, C.perfringens, C.septicum, P.aeuroginosa, A.pyogenes, S.zooepidermicus, F.necrophorum, F.nucleatum).
Для генетических исследований использовались нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и fimA референтных штаммов D.nodosus из Международного банка генов NCBI (США), всего 61 штамм.
Патологический материал. Доставлялся из неблагополучного хозяйства Ставропольского края.
Олигонуклеотидные праймеры. Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus применялись праймеры, сконструированные S.L.
Fontaine (1993).
Для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus применялись праймеры, сконструированные H. Zhou (2000).
Культивирование Ампулы со штаммами бактерий D.nodosus.
вскрывали в условиях бокса или ламинарного бокса и делали посевы на полужидкую тиогликолевую среду (Хаймедиа, Индия, кат. № М009-500), инкубировали при температуре 37°С в течение 3 – 4 суток.
С полужидкой среды колонии D.nodosus пересевали на плотную питательную среду (2,5% кровяной агар на тиогликолевой основе, содержащий 10% дефибринированной крови лошади) в чашки Петри, инкубировали при 37°С в течение 4 – 6 суток в анаэробных условиях.
Амплификация ДНК. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) в конечном объеме мкл, содержащем: 10 пМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 10 мМ трис-HCl (pH 9,0), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон Х-100 и 5 мкл исследуемого препарата ДНК. Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК (длиной н.п.) и фрагмента гена FimA (длиной около 440 н.п.) D.nodosus использовали одинаковые температурно - временные режимы (1-й цикл: 950С - 2 минуты, 560С - 25 секунд;
720С - 1 минута (1);
2-й цикл: 940С – 30 секунд, 560С - секунд, 720С – 50 секунд (35)).
Детекция результатов ПЦР. Осуществлялась методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле в трис - ацетатном буфере (pH 8.5), содержащем бромистый этидий в концентрации 0,4 – 0, мкг/мл. Гели просматривали с помощью трансиллюминатора. Размеры амплифицированных фрагментов оценивали в сравнении с ДНК-маркером GeneRulertm 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas, Литва).
Секвенирование. Амплифицированные фрагменты вырезали из геля и выделяли ДНК с использованием набора «DNA Extraction Kit» (Fermentas, Литва) по методике производителя. Для секвенирования ДНК по двум цепям использовали те же праймеры, что и для проведения ПЦР. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи секвенирования ПЦР - продукта с использованием набора «Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, США) согласно инструкции изготовителя.
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических дендрограмм. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright © 1997-2004, Ibis Biosciences, США) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version 7.1.0. (44) © 1993-2006, DNASTAR, США). Филогенетические Copyright Inc., дендрограммы были построены при помощи программы MegAlign из пакета программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 1993-2006, DNASTAR, США). Сравнительный компьютерный анализ нуклеотидных Inc., последовательностей и праймеров осуществляли с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка метода ПЦР – амплификации фрагментов гена 16S рРНК для идентификации возбудителя копытной гнили овец D.nodosus Ген 16S рРНК бактерий достаточно консервативен, однако имеет видоспецифические фрагменты, в мировом опыте он используется для видовой идентификации (Petti C.A., 2006;
Woo P.C., 2008). В геноме D.nodosus ген 16S рРНК представлен тремя копиями, что позволяет значительно увеличить чувствительность ПЦР (Fontaine S.L., 1993).
Разработку метода ПЦР – амплификации гена 16S рРНК осуществляли на производственном штамме D.nodosus ПП 82/90. Штамм культивировали в полужидкой питательной среде и на плотной питательной среде.
Этап выделения нуклеиновых кислот важен для успешного проведения ПЦР. Универсальным способом экстракции ДНК D.nodosus явился фенольно - хлороформный способ, который позволял получить препарат высокой чистоты и концентрации, пригодный для проведения ПЦР из культур в полужидкой питательной среде, с плотной питательной среды, а также из штаммов в лиофилизированном виде.
Высокая специфичность выбранных олигонуклеотидов для амплификации видоспецифичного для D.nodosus фрагмента гена 16S рРНК была подтверждена теоретически - сравнительным компьютерным анализом, и экспериментально (Рис.1).
12 3 45 6 78 9 10 11 12 13 14 М 1400 н.п.
1000 н.п.
783 н.п.
500 н.п.
Рис.1. Электрофореграмма результатов определения специфичности ПЦР для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus длиной 783 н.п. с использованием праймеров NOD F и NOD R. Треки: 1 – положительный контроль (ДНК D.nodosus производственного штамма ПП 82/90);
2 –ДНК D.nodosus в патматериале;
3 – ДНК здорового копытного рога;
4 - ДНК E.coli;
5 - ДНК S.aureus;
6 - ДНК B.subtilis;
7 ДНК C.perfringens;
8 - ДНК C.septicum;
9 - ДНК P.aeuroginosa;
10 - ДНК А.pyogenes;
11 ДНК S.zooepidermicus;
12 - ДНК F.necrophorum;
13 - ДНК F. nucleatum;
14 – отрицательный контроль (H2О);
М –ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п.). Треки 3-14 – отрицательный результат.
При оптимизации условий проведения ПЦР для получения надежной работы праймеров тестировали следующие параметры: концентрация ионов магния, температура отжига праймеров, временные режимы проведения ПЦР. Было установлено, что разработанные праймеры работают специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией MgCl (1,5 мМ), а положительные результаты амплификации получены в диапазоне температур от 52°С до 57°С.
Определение чувствительности разработанной ПЦР проводилось путем титрования культуры D.nodosus, определения количества бактериальных клеток (геномных копий) в пробе, выделения ДНК из проб фенольно хлороформным методом и использования е в качестве матрицы для проведения ПЦР.
1 2 3 4 5 6 7 М 1400 н.п.
1000 н.п.
783 н.п.
500 н.п.
100 н.п.
Рис.2. Электрофореграмма результатов определения чувствительности ПЦР для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus длиной 783 н.п. с использованием праймеров NOD F и NOD R. Матрица – ДНК D.nodosus штамма ПП 82/90. Треки: 1-6) серийные разведения ДНК D.nodosus;
1) 29106 копий в пробе;
2) 29105 копий в пробе;
3) 29104 копий в пробе;
4) 29103 копий в пробе;
5) 29102 копий в пробе;
6) 2910 копий в пробе;
7) 29 копий в пробе;
М – ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п).
По результатам этого исследования, можно заключить, что чувствительность метода ПЦР с использованием праймеров NOD F и NOD R составляет 290 бактерий в пробе (геномных копий) (Рис. 2).
В ходе исследований разработанной ПЦР был подтвержден вид производственного штамма ПП 82/90, как D.nodosus.
Разработка метода ПЦР – амплификации вариабельного фрагмента гена fimA D.nodosus для типирования штаммов Современные программы по ликвидации копытной гнили овец основаны на применении моноштаммовых вакцин, специфичных серологической группе эпизоотического штамма D.nodosus, что требует е точного определения Стандартным методом (Dhungyel O.P., 2008).
определения серологической группы является РА (реакция агглютинации), которая основана на агглютинации фимбрий бактерии. Однако, кроме выделения культуры возбудителя для проведения этой серологической реакции необходим полный набор специфических сывороток, которых сейчас нет в России. Выходом из этой ситуации является разработка генотипирования, основанного на ПЦР - амплификации гена fimA, кодирующего фимбриальные субъединицы.
Исследования по разработке метода ПЦР – амплификации гена fimA для типирования D.nodosus также проводились на производственном штамме ПП 82/90. Подготовка диагностического материала путем наращивания бактериальной массы и метод выделения ДНК были такими же, как в предыдущем разделе.
Подобранные нами праймеры охватывали все десять известных серогрупп возбудителя и после амплификации предполагали севенирование полученных ампликонов с проведением дальнейшего сравнительного компьютерного анализа полученных нуклеотидных последовательностей с референтными последовательностями гена размещенными в fimA, Международном банке генов (NCBI, США). Для данных праймеров была проверена теоретическая специфичность с помощью сравнительного компьютерного анализа. Было установлено, что праймеры не гибридизуются с неспецифическими нуклеотидными последовательностяхми других микроорганизмов.
При оптимизации условий проведения ПЦР для получения надежной работы праймеров подбирались следующие параметры: концентрация ионов магния, температура отжига праймеров, временные режимы проведения ПЦР. Было установлено, что праймеры работают специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией MgCl2 (1,5 мМ).
Оптимальной для отжига этих праймеров явилась температура в 56 - 62°С.
1 2 3 4 5 6М 1400 н.п.
1000 н.п.
440 н.п. 500 н.п.
100 н.п.
Рис.3. Электрофореграмма результатов определения чувствительности ПЦР с праймерами FimA-DH-F и FimA-DH-R для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus длиной 440 н.п. на матрице ДНК D.nodosus штамма ПП 82/90. Треки: 1-6) серийные разведения ДНК D.nodosus;
1) 29106 копий в пробе;
2) 29105 копий в пробе;
3) 29104 копий в пробе;
4) 29103 копий в пробе;
5) 29102 копий в пробе;
6) 2910 копий в пробе;
М – ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п).
По результатам оценки чувствительности ПЦР для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus было установлено, что чувствительность метода составляет 2900 геномных копии бактерии в пробе (Рис.3).
В ходе проведения разработки ПЦР для генотипирования производственного штамма D.nodosus ПП 82/90 была определена его серогруппа - Н, и серовариант - Н1.
Реактивирование, изучение жизнеспособности, сохранности морфологических, тинкториальных и культуральных свойств, а также молекулярно – генетическое исследование 27 штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко Единственная в России коллекция содержит 27 штаммов D.nodosus, которые были лиофилизированы в 1988 - 91 гг. Серотипирование этих штаммов в РА было проведено однократно, с помощью сывороток фирмы Coopers Animal Health N.Z. ltd. (Сидорчук А.А., Семенова И.Н., 1987).
Реактивацию штаммов мы начинали с наиболее поздней сушки, а в случае неудачи проводили посевы более ранних сушек. Следует отметить, что проведение реактивации настолько старых лиофилизированных культур D.nodosus проводилось впервые, данных по жизнеспособности таких штаммов не было ни в отечественной, ни в зарубежной литературе.
Первичные посевы проводили на полужидкую тиогликолевую среду.
Эти культуры росли в виде комочков ваты, часто с точечными вкраплениями различной величины и количества в разных частях пробирки, накопление культуры было слабое. При микроскопии таких культур в основном наблюдалось сохранение морфологических и тинкториальных свойств возбудителя, но часть клеток вс же были деформированными, плохо прокрашенными, изъеденными, овальными. Повторный пассаж таких культур значительно усиливали рост возбудителя, а также улучшал морфологические и тинкториальные свойства. Интересно, что на начальных этапах реактивации нами не наблюдался характерный для D.nodosus рост в виде ярко выраженных штрихов или «комет». При подтверждении хорошего роста и наличии характерного возбудителя, культуры пересевали на плотную питательную среду для определения культуральных свойств возбудителя на ней, а также наращивания биомассы возбудителя для дальнейшего проведения молекулярно-генетических исследований. Оценка роста проводилась визуально и микроскопией мазков. Рост культур чаще всего был в виде беловатых росинчатых колоний гладкого типа, довольно слабый, некоторые штаммы не удалось вырастить именно на этом этапе. Были штаммы, дававшие шероховатый тип колоний (Р-86, Войтик, Каз-9). После микроскопии характерных колоний и подтверждения наличия грамотрицательных палочек с утолщениями на концах, колонии использовались для молекулярно – генетического исследования. Если штамм давал хороший рост на плотной среде, выделение ДНК D.nodosus осуществлялось с помощью триреагента (Molecular Reasearch Center, Ins.Cincinnati, США) по методике производителя. При отсутствии роста на плотной среде и наличии роста на полужидкой среде, ДНК получали прямым внесением 5 мкл этой среды в ПЦР–смесь, а в случае неудачи осуществляли выделение фенольно-хлороформным способом.
Идентификацию вида возбудителя проводили с помощью пары праймеров NOD F и NOD R для амплификации участка гена 16S рРНК. Все жизнеспособные штаммы в этом исследовании были идентифицированы как D.nodosus с использованием разработанной ПЦР (таблица 1).
После ПЦР - амплификации вариабельного фрагмента гена fimA, секвенирования полученных ДНК фрагментов и сравнения их нуклеотидных последовательностей с референтными последовательностями Международного банка генов (NCBI, США) удалось получить нуклеотидных последовательностей вариабельных участков гена fimA и осуществить типирование штаммов D.nodosus.
Таблица 1.
Результаты амплификации методом ПЦР фрагментов генов 16S рРНК и fimA у штаммов D.nodosus № Название Идентифика Серогруппа Генотипирование по FimA п/п штамма ция по 16S в РА (группоспецифичное) рРНК (видовая) Л - 83 В1 В 1 + В 2 CN -6884 H + В 3 CN -6858 H + Знамя труда 4 - B + Войтик не определена В 5 + Каз - 9 В4 Е 6 + А - 86 не определена В 7 + Э- 8 G E + Б - 82 В 9 H + Львов не определена 10 H + Р - 86 не определена В 11 + Б-7 В4,H 12 H + КЯ - 82 В4 В 13 + Т - 80 В 14 H + Яг не определена В 15 + К-8 В 16 H + КЧ- 17 H H + Примечание: «+» - положительный результат.
По результатам молекулярно-генетической экспертизы удалось идентифицировать как D.nodosus все 17 штаммов (100%), взятых в анализ, генотипировать – также 17 штаммов (100%), в том числе те, которые не были серотипированы ранее в РА. Было установлено, что 8 штаммов принадлежат к генотипу Н (47%), 7 – к генотипу В (41,2%) и 2 штамма к генотипу Е (11,8%). При этом только один штамм полностью совпадает по серогруппе и сероварианту с генотипом (Л-83). У 3-х штаммов (Б-7, КЯ-82, КЧ-82) наблюдалось частичное совпадение, только по серогруппе. У 6-ти штаммов типирование в РА не проводилось и наши данные были получены впервые. У 7-ми штаммов не совпадают ни серогруппа, ни соответственно, серовариант с установленным генотипом (таблица 1).
Анализ результатов серологического и генетического типирования имеющихся у нас штаммов не показал высокой корреляции. О причинах расхождения этих методов можно дискутировать. Генотипирование предполагает более детальную характеристику амплифицированных участков генома и их оценку с помощью большего количества различных методик, по сравнению с серологическим методом, используемым для характеристики данных штаммов.
Разработка способов подготовки проб патологического материала для выявления ДНК D.nodosus методом ПЦР В случае копытной гнили овец поражения локализуются исключительно на копытцах животного. Из нескольких вариантов пробоподготовки патологического материала после проведения ПЦР с видоспецифичными праймерами NOD F и NOD R наилучшие результаты были получены из проб пораженных копытец вынужденно убитых больных овец. Для взятия патологического материала после вынужденного убоя больной копытной гнилью овцы отрезали копытце животного, помещали в стерильный полиэтиленовый пакет и ставили в лед. В таком виде материал доставляли в лабораторию в течение 24 часов. Если время доставки было 1- суток, копытце замораживали и везли во льду. В асептических условиях в стерильной ступке, отдельной для каждой пробы, пораженные ткани растирали в 0,9% растворе NaCl до получения непрозрачной суспензии. В работу брали жидкую часть этой суспензии, крупные частицы оставляли в ступке. В полученные таким образом пробы добавляли лизоцим в количестве 4 мг/мл и инкубировали при 4°С 2 часа для лизиса.
Выделение ДНК из всех проб проводили фенольно-хлороформным способом. Классическим методом постановки диагноза служило подтверждение клинического заболевания результатами микроскопии с нахождением феномена «Бевериджа». Положительный результат ПЦР подтверждали секвенированием ПЦР - фрагмента и сравнительным компьютерным анализом его нуклеотидной последовательности.
Таким образом, у 10-ти образцов патологического материала взятых и обработанных нашим способом после проведения ПЦР с видоспецифичными праймерами NOD F и NOD R был идентифицирован вид возбудителя D.nodosus, что во всех случаях коррелировало с классическим методом постановки диагноза и было подтверждено секвенированием полученных ПЦР – фрагментов.
Проведение филогенетического анализа штаммов Dichelobacter nodosus по гену fimA Для изучения эволюционной истории, установления родственных связей нами были исследованы фрагменты гена fimA 15-ти штаммов D.nodosus. Было установлено, что предложенный нами участок ДНК в виде вариабельного фрагмента гена fimA D.nodosus, отграниченного в начале прямыми праймерами, а в конце стоп – кодоном, позволяет точно распределять генотипы возбудителя в пределах образующихся кластеров.
Для соблюдения точной кластерной топологии дендрограммы, а также определения эволюционных связей с изолятами из других стран, в анализ были добавлены еще 23 референтные нуклеотидные последовательности гена fimA всех 10 серогрупп возбудителя из базы данных Международного банка генов (NCBI, США). Все добавленные последовательности были выровнены соответственно выбранному нами анализируемому фрагменту.
Обнаруживается значительная эволюционная дистанция между кластерами под номерами 1-8 и кластерами 9,10, что совпадает с подразделением всех серогрупп D.nodosus на два больших класса - I и II (Рис.
4).
нуклеотидные замены (х100) Рис.4. Дендрограмма, на основе анализа нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена FimA (длиной около 400 н.п.), показывающая степень филогенетического родства 15-ти депонированных в РФ штаммов (обозначены названия и серовариант) и 23-х референтных штаммов D.nodosus из Международного банка генов (NCBI, США) (обозначены номера доступа в базе данных). Цифры в узлах дендрограммы обозначают кластеры (серогруппу и генотип): 1) B;
2) A;
3) I;
4) E;
5) F;
6) M;
7) C;
8) G;
9) H;
10) D.
Наименьшие эволюционные дистанции наблюдаются внутри кластеров, между штаммами одной серогруппы, и тем более сероварианта. К генетически гетерогенным группам можно отнести кластеры B, H и в некоторой степени – Е. Литературные данные и результаты наших исследований подтверждают преобладание возбудителей данных серогрупп в мире, все они выделены из эпизоотических очагов болезни. Есть на дендрограмме и кластеры скорее энзоотических штаммов, чем вызывающих активные эпизоотические очаги. Так, кластеры A, I, D, G, C являются генетически устойчивыми и менее эпизоотически значимыми.
ВЫВОДЫ 1. Разработана методика ПЦР на основе амплификации фрагмента гена 16S рРНК, которая позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью проводить видовую диагностику культуры возбудителя копытной гнили овец - Dichelobacter nodosus.
2. Разработана методика на основе ПЦР – амплификации, последующего секвенирования и сравнительного компьютерного анализа вариабельного фрагмента гена fimA, для типирования штаммов на 10 групп и 19 вариантов Dichelobacter nodosus без использования серологических методов.
3. Показана возможность реактивации штаммов Dichelobacter nodosus после хранения в лиофилизированном виде с сохранением 20-летнего культурально - морфологических свойств и определения их вида и генотипа с помощью молекулярно – генетических методов.
4. Разработан способ подготовки проб патологического материала, для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.
5. Проведен филогенетический анализ на основе нового предложенного фрагмента гена fimA Dichelobacter nodosus, который показал корреляцию между серогруппами и генотипами возбудителя.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ На основании проведенных исследований разработана для практического использования методика ПЦР, позволяющая с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять видовую идентификацию возбудителя - D.nodosus без проведения культуральных исследований.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ Для использования способа в научно - исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению D.nodosus и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР», утвержденные Научно методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Алексеева С.В. Выбор вектора для синтеза рекомбинантного белка пилина Dichelobacter nodosus / Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии:
Сборник научных трудов молодых ученых. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ.
- 2009. – Вып. 5. - С. 115 – 119.
2. Сидорчук А.А., Забережный А.Д., Алексеева С.В. Молекулярная эпизоотология: возможности и перспективы / Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Сб. науч. тр. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ. 2009. - С. 223 - 229.
3. Молекулярное типирование и филогенетический анализ возбудителя копытной гнили овец / Панасюк С.Д., Алексеева С.В., Сидорчук А.А. и др.
/ Современные методы диагностики, профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных: сборник научных статей по материалам Международной научно-практической конференции. – Ставрополь:
- 2009.
- С. 8 - 13.
4. Структурные и функциональные особенности пилей Dichelobacter nodosus. Синтез белка пилина D.nodosus в различных рекомбинантных штаммах бактерий / Забережный А.Д., Грабовецкий В.В., Панасюк С.Д., Алексеева С.В. / Молекулярная генетика, вирусология и микробиология. 2009. - № 4. - С. 3 - 6.
5. Изучение жизнеспособности лиофилизированных штаммов Dichelobacter nodosus / Соколов М.Н., Соколова Н.А., Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Алексеева С.В. / Труды ВИЭВ. – 2010. - Т.76. - С. 109 - 111.
6. Ассоциированные вакцины «Нековак» и «Овикон» в системе мероприятий по профилактике и борьбе с инфекционными болезнями конечностей крупного и мелкого рогатого скота / Панасюк, С.Д., Сидорчук А.А., Алексеева С.В. и др. / Ветеринария. - 2010. - № 8. - С. 7 - 10.
7. Типирование Dichelobacter nodosus по гену fimA / Алексеева С.В., Панасюк С.Д., Забережный А.Д. и др. / Ветеринария. - 2011. - № 5. – С. - 29.