Экспрессные иммунохимические методы определения загрязнителей в продуктах питания
На правах рукописи
Нестеренко Ирина Сергеевна ЭКСПРЕССНЫЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ 03.00.23 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА – 2009
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный консультант:
профессор, доктор химических наук Еремин Сергей Александрович
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович профессор, доктор биологических наук Свешников Петр Георгиевич
Ведущая организация:
Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится "_" 2009 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан "_" 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И.К. Сакодынская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Жизнедеятельность человека неуклонно ведет к загрязнению среды его обитания, из которой мы получаем продукты питания. Отсюда понятна необходимость контролировать качество продуктов питания на предмет содержания различных загрязнителей. Известно, что безопасность пищевых продуктов по содержанию химических веществ и загрязнителей, ветеринарных препаратов и лекарственных средств, а также в микробиологическом и радиационном отношении определяется их соответствием гигиеническим нормативам, установленным государственным техническим регламентом, и контролируется государственными структурами на всех уровнях 1. Особое внимание уделяется контролю за содержанием все чаще применяемых в настоящее время различных антибактериальных средств, в частности, сульфаниламидных препаратов, которые широко используются в ветеринарии, и продуктов жизнедеятельности микроскопических грибов микотоксинов.
Перспективным направлением для детекции этих соединений в природных, пищевых и фармакологических объектах является разработка аналитических тест-систем, основанных на принципах биологического узнавания. Использование специфических взаимодействий антиген-антитело позволяет проводить идентификацию и количественное определение широкого круга аналитов-мишеней. Для сульфаниламидных препаратов и микотоксинов разработка иммунохимических методов ограничивается недоступностью специфических антител. В связи с этим, получение иммунореагентов для анализа новых объектов и разработка на их основе эффективных иммунохимических методик является актуальной задачей.
В соответствии с современными концепциями развития биоаналитической химии, миниатюризация и интеграция компонентов в формате тест-полосок и рассмотрение других вариантов неинструментальных иммунохимических методов позволяет повысить эффективность тест-систем при сокращении времени анализа, расхода реагентов и дает возможность проведения определения вне лаборатории. В литературе имеются сведения о вариантах иммунохроматографических методов специфического определения некоторых сульфаниламидных препаратов, однако групп-специфический подход для их иммунохимического определения практически не разработан.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась разработка экпрессных иммунохимических методик определения сульфаниламидных препаратов и микотоксинов и их применение для анализа продуктов питания. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
• осуществить синтез иммунохимических реагентов – конъюгатов аналитов с белками и меченных флуоресцеином производных;
• изучить влияние структуры иммунореагентов на основные характеристики методик;
• изучить подходы к индивидуальному и групп-специфическому определению сульфаниламидов методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА);
СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.
2002.
• подобрать условия определения сульфаниламидов и микотоксинов методами иммунохроматографиии;
• определить аналитические характеристики разработанных методик;
• разработать экспрессные методики пробоподготовки продуктов питания для определения в них сульфаниламидов и микотоксинов методами ПФИА и иммунохроматографии.
Научная новизна. Впервые разработана методика групп-специфического определения семи сульфаниламиднов в одной пробе. В результате оптимизации структур иммунореагентов впервые найдены условия и получены методики специфического определения сульфатиазола, сульфахиноксалина, сульфадиметоксина, сульфахлорпиридазина, сульфаметоксипиридазина и сульфапиридина методом ПФИА.
Впервые предложена методика групп-специфического определения сульфаниламидов с использованием тест-полосок на основе поликлональных антител. Оптимизирована процедура определения охратоксина А в специях методом тандемных колонок.
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований получены иммунореагенты и созданы экспрессные тест-системы для определения сульфаниламидных препаратов и микотоксинов на основе ПФИА и иммунохроматографических методов. Показано, что данные методики могут быть использованы для количественного определения данных соединений в меде, молоке, специях и других продуктах питания.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных конференциях: VII International Conference on Agri-Food Antibodies (Uppsala, Sweden, 2003);
VIII International conference on Agri-Food Antibodies (Chester, England, 2005);
Международная школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, Россия, 2006);
Международный конгресс по аналитической химии (Москва, Россия, 2006);
IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), Международная научно-практическая конференция "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (Москва, Россия, 2008), XV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2008", V Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2009) Публикации. По материалам исследований опубликовано 17 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ( главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 188 ссылок.
Работа изложена на страницах, содержит 63 рисунка и 30 таблиц.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Определение индивидуальных сульфаниламидов (СА) методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа В данной главе описана разработка экспрессного специфического определения СА методом ПФИА. Структурные формулы основных сульфаниламидов приведены на рис. 1.
O O NH S NH2 S NH H2N H2N NH O O сульфагуанидин сульфаниламид CH O O N N S NH H2N S NH H2N N N O O CH сульфадиазин сульфаметазин CH O N O N S NH H2N S NH H2N O N O сульфапиридин сульфамеразин O O N CH S S H2N NH S H2N NH N O N O N сульфаметизол сульфахиноксалин O O CH S S H2N NH S H2N NH O N N O O сульфатиазол сульфаметоксазол O O N N N N S S OCH H2N NH H2N NH Cl O O сульфахлорпиридазин сульфаметоксипиридазин OCH CH O O N CH N S NH H2N S H2N NH O N O O OCH сульфисоксазол сульфадиметоксин Рис. 1. Структурные формулы основных сульфаниламидов Начальным этапом разработки методики определения СА методом ПФИА помимо получения специфических антител, являлся синтез конъюгатов с флуоресцентной меткой (трейсеров), способных образовывать достаточно устойчивый комплекс с антителами.
Структура этих соединений, как правило, оказывает большое влияние на характеристики методик определения. В данной работе были синтезированы трейсеры, которые представляли собой конъюгаты сульфаметазина (СМЗ) с этилендиаминтиокарбомилфлуоресцеином (ЭДФ) и сульфатиазола (СТЗ), сульфапиридина (СП), сульфадиметоксина (СДМ), сульфахлорпиридазина (СХП), сульфаметоксипиридазина (СМП) и сульфахиноксалина (СХ) с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ). Общая структура трейсеров представлена на рис. 2.
O HO OH Рис. 2. Общая структурная формула трейсеров СА-ФИТЦ, где R-СТЗ, O СМП, СХП, СП, СХ и СДМ O S NH S R NH O NH O Для разработки специфических методик ПФИА заданных веществ было проведено тестирование реакционной способности синтезированных нами трейсеров. Титры антител при использовании гомологичных комбинаций реагентов составили 1:900, 1:3100, 1:3600, 100, 1:64000 для СТЗ, СП, СХ, СДМ и СМТЗ соответственно.
С целью изучения конкурентного связывания анализируемых антигенов были получены градуировочные кривые перечисленных выше соединений (рис. 3), из которых определены аналитические характеристики методик (табл. 1).
СТЗ 160 СМТЗ СХ СДМ СП mP 1E-41E-30,01 1 10 100 1000 [СА], нг/мл Рис. 3. Градуировочные графики для определения СТЗ, СМТЗ, СХ, СДМ, СП.
[СА]- концентрация сульфаниламидов.
Данные таблицы 1 показывают, что с помощью разработанных методик ПФИА, используя специфические к каждому из соединений антитела, можно определять СХ, СТЗ, СДМ и СП с пределами обнаружения более чем в 10 раз ниже ПДК. Самые низкие пределы обнаружения были достигнуты для СДМ и СТЗ при использовании гомологичных комбинаций иммунореагентов.
Таблица 1. Аналитические характеристики методики ПФИА сульфаниламидов Линейный Предел диапазон Определяемый обнаружения, IC50, нг/мл определяемых ПДК, нг/мл сульфаниламид нг/мл Р=0,95 n= концентраций, Р=0,95 n= нг/мл сульфаметазин 8,0±0,4 20-900 141±7 сульфахиноксалин 5,0±0,3 15-400 112±2 сульфатиазол 3,0±0,2 10-350 59±3 сульфапиридин 7,0±0,4 15-181 59±5 сульфадиметоксин 1,0±0,1 5-100 11±3 При анализе реальных объектов важно знать специфичность антител, т.к. в образцах может присутствовать сразу несколько СА. Для ее оценки были использованы сульфаниламидов и рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования (табл. 2). Из данных таблицы 2 видно, что все применяемые нами антитела обладали высокой специфичностью к детектируемому СА. Коэффициенты перекрестного реагирования не превышали 7 %. Согласно полученным данным, разработанные методики можно применять для контроля каждого из рассматриваемых веществ в смеси с их аналогами.
Таблица 2. Коэффициенты перекрестного реагирования для анти-СДМ, анти-СМТЗ, анти-СТЗ, анти-СП и анти-СХ Коэффициенты перекрестного реагирования, % Название антитела к антитела к антитела к антитела к антитела к соединения СДМ СМТЗ СТЗ СП СХ СМТЗ 1,2 0,5 1,5 0, СДЗ 0,5 5,0 0,2 0,6 0, СМР 0,1 7,0 0,1 1,5 0, СТЗ 0,1 0,1 7,0 0, СМК 0,1 0,1 1,6 0,1 0, СХ 0,2 1,3 0,1 0,2 СДМ 0,9 0,1 0,1 0, СП 0,1 3,7 2,9 0, САМ 0,1 0,1 0,1 0,1 0, СХП 0,1 0,1 0,7 0,2 0, СМП 0,1 0,2 0,1 0,2 0, Для разработки методик определения сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазина использованы поликлональные и моноклональные антитела, синтезированы трейсеры СМП-ФИТЦ и СХП-ФИТЦ (рис. 2). СХП и СМП имеют схожую структуру (рис. 1), поэтому представляляло интерес рассмотреть возможность применения для их определения как гомологичных, так и гетерологичных комбинаций иммунореагентов.
Поликлональные антитела к СХП и СМП были протестированы на предмет связывания как с гомологичными, так и гетерологичными трейсерами. В случае трейсера СМП-ФИТЦ наблюдалось более низкое значение титра, чем для СХП-ФИТЦ, как для гомологичной антисыворотки, так и антисыворотки, полученной к сульфахлорпиридазину. Возможно это связано с более низкой степенью очистки СМП, меченного флуоресцеинизотиоционатом.
В случае всех комбинаций трейсеров и антител были получены градуировочные кривые для расчета содержания СМП и СХП в образцах и определены аналитические характеристики (табл. 4).
(а) (б) СХП-ФИТЦ СХП-ФИТЦ СМП-ФИТЦ СМП-ФИТЦ mP mP 1E-3 0,01 1 10 100 1000 1E-3 0,01 1 10 100 1000 [СМП], нг/мл [СХП], нг/мл Рис. 4. Градуировочные кривые зависимости поляризации флуоресценции от концентрации СХП-(а) и СМП-(б) с использованием поликлональных антител Таблица 4. Аналитические характеристики методик определения сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазина СХП СМП ПрО*, IC50, Диапазон ПрО, IC50, Диапазон Трейсер Антитела нг/мл нг/мл определяемых нг/мл нг/мл определяемых P=0,95 P= 0,95 концентраций, P=0,95 P= 0,95 концентраций, n=20 n=3 нг/мл n=20 n=3 нг/мл СХП- Анти 3,0±0,2 93±5 13-650 15,0±0,8 465±10 40- ФИТЦ СХП СМП- Анти 1,0±0,1 10±1 3-42 7,0±0,4 50±3 20- ФИТЦ СХП СХП- Анти 5,0±0,3 61±3 15-250 1,0±0,1 15±1 3- ФИТЦ СМП СМП- Анти 5,0±0,2 113±6 15-60 1,0±0,1 28±1 6- ФИТЦ СМП *ПрО-предел обнаружения Из полученных данных (рис. 4, табл. 4) видно, что для определения этих соединений можно использовать как гетерологичные, так и гомологичные комбинации иммунореагентов.
Более удобным в использовании оказался трейсер СХП-ФИТЦ, т.к. при его связывании с антителами наблюдалась большая дискриминация между максимальным и минимальным значениями поляризации флуоресценции, что повышало чувствительность определения.
В таблице 5 приведены коэффициенты перекрестного реагирования при использовании гомологичных комбинаций реагентов, из значений которых видно, что методики определения СХП и СМП в данном случае характеризуются высокой специфичностью.
Коэффициенты перекрестного реагирования с остальными СА не превышают 10 %. Лишь в случае пары СХП - СМП коэффициенты составляют 25 и 20 %, что можно объяснить значительным стуктурным соответствием данных соединений (рис. 1).
Таблица 5. Коэффициенты перекрестного реагирования СR (%) Краткое Коэффициент перекрестного реагирования, % Сульфаниламид название антитела к СХП антитела к СМП сульфахлорпиридазин СХП сульфаметоксипиридазин СМП 25 сульфаниламид САМ 0,1 0, сульфатиазол СТЗ 2 сульфаметоксазол СМК 6 0, сульфахиноксалин СХ 0,1 0, сульфадиметоксин СДМ 0,1 сульфапиридин СП 0,1 сульфамеразин СМР 1 0, сульфаметазин СМТЗ 1 0, сульфадиазин СДЗ 0,1 0, В ходе разработки методик определения СХП и СМП были протестированы моноклональные антитела, полученные к СМП.
Для сравнения поликлональных и моноклональных антител использовали гомологичный трейсер СМП-ФИТЦ и гетерологичный СХП-ФИТЦ. Из градуировочных зависимостей (рис. 5) были получены аналитические характеристики данных методик (табл.
6). Нами также были расчитаны коэффициенты перекрестного реагирования и установлено, что изучаемые антитела специфичны к СХП и СМП.
Таблица 6. Титры антител и количественные характеристики методик ПФИА для определения СХП и СМП с использованием моноклональных антител ПрО*, нг/мл IC50, нг/мл Трейсер Титр Диапазон определяемых P=0,95;
n=20 P=0,95;
n= антител концентраций, нг/мл СХП СМП СХП СМП СХП СМП СМП-ФИТЦ 1:1700 0,30±0,02 0,70±0,04 39±3 11±1 2-430 2- СХП-ФИТЦ 1:5800 0,25±0,01 0,70±0,04 29±2 12±1 4-220 2- *ПрО-предел обнаружения (б) (а) СМП СМП СХП СХП 120 mP mP 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 1000 [СМП] и [СХП], нг/мл [СМП] и [СХП], нг/мл Рис. 5. Градуировочные графики зависимости поляризации флуоресценции от концентрации СМП и СХП, полученные при использовании трейсеров: СМП-ФИТЦ (а) и СХП-ФИТЦ-(б) 2. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методом ПФИА Сульфаниламиды часто присутствуют в различных объектах анализа не индивидуально, а сразу в группе из нескольких соединений. Поэтому представляло интерес предпринять попытку разработки групп-специфического определения сульфаниламидов. Они имеют в своей структуре общую часть, что учитывалось при выборе гаптена. В соответствии с этим было использовано несколько путей формирования его структуры (рис. 6). Первый заключался в модификации радикала при N1 и сохранении общей части, характерной для всех сульфаниламидов. Второй состоял в изменении обеих аминогрупп путем ввода в состав соединения более иммуногенных групп и определении в дальнейшем производных сульфаниламидов, модифицированных аналогичной группой. В работе были использованы антитела против следующих соединений: 4-(4-аминобензолсульфаниламино)-бензойной кислоты (САБ1), 4-(4-аминобензолсульфаниламино)-гексановой кислоты (САГ), 4-(4 аминобензолсульфаниламино)-бутановой кислоты, конъюгированной с 5,7 динитробензофуразаном (БФЗ-САБ). Схемы структур этих соединений приведены на рис. 6.
Следующий подход, использовавшийся нами для разработки групп-специфического определения сульфаниламидов заключался в том, что к белку-носителю присоединялось сразу несколько сульфаниламидов. Иммуноген на основе семи соединений, присоединеннных к бычьему сывороточному альбумину, в рамках совместных исследований был получен проф. Р. Абукнешей (Королевский университет, Лондон, Великобритания). В качестве соединительного элемента был использован ангидрид тримелитовой кислоты.
Для реализации первого подхода, нами синтезированы трейсеры на основе приведенных выше гаптенов. В дальнейшем с целью разработки методики групп специфического ПФИА было исследовано связывание антител анти-САГ и анти-САБ1 с трейсерами САБ-ЭДФ и САГ-ЭДФ и антисывороток анти-БФЗ-САБ с трейсером БФЗ-САБ ЭДФ.
O R'' NH R' S NH 4 O O O H2N S NH OH O 4-(4-аминобензолсульфаниламино)-гексановой кислота (САГ) O O H2N S NH OH O 4-(4-аминобензолсульфаниламино)-бензойной кислота (САБ1) NO O O O 2N NH S NH OH O HN NH O 4-(4-аминобензолсульфаниламино)-бутановой кислота, меченная 5,7- динитробензофуразаном (БФЗ-САБ) Рис. 6. Структурные формулы гаптенов Все антитела анти-САГ, анти-САБ1 показывают высокое значение титра при связывании с исследуемыми трейсерами (1:2300-1:4700). При использовании антител анти САГ-ОВА наблюдались более высокие значения титров (1:4100-1:4700) при взаимодействии как с гетерологичным трейсером (САБ-ЭДФ), так и с гомологичным (САГ-ЭДФ).
В работе нами также была изучена специфичность полученных антител, рассчитаны концентрации САБ при 50 % ингибировании нулевого сигнала (IC50) и коэффициенты перекрестного реагирования, которые приведены в таблице 7. Как видно из полученных данных, некоторые системы, такие как анти-САБ1-ОВА/САБ-ЭДФ и анти-САГ-БСА/САБ ЭДФ, являются строго специфичными по отношению к одному СА, а с помощью остальных пар реагентов можно осуществлять групп-специфический анализ лишь 3- сульфаниламидов. Пределы обнаружения при этом находятся в диапазоне от 12 до 150 нг/мл.
При тестировании антисывороток, полученных против БФЗ-САБ установлено, что наиболее высокое значение титров наблюдается для следующих пар иммунореагентов:
трейсера БФЗ-САБ и антител- анти-БФЗ-САБ-СИТ (№6) (1:1500) и анти-БФЗ-САБ-БСА (№1) (1:1600).
Таблица 7. Коэффициенты перекрестного реагирования групп-специфического определения сульфаниламидных препаратов анти-САГ-ОВА анти-САГ-БСА антиСАБ1-ТГ анти-САБ1-ОВА IC50, CR, IC50, CR, IC50, CR, IC50, CR, Сульфаниламид мкг/мл % мкг/мл % мкг/мл % мкг/мл % P=0,95 P=0,95 P=0,95 P=0, n=3 n=3 n=3 n= Трейсер САБ-ЭДФ САБ 0,9±0,1 100 0,6±0,1 100 0,9±0,1 100 0,6±0,1 САМ 6,7±0,3 14 8,0±0,4 8 6,6±0,3 14 12,9±0,8 СМТЗ 18,9±0,9 5 6,2±0,3 10 92,4±4,6 1 - 0, СДЗ 23,6±1,1 4 5,1±0,3 12 92,5±4,6 1 - 0, СМР 1,6±0,1 6 4,7±0,2 13 - 0,1 - 0, СМП 0,9±0,2 110 3,1±0,1 20 18,5±0,9 5 9,2±0,4 СХП 0,8±0,1 119 3,4±0,2 18 46,2±2,3 2 11,9±0,6 СП 2,2±0,1 43 0,9±0,1 62 0,7±0,1 133 5,4±0,2 СХ 7,9±0,4 12 4,4±0,1 14 4,6±0,2 20 6,4±0,3 СТЗ 47,1±2,4 2 12,3±0,6 5 13,2±0,7 7 9,6±0,5 СДМ 4,5±0,2 21 30,8±1,5 2 2,9±0,1 31 9,2±0,5 СМК 31,4±1,6 3 8,9±0,4 7 10,3±0,5 9 4,3±0,1 Трейсер САГ-ЭДФ САБ 1,2±0,1 100 0,5±0,1 100 1,1±0,1 100 0,6±0,1 САМ 3,6±0,2 33 6,8±0,4 7 6,6±0,3 16 - 0, СМТЗ - 0,1 7,5±0,4 6 21,2±1,1 5 - 0, СДЗ - 0,1 16,2±0,8 3 106,1±5,3 1 - 0, СМР - 0,1 - 0,1 - 0,1 - 0, СМП 1,4±0,1 85 9,7±0,5 5 4,2±0,2 15 13,2±0,7 СХП 1,3±0,1 90 7,0±0,3 7 4,9±0,3 21 13,4±0,8 СП 1,6±0,1 73 4,9±0,3 10 0,9±0,1 120 3,8±0,2 СХ 11,9±0,5 10 4,4±0,2 11 6,2±0,2 17 10,1±0,5 СТЗ 5,9±0,3 20 24,4±1,1 2 15,1±0,8 7 9,5±0,5 СДМ 7,9±0,4 15 6,9±0,5 7 2,7±0,1 40 7,2±0,4 СМК 4,8±0,2 25 - 0,1 14,1±0,7 8 4,9±0,3 Исследование перекрестного реагирования в этой системе проводилось с помощью синтезированых бензофуразановых производных САМ (белого стрептоцида), СМТЗ и СХП.
Выбор данных препаратов обусловлен тем, что они, во-первых, являются наиболее применяемыми в настоящее время, и, во-вторых, их структуры гомологичны структурам некоторых других сульфаниламидов (рис. 1). Например, СМТЗ, СДЗ и СМР отличаются всего лишь на одну СН2-группу, т.е. являются гомологами. Рассчитанные значения IC50 и коэффициентов перекрестного реагирования приведены в табл. 8.
Таблица 8. Значение коэффициентов перекрестного реагирования (CR) для бензофуразановых производных СА и БФЗ Антисыворотка №1 Антисыворотка № Название соединения IC50, нг/мл CR, % IC50, нг/мл CR, % P=0,95 n=3 P=0,95 n= БФЗ-САБ 3000±150 100,0 2500±125 100, БФЗ-САМ 16000±800 18,7 25700±1200 9, БФЗ-СХП 126000±6300 2,4 64000±3000 4, БФЗ-СМЗ 62500±3100 4,8 - 0, БФЗ - 0,1 - 0, Максимальное значение коэффициента перекрестного реагирования наблюдается для БФЗ-САМ. Видимо, это обусловлено тем, что данное соединение наиболее близко по структуре к используемому гаптену. При этом следует отметить, что чувствительность приведенной системы групп-специфического определения является недостаточной. Поэтому была предпринята попытка альтернативного подхода к групп-специфическому определению СА, который заключался в использовании для получения антител иммуногена, состоящего из бычьего сывороточного альбумина и семи фталевых производных СА, ковалентно присоединенных к нему 2. На основе полученных соединений были синтезированы флуоресцентные трейсеры с ЭДФ.
Реакционная способность этих трейсеров определялась путем титрования ими антител.
На основании полученных данных строили кривые титрования, которые приведены на рис. 7.
Каждое взаимодействие было охарактеризовано титрами антител, значения которых находились в диапазоне от 1:2000 до 1:38000.
Результаты эксперимента показали, что все полученные трейсеры связывались с антителами (рис. 7). Самый высокий титр наблюдался при взаимодействии с трейсером СТЗ Ф-2-ЭДФ, в основу которого входила молекула СТЗ, что свидетельствовало о том, что полученные антитела наиболее специфичны к этому сульфаниламиду. Это, вероятно, может быть связано со структурными особенностями иммуногена.
Фталевые производные: СДМ-Ф - сульфадиметоксина;
СТЗ-Ф- сульфатиазола;
СДЗ-Ф- сульфадиазина;
СМТЗ Ф- сульфаметазина;
СМК-Ф- сульфаметоксазола;
СМТ-Ф- сульфаметизола;
СМП-Ф сульфаметоксипиридазина.
СМК-Ф-ЭДФ СТЗ-Ф-ЭДФ СМТЗ-Ф-ЭДФ СДЗ-Ф-ЭДФ СМТ-Ф-ЭДФ СМП-Ф-ЭДФ СДМ-Ф-ЭДФ неиммунная сыворотка mP 1000 10000 разведение антисыворотки Рис. 7. Кривые титрования антител трейсерами на основе фталевых производных сульфаниламидов Проведенные исследования также выявили, что при использовании для анализа трейсеров, полученных на основе фталевых производных СА в течение 2 месяцев происходит значительное снижение максимальной величины поляризации флуоресценции со 180 до 87. Следует заметить, что такая тенденция к потере величины поляризации флуоресценции с течением времени была обнаружена у всех семи трейсеров. Можно предположить, что это связано со взаимодействием мето-карбоксильной группы фталевой ножки с флуоресцентной меткой. Этот факт подтверждается также присутствием незначительного количества осадка в метанольных растворах изучаемых трейсеров. По этой причине в дальнейшем нами были получены и использованы трейсеры на основе глутаровых производных СА (рис. 8).
O HO OH O O O S O NH O R NH S NH NH NH O Рис. 8. Общая структура трейсеров, полученных на основе глутаровых производных сульфаниламидов Трейсеры на основе глутаровых производных СА были синтезированы для всех исследуемых соединений и протестированы в аналигичных условиях методом ПФИА.
Наиболее подходящими из них оказались трейсеры, полученные на основе СМТЗ и СХП (титры составили 1/10000 для трейсера СМТЗ-ЭДФ и 1/11200 для СХП-ЭДФ). Выбранные на основе проведенных экспериментов комбинации иммунореагентов впоследствии использовались для получения серии градуировочных зависимостей с искомыми семью сульфаниламидами (СДМ, СТЗ, СДЗ, СМТЗ, СМК, СМТ и СМП), а также с другими представителями этой группы (табл. 9).
Из полученных результатов видно, что комбинация иммунореагентов антитела-СМЗ ЭДФ позволяет определять семь сульфаниламидов с пределами обнаружения в диапазоне 15 35 нг/мл, что более чем в два раза ниже установленных для них ПДК. Также следует отметить, что 4 из приведенных СА могут быть определены в смеси примерно с одинаковой чувствительностью. При замене в системе трейсера СМЗ-ЭДФ на СХП-ЭДФ полученная система может быть использована для выявления пяти СА с пределами обнаружения от 3 до 25 нг/мл. Однако оказалось, что данная комбинация реагентов не применима для определения СМТЗ и СДЗ.
Таблица 9. Пределы обнаружения и коэффициенты перекрестного реагирования (CR) для сульфаниламидов при использовании групп-специфичных антител и трейсера СМТЗ-ЭДФ СМТЗ-ЭДФ СХП-ЭДФ Сульфаниламид IC50, нг/мл CR, ПрО*, нг/мл IC50, нг/мл CR, ПрО, нг/мл P=0,95 n=3 % P=0,95 n=20 P=0,95 n=3 % P=0,95 n= СМК 5000±200 67 35,0±2,0 450±20 35 16,0±1, СМЗ 3400±100 100 15,0±1,0 14000±900 - 25,0±5, СТЗ 4500±200 76 35,0±3,0 160±10 100 3,0±0, СДМ 19100±900 18 40,0±2,0 740±90 20 55,0±9, СМТ 1900±100 178 40,0±4,0 180±10 90 15,0±2, СМП 16100±800 21 30,0±1,0 1800±100 9 23,0±3, СДЗ 3600±100 95 20,0±1,0 16000±800 - 30,0±7, *ПрО-предел обнаружения 3. Иммунохроматографическое определение сульфаниламидных препаратов методом тест-полосок На этом этапе работы была исследована возможность использования полученных иммунореагентов при групп-специфическом определении СА методом ПФИА для их иммунохроматографического определения, которое, как известно основано на движении вдоль носителя фронта жидкости с тестируемой пробой, в ходе которого осуществляются реакции антиген-антитело с участием определяемого вещества и формируются детектируемые иммунные комплексы.
Для групп-специфического определения СА методом тест-полосок были использованы антитела, предварительно протестированные методом ПФИА, против иммуногена анти-САГ ОВА, так как особый интерес представляла разработка методики одновременного определения нескольких СА в одной пробе. В качестве конъюгата аналит-белок использовался САБ-БСА. Разработка методики иммунохроматографического определения СА включала в себя несколько этапов: получение конъюгатов аналит-белок, антитела наночастицы золота, приготовление тест-полоски. В качестве контрольной анализируемой пробы брали раствор с концентрацией СА 30 нг/мл, что втрое ниже ПДК для СА (100 нг/мл).
Опытным путем подобрано оптимальное разведение конъюгата антител с наночастицами золота (1:100). Для проверки полученных нами тест-полосок был проведено определение с их помощью СА в водных растворах. Полученные данные представлены на рис. 9. Видно, что первый стрип содержит две полосы (рис. 9а) – это отрицательный результат, данный образец не содержал СА, на остальных полосках присутствует одна линия, это означает, что соответствущие тестируемые образцы содержали СА в различных концентрациях.
Контрольный уровень составил 30 нг/мл.
а) б) Рис. 9. Примеры стрип-тестов: а) образец воды и образцы сульфаниламидов с концентрациями 300 нг/мл;
б) образцы СА с концентрациями 100 нг/мл 4. Применение иммунохимических методов для определения сульфаниламидов в продуктах питания животного происхождения 4.1. Определение сульфаниламидов в меде Разработанные методики специфического определения выше перечисленных СА были оптимизированы для анализа образцов меда. Поскольку наиболее часто для лечения пчел применяются сульфаметазин, сульфатиазол и сульфапиридин, предоставленные нам образцы меда были проанализированы на содержание именно этих соединений. В связи с тем, что мед представляет собой многокомпонентную смесь, для разработки определения сульфаниламидов в нем в результате проведенных исследований был выбран оптимальный вид подготовки пробы, который заключался в экстракции СА смесью ацетонитрила и дихлорметана. Чтобы оценить применимость данной методики к контролю СА в реальных образцах меда был проведен тест на открытие данных веществ в пробах (табл. 10). Для этого использовали один образец российского меда и два из Бельгии, так как достоверно было известно, что эти образцы не содержали искомых соединений. Результаты приведены в таблице 10, из которой видно, что процент открытия изучаемых соединений в меде достаточно высок и изменяется в диапазоне 76-97 % для СМТЗ и 76-84 % для СТЗ и 69-97 % для СП, что является оптимальным для данного вида подготовки пробы. С увеличением добавленной концентрации процент открытия несколько возрастает. Некоторое несоответствие введенной и найденной концентраций СА при определении может быть связано с потерями при экстракции их из образцов, а также с потерями в интерфазе. Также это может быть связано с частичной экстракцией сахаров, которые мешают определению.
Аналитические характеристики методик: предел обнаружения, линейный диапазон определяемых концентраций и IC50 приведены в таблице 11.
Таблица 10. Тест на открытие для сульфаметазина и сульфатиазола и сульфапиридина в образцах меда Соединение Cульфаметазин Cульфатиазол Cульфапиридин Найдено, Найдено, Найдено, Введенно, Открытие, Открытие, Открытие, нг/мл нг/мл нг/мл нг/мл % % % Р=0,95 n=3 Р=0,95 n=3 Р=0,95 n= 25 19±1 76 19±1 76 18±1 50 44±7 88 41±3 83 35±6 70 63±3 90 59±8 84 53±4 210 147±7 70 164±5 78 205±11 700 681±10 97 - Таблица 11. Аналитические характеристики методики определения сульфаниламидов в меде Определяемый ПрО*, нг/мл Диапазон определяемых IC50, нг/мл сульфаниламид Р=0,95 n=20 концентраций, нг/мл Р=0,95 n= сульфаметазин 8,0±0,4 19-790 167± сульфатиазол 3±0,1 23-1000 159± сульфапиридин 7±0,3 19-768 220± *ПрО-предел обнаружения Так при проведении пробоподготовки образцов меда для экстракции использовали двухкратный объем растворителя, то следовательно, пределы обнаружения составили с учетом разбавления 16, 6, 14 нг/мл СМТЗ, СТЗ и СП соответственно, что значительно ниже ПДК, установленной для содержания СА в меде. Было проанализировано 35 разных образцов меда российских и зарубежных производителей. Представляло интерес сопоставить данные анализа сульфаниламидов в меде методом ПФИА с результатами анализа меда, полученными другими методами. Нами было проанализировано восемь образцов, предоставленных нашими коллегами из Германии. Полученные данные сопоставлены с анализом тех же образцов методом жидкостной хроматографии (ЖХ-МС/МС) и с помощью иммуносенсорного анализа. Результаты, полученные методом ПФИА для сульфатиазола и сульфаметазина, а также данные биосенсорного и хроматографического методов представлены в таблице 12, из которой видно, что концентрации сульфаметазина и сульфатиазола в меде, полученные в нашей работе методом ПФИА, находятся в хорошей корреляции с данными альтернативных методов. Это подтверждает достоверность результатов разработанной нами методики ПФИА сульфаниламидов в меде.
Таблица 12. Содержание сульфаметазина, сульфатиазола и сульфапиридина в образцых меда по данным различных методов Концентрация сульфаниламидов, нг/г № ПФИА ЖС/МС Иммуносенсор образца сульфаметазин сульфатиазол сульфаметазин сульфатиазол сульфаниламиды 1 34 6 29 - 2 16 6 5 - 3 58 36 - - 4 16 26 - 23 5 41 29 10 - 6 60 6 11 - 7 69 33 56 - 8 56 46 - - 4.2. Определение сульфаниламидных препаратов в молоке С физико-химической точки зрения молоко представляет собой сложную полидисперсную систему, в которой дисперсионной средой является вода, а дисперсной фазой— вещества, находящиеся в молекулярном, коллоидном и эмульсионном состоянии.
Именно вследствие гетерогенности объекта при выполнении ПФИА молока проводилась специальная подготовка пробы, основанная на осаждении белков молока метанолом. Для анализа проб молока были использованы иммунореагенты, подобранные нами ранее при разработке условий групп-специфического определения СА в водных растворах. Так, нами был использован трейсер САБ-ЭДФ и следующие антисыворотки: анти-САГ-ОВА, анти САБ1-ТГ, анти-САГ-БСА и анти-САБ1-ОВА. Чтобы оценить применимость данной методики к контролю СА в реальных образцах молока проводился тест на открытие данных веществ в пробах на примере САБ (табл. 13) Таблица 13.Тест на открытие в молоке [САБ], Анти-САГ-ОВА/САБ- Анти-САГ-БСА /САБ- Анти-САБ1-ТГ /САБ нг/мл ЭДФ ЭДФ ЭДФ 200 87% 101% 60% 400 85% 78% 75% 800 76% 75% 69% Как видно из таблицы 13, процент открытия изучаемых соединений в молоке достаточно высок и изменяется в пределах от 60 до 101. Некоторое несоответствие введенной и найденной концентраций СА при определении может быть связано с их соосаждением вместе с белками. Несколько более низкий процент открытия наблюдался в случае применения антисыворотки анти-САБ1-ТГ. Пределы обнаружения составили 40 нг/мл для САБ и САМ, что ниже более чем в 2 раза, чем ПДК для данных соединений.
6. Иммунохимические тест-методы определения микотоксинов в объектах растительного происхождения Одной из задач нашего исследования являлась разработка очень актуальных в настоящее время тест-методов для внелабораторного скрининга микотоксинов в продуктах питания на примере охратоксина А (ОТА) на основе визуальной детекции.
Метод объединил в себе очистку экстракта образца, концентрирование определяемого вещества и собственно его определение. В качестве подтверждающего метода использовалась жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Для определения микотоксинов использовалась трубка емкостью 1 мл, в которую помещали очищающий и детектирующий слои. Детектирующий иммунослой представлял собой гель на основе сефарозы 4B с активированными CNBr-группами с ковалентно связанными антителами, специфичными к ОТА. Анализ проводился в формате конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Показано, что приготовленные колонки дают воспроизводимые результаты как минимум в течение двух месяцев при хранении при температуре + 4 0С. Было апробировано и оптимизировано 3 процедуры проведения иммуноанализа, включающие семь, пять и три шага анализа. Для каждой из схем была разработана соответствующая колонка (рис. 10).
(А) (Б) (В) 1 2 Рис. 10. Варианты тест-колонки для проведения иммуноанализа. 1 – детектирующий иммунослой;
2 – очищающий слой;
3 - конъюгат. (А) – Детектирующий иммунослой находится внизу. Процедура включает 7 шагов. (Б) – Детектирующий иммунослой находится вверху. Процедура включает 5 шагов. (В)- Детектирующий иммунослой находится вверху, введен дополнительный фрит с коньюгатом.
В качестве объекта исследования были выбраны специи: Capsicum ssp. (красный перец, чили, кайенский перец, пили-пили, паприка), Piper spp (белый перец и черный перец), Myristica fragrance (мускатный орех), Zingiber officinale (имбирь), а так же лакрица. Выбор обусловлен сложностью и разнообразием матрицы образца, а так же интенсивносью его окраски. В качестве контрольной была выбрана концентрация ОТА 10 мкг/кг в соответствии с максимально допустимым уровнем, установленных ЕС. Варьирование условий показало, что получить данный контрольный уровень при использовании 0,5 мл экстракта позволяют разведения антител 1/100 и коньюгата с пероксидазой хрена 1/100, время развития окраски мин после добавления субстрата. Экстракцию проводили раствором метанол/ 3 % раствор бикарбоната натрия в соотношении 8:2.
Для оптимизации условий анализа к различным видам специй были использованы по одному образцу красного перца (пили-пили), паприки, чили, мускатного ореха, имбиря, черного перца и белого перца, для которых в предварительных экспериментах методом ВЭЖХ-МС/МС было показано отсутствие ОТА. Основное требование к методам скрининга – отсутствие ложноотрицательных результатов. Поэтому для контроля возможного матричного эффекта для каждого из образцов проводился анализ незагрязненного образца и образца, содержащего 10 мкг/кг ОТА. Полученные результаты показали, что при использовании колонки с детектирующим иммунослоем, расположенным внизу, интенсивная окраска образца, не содержащего ОТА, и отсутствие окраски образца, содержащего 10 г/кг ОТА, наблюдаются только для специй семейства Capsicum ssp.
(красного перца, паприки, чили). Таким образом, данный способ оказался непригоден для определения ОТА в части образцов.
Таким образом, для скрининга ОТА в образцах имбиря, мускатного ореха, черного перца и белого перца требовалась применение другой процедуры. Среди большого количества рассмотренных вариантов в качестве оптимальной была признана колонка, в которой детектирующий иммунослой располагался сверху (рис. 10 б) и процедура анализа, включающая пять шагов. Расположение детектирующего иммунослоя сверху позволило избежать нежелательного влияния примесей, попадающих при промывании из вышележащих слоев в нижележащие. При этом стадия связывания первичных антител проводилась при подготовке колонки. Данный подход был использован для скрининга образцов специй. Было показано полное отсутствие ложноотрицательных результатов, кроме того, контрольный метод ЖХ-МС/МС подтвердил как положительные, так и отрицательные результаты. В целях дальнейшего упрощения и сокращения времени анализа была предложена процедура, включающая три шага. Сокращение числа шагов стало возможным в результате включения в колонку дополнительного фрита, на который был нанесен конъюгат (рис. 13 в). Для предотвращения контакта конъюгата с буфером и детектирующим иммунослоем до проведения анализа, разделяющая мембрана располагалась на расстоянии примерно 2 см над детектирующим иммунослоем.
Было проанализировано 27 образцов Capsicum spp., черного и белого перца, мускатного ореха, имбиря и лакрицы. Результаты, полученные с помощью данного тест-метода приведены на рис. 11. Для сравнения приведены результаты, полученные методом ЖХ МС/МС. Из рисунка видно, что получено полное совпадение результатов тест-метода и подтверждающего метода.
OTA, µg/kg ОТА, нг/г + - - - - - - ±± - - -- - ± - - ±- ++++- - + +±- - - ± - - - - - -- - - - - ±- ++++- - + + - - - - - ± - - - - -- - - - - - - ++++- - ± cut-off контр. уровень red pepper licorice ginger cayenne chilli мускат.
пили кайенск.
имбирь орех перец перец перец чили перец лакрица белый паприка красный черный nutmeg paprika pili-pili white pepper black pepper Рис. 11. Результаты определения ОТА при использовании процедуры из трех шагов и метода ЖХ-МС/МС.
(-) – окрашивание детектирующего слоя в голубой цвет, отрицательный результат (+) – отсутствие окрашивания;
ОТА присутствует в концентрации более, чем 10 нг/г (±) - отрицательный результат – развитие малоинтенсивной синей окраски детектирующего иммунослоя, концентрация OTA 10 мкг/кг.
ВЫВОДЫ 1. Разработаны методики поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) для индивидуального определения семи сульфаниламидных препаратов: сульфаметазина, сульфатиазола, сульфахиноксалина, сульфапиридина, сульфадиметоксина, сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазина. Пределы обнаружения составили 1- нг/мл, что значительно ниже ПДК. Установлено, что гомологичная комбинация трейсера и антител позволяет получить более низкие пределы обнаружения.
2. Разработана методика групп-специфического определения сульфаниламидов с помощью антител, полученных к иммуногену, на основе химерной молекулы, содержащей фрагменты семи сульфаниламидов. Установлено, что данные антитела специфичны к семи искомым сульфаниламидам и их гомологам, а также практически не чувствительны к остальным представителям данной группы лекарственных веществ. Пределы обнаружения составили 3-55 нг/мл.
3. Показана возможность использования антител, специфичных к 4-(4 аминосульфаниламино)-гексановой кислоте, конъюгированной с овальбумином, для одновременного определения пяти сульфаниламидов методом тест-полосок. Контрольный уровень составил 30 нг/мл.
4. Оптимизированы методики групп-специфического и специфического определения сульфаниламидов методом ПФИА для анализа реальных объектов меда и молока.
Отработаны условия подготовки образцов. Пределы обнаружения разных сульфаниламидов находились в интервале от 6 до 16 нг/мл для меда и от 40 до150 нг/мл для молока.
5. Показана возможность разработки иммуноаффинных тандемных колонок для определения микотоксинов. Пороговая концентрация составила 10 нг/мл. Методика применена для определения охратоксина А в специях.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Zhang S., Wang Z., Nesterenko I.S., Eremin S. A., Shen J. Fluorescence polarisation immunoassay based on a monoclonal antibody for the detection of sulphamethazine in chicken muscle // Int. J. Food Sci. Tech. 2007. V.42. P. 36-44.
2. Goryacheva I. Yu., Saeger S. De, Nesterenko I.S., Eremin S. A., Peteghem C. Van. Rapid all in-one three-step immunoassay for non-instrumental detection of оchratoxin A in high-coloured herbs and spices. // Talanta. 2007. V.72. P.1230-1234.
3. Wang Z., Zhang S., Nesterenko I.S., Eremin S.A., Shen J. Monoclonal Antibody-Based Fluorescence Polarization Immunoassay for Sulfamethoxypyridazine and Sulfachloropyridazine. // J. Agric. Food Chem. 2007. V. 55. P. 6871-6878.
4. Aili D., Enander K., Rydberg J., Nesterenko I., Bjrefors F., Baltzer L., Liedberg B. Folding Induced Assembly of Polypeptide Decorated Gold Nanoparticles. // J. Am. Chem. Soc. 2008. V.
130. P. 5780-5788.
5. Нестеренко И.С., Нокель М.А., Еремин С.А. Иммунохимические методы определения сульфаниламидных препаратов. Обзор. // Журн. Анал. Хим. 2009. Т. 64. № 5. С. 1-20.
6. Murtazina N.R., Everest S., Brown J., Jackman R., Nesterenko I.S., Eremin S.A.. Polarization fluoroimmunoassays for sulfonamides using highly specific antibodies. Book of abstract. VII International Conference on Agri-Food Antibodies. Uppsala, Sweden. September 10-13. 2003.
P. L-06.
7. Eremin S.A., Ermolenko D.N., Murtazina N.R., Nesterenko I.S., Mart'ianov A.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. ELISA and fluorescence polarization immunoassay for detection of sulfanilamide and generic screening of sulfonamides.// VIII International conference on Agri Food Antibodies. 6-9 September. 2005. Chester, England. Programme, Abstracts and List of Delegates. PL-04. P. 19.
8. Nesterenko I.S., Nokel M.A. Determination of sulfonamides in honey by polarization fluorescence immunoassays.// Young Scientists Conference «Biotechnology for future». June 6 8. 2006. St. Petersburg, Russia. Book of abstract. P.65.
9. Eremin S.A., Nesterenko I.S., Nokel M.A., Wang Z., Zhang S., Shen J. Detection of sulfonamides by Fluorescence Polarization Immunoassay.// International Congress on Analytical Sciences. June 25-30. 2006. Moscow, Russia. Book of abstract. Vol. 2, 3-P111, P.
429.
10. Нестеренко И.С., Гасилова Н.В. Применение поляризационного флуоресцентного иммуноанализа для определения сульфаниламидных препаратов в реальных объектах.// Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология – современные биоаналитические системы, методы и технологии.» 28 октября- 3 ноября. 2006. г.
Пущино. С.13.
11. Нестеренко И.С., Горячева И.Ю., Saeger S. De, Еремин С.А., Peteghem C. Van.
Определение охратоксина А в специях и лакрице методом трехстадийного иммунохроматографического анализа.// V Всероссийский Конгресс по Медицинской Микологии. 28 марта. 2007. Москва. C. 12. Нестеренко И.С. Применение поляризационного флуоресцентного иммуноанализа для определения сульфаниламидных препаратов в меде.// IV Международный конгресс «Биотехнология: состояние, перспективы развития». 12-16 марта. 2007. Москва. С.191.
13. Шарышев А.А., Нестеренко И.С., Еремин С.А. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методами поляризационно-флуоресцентного иммуноанализа и иммуноферментного анализа.// XV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых « Ломоносов-2008». 14-18 апреля.
2008. Москва. С. 81.
14. Нокель М.А., Нестеренко И.С., Еремин С.А. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методами поляризационно-флуоресцентного иммуноанализа.// XV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых « Ломоносов-2008». 14-18 апреля. 2008. Москва. С. 283.
15. Нестеренко И.С. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методом стриповых полосок с использованием наночастиц золота.// Школа-семинар «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы». 9-11 декабря. 2008. Белгород С. 23.
16. Еремин С.А., Нестеренко И.С., Белоглазова Н.В. Скрининг пищевых продуктов на токсиканты методом поляризационного флуороиммуноанализа. Международная научно практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты».12-16 марта 2008. Москва. Материалы конференции, С. 367.
17. Нестеренко И.С. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методом тест-полосок. V Московский международный конгресс "Биотехнология:
состояние и перспективы развития". 16-20 марта. 2009. С. 23.