Формирование коллекции природных микромицетов и выявление штаммов с антибактериальными и москитоцидными свойствами
На правах рукописи
Юскевич Виктория Викторовна ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ПРИРОДНЫХ МИКРОМИЦЕТОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ШТАММОВ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ И МОСКИТОЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Оболенск - 2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ Научные руководители:
член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич;
кандидат биологических наук Володина Лариса Ивановна
Официальные оппоненты:
Теплякова Тамара Владимировна – доктор биологических наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусо логии и биотехнологии Вектор», заведующая лабораторией микологии отдела биофизи ки и экологических исследований Коломбет Любовь Васильевна – доктор биологических наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микро биологии и биотехнологии», учёный секретарь
Ведущая организация:
Институт систематики и экологии животных, Сибирское отделение Российской академии наук
Защита состоится « 1 » марта 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государствен ный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск, [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного уч реждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и био технологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ) Автореферат разослан « » января 2013 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Фурсова Надежда Константиновна
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Микроскопические грибы привлекают всё более при стальное внимание биотехнологов. Они продуцируют биологически активные вещества (БАВ) различной химической природы и специфики действия (антибиотики, ферменты, липиды, алкалоиды и другие метаболиты), нашедшие применение в сельском хозяйстве (Коломбет, 2007), медицине (Holliday, Cleaver, 2008) и пищевой промышленности (Сас сон, 1987). Доля метаболитов грибов составляет более 50% от всех открываемых биоло гически активных природных соединений (Бибикова, Катлинский, 2008). Число извест ных видов грибов увеличивается с каждым годом (Hibbett, 2011) и, вероятно, достигает 1,5 миллионов видов (Hawksworth, 2001). Однако большинство видов микроскопиче ских грибов остаётся ещё слабо изученным и невостребованным потенциалом.
Коллекции чистых культур являются важнейшими средствами для сохранения микробиологических ресурсов и поиска высокоэффективных штаммов грибов – антаго нистов, перспективных для создания новых биопрепаратов. В ГНЦ ПМБ cформирована рабочая коллекция мицелиальных грибов. Коллекция создана на основе изолятов из по гибших насекомых и образцов почв, собранных в ходе экспедиций в заповедники раз ных регионов России и СНГ. Целью этих экспедиций являлось создание коллекции культур энтомопатогенных и почвенных грибов из разных природно-климатических зон для последующего их изучения как возможных продуцентов биологически активных веществ. Значительная часть коллекции грибных культур состоит из представителей родов, использующихся в биотехнологической промышленности (при производстве средств защиты растений, антибактериальных препаратов, ферментов и т. д.). Предста вители рода Cordyceps являются богатыми источниками биологически активных ве ществ и издавна применяются в традиционной китайской медицине (Holliday, Cleaver, 2008). Экстракты, выделенные из культуры этого гриба, проявляют антиоксидантные, иммуномодулирующие, гипогликемические, гипотензивные, сосудорасширяющие и противораковые свойства, препятствуют процессам старения (Бабицкая и др., 2009).
При проведении научно-исследовательских работ в ГНЦ ПМБ выявлен ряд грибов, обладающих активностью против патогенных микроорганизмов, таких как Staphylococ cus aureus, Serratia marcescens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus и Candida albi cans, а также особо опасных патогенов Bacillus anthracis и Francisella tularensis. Кроме того, выявлен ряд штаммов и их метаболитов, активных в отношении личинок кровосо сущих комаров, которые могут быть использованы для производства инсектицидов но вого поколения, не содержащих живых культур. В коллекции содержится также боль шое количество условно – патогенных грибов, которые могут быть использованы в ка честве тест-культур для поиска продуцентов новых противогрибных препаратов.
Главной задачей любой микробиологической коллекции является поддержание и сохранение биологического материала в условиях, обеспечивающих неизменность ос новных свойств штаммов. Штаммы некоторых видов грибов, заложенные на хранение традиционными методами, не удается сохранить даже на протяжении одного-двух лет.
Необходима дополнительная работа по оптимизации защитных сред и режимов заклад ки на хранение, а также по выбору питательных сред и стадий развития гриба, обеспе чивающих наибольшую стабильность в процессе хранения.
Одним из перспективных для длительного хранения мицелиальных культур можно считать метод контактно-сорбционного обезвоживания (КСО). В ГНЦ ПМБ разработан метод КСО с применением ионообменной смолы для бактериальных штаммов (Пат. SU 1831498 А3, 1991). Экспериментально показано, что данный метод применим и для большинства видов мицелиальных грибов. Метод не является энергоемким, не требует сложного технологического и лабораторного оборудования и может быть использован даже в полевых условиях.
Цель исследования – формирование коллекции природных микромицетов, изуче ние биологических свойств коллекционных культур и отбор штаммов, перспективных для разработки новых бактерицидных, фунгицидных или москитоцидных препаратов.
Задачи исследования:
1. Сформировать коллекцию мицелиальных грибов. Идентифицировать выделенные культуры.
2. Усовершенствовать состав питательной среды для выделения и культивирования мицелиальных грибов.
3. Определить стадии развития грибов, оптимальные для закладки их на длительное хранение.
4. Адаптировать метод контактно-сорбционного обезвоживания для длительного хра нения мицелиальных грибов разных таксономических групп.
5. Провести исследование коллекции микромицетов на наличие продуцентов биологи чески активных веществ, перспективных для разработки новых бактерицидных, фунги цидных и москитоцидных препаратов.
Научная новизна:
Создана коллекция паспортизованных штаммов мицелиальных грибов, являющая ся основой для разработки новых антибактериальных и москитоцидных препаратов.
Показано, что метод контактно-сорбционного обезвоживания обеспечивает дли тельное хранение (не менее 5 лет) мицелиальных грибов разных таксономических групп без утраты их свойств.
Впервые установлено, что грибы Calcarisporium arbuscula Preuss, Clonostachys candelabrum (Bonord.) Schroers и их метаболиты обладают москитоцидными свойства ми.
Установлено, что 19 штаммов грибов, относящихся к классу Ascomycetes, облада ют одновременно москитоцидными, бактерицидными и фунгицидными свойствами.
Практическая значимость:
В государственную коллекцию «ГКПМ – Оболенск» депонированы 38 штаммов мицелиальных грибов с высокой антагонистической или москитоцидной активностью.
Разработаны методические подходы для долгосрочного хранения мицелиальных грибов, включающие состав питательной среды, стадии развития грибной культуры и метод КСО.
148 культур грибов депонированы и включены в каталог центральной коллекции энтомопатогенных грибов Департамента сельского хозяйства США – ARSEF (междуна родный уровень внедрения) http://arsef.fpsnl.cornell.edu.
Положения, выносимые на защиту:
1. Созданная рабочая коллекция микромицетов, насчитывающая 1336 паспортизо ванных штаммов, является потенциальным источником для отбора штаммов – проду центов биологически активных веществ.
2. Метод контактно-сорбционного обезвоживания пригоден для длительного хра нения мицелиальных грибов разных таксономических групп.
3. Усовершенствованная питательная среда обеспечивает рост и спорообразование 320 видов микромицетов.
4. Микромицеты, обладающие антагонистической активностью: 120 штаммов с фунгицидной активностью в отношении C. albicans, 202 штамма - антагониста S.
aureus, S. marcescens или B. cereus;
105 штаммов - антагонистов B. anthracis, 95 штам мов - антагонистов F. tularensis и 182 штамма с москитоцидной активностью.
Работа выполнена в отделе коллекционных культур ФБУН ГНЦПМБ в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработ ки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 2011-2015 гг.): НИР «Идентификация и изучение биологических, молекулярно-генетических, биохимиче ских характеристик возбудителя туляремии, в том числе культур с атипичными свойст вами», номер гос. регистрации 01201172652;
НИР 042 «Совершенствование деятельно сти коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ в соответствии с современными достижениями науки и технологии», номер гос. регистрации 01201172659;
НИР 045 «Разработка и исследова ние новых дезинфектантов, антимикробных и инсектицидных препаратов», номер гос.
регистрации 01201172662;
в рамках ФЦП «Национальная система химической и биоло гической безопасности Российской Федерации (2009 – 2014 годы)»: государственный контракт № 39-Д от 30.05.2012 «Разработка средств обеззараживания сибиреязвенных почвенных очагов с использованием новых композиций дезинфектантов и биологиче ских препаратов», номер гос. регистрации 01201267512.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором.
Экспериментальные результаты, представленные в отдельных главах, получены совме стно с сотрудниками ФБУН ГНЦ ПМБ: к.б.н. Л. И. Володиной, к.б.н. В. Е. Лиховидо вым, Е. В. Быстровой, к.б.н. А. Н. Наумовым, Е. М. Асланян, Н. А. Коробовой, к.м.н.
Л. И. Марининым, к.б.н. Н. А. Шишковой, д.б.н. В. М. Павловым, Г. М. Вахрамеевой, к.б.н. Е. И. Асташкиным, к.б.н. Д. М. Пачкуновым;
а также к.б.н. А. В. Александровой (МГУ) и Б. А. Борисовым (ИПЭЭ РАН).
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на семи российских и международных конференциях: VII-й Межгосударственной научно-практической кон ференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного зна чения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита го сударств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников со дружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.);
Международной конференции «Горные экосистемы и их компоненты» (13-18 сентября 2007 г., Нальчик);
Междисциплинарном Микологическом Форуме ( 23 апреля 2009 г., Москва);
Международной конференции «Почвы и растительный мир горных террито рий» (24-29 августа 2009г., Нальчик);
Международной научно – практической конфе ренции «Интегрированная защита растений: стратегия и тактика» (5-8 июля 2011 г., Минск);
Международном научном симпозиуме «Защита растений: проблемы и перспек тивы» (29-31 октября 2012 г., Кишинёв);
Третьем съезде микологов (12-15 октября г., Москва).
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Учёного сове та ГНЦ ПМБ от 15 ноября 2007 г. (протокол № 8, приказ № 135 от 30.11.2007 г.) с изме нениями, утверждёнными на заседании Учёного совета ГНЦ ПМБ от 19 ноября 2012 г.
(протокол № 11). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 27 от 19 ноября 2012 г.).
Публикации. Основное содержание работы
отражено в 11 научных публикациях, в том числе в одной статье, опубликованной в рецензируемом журнале, рекомендован ном ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах маши нописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, мате риалы и методы исследования, результаты и обсуждения, выводы и список литературы, включающий 101 работу отечественных и 123 работы зарубежных авторов, список со кращений и четыре приложения. Работа иллюстрирована 59 рисунками и 14 таблицами.
Приложения состоят из списка видов микромицетов, хранящихся в коллекции (А);
справок о депонировании (Б);
списка штаммов, депонированных в американскую кол лекцию энтомопатогенных грибов - ARSEF (В) и списка публикаций по теме диссерта ции (Г).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В работе использовали рабочую коллекцию микромицетов, состоящую из 1336 штам мов, относящихся к 333 видам 130 родов. Исследовали биологические свойства 505 штам мов микромицетов, относящихся к 225 видам 115 родов.
Тест – объектами служили бактериальные штаммы, полученные из государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ – Оболенск): P. fluorescens В - 3785, S.
marcescens В - 6498 (АТСС 13880), B. сereus В - 1447, метициллинрезистентный штамм S.
aureus В - 4849, вакцинный штамм B. anthracis СТИ - 1, вакцинный штамм F. tularensis 15/10, Paenibacillus macerans В - 1410, Paenibacillus polymyxa В - 1999, Pectobacterium caro tovorum ssp. carotovorum В – 4966;
дрожжи C. albicans В - 4845;
личинки второго возраста комаров Aedes aegypti, Culex pipiens, Culex pipiens molestus, Anopheles messeae. Видовое соответствие тест – культур было проверено с использованием тест – систем PLIVA LACHEMA, фотометра Multiskan Ascent (Финляндия) и программы «Микроб Автомат», а также сиcтемы MALDI Biotyper.
Полевые образцы погибших насекомых, перед выделением из них грибов, фотографи ровали на экспедиционной базе в день сбора. Затем мицелий и конидии инокулировали на твёрдую питательную среду в чашки Петри. Посевы инкубировали в термостате при темпе ратуре (24 ± 0,5) °С в течение 10 – 20 дней до массового спорообразования. Для выделения чистых культур грибов применяли среды: Сабуро, Чапека, картофельно – декстрозный агар, мальт-экстрат агар, микологический бульон, рисовый агар, среду с добавлением мучного хрущака, cреду для энтомофторовых грибов (СМЖ), среду Сабуро с почвенной вытяжкой, модифицированную микологическую среду (ММС). Тест – культуры выращивали на средах:
ГРМ - агаре, мясо – пептонном агаре, агаре Хоттингера.
Питательную среду расфасовывали в чашки Петри диаметром 60 мм, установленные с небольшим наклоном. Это позволяло получить свободный от питательной среды участок дна чашки, через который можно было микроскопировать культуру и следить за процессом образования конидий, не открывая чашку.
Идентифицировали выделенные культуры по макро - и микроморфологическим при знакам. Для детального изучения микроморфологии готовили препараты на стекле, исполь зуя молочную кислоту. Микрофотографирование производили с использованием фотоаппа рата Olympus, встроенного в микроскоп Биолам П2-1, при общем увеличении в 500 и раз.
В отдельных случаях, для уточнения видовой принадлежности культур, а также для ус тановления идентичности выделенных анаморфных изолятов собранным телеоморфным об разцам использовали молекулярно – генетические методы идентификации - RFLP и RAPD PCR.
Для хранения штаммов использовали методы криоконсервации, лиофилизации, КСО, а также хранение под минеральным маслом и в дистиллированной воде. Для хранения в жид ком азоте использовали в качестве криопротектора 10 % водный раствор глицерина с добав лением 5% лактозы и ультрабыстрый режим замораживания. При лиофилизации в качестве защитной среды использовали 10 % раствор сахарозы с 1,5 % желатины или 10 % обезжи ренное молоко.
При КСО в качестве сорбента влаги использовали ионообменную смолу КБ4-П2.
Жизнеспособность проверяли через 1-3 суток после консервации, затем периодически в процессе хранения.
Стабильность биологических свойств штаммов оценивали по морфологическим харак теристикам при высеве на стандартные питательные среды и наличию антагонистической активности после длительного хранения.
Для определения антимикробного спектра действия грибных культур использовали ме тод блоков, основанный на способности веществ диффундировать в толщу агара и задержи вать рост тест-объектов, находящихся в зоне диффузии. Тестируемые штаммы культивиро вали на агаризованной питательной среде ММС в течение 5-13 дней. Вырезанные из агара блоки с исследуемой культурой гриба помещали на засеянные и подсушенные газоны тест культуры. Каждый опыт проводили в трёх повторностях. Активность грибных штаммов оп ределяли по среднему значению диаметра зоны подавления роста микробных культур.
Москитоцидную активность определяли на личинках второго возраста комаров Aedes aegypti, Culex pipiens, Culex pipiens molestus, Anopheles messeae. На первом этапе опреде ляли активность мицелиальной культуры, выращенной на плотной агаризованной среде ММС до стадии массового спорообразования. Культуру с агара смывали дистиллированной водой. Концентрацию суспензии доводили до 1 106 конидий. Разливали по 1 мл смыва ко нидий в три лунки 24 - луночных планшетов с диаметром лунок 16 мм. В каждую лунку по мещали по 10 личинок комаров второго возраста. Планшеты инкубировали в термостате при 250 C. Контролем служили личинки, помещённые в 3 лунки с дистиллированной водой. На блюдение проводили в течение первых суток каждые 30 минут, затем ежесуточно в течение четырёх суток. Производили подсчёт живых и погибших личинок. Оценивали активность мицелиальной культуры грибов по времени наступления гибели 50 % личинок (средне летальное время смертности LT50). Штаммы, вызывающие гибель личинок комаров в тече ние первых суток, отмечали как высокоактивные.
На втором этапе определяли активность инсектицидных метаболитов в супернатанте культуральной жидкости по величине средне-летальной концентрации (LC50). Исследовали штаммы, у которых была выявлена активность на первом этапе. Наработку биомассы прово дили в качалочных колбах на среде следующего состава (г/л): соевая мука - 20.0;
дрожжевой экстракт - 8.0;
глюкоза - 30.0;
КН2РО4 - 3.0;
МgSO4 - 0.7. Культивирование проводили при температуре 230С и рН среды - 6.0 на микробиологической качалке в течение 3 - 5 дней до выхода культуры на стационарную фазу роста и образования бластоспор. Культуральную жидкость центрифугировали. Для определения LC50 использовали ряд последовательных двукратных разведений супернатанта водой. Далее исследования проводили по методике, описанной для оценки смывов грибов с плотной питательной среды. Смертность личинок учитывали через 24 часа. Подсчет LC50 и LT50 проводили по методу Кербера.
Результаты исследований и их обсуждение Формирование коллекции На начальных этапах работы коллекцию формировали из изолятов, выделенных из полевых образцов, собранных во время экспедиций в заповедники Приморского Края, Курильских островов, Краснодарского края, Абхазии, Астраханской области, Украины и Белоруссии. За время полевых работ собрали более 2000 погибших насекомых и око ло 500 образцов почв, из которых нам удалось выделить свыше 1000 изолятов мицели альных грибов.
Кроме того, в состав коллекции вошли 44 штамма, полученные из отдела средств защиты растений ВНИИПМ, хранившиеся под вазелиновым маслом с 1983 - 2005 гг. и штаммов, заложенные в тот же период на ионообменную смолу. В рамках совместной работы по проекту МНТЦ № 2338 «Энтомопатогенные грибы и их метаболиты» из Американской коллекции ARSEF были получены 125 штаммов энтомопатогенных гри бов.
В дальнейшем коллекцию пополняли изолятами из образцов, собранных преиму щественно в Московской области, а также грибами, выделенными Александровой А.В.
из почв Южного Вьетнама, Якутии, Красноярского края, Ленинградской, Тверской, Ас траханской, Ростовской областей и полученными нами в рамках сотрудничества с ка федрой микологии и альгологии МГУ.
На насекомых, собранных в ходе экспедиций, чаще всего встречались анаморфные виды родов Isaria, Paecilomyces, Beauveria, Lecanicillium. Выделили 122 микромицета, относящихся к роду Lecanicillium, 190 штаммов Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., 86 штаммов Isaria farinosa (Holmsk.) Fr. Часто встречались виды I. tenuipes (Peck) Sam son, и I. fumosorosea Wize.
Наибольшее количество видов Cordyceps – подобных грибов и их анаморф собра ли во время экспедиций на Дальний Восток. В неисследованном прежде Лазовском за поведнике было найдено, по меньшей мере, 32 вида грибов этой группы. Представите лей этого рода находили также в горных лесах на Западном Кавказе, в Сочинском и Мостовском районах Краснодарского края. Из них Ophiocordyceps corallomyces (A.
Mller) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora и O. stylophora (Berk. & Broome) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora были известны ранее в России только на юге Дальнего Востока. К сожалению, многие виды, например, O. nutans (Pat.) G.H.
Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora, который часто встречался в Приморском Крае, выделить в культуру из стром не удалось. Успешно выделяли C. militaris (L.) Link и Elaphocordyceps ophioglossoides (Ehrh.) G.H. Sung, J.M. Sung & Spatafora (рисунки 1, 2).
При обработке полевых образцов выделили изоляты редких грибов, ранее извест ных по единичным находкам: Evlachovaea spp. (Borisov, 1999), Paecilomyces borystheni cus B.A. Borisov & Tarasov (Borisov, 1997).
Рисунок 1 - Cordyceps militaris F-854, Рисунок 2 - Elaphocordyceps ophioglossoides среда ММС, 16 суток (ув.1000) F-147, среда ММС, 16 суток (ув.1000) Впервые на территории России (в Сочинском районе) найден 1 экземпляр ана морфного гриба Isaria coleopterora (Samson & H.C. Evans) Samson & Hywel-Jones, обна руживаемый обычно в тропических регионах (рисунки 3, 4).
Рисунок 3 - Isaria coleopterora Рисунок 4 - Isaria coleopterora F- 531 на среде ММС, 21 сутки F- 531, среда ММС, 16 суток (ув.1000) В 2001 и 2002 г. выделение грибов в культуру проводили в лабораторных условиях через 40-90 дней после сбора образцов погибших насекомых или стром аскомицетов.
Для более успешного изолирования энтомопатогенных грибов разработали специ альный состав питательной среды (ММС), позволяющий выделять в культуру микро мицеты в экспедиционных условиях. Во время экспедиций, проводившихся в 2004- годах, высевы микологического материала производили на твёрдые питательные среды непосредственно в дни сбора полевых образцов. Изоляты закладывали на хранение на ионообменную смолу в пенициллиновые флаконы прямо в полевых условиях. Эти ме тодические приёмы позволили увеличить результативность выделения микромицетов в чистую культуру с 10 – 20% в 2001 – 2002 гг. до 56 – 74 % в 2004 – 2005 гг. (Володина и др., 2009).
Идентификация выделенных изолятов Идентификация анаморфных грибов основана на изучении макро- и микроморфо логических признаков. Для того, чтобы стандартизировать полученные результаты, вы деленные изоляты пересевали на стандартные питательные среды: Чапека, Сабуро и картофельно – декстрозный агар (Саттон и др., 2001). Идентификацию проводили со вместно со специалистами - микологами А. В. Александровой (МГУ) и Б. А. Борисовым (ИПЭЭ РАН). Грибы идентифицировали, используя литературу отечественных и зару бежных авторов. По морфологическим признакам идентифицировали до вида штаммов и до рода - 66 штаммов.
Для уточнения видовой принадлежности ряда культур, относящихся к родам Beau veria, Lecanicillium, Paecilomyces, Cordyceps, Evlachovaea проводили совместную работу с группой молекулярно-генетической идентификации отдела молекулярной микробио логии ГНЦ ПМБ. В результате исследований, проведённых молекулярно генетическими методами, основанными на PCR (методы RFLP и RAPD-PCR), иденти фицировали 116 штаммов микромицетов.
Номенклатура микромицетов уточнена по электронным базам данных Index Fungo rum http://www.indexfungorum.org и MycoBank http://www.mycobank.org по состоянию на 1 ноября 2012 г.
Состав и паспортизация коллекции Большую часть коллекции составляют энтомопатогенные грибы (717 штаммов видов 23 родов), выделенные из погибших насекомых, и микромицеты, выделенные из образцов почв, собранных во время экспедиций. В основном, это грибы, являющиеся бесполой стадией развития грибов класса Ascomycetes, и несколько родов класса Zygo mycetes (Batkoa, Conidiobolus, Absidia, Gongronella, Mortierella и Zygorhynchus). На се годняшний день общий номенклатурный объём коллекции составляет 1336 штаммов микромицетов, относящихся к 333 видам 130 родов. 787 штаммов 22 родов являются условно патогенными и могут быть использованы в качестве тест – культур при поиске продуцентов и разработке новых фунгицидов. Штаммы паспортизованы, создан элек тронный каталог коллекции.
Оптимизация состава питательных сред Для выделения грибов в культуру применяли традиционные агаризованные пита тельные среды Сабуро, Чапека, картофельно – декстрозный, рисовый и мальт-агар;
сре ды, содержащие хитин и почвенный экстракт, а также среду с яичным желтком. При этом выделить мицелиальные грибы в культуру удавалось не всегда. По данным Papie rok и Hajek (Papierok et al., 1997), для выделения, например, энтомофторовых грибов, классические микологические среды неприемлемы, так как рост на них бедный, либо вообще отсутствует. Такие грибы нуждаются в богатых питательных средах, что обес печивается добавлением яичных желтков, витаминов и аминокислот, а в отдельных случаях – тканей насекомых. Однако приготовление таких питательных сред довольно трудоёмко и не всегда точно воспроизводимо.
В процессе работы было обнаружено, что среда Сабуро позволяет получать доста точное количество грибной биомассы, но не все культуры на этой среде достаточно бы стро образуют споры, что совпадает с литературными данными (Саттон и др., 2001).
Быстрое спорообразование обеспечивает среда Чапека, но рост на этой среде скудный.
Для выделения грибов из полевых образцов и дальнейшего культивирования разработа ли питательную среду ММС следующего состава, (г/л): NaNO3 — 2.0;
KCl — 0,5;
FeSO4 7H2O — 0,01;
MgSO4 7H2O - 0,5;
КН2РО4 — 1,0;
глюкоза — 10,0;
мальтоза — 10,0 мясной пептон — 5,0;
дрожжевой экстракт— 5,0;
бактериальный агар — 15,0;
ген тамицин — 0,04 мг/мл. Конечное значение рН – 7,3 ± 0,2. Гентамицин не оказывал влияния на рост и развитие грибов, и в то же время эффективно подавлял рост бакте рий.
При сравнении роста и развития микромицетов на питательных средах Чапека, Са буро и ММС, оказалось, что даже при одинаковом нарастании грибной биомассы на средах ММС и Сабуро, появление спор на среде Сабуро происходило позже, чем на мо дифицированной среде. Сравнивая рост исследуемых культур на средах ММС и Чапека, можно сделать вывод, что при одинаковых сроках спорообразования, нарастание гриб ной биомассы было большим на ММС, чем на среде Чапека (таблица 1).
На рисунках 5, 6 в качестве примера показан рост на обеих средах гриба Simplicil lium lamellicola (F.E.V. Sm.) Zare & W. Gams.
Рисунок 5 - Simplicillium lamellicola, Рисунок 6 - Simplicillium lamellicola F-504, среда ММС, 7 сут F-504, среда Чапека, 7 сут В дальнейшей работе использовали среду ММС как для выделения культур из со бранных в экспедициях образцов, так и для культивирования всех коллекционных штаммов. Она является достаточно богатой и стандартизованной питательной средой и позволяет в короткие сроки получить достаточное количество спор, необходимое для закладки культуры на длительное хранение. При проверке грибов на антагонистческую активность тестируемые грибы выращивали на среде ММС без добавления гентамици на. Данные о росте и развитии некоторых грибов на разных средах представлены в таб лице 1.
Таблица 1 - Сравнение роста и развития микромицетов на разных питательных средах ММС Чапека Сабуро Появле- Появле- Появление Род, вид Рост ние спор, Рост ние спор, Рост спор, су сутки сутки тки +++* 3 + 3 ++ Fusarium solani (Mart.) Sacc.
Fusarium sporotrichioides +++ 3 ++ 3 ++ Sherb.
Fusarium culmorum (W.G. +++ 3 + 3 +++ Sm.) Sacc.
Geomyces pannorum (Link) +++ 5 ++ 5 +++ Sigler & J.W. Carmich.
+++ 7 ++ 7 ++ Cordyceps militaris (L.) Link Beauveria amorpha (Hhn.) +++ 7 ++ 7 +++ Samson & H.C. Evans Mariannaea elegans (Corda) +++ 6 + 6 ++ Samson Tolypocladium geodes W. +++ 6 ++ 6 +++ Gams Arthrobotrys oviformis +++ 7 ++ 7 +++ Soprunov Примечание: * (+) – скудный рост, (++) - слабый рост, (+++) – обильный рост Определение стадий развития грибов разных таксономических групп, оптимальных для закладки их на длительное хранение Хранение культур мицелиальных грибов в коллекции осуществляется дублирова но, несколькими способами. С целью обеспечения долговременного сохранения грибов испытаны разные способы хранения – криоконсервация, сублимационное высушивание, хранение под минеральным маслом, в дистиллированной воде, на ионообменной смоле.
Все способы оказались приемлемыми и используются для хранения грибов.
Исследовали возможность хранения грибов на разных стадиях развития. В процес се работы выяснили, что самой оптимальной для консервации культур является стадия массового спорообразования, когда конидиогенные структуры хорошо сформированы.
Для большинства анаморфных грибов при культивировании их на твёрдых питательных средах она наступает на 10 – 14 сутки. Зрелые конидии успешно сохраняются всеми способами: под минеральным маслом, в дистиллированной воде, в жидком азоте, в лиофилизированном виде, при минус 80 0С и на ионообменной смоле.
Гриб Botrytis cinerea Pers., образующий в чистой культуре склероции, на ионооб менной смоле сохранил жизнеспособность в течение 5 лет. По данным Иванушкиной с соавторами, при хранении на силикагеле грибы рода Botrytis оказались наименее устой чивыми из всех других грибов, и даже при низкотемпературном хранении только 60% изученных штаммов этого рода сохраняли жизнеспособность в течение 10 лет (Ива нушкина и др., 2010).
Энтомопатогенные грибы родов Conidiobolus и Batkoa, образующие покоящиеся споры, а также штаммы, не образовывавшие конидий на всех опробованных средах, лучше всего хранились в стадии мицелия в дистиллированной воде (не менее 1 года).
Humber отмечает, что хранение в воде может быть приемлемо почти для всех микроми цетов, особенно для сохранения энтомофторовых грибов, и для успешного сохранения культур объём воды должен примерно в 40 раз превышать объём закладываемого мате риала (Humber, 1997).
Сравнение метода контактно – сорбционного обезвоживания с общепринятыми методами хранения микромицетов Для криоконсервации микромицетов использовали 10 % водный раствор глицери на с добавлением 5% лактозы в качестве криопротектора и ультрабыстрый режим замо раживания. Все культуры, заложенные на хранение в жидкий азот, оказались жизнеспо собными, независимо от срока хранения.
Для сублимационного высушивания в качестве защитной среды использовали 10 % раствор сахарозы с 1,5 % желатины или 10 % обезжиренное молоко. При проверке жизнеспособности разницы при использовании обеих защитных сред не наблюдали.
Все культуры, образующие конидии, успешно сохраняли в лиофилизированном виде, кроме некоторых, представленных в таблице 2. Не удалось также сохранить этим спо собом энтомофторовые грибы, что соответствует данным других исследователей. Ива нушкина с соавторами отмечают, что грибы рода Conidiobolus и другие виды Entomoph thorales теряют жизнеспособность уже в процессе лиофилизации (Иванушкина и др., 2010). Humber также отмечает, что энтомофторовые грибы плохо сохраняются в лиофи лизированном виде (Humber, 1997).
Контрольные высевы показали, что конидии коллекционных штаммов грибов под вазелиновым маслом успешно хранились в течение 5 лет, что совпадает с литературны ми данными (Humber, 1997). Исключением являлись три штамма S. lamellicola, которые оказались нежизнеспособными после 44 месяцев хранения, и один штамм Conidiobolus sp., не сохранившийся под маслом в течение 1 года.
Достаточно простым в применении является метод хранения культур в высушен ном состоянии на адсорбентах. В качестве носителей и адсорбентов используют почву, кварцевый песок, вату, фильтровальную бумагу и др. Указанные носители плохо под даются стандартизации и, полученные с их использованием, результаты трудно воспро изводимы. Чаще используется КСО с применением стандартных искусственных сор бентов – силикагеля для грибов (Иванушкина и др., 2010) и ионообменной смолы для бактерий. В литературных источниках не найдено упоминаний об использовании ионо обменной смолы для хранения грибов.
В исследовании использовали методику КСО на ионообменной смоле марки КБ4 П2 с высокой влагоёмкостью, разработанную сотрудниками ГНЦ ПМБ для хранения бактериальных штаммов (Пат. SU 1831498 А3, 1991). В ходе работы, на разных сроках хранения (от 5 до 18 лет) проверили жизнеспособность 166 штаммов мицелиальных грибов, относящихся к 56 видам 31 рода. Все исследованные культуры сохранили жиз неспособность в течение всех сроков наблюдения. Исключением являлись энтомофто ровые грибы родов Batkoa и Conidiobolus, а также грибы рода Nectria, образующие мно гоклеточные макроконидии. Для восстановления штаммов после хранения на ионооб менной смоле требовалась разная продолжительность периода регидратации, от одного часа до 14 суток.
В таблице 2 приведены сравнительные данные по проверке жизнеспособности не которых представителей микромицетов. При контрольных высевах культуры, представ ленные в таблице, дольше сохраняли жизнеспособность при хранении на ионообменной смоле, чем высушенные лиофильно.
Таблица 2 - Сравнение жизнеспособности микромицетов, заложенных на хранение двумя способами Способ хранения В лиофилизированном Кол. № На смоле Вид микромицета виде F Срок набл. Наличие Срок набл. Наличие (мес.) роста (мес.) роста Lecanicillium aphanocladii 252 56 90 + Zare & W. Gams Lecanicillium longisporum 224 56 84 + (Petch) Zare & W. Gams Chaetomium globosum 51 86 96 + Kunze Paecilomyces borysthenicus 1063 36 41 + B.A. Borisov & Tarasov Paecilomyces marquandii 266 45 82 + (Massee) S. Hughes Морфолого - культуральные свойства изученных штаммов после хранения на ио нообменной смоле не изменялись. У штаммов микромицетов, обладающих антагони стическими свойствами, после длительного хранения на смоле эти свойства сохраня лись на том же уровне, причем в первом пассаже, тогда как после хранения под мине ральным маслом нередко культуру приходилось пересевать 2-3 раза, чтобы восстано вить исходные свойства. Для культур грибов, не образующих конидии, способ КСО оказался неприемлем. Для хранения мицелия таких культур использовали воду или за мораживание при минус 80 °C. По данным Н. Е. Иванушкиной с соавторами (Ивануш кина и др., 2010), оптимальной для хранения мицелиальных грибов на силикагеле явля ется температура минус 150 °C, однако многие грибы способны храниться и при 4°C.
Ластра с соавторами (Lastra et al., 2002) отмечали, что штаммы Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokn сохраняли жизнеспособность на силикагеле при 4 °C в течение 3, а Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & W. Gams - 12 месяцев. В наших опытах штаммы этих же видов грибов, заложенные на хранение на ионообменной смоле, при той же температуре сохраняли жизнеспособность 120 и 96 месяцев, соответственно.
В коллекции заложены на хранение методом КСО 120 видов мицелиальных гри бов. К преимуществам данного метода следует отнести низкую себестоимость, так как метод не требует применения дорогостоящего оборудования;
возможность хранения при температуре 4 С;
компактность хранящегося материала;
длительность промежу т ков между перезакладками на новые сроки;
удобство при пересылке культур. Простота метода позволяет использовать его в полевых условиях. Продемонстрировали возмож ность применения этого метода для длительного хранения (не менее 3,5 лет) аскоспор рода Cordyceps, заложенных на хранение во время экспедиций.
Анализ коллекции на антибиотическую и москитоцидную активности Антагонистические свойства грибов по отношению к микроорганизмам ме дицинского значения. Грибы являются продуцентами большого количества антибио тически активных веществ. Изучение антибактериальной активности мицелиальных грибов в отношении грамположительных кокков проводили на метициллинрезистент ном штамме S. aureus В - 4849. В результате исследований выявили 120 штаммов 64 ви дов 26 родов грибов – антагонистов, обладающих бактерицидной активностью. Штам мы с зонами подавления 15 мм и выше обнаружены в родах Acrostalagmus, Chaetomium, Clonostachys, Cylindrocarpon, Drechmeria, Fusarium, Gongronella, Hamigera, Humicola, Malbranchea, Metarhizium, Microdochium, Nodulisporium, Oidiodendron, Pestalotiopsis, Plesiospora, Simplicillium, Stilbella, Trichoderma. Высокоактивными по отношению к S.
aureus являются штаммы Trichoderma harzianum Rifai, S. lamellicola, Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Houbraken, Hywel-Jones & Samson.
Пример антагонизма приведен на фотографии (рисунок 7). На рисунке 8 представ лена микрофотография гриба – антагониста Simplicillium lamellicola.
Рисунок 7 - Зоны подавления роста Рисунок 8 - Simplicillium lamellicola, S. aureus грибом Simplicillium среда ММС, 12суток (ув.1000) lamellicola (две повторности) Исследование антагонистической активности мицелиальных грибов в отношении грамотрицательных бактерий проводили на культуре S. marcescens В - 6498 (АТСС 13880), относящейся к группе энтеробактерий. Исследовали 245 штаммов микромице тов – представителей 96 видов 35 родов. В результате выявили 25 культур, относящихся к 21 виду 17 родов: Acremonium, Acrostalagmus, Arachnoderma, Aspergillus, Aureobasi dium, Cosmospora, Cylindrocarpon, Fusarium, Gongronella, Humicola, Lecanicillium, Mi crodochium, Penicillium, Pestalotiopsis, Phoma, Purpureocillium, Trichoderma, обладаю щих антагонистическими свойствами в отношении данного патогена. Результаты ис следований представлены на диаграмме (рисунок 9). Вариация размера зон подавления тест – культуры между штаммами в пределах вида отмечена разными цветами. Почти все штаммы оказались высокоактивными (зоны подавления роста S. marcescens 20 мм и выше). Культуры, подавляющие рост S. marcescens, проявляли также антагонистиче скую активность и в отношении метициллинрезистентного штамма S. aureus, за исклю чением Trichoderma viride Pers., Penicillium sp. и Phoma herbarum Westend..
Диаметр зоны подавления (среднее значение, мм) Min Max Вид Рисунок 9 – Микромицеты - антагонисты S. marcescens. Min – зона подавления тест-культуры штаммом гриба с наименьшей активностью, max - зона подавления тест-культуры штаммом гриба того же вида с наибольшей активностью Культуру B. cereus В - 1447 использовали в качестве тест-объекта для изучения коллекционных штаммов микромицетов на наличие антагонистических свойств в от ношении бацилл. Из исследованных 245 штаммов мицелиальных грибов, выявили на личие активности у 95 культур, которые относятся к 54 видам 25 родов.
Самые высокие зоны подавления роста патогена отмечены у микромицетов в ро дах Aspergillus, Beauveria, Clonostachys, Oedocephalum, Penicillium, Simplicillium, Tricho derma. Исследования Семёновой и Семёнова подтверждают способность гриба T. viride подавлять развитие культуры B. cereus в почвенных моделях бинарных культур (Семё нова, Семёнов, 2012).
В результате исследований не обнаружили чёткой корреляции между наличием у мицелиальных грибов ингибирующих свойств, проявленных в отношении бацилл B. ce reus и B. anthracis.
Для изучения микромицетов на наличие антагонистической активности по отно шению к возбудителю сибирской язвы, в качестве тест – объекта использовали вакцин ный штамм B. anthracis СТИ - 1. Оказалось, что культуры микромицетов проявляли ин гибирующее действие в отношении возбудителя сибирской язвы, подавляя прорастание спор B. anthracis.
Активность штаммов грибов определяли по диаметру зоны подавления роста бак териальной культуры. Диаметр зоны подавления роста от 21 мм и более принимали за высокую активность, 10-20 мм – за умеренную, 8 - 9 мм – за низкую активность. Иссле довали 505 грибных штаммов, относящихся к 225 видам 115 родов. Активными против возбудителя сибирской язвы B. anthracis оказались 105 штаммов, относящихся к 69 ви дам 33 родов. Из них 15 штаммов показали высокую активность, 85 штаммов оказались умеренно активными и 5 штаммов проявили слабую активность. Примеры зон подавле ния представлены на фотографиях (рисунки 10, 11).
Рисунок 10 - Зоны подавления роста Рисунок 11 - Зоны подавления роста B. anthracis грибами: B. anthracis грибом Penicillium 1 - Drechmeria coniospora brevicompactum Dierckx (две повторности) (Drechsler) W. Gams & H.-B. Jansson 2 - Ophiocordyceps variabilis (Petch) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora 3 - Simplicillium sp.
4 - Metarhizium anisoplia (Metschn.) Sorokn Наибольшее количество активных видов и штаммов обнаруживается среди поч венных грибов родов Penicillium (13 видов, 24 штамма) и Trichoderma (7 видов, штаммов). Штаммами с максимальными зонами подавления роста патогена являлись Penicillium chrysogenum Thom (40 мм) и P. vulpinum (Cooke & Massee) Seifert & Samson (30 мм);
Trichoderma koningii Oudem. (40 мм) и T. harzianum (30 мм). Грибы – антагони сты с высокой ингибирующей активностью отмечаются также в родах Acrostalagmus, Aspergillus, Chaetomium, Hamigera и Paecilomyces.
Штаммы с умеренной активностью обнаружены в родах Beauveria, Geotrichum, Metacordyceps, Metarhizium, Ophiocordyceps Drechmeria, Harposporium, Tolypocladium, Simplicillium, Stibella, Lecanicillium, Cosmospora, Fusarium, Nodulisporium, Purpureocil lium, Pestalotiopsis, Polycephalomyces, Pseudallescheria, Rotiferophthora, Scopulariopsis, Stachybotrys, Ulocladium.
Среди микроорганизмов, подавляющих развитие возбудителя туляремии, микро мицеты являются наименее изученной группой. В качестве тест –культуры возбудителя туляремии F. tularensis использовали вакцинный штамм 15/10.
Были исследованы 505 штаммов грибов. Выявили 95 культур, проявляющих анта гонистические свойства в отношении F. tularensis. Из них 41 культура показала высо кую активность, 54 штамма оказались умеренно активными. Штаммы – антагонисты являются представителями 54 видов 27 родов: Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Beauveria, Calcarisporum, Chaetomium, Clonostachys, Cosmospora, Cylindrocarpon, Drechmeria, Fusarium, Hamigera, Humicola, Metarhizium, Microdochium, Nodulisporium, Paecilomyces, Penicillium, Pestalotiopsis, Pseudallescheria, Purpureocillium, Simplicillium, Stibella, Synnematium, Tolypocladium, Trichoderma, и Ulocladium.
Наибольшее количество активных штаммов отмечено в родах Clonostachys ( штаммов), Penicillium (26 штаммов), Trichoderma (13 штаммов), Fusarium (8 штаммов), Aspergillus (7 штаммов) и Metarhizium (6 штаммов). Наиболее высокую активность про являли грибы Clonostachys candelabrum. Диаметр зоны подавления роста патогена со ставил для этих штаммов 42 - 50 мм. Высокоактивными являлись также штаммы B. bas siana (30 мм), Acremonium pteridii W. Gams & J.C. Frankland (30 мм), Calcarisporum ar buscula Preuss (35 мм), Cosmospora berkeleyana (P. Karst.) Grfenhan, Seifert & Schroers (30 мм), Fusarium oxysporum Schltdl. (33 мм), Humicola fuscoatra Traaen (32 мм), Micro dochium bolleyi (R. Sprague) de Hoog et Herm.-Nijh. (30 мм), P. brevicompactum (30 мм), P. chrysogenum (30 мм), P. vulpinum (42 мм), P. lilacinum (32 мм), T. harzianum и T. aspe rellum Samuels, Lieckf. & Nirenberg c одинаковой зоной просветления 40 мм.
Исследование мицелиальных грибов на наличие фунгицидных свойств проводили на культуре C. albicans B – 4845. Изучили 505 штаммов 225 видов 115 родов микроми цетов. Фунгицидные свойства проявляли 120 штаммов, относящихся к 62 видам 24 ро дов. Наиболее высокой антагонистической активностью (диаметр зоны подавления рос та тест – культуры 15 мм и выше) обладали 36 культур 20 видов (диаграмма на рисунке 12). Они относятся к 10 родам микромицетов: Aspergillus, Calcarisporum, Clonostachys, Malbranchea, Mariannaea, Metarhizium, Plesiospora, Trichoderma, Penicillium, Purpureo cillium. Высокоактивные штаммы микромицетов, обладающие сильно выраженными фунгицидными свойствами, можно рассматривать как перспективные для разработки новых противогрибных препаратов.
Диаметр зоны подавления (среднее значение, мм) Max Min Вид Рисунок 12 - Наиболее активные грибы - антагонисты C. albicans. Min – зона подавления тест культуры штаммом гриба с наименьшей активностью, max - зона подавления тест-культуры штаммом гриба того же вида с наибольшей активностью Антагонистические свойства грибов по отношению к фитопатогенным бакте риям. В качестве тест-объектов были выбраны бактериальные культуры, вызывающие мягкие гнили овощей и луковичных P. fluorescens (B - 3785), P. carotovorum ssp. caroto vorum (B - 4966), P. polymixa (B - 1999), а также P. macerans (B - 1410) - патоген льна.
Исследовали 125 штаммов грибов, антагонистическая активность выявлена у 40 штам мов, относящихся к 33 видам 20 родов. Наиболее активными в отношении сразу не скольких возбудителей болезней растений оказались штаммы грибов A. pteridii, Clonostachys candelabrum (Bonord.) Schroers, M. anisopliae, Hamigera avellanea (Thom & Turesson) Stolk & Samson, M. bolleyi, P. vulpinum, P. herbarum и нескольких видов рода Trichoderma.
Москитоцидные свойства мицелиальных грибов. Москитоцидную активность штаммов определяли на личинках второго возраста комара Aedes aegypti, являющегося переносчиком жёлтой лихорадки и других тропических лихорадок. Тестируемые штам мы классифицировали по активности: LT50 24 часа и LC50 10 % разведенного супер натанта на первый день учета - высокоактивные;
LT50 120 часов и LC50 1 50 % от раз веденного супернатанта – умеренно активные. Из исследованных нами 505 штаммов активностью в отношении личинок кровососущих комаров Aedes aegypti обладали штамма 48 родов микромицетов, из них 117 штаммов с высокой активностью и 65 уме ренно активных штаммов. Штаммы с высокой москитоцидной активностью выявлены в родах Aspergillus, Beauveria, Calcarisporium, Chaunopycnis, Chrisosporium, Clonos tachys, Cordyceps, Engyodontium, Evlachovaea, Fusarium, Geomyces, Harposporium, Malbranchea, Metarhizium, Paecilomyces, Polycephalomyces, Penicillium, Simplicillium и других. Москитоцидные свойства некоторых грибов этого списка (в тексте они выделе ны) в литературе не описаны.
Информация о наиболее активных штаммах представлена в таблице 3.
Таблица 3 – Микромицеты с высокой москитоцидной активностью LT50, Штаммы грибов LC50, % сутки Calcarisporium arbuscula Preuss, шт.1 0,5 5,5 ± 0, Chrisosporium keratinophilum D. Frey ex J.W. Carmich., шт.1 0,5 10,0 ± 0, Clonostachys candelabrum (Bonord.) Schroers, шт.1 0,5 8,5 ± 0, Clonostachys rosea (Link) Schroers, Samuels, Seifert & W. Gams, шт.1 0,5 35,0 ± 2, Clonostachys rosea, шт.2 0,6 22,5 ± 1, Clonostachys rosea, шт.3 0,5 20,0 ± 1, Engyodontium album (Limber) de Hoog, шт.1 1,2 * Lecanicillium muscarium (Petch) Zare & W. Gams, шт.1 1,2 * Metarhizium flavoviride W. Gams &Rozsypal;, шт.1 0,5 10,0 ± 0, Isaria farinosa (Holmsk.) Fr., шт.1 0,7 12,0 ± 1, Isaria farinosa, шт.2 1,2 31,0 ± 1, Pestalotiopsis maculans (Corda) Nag Raj, шт.1 1,0 10,5 ± 0, Polycephalomyces sp., шт.1 1,2 * Polycephalomyces sp., шт.2 1,0 * Tolypocladium cylindrosporum W. Gams, шт.1 0,5 10,2 ± 0, Tolypocladium cylindrosporum, шт.2 1,1 * Tolypocladium inflatum W. Gams, шт.1 1,2 10,0 ± 0, Tolypocladium inflatum, шт.2 1,2 10,0 ± 0, Tolipocladium sp., шт.1 0,8 9,0 ± 0, Примечание: * – активность супернатанта культуральной жидкости отсутствует Для энтомопатогенных грибов, представленных в таблице 3, активность суперна танта культуральной жидкости составляла LC50 = 5,5-35,0 %;
активность смывов LT50 = 0,5-1,2 суток. Наивысшей активностью из этого списка обладали грибы C. arbuscula (LC50 = 5,5 %, LT50 = 0,5 суток) и C. candelabrum (LC50 = 8,5 %, LT50 = 0,5 суток). Прове рено действие супернатанта культуральной жидкости обоих штаммов на личинках вто рого возраста четырех видов комаров. Полученные результаты представлены на диа грамме (рисунок 13).
Активность супернатанта К Ж, LC 50, % 15, 13, 12 Clonostachys candelabrum 10 8, 8 6, 5,9 5,5 5, 5,5 Calcarisporium arbuscula Aedes Culex pipiens Culex pipiens Anopheles aegypti molestus messeae Вид комаров Рисунок 13 - Москитоцидная активность грибов C. arbuscula и C. candelabrum в отношении разных видов комаров Активность супернатанта культуральной жидкости гриба C. candelabrum против личинок второго возраста комаров разных видов составляет 8,5 - 15,3 %, гриба C. arbus cula 5,5 - 6,1 %. Полученные результаты свидетельствуют о том, что оба гриба обла дают высокой москитоцидной активностью в отношении личинок различных видов ко маров, включая переносчиков малярии и других опасных возбудителей болезней чело века и теплокровных животных. Эти грибы следует рассматривать как наиболее пер спективные для разработки москитоцидных препаратов метаболитного действия. На рисунках 14 и 15 представлены микрофотографии обеих культур.
Рисунок 14 – C. candelabrum, Рисунок 15 – C. arbuscula, среда ММС, 12 суток (ув.500) среда ММС, 12 суток (ув.1000) Эти штаммы были переданы в группу биохимического анализа лаборатории био инсектицидных препаратов для получения метаболитов. В результате очистки и фрак ционирования полученных из этих грибов экстрактов, из них выделили активные веще ства, обладающие москитоцидной активностью. На основе коллекционных штаммов грибов C. arbuscula и C. candelabrum и их метаболитов, лабораторией инсектицидных биопрепаратов были получены 2 патента Российской Федерации.
В ходе наших исследований было выявлено, что 19 штаммов грибов, относящихся к классу Ascomycetes, обладают одновременно москитоцидными, бактерицидными и фунгицидными свойствами, например, S. lamellicola, C. berkeleyanum, M. flavoviride, P.
lilacinum.
Скринингом на наличие антагонистической и москитоцидной активности было ох вачено 37 % коллекционных штаммов. В результате проведённых исследований выяв лено в отношении каждого из исследованных тест – объектов порядка 100 культур антагонистов. Наличие высокоактивных грибов – антагонистов сибиреязвенных бацилл среди родов почвенных грибов Penicillium, Hamigera, Trichoderma может сыграть нема ловажную роль при разработке методов и средств биологической санации скотомо гильников и оздоровления почвенных территорий, загрязненных возбудителями инфек ционных заболеваний. Поскольку почва является естественной средой обитания грибов, их действие может быть долговременным, а кроме того, экономически выгодным и эко логически целесообразным.
Культуры с высокой бактерицидной, фунгицидной и / или москитоцидной актив ностью (38 штаммов) депонированы в государственную коллекцию «ГКПМ-Оболенск» в качестве потенциальных продуцентов новых биопрепаратов.
148 коллекционных штаммов депонированы в ARSEF (центральную коллекцию энтомопатогенных грибов Департамента Сельского хозяйства США). Перечень приня тых на хранение штаммов приведён в каталоге 2012 г.
ARSEF http://arsef.fpsnl.cornell.edu.
Учитывая огромное биоразнообразие грибов, всё ещё остаётся большое количест во не изученных или слабо изученных видов. Кроме того, разные штаммы одного вида значительно различаются по диаметру зоны подавления тест – культуры, что свиде тельствует о целесообразности изучения широкого набора штаммов в пределах вида и продолжения работы по поиску природных источников биологически активных ве ществ.
ВЫВОДЫ 1. В результате выделения и идентификации природных изолятов микромицетов создана рабочая коллекция, насчитывающая 1336 паспортизованных штаммов мицели альных грибов, относящихся к 333 видам 130 родов, которая является научным потен циалом для поиска потенциальных продуцентов москитоцидных, антибактериальных и фунгицидных препаратов.
2. Разработан состав питательной среды для выделения и культивирования мице лиальных грибов, содержащий набор минеральных солей и органических компонентов.
В отличие от стандартной среды Чапека, она обеспечивает обильный рост вегетативно го мицелия, и в отличие от среды Сабуро, способствует быстрому и обильному споро образованию 320 видов коллекционных культур.
3. Определены стадии развития грибов, оптимальные для закладки их на длитель ное хранение: зрелые конидии и склероции - методами криоконсервации, лиофилизации и КСО на ионообменной смоле (хранятся не менее 5 лет);
вегетативный мицелий - в дистиллированной воде (хранится не менее 1 года).
4. Отработан способ КСО с применением ионообменной смолы, позволяющий без использования дорогостоящего технологического оборудования и высоких энергетиче ских затрат, хранить 120 видов грибных культур на протяжении от 5 до 18 лет (срок на блюдения). Данный метод, наряду с хранением на силикагеле, может быть применен для длительного сохранения многих видов мицелиальных грибов.
5. Выявлены 182 штамма 48 родов микромицетов, проявляющие москитоцидную активность. Впервые установлено наличие москитоцидной активности у представите лей 8 родов.
6. Обнаружена фунгицидная активность 120 штаммов грибов в отношении широко распространенного патогена C. albicans.
7. Установлена антагонистическая активность 202 штаммов, относящихся к видам 47 родов, обладающих способностью подавлять рост одного или нескольких ви дов бактериальных патогенов, в том числе 105 штаммов грибов – антагонистов B. anth racis, 95 культур – антагонистов F. tularensis, 40 штаммов- антагонистов фитопатоге нов.
По теме диссертации опубликованы следующие работы а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Юскевич В.В., Володина Л.И., Александрова А.В., Лиховидов В.Е., Баранов А.М.
1.
Применение контактно-сорбционного обезвоживания для длительного хранения микромицетов разных таксономических групп // Микология и фитопатология. 2011. - Т. 45, вып. 6. - С. 535-540.
б) тезисы научных конференций Володина Л.И., Лиховидов В.Е., Баранов A.M., Амельченко В.В., Юскевич В.В.
2.
Создание и хранение коллекции штаммов микромицетов – потенциальных проду центов биологически активных веществ с инсектицидными и фармакологическими свойствами // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт - Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств – участников «Содружества Не зависимых Государств»: Материалы VII Межгосударственной научно – практиче ской конференции государств – участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская область). – Оболенск, 2006. – С. 93-94.
Володина Л.И., Юскевич В.В., Амельченко В.В., Баранов А.М., Лиховидов В.Е., 3.
Исангалин Ф.Ш., Александрова А.В. Формирование коллекции штаммов микроми цетов, выделенных, преимущественно, из насекомых в горных лесных экосистемах Западного Кавказа // Горные экосистемы и их компоненты. Труды международной конференции. Часть 1. М.: Т-во научных изданий КМК. – 2007. - С.143-148.
Лиховидов В.Е., Володина Л.И., Исангалин Ф.Ш., Юскевич В.В., Леднев Г.Р., 4.
Александрова А.В., Ивашов А.В. Энтомопатогенные грибы лесов горного Крыма // Экология горных экосистем: Материалы конференции (13-18 сентября 2007 г., Нальчик). Часть 2. М.: Т-во научных изданий КМК. – 2007. - С. 114-119.
5. Лиховидов В.Е., Володина Л.И., Наумов А.Н., Юскевич В.В., Асланян Е.М., Бы строва Е.В., Баранов А.М., Александрова А.В., Борисов Б.А. Энтомофильные гри бы горных экосистем южных территорий Приморья и Курил // Почвы и расти тельный мир гонных территорий. Труды международной конференции. М.: Т-во научных изданий КМК. – 2009. - С. 210 – 216.
Володина Л.И., Лиховидов В.Е., Борисов Б.А., Юскевич В.В., Наумов А.Н., 6.
Амельченко В.В., Асланян Е.М., Быстрова Е.В., Исангалин Ф. Ш., Баранов А.М., Александрова А.В., Леднёв Г.Р., Глупов В.В. Культуры возбудителей микозов бес позвоночных в коллекции в коллекции ГНЦ ПМБ и изучение их в качестве потен циальных продуцентов биологически активных веществ // Иммунопатология, Ал лергология, Инфектология. - 2009. - № 1. - С. 52-53.
7. Борисов Б.А., Володина Л.И., Лиховидов В.Е., Асташкин Е.И., Ковалев Ю.Н., Пачкунов Д.М., Юскевич В.В., Баранов А.М., Тарасов К.Л., Александрова А.В.
Энтомопатогенные грибы анаморфного рода Evlachovaea: мировые данные и но вые результаты оригинальных исследований // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2009. - № 1. - С. 51-52.
8. Лиховидов В.Е., Володина Л.И., Наумов А.Н., Быстрова Е.В., Юскевич В.В. На учный потенциал коллекции «ГКПМ – Оболенск» для разработки новых биопес тицидов и биомоскитоцидов // Интегрированная защита растений: стратегия и тактика: Мат. междунар. науч. – практ. конф. ( Минск, 5 – 8 июля 2011). - Несвиж, 2011. - С. 288-290.
9. Юскевич В.В., Володина Л.И., Александрова А.В., Быстрова Е.В., Лиховидов В.Е., Дятлов И.А. Создание и анализ коллекции микромицетов на основе энтомопатоген ных грибов и микроорганизмов – антагонистов возбудителей болезней с/х культур // Материалы Международного научного симпозиума «Защита растений: проблемы и перспективы» ( Кишинёв, 30 – 31 октября 2012). - Кишинёв, 2012. - С. 293 - 296.
10. Юскевич В.В., Дятлов И.А., Володина Л.И., Александрова А.В., Быстрова Е.В., Лиховидов В.Е. Создание и анализ коллекции микроскопических грибов – антаго нистов патогенных микроорганизмов // Современная микология в России. М.: На циональная академия микологии. – 2012. - Т. 3. - С. 401 - 402.
11. Лиховидов В.Е., Володина Л.И., Юскевич В.В., Шишкова Н.А., Маринин Л.И., Быстрова Е.В., Наумов А.Н. Поиск штаммов микромицетов, обладающих бактери цидной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы // Современная ми кология в России. М.: Национальная академия микологии. – 2012. - Т. 3. - С. 381.
Благодарности Приношу глубокую благодарность моим научным руководителям – член-корр.
РАМН, д.м.н., проф. Дятлову И. А. и к.б.н. Володиной Л. И. за осуществление руково дства и оказание методической помощи в проведении исследовательских работ, а также к.б.н. Лиховидову В. Е. за общую организацию и координацию работы.
Выражаю искреннюю признательность к.б.н. Александровой А. В. (МГУ) за пре доставленные образцы почвенных изолятов и участие в идентификации;
Борисову Б. А.
(ИПЭЭ РАН), к.б.н. Леднёву Г. Р. (ВИЗР) и д.б.н. Глупову В. В. (ИСиЭЖ СО РАН) за помощь в сборе, идентификации и фотографировании полевых образцов.
Благодарю сотрудников к.б.н. Асташкина Е. И. и к.б.н. Пачкунова Д. М. за участие в идентификации изолятов;
Быстрову Е. В., к.б.н. Наумова А. Н., Асланян Е. М., Коро бову Н. А., к.б.н Мокриевича А. Н., к.м.н. Маринина Л. И., к.б.н. Шишкову Н. А., д.б.н.
Павлова В. М., Вахрамееву Г. М. за участие в совместных исследованиях по антагониз му грибов.
Глубоко признательна ведущей организации, официальным оппонентам и всем ре цензентам настоящей работы за высказанные замечания, вопросы и рекомендации.