Молекулярные механизмы взаимодействия оксида азота(ii) и низкоинтенсивного лазерного и светодиодного излучения с митохондриями биофизика –
На правах рукописи
Буравлев Евгений Александрович Молекулярные механизмы взаимодействия оксида азота(II) и низкоинтенсивного лазерного и светодиодного излучения с митохондриями Биофизика – 03.01.02
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Осипов А.Н.
Официальные оппоненты:
Потапенко Александр Яковлевич – доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, заведующий кафедрой физики и математики.
Ванин Анатолий Федорович – доктор биологических наук, профессор, зав.
лабораторией ФГБУН Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.
Ведущая организация:
НИИ Экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава РФ
Защита состоится «_»2013 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 при ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России по адресу: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России.
Автореферат разослан «»20 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Мурина М.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования.
Среди многочисленных реакций оксида азота(II) наиболее важными являются реакции с кислородом, SH-группами и металлами переменной валентности, которые входят в состав гемовых и негемовых белков. На молекулярном уровне физиологические эффекты оксида азота(II) реализуются, обычно, через взаимодействие с гемовыми и негемовыми белками. Например, известно, что когда оксид азота (II) образует нитрозильный комплекс с гемом гуанилат-циклазы, то наблюдается увеличение каталитической активности фермента. В результате происходит расслабление гладкой мускулатуры сосудов и увеличивается кровоснабжение ткани. Не менее важной реакцией оксида азота(II) в клетке/организме является реакция с белками электрон-транспортной цепи митохондрий, среди которых важно упомянуть цитохром с, цитохром с оксидазу и негемовые железо-серные белки. Оксид азота(II) ингибирует их каталитическую активность, снижает дыхание митохондрий и синтез АТФ.
Согласно теории о механизмах действия низкоинтенсивного лазерного излучения видимого диапазона, предложенной Ю.А. Владимировым лазерное излучение вызывает разрушение нитрозильных комплексов. В ряде патофизиологических процессов, протекающих с участием оксида азота(II), нитрозильные комплексы белков могут играть важную роль. Это касается состояний, связанных с нарушениями кровообращения – ишемия, гипертензия, шок.
При наличии в организме большого количества бактериальных липополисахаридов проявляется состояние известное как эндотоксический шок. В этом состоянии в организме образуется значительное количество оксида азота(II), который оказывает заметное воздействие на функции белков и ферментов. Например, низкие (наномолярные) концентрации оксида азота(II) способны ингибировать цитохром с оксидазу. Высокие концентрации NO ингибируют дыхательную цепь митохондрий из-за нитрозилирования тиолов и блокирования железо-серных центров в митохондриальных дыхательных комплексах. Также в результате взаимодействия с кислородом в процессе дыхания митохондрий оксид азота(II) способен образовывать пероксинитрит. Пероксинитрит вызывает необратимое повреждение, как белковых комплексов дыхательной цепи, так и мембран митохондрий. Поэтому изучение роли оксида азота(II) в регуляции дыхания митохондрий имеет важное значение для понимания механизмов протекания этого патологического состояния и может оказать влияние на разработку методов его диагностики и лечения. Важным свойством нитрозильных комплексов является их фоточувствительность. В работах, проведенных в нашей лаборатории (Mittermayr, 2007), было показано, что гемоглобин и цитохром с могут распадаться при действии лазерного излучения с длиной волны 442 нм.
Цель и задачи исследования Основной целью нашей работы является исследование влияния лазерного и светодиодного излучения и оксида азота(II) на функционирование митохондрий.
Для достижения этой цели были поставлены следующие актуальные задачи:
Изучить воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения (442 нм) и 1.
гемоглобина на нитрозильные комплексы негемового железа митохондрий.
Изучить влияние лазерного и светодиодного излучения на функционирование 2.
митохондрий в норме и при воздействии экзогенного NO.
Изучить влияние лазерного и светодиодного излучения на функционирование 3.
митохондрий в норме и при воздействии эндогенного NO, образующегося в организме на модели эндотоксического шока.
Изучить влияние степени восстановления митохондриальных переносчиков в 4.
норме и при воздействии эндогенного NO, образующегося в организме на модели эндотоксического шока.
Исследование роли эндогенных порфиринов в механизме действия 5.
низкоинтенсивного лазерного излучения видимого диапазона (632,8 нм) на свободно-радикальные процессы в крови крыс при действии на организм липополисахаридов.
Научная новизна исследования Результаты данного исследования о действии лазерного и светодиодного излучения на митохондрии, которые были подвергнуты воздействию эндогенного и экзогенного оксида азота(II), вносят вклад в фундаментальную науку. При проведении исследования было показано образование негемовых нитрозильных комплексов в митохондриях животных, подвергавшихся действию липополисахарида, в присутствии оксида азота(II) и восстановителя;
измерены параметры дыхания митохондрий при облучении (442, 532 и 650 нм, дозами 3- Дж/см2) для контрольной группы и группы с введением липополисахаридов;
измерены зависимости супероксиддисмутазная активности плазмы крови крыс и функциональной активности лейкоцитов от содержания эндогенных порфиринов в плазме крови при облучении.
Практическое значение работы Результаты данного исследования о действии лазерного и светодиодного излучения на митохондрии, подвергавшиеся воздействию эндогенного и экзогенного оксида азота(II), вносят вклад в фундаментальную науку. Полученные в ходе работы результаты, при дальнейшем изучении, могу быть использованы в клинической практике для лечения и диагностики такого патологического состояния, как эндотоксический шок.
Положения, выносимые на защиту В результате действия лазерного облучения с длиной волны 442 нм на 1.
митохондрии в присутствии NO происходит распад нитрозильных комплексов негемового железа(II). Процесс транс-нитрозилирования с помощью гемоглобина можно рассматривать как альтернативный путь разрушения этих нитрозильных комплексов.
Облучение митохондрий лазерным и светодиодным светом (442, 532 и 650 нм) 2.
вызывает снижение дыхательного контроля. При облучении митохондрий лазером с длиной волны 442 нм дозами 3-12 Дж/см2 наблюдется увеличение скорости дыхания в состоянии V3. При облучении синим светом митохондрий, ингибированных оксидом азота(II), происходит частичное восстановление скорости дыхания V3 и дыхательного контроля. Эти данные свидетельствуют о том, что лазерное излучение 442 нм вызывает разрушение нитрозильных комплексов дыхательной цепи митохондрий (образуемых экзогенным или эндогенным NO). В случае с красным излучением наблюдается снижение скорости дыхание митохондрий в состоянии V3, что может быть связано с фотодинамическим повреждением митохондрий.
Облучение митохондрий животных, подвергавшихся действию ЛПС, 3.
лазерным и светодиодным светом (442, 532 и 650 нм) вызывает снижение дыхательного контроля. При этом при облучении синим светом в дозе 6 Дж/см увеличивается скорость дыхания митохондрий в состоянии V3. В необлученных митохондриях коэффициент дыхательного контроля ниже, чем в контрольной группе. Это, возможно, связано с увеличением скорости дыхания митохондрий в состоянии V3 по сравнению с контрольной группой.
Методом ЭПР показано образование нитрозильных комплексов негемового 4.
железа в митохондриях от животных, подвергавшихся действию ЛПС, в присутствии NO и восстановителя, который восстанавливает железо(III) до железа(II) в железо-сернистых центрах дыхательной цепи митохондрий.
Показано, что изменение супероксиддисмутазной активности плазмы 5.
крови и продукции радикалов полиморфноядерными лейкоцитами являются наиболее чувствительными показателями при изучении эффектов низкоинтенсивного лазерного излучения красного диапазона(632,8 нм) в норме и в условиях экспериментального эндотоксического шока от концентрации эндогенных порфиринов в плазме крови.
Внедрение результатов Результаты исследования вошли в программу обучения студентов медико биологического факультета РНИМУ им Н.И. Пирогова и факультета фундаментальной медицины МГУ им М.В. Ломоносова.
Публикации По теме диссертации опубликовано 10 печатных научных работ, в том числе статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личное участие автора Автор проделал значительный экспериментальный и аналитический объем работы. Также им были освоены методы выделения митохондрий и клеток крови, измерение биохимического потребления кислорода и мембранного потенциала митохондрий, измерения ЭПР-спектров, а так же хемолюминесцентные, флуоресцентные и спектрофотометрические методы анализа. Лично автором проведена обработка и статистический анализ результатов.
Апробация работы Материалы работы были представлены на: национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2011);
международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011 и 2012);
международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, Беларусь, 2012);
ежегодной конференции НИИ Физико-химической медицины (Москва, 2010), международном конгрессе «Лазер Хельсинки» (Хельсинки, Финляндия, 2012), IV-м съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012). Диссертационная работа апробирована 31 августа 2012 г.
на совместно заседании кафедры общей и медицинской биофизики МБФ ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Миздравсоцразвития России и отдела медицинской биофизики НИИ ФПБИ.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 126 страницах, содержит 32 рисунка, 3 таблицы и схем;
состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов» и выводов. Список литературы включает 124 наименования.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Выделение митохондрий из гепатоцитов В работе использовали самцов белых крыс Wistar (Филиал «Андреевка» НЦБМТ РАМН, Россия) в возрасте 3-4 месяца и массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария.
Митохондрии выделяли из печени крыс (Storrie, 1990). Все манипуляции проводили при температуре 0-4 °C на льду. Образец печени массой около 4 г промывали в буфере. Затем образец гомогенизировали в 40 мл этого же буфера, содержащем 1 мг/мл дилипидированного БСА. Полученную суспензию центрифугировали при 600 g 5 минут. Надосадочную жидкость отделяли и центрифугировали при 11000 g 10 минут. После удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспензировали в 40 мл буфера выделения и центрифугировали при 600 g и при 11000 g, как описано выше. После последнего центрифугирования осадок ресуспензировали в буфере хранения при температуре 0-4 °C (на льду).
Модель экспериментального эндотоксического шока Использовали стандартную модель получения эндотоксического шока (Kozlov, 2006). Для этого крысам вводили липополисахарид В (ЛПС) из расчета 25 и мг/кг. В контрольных группах животным вводили эквивалентное количество физиологического раствора. Все инъекции делали внутрибрюшинно сразу после первого забора крови или за 4 ч. до выделения митохондрий.
Регистрация ЭПР спектров митохондрий Для регистрации спектров ЭПР использовали ЭПР-спектрометр Varian Е (США). Параметры измерения: центр поля – 0,33 Тл;
диапазон сканирования – мТл;
постоянная времени– 3,0 с;
амплитуда модуляции – 4•10-4 Тл;
время записи – мин;
частота 9,44 МГц;
мощность – 20 мВт.
Суспензию митохондрий объемом 250 мкл замораживали в жидком азоте в виде стержня диаметром 4 мм и длиной 4 см. Полученный образец быстро помещали в сосуд Дьюара. Образец охлаждали жидким азотом. Измерения проводили при температуре 77 К.
Электрохимические измерения В электрохимическую ячейку помещали 1 мл суспензии митохондрий в буферном растворе (рН 7,5), ячейку закрывали и при постоянном перемешивании регистрировали изменение концентрации кислорода во времени. В качестве субстратов дыхания митохондрий использовали сукцинат натрия и АДФ в конечной концентрации 10 и 0,2 мМ соответственно. Для измерения в присутствии ионов кальция в ячейку добавляли раствор CaCl2 в конечной концентрации 200 мкМ, при этом АДФ не добавлялся.
Измерение флуоресценции эндогенных порфиринов в плазме крови крыс Измерения флуоресценции проводили с помощью оптического спектрометра FS-003V (ООО «Кластер», Россия), позволяющего проводить дистанционные измерения оптических спектров с поверхности или из объема различных материалов, включая спектры отражения и флуоресценции биологических объектов.
Облучение образцов Облучение проводили в пластиковой пробирке (2 мл) при постоянном перемешивании, на расстоянии 20 см от источника излучения до образца. Для облучения использовали He-Cd лазер (442 нм), твердотельный лазер (532 нм) и лазерный диод (650 нм).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента. Результаты приведены в виде средних арифметических значений, их разброс описывали среднеквадратической ошибкой средней величины.
РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Оценка сродства оксида азота(II) к гемоглобину и митохондриальным комплексам переноса электронов Ранее в наших работах (Dungel, 2008) было показано, что нитрозильные комплексы гемового железа могут подвергаться фотолизу при действии на них лазерного излучения. Результатом действия лазерного облучения 442 нм (в дозах 24, 60 и 120 Дж/см2) или добавления гемоглобина к митохондриям, содержащим NO, является фотолиз нитрозильных комплексов негемового железа(II) в митохондриях.
В результате добавления гемоглобина к нитрозильным комплексам FeS-белков митохондрий происходит процесс транс-нитрозилирования (рис. 1). Этот процесс можно рассматривать как альтернативный путь разрушения этих нитрозильных комплексов.
Рис. 1. Влияние гемоглобина на ЭПР сигнал нитрозильных комплексов в митохондриях в присутствии оксида азота(II).
Мит+NO АДФ Гемоглобин Дыхание митохондрий АДФ ингибировано NO ДК = 3, ДК = 1,0 Восстановление дыхания митохондрий отсутствует Рис. 2. Влияние восстановленного гемоглобина на поглощение кислорода митохондриями в присутствии NO. Можно видеть, что добавление гемоглобина усиливает процесс дыхания митохондрий.
Оксид азота(II) ингибирует работу дыхательной цепи митохондрий и снижает коэффициент дыхательного контроля до 1. После добавления к митохондриям гемоглобина происходит восстановление уровня дыхания до прежнего уровня.
Коэффициент дыхательного контроля становится 3,7 (в контрольной группе – 4,0).
Облучение лазером с длиной волны 442 нм и дозой 30 Дж/см2 на систему NO митоходрии-гемоглобин значимого эффекта не дало. Коэффициент дыхательного контроля митохондрий при этом увеличился до 3,8 (рис. 2). Из приведенных результатов можно предположить, что гемоглобин оказывает положительное воздействие на функционирование митохондрий в присутствии NO. Вероятно, большее сродство NO к гемоглобину способствует его переносу от митохондрий к гему и образованию нитрозогемоглобина. Можно сделать предположение, что происходит перенос оксида азота(II) от S-нитрозотиолов I и/или II комплексов митохондрий к гему эритроцитов. Можно также предположить, что гем имеет большее сродство к оксиду азота(II), чем SH-группы в митохондриях.
2. Влияние оксида азота(II) и лазерного излучения на митохондрии в условиях гипоксии Известно, что негемовые нитрозильные комплексы с SH-группами образуются тогда, когда железо в железо-сернистых центра дыхательных комплексов митохондрий находится в восстановленном состоянии (Brown, 2004). Чтобы их увидеть, мы использовали восстановители и самопроизвольное восстановление переносчиков электронов в дыхательной цепи митохондрий в отсутствии терминального кислорода.
Методом ЭПР показано образование негемовых нитрозильных комплексов в митохондриях от животных, при действии ЛПС, в присутствии NO и восстановителя, который восстанавливает железо(III) до железа(II) в железо сернистых центрах дыхательной цепи митохондрий (рис. 8). В отсутствии восстановителя/гипоксии образование нитрозильных комплексов не происходит, видимо, из-за большого содержания железа(III). В митохондриях контрольной группы нитрозильные комплексы образовывались как в присутствии восстановителя/гипоксии, так и без него. В контрольной группе сигнал ЭПР о наличии нитрозильных комплексов в образцах интактных митохондрий отсутствует.
При добавлении к интактным митохондриям 3 мкМ раствора оксида азота(II) на ЭПР спектре (рис. 3) появляется несимметричный сигнал с центром g = 2,03 и шириной около 9 мТл (Boese, 1995). Таким образом, можно сделать предположение, что данный сигнал принадлежит негемовому нитрозильному комплексу железа(II).
Возможно, что не вс железо в образце митохондрий имело степень окисление II+.
Поэтому, для того чтобы увеличить его содержание и, как следствие, увеличить количество образующихся нитрозильных комплексов, использовали восстановители дитионит натрия и L-аскорбиновую кислоту. В ЭПР спектре данного образца при добавлении такого же количества оксида азота(II) происходит увеличение интенсивности сигнала и, как следствие, содержания нитрозильных комплексов (рис.3).
Для того чтобы выяснить существует ли такой процесс in vivo, нами было Рис. 3. Влияние восстановителя Na2S2O4 на митохондрии печени крыс контрольной группы и при гипоксических условиях.
предложено создать для митохондрий условия с минимальным содержанием кислорода, которые можно трактовать как гипоксические условия. Для этого к образцу митохондрий добавляли субстрат для дыхания(сукцинат натрия) и АДФ в конечных концентрациях 10 и 0,6 мМ, соответственно.
В данных условиях дыхательные комплексы митохондрий вероятно должны содержать в основном только железо(II). При добавлении к таким митохондриям NO происходило появление на спектре сигнала негемовых нитрозильных комплексов железа(II) с такими же параметрами как описано выше. Интенсивность сигнала ЭПР нитрозильных комплексов митохондрий при действии на них NO в результате добавления дитионита натрия и при гипоксических условиях была примерно Рис. 4. Влияние лазерного облучения 442 нм Рис. 5. Интенсивности сигналов ЭПР на митохондрии в условиях гипоксии. митохондрий в условиях гипоксии.
одинакова.
На рис. 4 приведены ЭПР спектры, полученные при проведении данного эксперимента. На них видно, что интактные митохондрии не имеют сигнала ЭПР нитрозильных комплексов, при добавлении NO (3 мкМ) происходит появление сигнала с центром g = 2,03 и шириной 9 мТл. Видно, что интенсивность сигнала уменьшается с увеличением дозы облучения. Облучение дозой 24 Дж/см уменьшает интенсивность сигнала на 20%, доза 60 Дж/см2 – на 40%, а максимальная доза облучения сводит интенсивность сигнала почти до минимума (рис. 5).
Таким образом, можно предположить, что негемовые нитрозильные комплексы железа в дыхательной цепи митохондрий являются фоточувствительными и их содержание уменьшается при действии на них лазерного света с длиной волны нм с увеличение дозы облучения.
3. Влияние лазерного излучения и оксида азота(II) на скорость дыхания и мембранный потенциал митохондрий Действие оксида азота(II) на дыхательную цепь митохондрий подробно описано в обзоре (Brown, 1999). Наномолярные концентрации NO избирательно ингибируют цитохром с оксидазу, конкурируя с кислородом, и ингибирование полностью обратимо при удалении NO. Более высокие концентрации NO могут ингибировать другие комплексы в дыхательной цепи, возможно, нитрозилируя или окисляя белковые тиоловые группы и ингибируя железо из железосерных центров.
Рис. 6. Кинетические кривые потребления кислорода митохондриями контрольной группы (А) после лазерного облучения митохондрий при = 442 нм (1), = 532 нм (2), = 650 нм (3) и без облучения (4);
зависимости скорости потребления кислорода митохондрий в состоянии V3 в присутствии сукцината натрия (Б), скорости потребления кислорода в состоянии V4 в присутствии сукцината натрия и АДФ (В) и коэффициента дыхательного контроля (Г) контрольной группы крыс от дозы лазерного облучения при = 442 нм (1), = 532 нм (2) и = 650 нм (3) в % от необлученных митохондрий. * - отмечены точки, отличающиеся от контрольного значения ( = 0,05).
Пероксинитрит проводит к необратимому ингибированию дыхания митохондрий и разрушает различные компоненты митохондрий окислительными реакциями. Пероксинитрит разрушает или ингибирует митохондриальные комплексы I, II, IV и АТФ-синтазу, аконитазу, креатин киназу, мембрану митохондрии, митохондриальную ДНК, СОД, и индуцирует набухание митохондрии, деполяризацию, выход кальция и проницаемость. Ингибирование NO цитохром оксидазы может участвовать в физиологическом регулировании скорости дыхания, о чем свидетельствует открытие возможности регулирования клеточного дыхания синтезом NO отдельными клетками, и открытие in vivo стимуляции ткани и потребления кислорода всем телом ингибированием NO синтазы. Недавнее открытие того, что митохондрии могут содержать NO синтазы и производить определенное количество NO для регулирования собственного дыхания, также может наводить на мысль, что это регулирование может быть важным для физиологического регулирования энергетического обмена. В 80-х годах была показана светочувствительность нитрозильных комплексов цитохром с оксидазы при температуре жидкого азота (Boelens, 1983).
Согласно данным, полученным в нашей лаборатории (Борисенко, 2002), действие излучения в сине-зеленой области спектра направлено на фотолиз нитрозильных комплексов цитохрома с. В нашей работе была исследована светочувствительность митохондрий, дыхательная цепь которых ингибирована оксидом азота. Концентрации оксида азота и время инкубации были выбраны нМ (низкая, близкая к физиологической концентрации NO 200 нМ) и время инкубации 30 с.
Добавление оксида азота(II) в концентрации 300 нм к митохондриям вызывала падение скорости V3 и коэффициента дыхательного контроля примерно в два раза.
При этом в данных условиях облучение только в случае синего лазера приводило к статистически значимому росту скорости V3, а также росту коэффициента дыхательного контроля.
Зеленый (532 нм) и красный (650 нм) источники света подобными эффектами не обладали (рис 6). Вероятно действие лазера с длинной волны 442 нм связано с разрушением в дыхательной цепи митохондрий нитрозильных комплексов. Но определить какие именно комплексы в дыхательной цепи чувствительны к излучению довольно затруднительно.
4. Влияние лазерного излучения на функционирование митохондрий при экспериментальном эндотоксическом шоке На рис. 7А приведены кинетические кривые потребления кислорода митохондриями группы животных, которым вводили липополисахарид. Видно, что воздействие лазерного и светодиодного облучения влияет на скорость потребления кислорода митохондриями.
Можно видеть, что при экспериментальном эндотоксическом шоке наблюдается увеличение скорости потребления кислорода митохондриями в состоянии V4 для всех использованных источников облучения по сравнению с необлученными образцами примерно на 40% (рис. 7Б). Максимальный эффект Рис. 7. Кинетические кривые потребления кислорода митохондриями группы крыс с введенным ЛПС (А) после лазерного облучения митохондрий при = 442 нм (1), = 532 нм (2), = 650 нм (3) и без облучения (4) ;
зависимости скорости потребления кислорода митохондрий в состоянии V3 в присутствии сукцината натрия (Б), скорости потребления кислорода в состоянии V4 в присутствии сукцината натрия и АДФ (В) и коэффициента дыхательного контроля (Г) группы крыс с введенным ЛПС от дозы лазерного облучения при = 442 нм (1), = 532 нм (2) и = 650 нм (3) в % от необлученных митохондрий. * отмечены точки, отличающиеся от контрольного значения ( = 0,05).
наблюдается при облучении синим и зеленым лазерами с длиной волны = 442 нм (при дозе 6 Дж/см2) и = 532 нм (при дозе 12 Дж/см2).
В результате облучения длиной волны 442 нм происходит постепенное увеличение скорости V3, которое достигает максимума (132%) для дозы 6 Дж/см2, после чего происходит снижение.
В случае облучения лазером с длиной волны 532 нм обнаружены статистически значимые отклонения от контроля V3 и наблюдается постепенное снижение примерно на 10%. При действии красного света с длиной волны 650 нм на митохондрии при дозе облучения 3 Дж/см2 заметных отличий от контроля найдено не было, а при дозе облучения 6 Дж/см2 происходит снижение скорости дыхания V до 75%.
При облучении синим лазером с длиной волны 442 нм в дозе 6 Дж/см максимум достигал 130% после чего происходило резкое снижение (до 110%) потребления кислорода в этом состоянии (рис. 7В). Для других длин волн подобного выраженного максимума выявлено не было. При действии лазерного света с длиной волны 532 нм статистически значимые отличия наблюдались при максимальной дозе облучения ( Дж/см2). При воздействии лазерного света с длиной волны 650 нм в целом картина та же, что и в экспериментах без введения ЛПС. Снижение скорости V3 происходило на 20-25%.
Рис. 8. Влияние восстановителя Na2S2O4 на На рис. 7Г показана зависимость митохондрии печени крыс, подвергавшихся коэффициента дыхательного контроля действию ЛПС.
митохондрий печени группы крыс с введенным ЛПС от дозы облучения.
При воздействии ЛПС на организм и без облучения происходило снижение коэффициента дыхательного контроля митохондрий в среднем на 30%.
Дыхательный контроль таких митохондрий в среднем составлял 2,5. Коэффициент дыхательного контроля снижался при облучении всеми длинами волн, как и в контрольной группе. При этом наибольшее снижение происходило при облучении длинами волн = 532 нм и = 650 нм примерно на 25%.
Из ЭПР спектров митохондрий крыс, подвергавшихся действию ЛПС, видно, что не происходит появления сигнала нитрозильных комплексов в присутствии оксида азота(II). Этот сигнал появляется только после инкубации данных митохондрий с восстановителем (рис. 8). Это может свидетельствовать о том, что в митохондриях крыс, подвергавшихся действию ЛПС, в дыхательных комплексах в основном содержится железо(III).
5. Воздействие лазерного излучения красного диапазона (632,8 нм) на свободно-радикальные процессы в крови крыс Наиболее чувствительным параметром к воздействию света стала супероксиддисмутазная активность (АСОД) плазмы крови крыс (рис. 9, кривые СОД) (Мачнева, 2008). В контрольной группе животных без введения ЛПС и без облучения (рис. 9, кривая СОД) АСОД практически не изменялась при любом количестве эндогенных порфиринов(ЭП) в плазме крови. В группе с введением ЛПС без облучения наблюдали некоторое увеличение супероксиддисмутазной активности (в среднем на 26%), которое, однако, тоже не зависело от содержания этих порфиринов. Такое увеличение исследуемого параметра, вероятно, является проявлением защитных механизмов организма в ответ на бактериальную инфекцию, например, это может являться компенсацией снижения активности лейкоцитов при инициировании эндотоксического шока (рис. 9, кривая ХЛ).
Облучение животных низкоинтенсивным лазерном светом в красном диапазоне существенно влияло на АСОД (рис. 9) и эффекты зависели от количества ЭП. Собственно видимое излучение (рис. 9) приводило в большинстве случаев (содержание ЭП: от 57,4 до 91,8 нМ) к увеличению СОД активности плазмы (в среднем на 153%). Однако при минимальном (51 нМ) и максимальном (105,9 нМ) количестве эндогенных порфиринов существенного влияния света на исследуемый параметр не наблюдали. Данные результаты проявляют возможную роль ЭП как первичных акцепторов квантов излучения в цепи лазер-индуцированного изменения СОД активности плазмы крови. Это еще в большей степени подтверждается при изучении эффектов видимого света в красном диапазоне на СОД активность в условиях эндотоксического шока (рис. 9, кривая СОД). Воздействие лазерного излучения было более выражено и существенно зависело от содержания ЭП. При минимальных (44,6 и 52,0 нМ) и максимальной (109,7 нМ) концентрациях эндогенных порфиринов наблюдали угнетение СОД активности плазмы (в среднем на 29%). А в интервале содержания ЭП от 57,4 до 90,6 нМ лазерное излучение увеличивало исследуемый параметр (в среднем на 138%).
При исследовании лазер-индуцированных изменений функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов крови крыс (рис. 9, кривые ХЛ) обнаружили аналогичные зависимости, которые, однако, были еще более выражены в условиях эндотоксического шока. Необходимо отметить, что в контрольных группах (рис. 9, кривые ХЛ) существенного изменения активности лейкоцитов не происходило вне зависимости от содержания ЭП. В группе, где моделировали экспериментальный эндотоксический шок, наблюдали небольшое снижение данного показателя, что соответствует данным литературы и является угнетением активности лейкоцитов в первые часы развития шоковой реакции (Pascual, 1997).
Лазерное излучение, как в случае изменений СОД активности, приводило к активации лейкоцитов в среднем диапазоне содержания ЭП и к угнетению исследуемого показателя при минимальных или максимальных значениях концентрации эндогенных порфиринов. Так в группе без введения ЛПС (рис. 9, кривая ХЛ) в интервале ЭП от 57,4 до 91,8 нМ активность лейкоцитов в ответ на облучение возрастала в среднем на 82%, а в группе с введением ЛПС (рис. 9, кривая ХЛ) в интервале концентраций эндогенных порфиринов от 57,4 до 90,6 нМ – на 221%. При минимальных и максимальных концентрациях ЭП хемилюминесцентный ответ изменялся несущественно или снижался.
В следующей серии экспериментов мы проводили измерение процессов перекисного окисления в липидах мембран эритроцитов крыс. Для этого мы использовали, метод основанный на измерении флуоресценции цис-паринариевой кислоты (Steenbergen, 1997). В контрольных группах через 4 часа после начала эксперимента наблюдалось снижение уровня окисленных липидов в эритроцитах крови крыс в среднем на 25% в группе без введения ЛПС (рис. 9, кривая ФЛ) и на 40% в группе с введением ЛПС (рис. 9, кривая ФЛ). Это может быть связано с реакцией организма на забор крови и результатом увеличения количества молодых эритроцитов. Однако лазерное излучение приводило к возрастанию уровня окисленных липидов в мембранах эритроцитов, при этом эффект был более выражен в условиях эндотоксического шока и не зависел от содержания ЭП. Так в группе без введения ЛПС процент падения флуоресценции цис-ПК после облучения в среднем возрос на 46% (рис. 9, кривая ФЛ), а в группе с введением ЛПС – на 132% Рис. 9. Зависимости супероксиддисмутазной активности плазмы крови крыс (СОД), хемилюминесцентного ответа лейкоцитов крови крыс (ХЛ) и флуоресценции цис паринариевой кислоты в липидах мембран эритроцитов крови крыс (ФЛ) от концентрации эндогенного порфирина в плазме крови крыс. Содержание эндогенных порфиринов измеряли в плазме крови крыс после первого забора крови. 1 - контрольная группа крыс – без облучения лазером и без введения ЛПС ;
2 - группа крыс с облучением лазером, без введения ЛПС;
3 - группа крыс с введением ЛПС, без облучения лазером;
4 – группа крыс с введением ЛПС и с облучением лазером. По оси ординат - измеряемый параметр: А - изменение супероксиддисмутазной активности плазмы крови за 4 часа проведения эксперимента АСОД II/АСОД I, где АСОД II и АСОД I - СОД активность плазмы крови крыс, выделенной вначале эксперимента (первый забор крови, 0 часов, А СОД I ) и через часа после начала эксперимента (второй забор крови, АСОД II ) соответственно;
Б хемилюминесцентный ответ лейкоцитов крови III/II, где III - максимальная интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов, выделенных из крови через 4 часа после начала эксперимента (второй забор крови), II - максимальная интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов, выделенных из крови вначале эксперимента (первый забор крови, 0 часов);
В - падения флуоресценции цис-паринариевой кислоты в липидах эритроцитов крови крыс за 4 часа проведения эксперимента ПФII/ПФI, где ПФI и ПФII % падения флуоресценции цис-паринариевой кислоты в липидах эритроцитов, выделенных из крови в начале эксперимента (первый забор крови, 0 часов, ПФ I) и через часа после начала эксперимента (второй забор крови, ПФII), соответственно.
(рис. 9, кривая ФЛ). Такое возрастание количества окисленных липидов может быть, в частности, вызвано активацией лейкоцитов (рис. 9, кривые ХЛ) в среднем интервале концентраций ЭП и снижением антиоксидантной защиты (например, СОД активности) при минимальных и максимальных уровнях ЭП. Сами эндогенные порфирины в данном случае не рассматриваются как первичные акцепторы, так как окисление липидов мембран эритроцитов это проявление системных взаимосвязанных и во многом вторичных процессов. Согласно фотодинамической теории о терапевтических механизмах действия лазерного излучения ЭП важны как первичные фотоакцепторы для инициирования окисления липидов в мембранах лейкоцитов, что запускает каскад реакций по их активации (Клебанов, 2005). Из трех исследованных нами параметров супероксиддисмутазная активность плазмы крови и функциональная активность полиморфноядерных лейкоцитов крови являются наиболее чувствительными показателями при изучении терапевтических эффектов низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм и дозой облучения 1,5 Дж/см2 без и в условиях эндотоксического шока. Лазер индуцированные изменения обоих этих параметров зависят от содержания эндогенных порфиринов в плазме крови.
Выводы В результате действия лазерного излучения с длиной волны 442 нм (в дозах 1.
24, 60 и 120 Дж/см2) происходит фотолиз нитрозильных комплексов негемового железа(II) в митохондриях. При добавлении гемоглобина к нитрозильным комплексам митохондрий происходит процесс транс-нитрозилирования, в результате чего образуются нитрозильные комплексы гемоглобина. Этот процесс можно рассматривать как альтернативный путь разрушения нитрозильных комплексов митохондрий.
Исследование действия низкоинтенсивного лазерного и светодиодного 2.
излучения на дыхание митохондрий (442, 532 и 650 нм, в дозах 3-30 Дж/см2) показало, что такое воздействие вызывает снижение коэффициента дыхательного контроля, в первую очередь за счет увеличения V3. При облучении митохондрий лазером с длиной волны 442 нм в дозах 3-12 Дж/см2 наблюдается увеличение скорости дыхания в состоянии V3 на 10-12%. При облучении синим светом митохондрий, ингибированных оксидом азота(II), происходит частичное восстановление скорости дыхания V3 на 60%, а коэффициента дыхательного контроля – на 40%. Эти данные свидетельствуют о том, что синее лазерное излучение (442 нм) вызывает разрушение нитрозильных комплексов дыхательной цепи митохондрий (образуемых экзогенным или эндогенным NO). В случае облучения красным светодиодом (650 нм) наблюдается существенное(на 25%) снижение скорости дыхание митохондрий в состоянии V3, что может быть связано с фотодинамическим повреждением митохондрий.
Облучение митохондрий животных, подвергавшихся действию 3.
липополисахаридов, низкоинтенсивным лазерным (442, 532 нм) и светодиодным (650 нм) излучением в дозах 3-30 Дж/см2 вызывает снижение коэффициента дыхательного контроля: синим лазерным светом на 10%, зеленым и красным – на 40%. При этом синий свет (442 нм) в дозе 6 Дж/см2 увеличивал на 30 % скорость дыхания митохондрий в состоянии V3. В необлученных митохондриях коэффициент дыхательного контроля составил 2,5, что на 30% ниже, чем в контрольной группе (3,5).
Образование нитрозильных комплексов негемового железа в митохондриях 4.
животных, подвергавшихся действию липополисахаридов, регистрируемых методом ЭПР, происходит только в присутствии восстановителя (дитионита натрия). В его отсутствие образование данных нитрозильных комплексов не наблюдается. В митохондриях контрольной группы нитрозильные комплексы образуются как в присутствии восстановителя, так и без него.
Супероксиддисмутазная активность плазмы крови и функциональная 5.
активность лейкоцитов являются наиболее чувствительными показателями при изучении эффектов низкоинтенсивного лазерного излучения красного диапазона (632,8 нм, доза облучения 1,5 Дж/см2) в норме и в условиях экспериментального эндотоксического шока в интервале концентрации эндогенных порфиринов в плазме от 60 до 100 нМ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Мачнева Т.В., Буравлев Е.А., Булгакова Н.Н., Владимиров Ю.А., Осипов А.Н.
1.
Роль эндогенных порфиринов в эффектах низкоинтенсивного лазерного излучения красного диапазона на свободно-радикальные процессы в крови крыс при экспериментальном эндотоксическом шоке // Биофизика. 2011. Т.56. №4: 705-713.
Буравлев Е.А., Осипов А.Н. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения 2.
на свободно-радикальные процессы при экспериментальном эндотоксическом шоке // Вестник РГМУ. 2011. №1: 180-181.
Буравлев Е.А., Жидкова Т.В., Владимиров Ю.А., Осипов А.Н. Влияние 3.
лазерного излучения синего и зеленого диапазона на параметры дыхания митохондрий при экспериментальном эндотоксическом шоке // Вестник РГМУ.
2012. №1: 237-238.
4. Buravlev E.A., Zhidkova T.V., Vladimirov Y.A., Osipov A.N. Effects of laser and LED radiation on mitochondrial respiration in experimental endotoxic shock // Laser Med Sci. 2012. in-press.
5. Buravlev E.A., Zhidkova T.V., Vladimirov Y.A., Osipov A.N. Effects of blue and green low power laser irradiation on the mitochondrial respiration in experimental endotoxic shock // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2012. V.9. Suppl 1:3-4.
Буравлев Е.А., Жидкова Т.В., Осипов А.Н., Владимиров Ю.А. Действие 6.
лазерного излучения видимого диапазона на дыхательную цепь митохондрий. 7-я национальная научно-практической конференция «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Материалы конференции, Смоленск. ФГУ, 2011, С. 102-103.
Буравлев Е.А., Мачнева Т.В., Булгакова Н.Н., Владимиров Ю.А., Осипов А.Н.
7.
Влияние лазерного излучении низкой интенсивности на свободно-радикальные процессы в крови крыс при эндотоксическом шоке. 7-я национальная научно практической конференция «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Материалы конференции, Смоленск. ФГУ, 2011, С. 35-37.
Мачнева Т.В., Буравлев Е.А., Осипов А.Н. Эффекты низкоинтенсивного 8.
лазерного света при эндотоксическом шоке. Сборник статей Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». Минск, Беларусь, 2012, часть 2, С. 56–58.
Мачнева Т.В., Буравлев Е.А., Осипов А.Н. Эффекты низкоинтенсивного 9.
лазерного излучения и эндогенные порфирины. Материалы докладов IV-го съезда биофизиков России. Нижний Новгород, 2012, часть 3, С. 156.
10. Буравлев Е.А., Жидкова Т.В., Владимиров Ю.А., Осипов А.Н. Влияние на параметры дыхания митохондрий низкоинтенсивного лазерного излучения при экспериментальном эндотоксическом шоке. Материалы докладов IV-го съезда биофизиков России. Нижний Новгород, 2012, часть 5, С. 11.