Перенос генов в клетки костного мозга с помощью лентивирусных векторов ex vivo
На правах рукописи
Радюхина Наталья Владимировна ПЕРЕНОС ГЕНОВ В КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА С ПОМОЩЬЮ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ EX VIVO 03.00.25 –Клеточная биология, Цитология, Гистология 03.00.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва, 2009
Работа выполнена в лабораториях молекулярной и клеточной кардиологии и клеточной инженерии Научно-исследовательского института экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно производственный комплекс МЗ и СР РФ» Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Тарарак Эдуард Михайлович кандидат биологических наук Власик Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович доктор биологических наук Болтовская Марина Николаевна
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им.
Н.К. Кольцова РАН
Защита диссертации состоится «24» июня 2009 года в 1330 на заседании Диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в ФГУ «Российский кардиологический научно производственный комплекс МЗ и СР РФ», по адресу 121552, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ и СР РФ»
Автореферат разослан «» _ 2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Синицын В.Е.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Исследования последних лет свидетельствуют о том, что костный мозг может поставлять циркулирующие костномозговые предшественники, участвующие в репарации сосудистой стенки. В экспериментах на животных показано, что такие клетки участвуют в новообразовании интимы магистральных артерий при экспериментальной аллотрансплантации органов, после механического повреждения сосудов и при гиперлипидемически индуцированном атеросклерозе [Sata et al., 2000].
Экспериментальные доказательства участия клеток костного мозга в репарации сосудов после повреждения ранее были получены и в нашей лаборатории. Иммуноцитохимические и авторадиографические исследования кинетики пролиферации клеток, участвующих в репарации сонной артерии крысы после повреждения показало, что они имеют скорее гематогенное, чем местное происхождение [Ильинская и соавт., 2003]. Нами также были приведены доказательства костномозгового происхождения клеток, участвующих в образовании неоинтимы после баллонной ангиопластики сонных артерий химерных крыс, с маркированными по Y-хромосоме клетками костного мозга. При этом было показано, что в области репарации артерии значительную долю (38%) составляли клетки, несущие маркер донорских клеток – Y-хромосому, что свидетельствовало о костномозговом происхождении этих клеток [Ильинская и соавт., 2008;
Тарарак и соавт., 2008].
В связи с тем, что за последние 10-15 лет методология переноса генов в клетки млекопитающих получила значительное развитие, в настоящее время активно разрабатываются подходы к генной терапии различных заболеваний.
Основной ее принцип заключается во введении в клетки организма необходимых генов, оказывающих определенное терапевтическое воздействие, или, напротив, в выключении экспрессии генов, способствующих развитию патологического процесса. Значительные успехи уже были достигнуты в экспериментах по переносу генов в клетки экспериментальных животных для коррекции миодистрофии Дюшенна [Li et al., 2005], муковисцидоза легких [Copreni et al., 2004], повреждения периферических нервов [Tannemaat et al., 2008]. Также были проведены первые клинические исследования по генотерапии наследственных заболеваний крови [Cavazzana-Calvo et al., 2002;
Muul et al., 2003].
Особое место среди других систем трансгенного переноса занимают лентивирусные системы, ввиду их уникальной способности доставлять гены в неделящиеся клетки млекопитающих [Curran M.A. et al, 2000], в том числе и в стволовые [Tahara-Hanaoka S et al., 2002, Horn PA. et al. 2004, Geraerts M et al., 2006, Liang M, 2009]. Это их свойство особенно важно для переноса генов в примитивные стволовые клетки костного мозга, так как основная масса последних находится вне клеточного цикла, а мобилизация в цикл существенно сказывается на пролиферативном потенциале и судьбе стволовых клеток после их трансплантации in vivo [Traycoff C.M. et al., 1998]. Исследования на животных показали, что векторы на основе HIV-1 могут использоваться для введения генетического материала в в терминально дифференцированные и стволовые нейральные клетки [Geraerts et al., 2006;
Torashima et al., 2006;
Naldini et al., 1996], гепатоциты [Oertel et al., 2003;
Tang et al., 2006], мышечные клетки [Kafri et al., 1997], и гемопоэтические стволовые клетки [Tahara-Hanaoka et al., 2002;
Horn et al. 2004] с полным сохранением всех функций и свойств этих клеток. Также in vitro успешно подвергались трансдукции практически все типы человеческих клеток, в том числе: CD34+ клетки из периферической и пуповинной крови [Miyoshi et al., 1999, Chinnasamy et al., 2004, Horn et al. 2004, Liang et al., 2009], эмбриональные стволовые клетки [Gropp M. et al., 2006]. Но если эффективность трансдукции CD34+ клеток, циркулирующих в периферической крови достаточно высока, то при трансдукции субпопуляций костномозговых клеток, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками (Lin-c-kit+ или Lin-c-kit+Sca-1+) редко удается зафиксировать значительное количество флуоресцирующих клеток in vitro и еще меньше среди их потомков после трансплантации in vivo [Chen et al., 2000].
Поэтому, на сегодняшний день весьма актуальной становится задача разработки эффективного метода доставки генов научного и терапевтического интереса в клетки костного мозга, с последующей их стабильной экспрессией в клетках-«мишенях».
Данное исследование явилось начальным этапом разработки методов переноса генов в костномозговые клетки. В дальнейшем, маркирование костномозговых клеток флуоресцентной меткой, с одной стороны, позволит проследить и охарактеризовать их возможное участие в процессах репарации и патологической перестройки стенки кровеносных сосудов. С другой, – доставка в эти клетки генов терапевтического интереса может быть использована для разработки подходов к генотерапии окклюзивных заболеваний сосудов.
Цель исследования Изучить эффективность лентивирусной трансдукции популяций клеток костного мозга мыши, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками ex vivo. Оценить длительность экспрессии введенного трансгена in vitro и ex vivo.
Задачи исследования 1. Сравнить способность лентивекторов, сконструированных на основе вирусов иммунодефицита кошки (FIV) или человека (HIV), а также HIV векторов, в которых экспрессия трансгена обеспечивается разными промоторами, эффективно трансдуцировать клетки костного мозга. Провести трансдукцию субпопуляций клеток костного мозга мыши с фенотипами Lin-c kit+, Lin-c-kit+Sca-1+ и CD105+Sca-1+ с помощью лентивирусных векторов, содержащих в качестве репортерных гены зеленого (copGFP) или красного (dsRed) флуоресцентных белков.
2. Оценить стабильность экспрессии и интенсивность флуоресценции репортерных генов на клетках культуры фибробластов мыши линии NIH/3T после их трансдукции лентивирусными HIV-векторами.
3. In vivo методом селезеночных колоний оценить эффективность трансдукции колониеобразующих единиц селезенки, присутствующих в субпопуляции клеток с фенотипом Lin-c-kit+. Провести морфологический и иммуноцитохимический анализ клеток селезеночных колоний.
4. Получить радиационных костномозговых химерных мышей путем замещения костного мозга самок на трансдуцированные in vitro костномозговые клетки самца. В разные сроки после восстановления кроветворения выявить наличие трансдуцированных клеток в костном мозге и периферической крови химерных животных методом ПЦР и цитофлуориметрии в потоке. Провести иммуноцитохимический анализ клеток костного мозга химер.
Научная новизна и практическая значимость работы В работе продемонстрировано преимущество использования для трансдукции клеток костного мозга векторов, полученных на основе лентивируса HIV-1, а не FIV. При этом лучшую экспрессию трансгена в клетках-«мишенях» обеспечивает промотор вируса стволовых клеток мыши, по сравнению с промотором ранних генов цитомегаловируса человека, который наиболее часто используется в генетических конструкциях для контроля экспрессии трансгена при переносе генов в стволовые и прогениторные клетки.
В работе также была показана стабильность экспрессии трансгенов, введенных в клетки с помощью лентивирусных HIV-векторов, в течение 3-х месяцев культивирования. Впервые в опытах ex vivo методом селезеночных колоний обнаружено, что лентивирусные HIV-векторы способны с высокой эффективностью трансдуцировать КОЕ-с и в составе генома передаваться их потомкам. При этом показано отсутствие выраженного негативного влияния использованных векторов на процесс гемопоэза в колониях. Также в работе впервые было продемонстрировано, что лентивирусные HIV-векторы способны трансдуцировать ex vivo клетки-предшественники костного мозга, находящиеся на разных ступенях иерархии гемопоэтических клеток, в том числе и стволовые. При этом процесс трансдукции не влияет на потенциал гемопоэтических стволовых клеток репопулировать костный мозг и кровь летально облученных животных. Также впервые было показано, что трансген, доставленный в клетки костного мозга с помощью HIV-вектора, сохраняется в геноме клеток-«мишеней» как минимум в течение одного года.
Таким образом, полученные в работе результаты существенно дополняют имеющиеся в современной литературе данные по переносу генов в стволовые и прогениторные клетки костного мозга с помощью векторов, полученных на основе лентивирусов.
Разработанная при выполнении настоящей работы технология переноса генов, в дальнейшем, позволит получить новые данные, которые будут способствовать уточнению этапов мобилизации костномозговых клеток предшественников элементов сосудистой стенки, их миграции через кровь и инвазии в область репарации. При дальнейшем изучении эти этапы наряду с исследованием пролиферации и дифференцировки низкодифференцированных клеток в зрелые элементы очагов гиперплазии сосудистой стенки могут стать важными точками приложения стратегии генной и клеточной терапии при лечении стенозирующих заболеваний артерий.
Апробация работы Основные положения диссертационной работы были доложены на конференциях: XIV International Symposium on Atherosclerosis (Rome, 2006), 46th Annual Meeting of the American Society for Cell Biology (San Diego, CA, 2006), 76th European Atherosclerosis Society Congress (Helsinki, 2007), 7-th Internationmal congress on coronary artery disease (Venice, 2007), Российском национальном конгрессе кардиологов. Конгрессе кардиологов стран СНГ (Москва, 2007), V конференции молодых ученых России: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007), на межлабораторном семинаре в Институте экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ РФ и были рекомендованы к защите. Материалы диссертационной работы отражены в 11 публикациях: 3 статьи и 8 публикаций в сборниках докладов научных конференций.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из 6 разделов: “Bведение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты и их обсуждение”, “Заключение”, “Выводы” и “Список использованных источников”. Работа проиллюстрирована 18 рисунками, таблицами, список использованной литературы включает 218 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы Животные В работе использовали 12-14-недельных мышей – гибридов первого поколения CBAC57Bl/6 в качестве доноров (самцы) и реципиентов (самки) костного мозга.
Клеточные культуры Для переноса генов использовали переживающие первичные культуры, образованные клетками субпопуляций костного мозга с фенотипами Lin-c Kit+, Lin-c-Kit+Sca-1+ или CD105+Sca-1+. Переживающая культура не позволяет в течение длительного времени наблюдать за трансдуцированными клетками, однако дает возможность быстро, в течение недели, оценить эффективность трансдукции костномозговых клеток.
Выделенные с помощью метода иммуномагнитной сепарации клетки костного мозга высевали в лунки 24-луночного планшета в концентрации 0,5 1105 клеток/мл в среде RPMI 1640 с добавлением 15% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы и 10% смеси сред, кондиционированных клетками линий линий NCTC клон 929 и WEHI-3B (2:1), и культивировали, в течение 5-7 дней при 37°C в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2.
Для оценки стабильности интеграции генетической конструкции в геном клеток-«мишеней» и экспрессии репортерного гена проводили трансдукцию клеток линии NIH/3T3 (эмбриональные фибробласты мыши). В контексте решения данной задачи преимущество этих клеток состоит в том, что в отличие от клеток костного мозга, их можно легко культивировать на протяжении длительного периода времени.
Клетки линии HEK-293T использовали для получения препаратов псевдовирусных частиц. Эти клетки являются производными эпителия почки человека. Культура получена из клеток культуры HEK-293 путем вставки в их геном большого Т-антигена вируса SV40. Такие клетки характеризуются высокой способностью трансфицироваться.
Клетки линий HEK-293T, NIH/3T3, культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 50 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,02 mM L-глутамина в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2.
Пассирование клеток проводили 2 раза в неделю, когда конфлуентность монослоя достигала 80-90%.
Методы Выделение клеток костного мозга мыши Костный мозг вымывали из бедренных костей мыши цитратным буфером и ресуспендировали с помощью шприца с иглой диаметром 22G. Для получения гомогенной суспензии клетки разбивали многократным последовательным пропусканием суспензии через иглы диаметром 23G и 25G, а затем пропускали через клеточный фильтр с диаметром пор 30 мкм (Miltenyi Biotec), эритроциты лизировали.
Для выделения субпопуляций клеток костного мозга с фенотипами Lin-c Kit+, Lin-c-Kit+Sca-1+ или CD105+Sca-1+, обогащенных прогениторными и стволовыми клетками, использовали наборы Lineage Cell Depletion Kit, CD MicroBeads, CD105 MultiSort Kit (PE), Anti-Sca-1 MicroBead Kit (FITC) и антитела CD117-PE фирмы Miltenyi Biotec. Выделение проводили согласно протоколам производителя, комбинируя реагенты из разных наборов для получения необходимых субпопуляций клеток.
Для проведения сепарации использовали охлажденные до +4оС растворы, все операции, по возможности, проводили на льду. Подсчет клеток проводили в гемоцитометре, жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,5% раствора трипанового синего. Для уменьшения неспецифического связывания антител все манипуляции с клетками проводили с использованием раствора PBS, содержащего 2 mM ЭДТА и 0,5% сыворотки плода коровы или БСА.
Получение препаратов псевдовирусных частиц Препараты псевдовирусных частиц получали методом транзиентной липосомной котрансфекции клеток линии HEK-293Т экспрессионной и одной (в случае получения FIV-частиц) или двумя (в случае получения HIV-частиц) «упаковочными» плазмидами. Экспрессионные плазмиды, использованные в работе, представляют собой репликационно неактивные лентивекторы, сконструированные, на основе лентивирусов иммунодефицитов кошки (FIV) или человека (HIV). Для получения псевдовирусных HIV-частиц использовали экспрессионную плазмиду pCopGXL-H1 (System Biosciences), которая содержала в своем составе репортерный ген флуоресцентного белка сopGFP из копеподы Pontellina plumata под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека (CMV). Для получения псевдовирусных частиц на основе лентивируса HIV-1 использовали три варианта экспрессионных векторов pLA-CMV-Сop-GFP-H1, pLA-CMV-DsRed-H1 и pLA-MSCV DsRed-H1, кодирующих гены сopGFP или красного флуоресцентного белка dsRed из рифового коралла Discosoma sp. Все три плазмиды имели родственную функциональную структуру, которая включала тот же набор элементов, что и плазмида, сконструированная на основе лентивируса FIV. Для получения псевдовирусных частиц на основе FIV использовали «упаковочную» плазмиду pVSV-G-C34N, предоставленную фирмой «Мона», для получения HIV-частиц использовали «упаковочные» плазмиды pVSV-G и р8.2 (System Biosciences).
За день до трансфекции клетки линии HEK293T высевали в культуральные флаконы в концентрации 0,3106 клеток/мл и культивировали в среде DMEM, содержащей 10% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы и L-глутамин. На следующий день, когда клетки достигали субконфлуентности среду заменяли на смесь для трансфекции, содержащую препараты ДНК плазмид в соотношении 1:1 в случае получения FIV-частиц и 1:1:1 в случае получения HIV-частиц. Трансфекцию проводили с использованием липофектамина и реагента ПЛЮС (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя.
Через 24 часа после трансфекции среду заменяли на DMEM, содержащую 2% сыворотки. После этого среду с псевдовирусными частицами собирали дважды, через 48 и 72 часа, стерильно фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Corning-Costar) и добавляли 40%-й раствор полиэтиленгликоля (PEG 8000) в ФСБ до конечной концентрации 12%. Осаждение псевдовирусных частиц центрифугированием (40 мин при 1400g, комнатная температура) проводили не ранее чем через 24 часа после добавления PEG. Осадок растворяли в среде RPMI, содержащей 25мМ HEPES. Нерастворенные агрегаты удаляли центрифугированием (5 мин при 1700g, комнатная температура), а надосадочную жидкость замораживали и хранили при – 800С.
Трансдукция клеток костного мозга Для трансдукции клетки костного мозга высевали в 24-луночный планшет в концентрации 0,5-1105 клеток/мл в ростовой среде, добавляли препарат псевдовирусных частиц (50-200 мкл) и полибрен до конечной концентрации 5 мкг/мл. Общий объем среды доводили до 500 мкл. При использовании каждой генетической конструкции количество псевдовирусных частиц, вносимых для трансдукции, определяли в предварительных экспериментах, в которых оценивали цитотоксический эффект, оказываемый на клетки данной конструкцией. Через 24 часа клетки отмывали, добавляли 1 мл свежей среды, и культивировали в течение недели или вводили облученным мышам для получения селезеночных колоний или длительного восстановления кроветворения. Анализ экспрессии репортерного гена клетками культуры проводили с помощью метода цитофлуориметрии в потоке. Интеграцию генетической конструкции в геном клеток-«мишеней» определяли по наличию в ДНК этих клеток фрагмента proHIV последовательности нуклеотидов вектора с помощью ПЦР.
Трансдукция клеток линии NIH/3T Для оценки стабильности интеграции генетической конструкции в геном клеток-«мишеней» и длительности экспрессии трансгена проводили трансдукцию клеток линии NIH/3T3. Для этого использовали три вида псевдовирусных частиц, полученных на основе экспрессионных векторов pLA CMV-сop-GFP-H1, pLA-CMV-DsRed-HLb и pLA-MSCV-DsRed-H1.
Клетки высевали в 6-луночный планшет в концентрации 0,3 клеток/мл. Когда клетки достигали субконфлуентности, в лунки добавляли мкл препарата псевдовирусных частиц в свежей среде и полибрен до конечной концентрации 5 мкг/мл. Через 48 часов клетки отмывали и культивировали в течение трех месяцев. Анализ экспрессии клетками флуоресцентного белка и наличие вектора в составе их генома проводили один раз в неделю в течение трех месяцев.
Получение гемопоэтических колоний в селезенках у летально облученных мышей Для тестирования результатов трансдукции клеток костного мозга in vivo использовали метод получения гемопоэтических колоний в селезенках летально облученных мышей [Till et al., 1961] с некоторыми модификациями.
Самок мышей со средней массой 18-20 г подвергали летальной дозе облучения (10 Гр) в течение двух сеансов по 25 минут с перерывом в 3 часа (мощность дозы 17 сГр/мин). Через 1-24 ч после облучения самкам в хвостовую вену вводили 0,5 мл среды DMEM, содержащей 3103 трансдуцированных клеток донорского костного мозга самца с фенотипом Lin-c-kit+. Было проведено два эксперимента по получению селезеночных колоний. В первом эксперименте для трансдукции клеток использовали псевдовирусные частицы, полученные на основе экспрессионного вектора pLA-CMV-сop-GFP-H1, содержащие ген сopGFP под промотором CMV. Во втором эксперименте клетки трансдуцировали псевдовирусными частицами на основе вектора pLA-MSCV DsRed-H1, которые содержали ген dsRed под промотором MSCV.
Через 10 дней (эксперимент по трансдукции гена сopGFP) или 12 дней (эксперимент по трансдукции гена dsRed) после введения клеток костного мозга животных умерщвляли, извлекали селезенки, проводили их визуальный осмотр на наличие колоний и фотографировали с помощью цифровой камеры Nikon Coolpix.
Для проведения цитофлуориметрического и ПЦР-анализов готовили суспензию клеток колоний.
Приготовление суспензии клеток селезеночных колоний Для приготовления одноклеточной суспензии из селезенок вырезали наружные колонии, которые осторожно гомогенизировали с помощью металлического пестика в отдельных микроцентрифужных пробирках (Corning Costar) (объем пробирок 1,5 мл) в среде DMEM и пропускали через клеточное сито с диаметром пор 30 мкм (Miltenyi Biotec).
Морфологический анализ селезеночных колоний Для проведения морфологического анализа часть селезенок с колониями фиксировали по Буэну и после проведения рутинной гистологической проводки заливали в парафиновую среду HISTOMIX. Гистологические срезы толщиной мкм получали на микротоме Reichert Jung 2050 SuperCut (Германия), окрашивали гематоксилин - эозином или гематологическим красителем по Гимзе (Sigma) и заключали в синтетическую среду Depex. Срезы изучали с помощью микроскопа Leica CTR5000, оснащенного цифровой фотокамерой Leica DFC 420C и системой для анализа изображения Leica Application Suite Las.
Длительное восстановление кроветворения у летально облученных мышей Еще один способ тестирования результатов трансдукции in vivo использованный в работе – метод длительного восстановления кроветворения у летально облученных мышей. Для получения радиационных костномозговых химерных животных летально облученным в дозе 10 Гр самкам мышей внутривенно вводили трансдуцированные клетки субпопуляций костного мозга самца с фенотипами Lin-c-kit+ (2105 клеток), Lin-c-kit+Sca-1+ (800 клеток) или CD105+Sca-1+ (1600 клеток). При введении клеток с фенотипами Lin-c-kit+Sca-1+ и CD105+Sca-1+ животным вводили защитную дозу клеток сингенного костного мозга самки (2105 и 1106 клеток, соответственно).
В разное время после облучения химерных животных умерщвляли, выделяли клетки костного мозга и крови. Кровь забирали из сердца животного и переносили в цитратный буфер для предотвращения свертывания. В суспензиях клеток костного мозга и крови эритроциты лизировали, а оставшиеся клетки пропускали через клеточное сито с диаметром пор 30 мкм.
Выявление экспрессии dsRed в клетках костного мозга и крови химерных мышей в разные сроки после восстановления кроветворения проводили с помощью метода поточной цитофлуориметрии. Для подтверждения факта химеризма проводили ПЦР-анализ ДНК, выделенной из клеток костного мозга на наличие Y-хромосомы. Для выявления присутствия в костном мозге химерных мышей трансдуцированных клеток проводили ПЦР-анализ на наличие фрагмента proHIV встроенного в геном вектора.
Иммуноцитохимическое окрашивание Для установления типов клеток костного мозга, экспрессирующих dsRed, а также для анализа процессов восстановления кроветворения у химерных животных, проводили их иммуноцитохимическое окрашивание моноклональными антителами против антигенов CD3 (маркер тимоцитов и Т клеток), Ly6-G (маркер гранулоцитов и моноцитов), Ter-119 (маркер клеток эритроидного ряда) и В-клеток) и маркеров B220 (маркер низкодифференцированных гемопоэтических клеток c-kit, Sca-1, и CD34 (BD Biosciences). Клетки, окрашенные антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой, анализировали с помощью метода поточной цитофлуориметрии. Для визуализации антигенов, связанных с биотинилированными антителами, использовали флуоресцентную метку PerCP (длина волны флуоресценции 675 нм) или FITC (длина волны флуоресценции 520 нм (BD Biosciences)), конъюгированную со стрептавидином.
Поточная цитофлуориметрия Выявление экспрессии репортерного гена клетками костного мозга и селезеночных колоний, а также анализ клеток, окрашенных антителами, проводили на поточном цитофлуориметре FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems) в соответствии с инструкциями производителя. Для анализа полученных результатов использовали программный пакет CellQuest (BD).
Выделение ДНК Геномную ДНК из клеток селезеночных колоний и костного мозга химерных животных выделяли с использованием набора QIAamp DNA Blood MIDI Kit Protocol (Qiagen) в соответствии протоколом производителя.
Полимеразная цепная реакция ПЦР проводили с использованием реактивов из набора SuperScript (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Пробирки с необходимыми ингредиентами помещали в амплификатор PCRExpress HBP110 (HIBAID Ltd, UK) с нагреваемой крышкой. ПЦР проводили в соответствии с заданными программами.
Образцы ДНК, выделенной из клеток селезеночных колоний и костного мозга всех экспериментальных животных, были проанализированы на наличие фрагмента Y-хромосомы. Образцы ДНК, выделенной из клеток селезеночных колоний и костного мозга животных, которым вводили трансдуцированные клетки, были проанализированы на присутствие маркерного фрагмента proHIV ДНК вектора, встроенного в геном клетки-«мишени». Для подтверждения наличия равного количества ДНК в пробах все образцы ДНК были проанализированы на присутствие маркерного гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы G3PDH. Количества циклов амплификации были равны 36-ти при выявлении фрагментов Y-хромосомы и ProHIV и 30-ти при выявлении гена G3PDH.
Праймеры, использованные в работе для выявления фрагмента Y хромосомы мыши, были любезно предоставлены зав. лаб. физиологии крови Гематологического центра РАМН д.б.н. Н.И. Дризе. Они имели следующую последовательность нуклеотидов:
mouse SRY sense: 5' CTC TGA TGG GAC AAA CTT TAC G 3' mouse SRY antisense: 5' TGA GTG CTG ATG GGT GAC GG 3'.
Праймеры для выявления фрагмента встроенного в геном клетки лентивектора proHIV и для выявления гена G3PDH были любезно предоставлены фирмой «Мона» и имели следующие последовательности нуклеотидов:
ProHIV1D: 5' GGG GAC TGG AAG GGC TAA TTC 3' ProHIV2R: 5' TGC GTC GAG AGA GCT CTG GTT 3' G3PDH: 5' ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3' G3PDH: 5' TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3' Электрофорез ДНК Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле.
Для приготовления 2,5% агарозного геля 1 г агарозы растворяли в 40 мл буфера ТАЕ (40мМ TRIS-acetate-EDTA, рН=7,6). Смесь доводили до кипения и после полного растворения агарозы остужали до комнатной температуры. К смеси добавляли 1 мкл бромистого этидия и заливали в форму. После застывания гель помещали в камеру для электрофореза и в лунки наносили пробы. В каждую пробу добавляли 5 мкл смеси ПЦР-продуктов и 1 мкл красителя – маркера ДНК. Для идентификации продуктов реакции готовили пробы, содержащие маркеры молекулярных весов ДНК.
Горизонтальный электрофорез проводили в буфере ТАЕ при напряжении 120 V в течение 25 мин.
После окончания электрофореза для визуализации продуктов реакции гель просвечивали на ультрафиолетовом трансиллюминаторе Alpha Innotech Сorporation и фотографировали с помощью системы Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 (Kodak Digital Science).
Статистическая обработка данных Статистическая обработка полученных цифровых результатов проводилась с использованием программы Microsoft Excel (Microsoft).
Обработка вариационных рядов включала подсчет значений средних арифметических величин и ошибки средних величин. Сравнение вариационных рядов осуществляли при помощи Т-критерия Стьюдента. Различие считали статистически достоверным, если уровень значимости был p0,05, что является мерой достаточной надежности результатов. Построение графиков и гистограмм проводили в программе Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Основной задачей исследования явилась разработка эффективного способа переноса генов в геном клеток костного мозга мыши методом лентивирусной трансдукции ex vivo. Принцип метода заключается в извлечении клеток костного мозга из организма животного, проведении трансдукции этих клеток in vitro и возвращении генетически модифицированных клеток в организм сингенного животного. Работа была построена из двух частей. Первая часть была выполнена in vitro и посвящалась отработке метода трансдукции субпопуляций клеток костного мозга мыши, обогащенных прогениторными и стволовыми клетками, с помощью генетических конструкций, созданных на основе вирусов кошачьего (FIV) или человеческого иммунодефицита типа 1 (HIV-1). В этой части работы были подобраны оптимальные условия для проведения трансдукции и выбраны векторы, позволяющие добиться наиболее эффективного маркирования клеток.
Вторая часть исследования была посвящена экспериментам in vivo, в которых для тестирования результатов трансдукции, проведенной in vitro, использовали методы получения селезеночных колоний и длительного восстановления кроветворения у летально облученных мышей.
Трансдукция клеток с помощью лентивирусных векторов in vitro Для проведения трансдукции использовали субпопуляции клеток костного мозга с фенотипами Lin-c-kit+, Lin-c-kit+Sca-1+ или CD105+Sca-1+, выделенные с помощью метода иммуномагнитной сепарации. Все три субпопуляции являлись обогащенными малодифференцированными клетками предшественниками, содержащими стволовые и коммитированные клетки предшественники в различных соотношениях [Okada et al., 1991, Okada et al., 1992, Chen et al., 2003].
Процедура обогащения позволяет использовать значительно меньшие количества клеток для получения селезеночных колоний или длительного восстановления кроветворения у летально облученных мышей. Использование меньшего количества клеток при проведении трансдукции, в свою очередь, позволило увеличить число псевдовирусных частиц, приходящихся на одну клетку, что повышало вероятность встраивания вектора в геном клетки «мишени».
Трансдукция клеток костного мозга векторами на основе лентивирусов FIV и HIV Данные многочисленных исследований свидетельствуют о том, что векторы, сконструированные на основе лентивируса HIV-1, способны осуществлять эффективный перенос генов в гемопоэтические клетки, в том числе и в стволовые [Miyoshi et al., 1999;
Chen et al., 2000;
Tahara-Hanaoka et al., 2002;
Horn et al., 2004]. Напротив, данные по трансдукции клеток костного мозга с помощью векторов, полученных на основе вируса FIV немногочисленны и противоречивы [Price et al., 2002;
Kyrkanides et al., 2003].
Поэтому на первом этапе работы для подбора оптимального лентивектора для переноса гена репортерного белка в клетки костного мозга мыши было проведено сравнительное исследование способности псевдовирусных частиц, созданных на основе вирусов FIV или HIV-1, трансдуцировать эти клетки.
При сравнении эффективности FIV- и HIV-векторов использовали псевдовирусные частицы, «упакованные» на основе экспрессионных плазмид pCopGXL-H1 и pLA-CMV-Сop-GFP-H1. Обе плазмиды, в качестве репортерного, кодировали ген зеленого флуоресцентного белка copGFP под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека (CMV). По данным метода поточной цитофлуориметрии доля клеток, экспрессирующих copGFP, составила 3-44% после трансдукции псевдовирусными FIV-частицами 50µ 50µ А 100µ Рис. 1. Экспрессия белка copGFP в культуре, образованной клетками костного мозга с фенотипом Lin-c-kit+, трансдуцированными псевдовирусными HIV-частицами на 7-е сутки культивирования. Доля клеток, экспрессирующих трансген, составила 27%.
А – флуоресцентная микроскопия;
Б – фазовый контраст.
и 2,5-27% при использовании генетической конструкции, созданной на основе вируса HIV.
Максимальная эффективность трансдукции была достигнута в случае использования FIV-вектора. Однако, в тех случаях, когда были достигнуты высокие значения доли флуоресцирующих клеток, полученные на его основе псевдовирусные частицы оказывали токсическое действие на клетки.
Напротив, HIV-частицы, наряду с обеспечением высокой эффективности трансдукции, обладали минимальным цитотоксическим эффектом in vitro.
Культура клеток костного мозга, трансдуцированных такими частицами, при исследовании с помощью фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии, почти не отличалась от таковой, не подвергавшейся заражению: количество клеток в культуре быстро росло, были заметны конгломераты делящихся, дифференцирующихся кроветворных клеток (рис. 1).
Учитывая результаты данной части исследования, для проведения дальнейших экспериментов были выбраны генетические конструкции, полученные на основе лентивируса HIV-1. HIV-вектор, кодирующий ген copGFP под контролем промотора CMV, в дальнейшем, был использован для проведения экспериментов по получению селезеночных колоний.
Сравнительное исследование способности промоторов CMV и MSCV обеспечивать экспрессию трансгена в клетках костного мозга На следующем этапе исследования был проведен сравнительный анализ способности промоторов, под контролем которых находится репортерный ген, обеспечивать высокий уровень экспрессии трансгена. Для этого клетки костного мозга с фенотипом Lin-c-kit+ трансдуцировали псевдовирусными частицами, полученными на основе экспрессионных HIV-векторов pLA-CMV DsRed-H1 и pLA-MSCV-DsRed-H1, кодирующих ген dsRed под контролем CMV- или MSCV-промотора, соответственно. Оказалось, что наибольшая эффективность трансдукции (21±3,5%) была достигнута при использовании для «упаковки» псевдовирусных частиц экспрессионной плазмиды pLA-MSCV DsRed-H1. При использовании вектора pLA-CMV-DsRed-H1 эффективность трансдукции была значительно ниже и составила 13±2,9%. Оба вектора не оказывали токсического воздействия на клетки.
ПЦР-анализ клеток, трансдуцированных каждой из исследованных конструкций, подтвердил наличие интегрированного вектора в их геноме.
Основываясь на результатах данного эксперимента для переноса гена dsRed в геном костномозговых клеток методом ex vivo нами были выбраны псевдовирусные частицы, полученные на основе вектора pLA-MSCV-dsRed-H1.
Трансдукция клеток костного мозга с фенотипами Lin-c-Kit+, Lin-c Kit+Sca-1+ и CD105+Sca-1+ Эффективность трансдукции клеток костного мозга с фенотипами Lin-c Kit+, Lin-c-Kit+Sca-1+ и CD105+Sca-1+ in vitro выбранным вектором pLA-MSCV dsRed-H1, составила 21±4,1%, 16±2,6% и 8±1,8%, соответственно. Клетки этих субпопуляций, в дальнейшем, были использованы для проведения экспериментов in vivo.
Трансдукция клеток линии NIH/3T На данном этапе работы проводилась оценка стабильности экспрессии репортерных генов трансдуцированными клетками культуры фибробластов мыши линии NIH/3T3 в течение трех месяцев культивирования. Выбор последних был обусловлен тем, что в отличие от клеток костного мозга фибробласты NIH/3T3 можно легко культивировать на протяжении продолжительного периода времени. Кроме того, эффективность трансдукции этих клеток значительно выше таковой для костномозговых клеток, что позволяет легко регистрировать как изменение доли флуоресцирующих клеток так и средней интенсивности их флуоресценции.
Для проведения анализа изменений в экспрессии репортерного гена с В А Б 100µ 100µ Рис.
Рис. 2. Флуоресценция трансдуцированных клеток линии NIH/3T3 на день культивирования.
А – клетки после трансдукции вектором pLA-CMV-Сop-GFP-H1;
Б – клетки после трансдукции вектором pLA-CMV-DsRed-H1;
В – клетки после трансдукции вектором pLA-MSCV-DsRed-H1.
Доля флуоресцирующих флуоресценции клеток, Интенсивность клеток, % усл.ед.
20 4 15 22 31 37 45 53 60 70 86 4 15 22 31 37 45 52 59 70 86 А Б Время, сут Время, сут Рис. 3. Изменения доли флуоресцирующих клеток (3 А) и средней интенсивности их флуоресценции (3 Б) в популяции фибробластов мыши NIH/3T3.
Трансдукция векторами pLA-CMV-Сop-GFP-H1 ( ), pLA-MSCV-DsRed ) или pLA-CMV-DsRed-H1 ( H1 ( ) течением времени клетки трансдуцировали псевдовирусными частицами, полученными на основе различных экспрессионных векторов: pLA-CMV-Сop GFP-H1, pLA-CMV-DsRed-H1 и pLA-MSCV-DsRed-H1.
Исследование продемонстрировало способность всех трех векторов эффективно трансдуцировать клетки линии NIH/3T3. На рис. 2 приведена флуоресценция трансдуцированных клеток на 45 день культивирования, а временная зависимость изменения доли флуоресцирующих клеток и средней интенсивности флуоресценции представлены в виде графиков на рис. 3А и 3Б, соответственно.
Максимальная эффективность трансдукции клеток наблюдалась при использовании вектора, кодирующего ген copGFP. Необратимого снижения доли флуоресцирующих клеток в течение всего периода культивирования отмечено не было.
Что касается средней интенсивности флуоресценции трансдуцированных клеток, то были показаны высокие ее значения после трансдукции вектором, кодирующим белок copGFP, по сравнению с таковыми, достигнутыми при использовании векторов, кодирующих белок dsRed. Значительного снижения значений средней интенсивности флуоресценции также не наблюдалось.
Результаты ПЦР-анализа ДНК, выделенной из клеток, трансдуцированных каждым из исследованных векторов, подтвердили наличие интегрированного вектора в их геноме на всех сроках анализа.
Несмотря на то, что в процессе культивирования наблюдались некоторые различия в изменении экспрессии трансгенов, в целом, проведенные in vitro исследования свидетельствуют о стабильности интеграции и экспрессии генов, доставленных в клетки с помощью векторов, полученных на основе лентивируса HIV-1.
Анализ результатов трансдукции in vivo Получение гемопоэтических колоний в селезенках у летально облученных мышей Для тестирования результатов трансдукции in vivo мы использовали метод селезеночных колоний [Till et al., 1961]. Метод основан на том, что в селезенках у облученных мышей можно наблюдать дискретные очаги гемопоэза, клетки которых являются клонами – потомками одной полипотентной кроветворной клетки, колониеобразующей единицы селезенки (КОЕ-с). Образование колоний происходит за счет деления и дифференцировки потомков КОЕ-с, что необходимо для быстрого накопления пула дифференцированных клеток для поддержания клеточного состава крови в организме облученного животного. Колонии-клоны бывают нескольких типов:
эритроидные, гранулоцитарные, мегакариоцитарные и смешанные.
Использование летальной дозы облучения в сочетании с внутривенным введением донорских клеток костного мозга позволяет получить колонии, образованные исключительно введенными клетками. Реципиентских колоний в этом случае почти не образуется. В нашей работе этот прием был использован для оценки эффективности трансдукции КОЕ-с костного мозга по их потомкам в колониях-клонах in vivo.
Для получения селезеночных колоний летально облученным животным вводили трансдуцированные клетки костного мозга с фенотипом Lin-c-kit+.
Выбор этой субпопуляции клеток был обусловлен тем, что в ней содержатся практически все КОЕ-с костного мозга [Okada et al., 1991].
При тестировании результатов трансдукции с использованием псевдовирусных частиц, кодирующих ген dsRed, селезенки изолировали через 10 дней после облучения, тогда как при использовании псевдовирусных частиц, кодирующих copGFP – через 12 дней. Макроскопическое исследование показало, что все селезенки имели хорошо заметные крупные колонии (рис. 4).
Результаты цитофлуориметрического и ПЦР-анализов клеток колоний приведены в таблице 1.
Полученные в этих экспериментах данные свидетельствовали о высокой эффективности трансдукции КОЕ-с при использовании обеих генетических конструкций.
При проведении обоих опытов было отмечено, что в некоторых proHIV положительных колониях отсутствовала экспрессия трансгена. Кроме того, не все клетки внутри отдельных колоний экспрессировали трансген. Возможно, эти факты объясняются функционированием в клетке эпигенетических механизмов модификации хроматина, которое может приводить к выключению экспрессии чужеродного гена в клетке-«мишени».
Табл. 1. Сводная таблица данных, полученных после проведения цитофлуориметрического и ПЦР-анализов клеток селезеночных колоний Доля колоний, Вектор, Доля клеток Доля колоний, клетки которых использованный экспрессирующих клетки которых содержали для трансген внутри фрагмент proHIV экспрессировали трансдукции отдельных колоний, трансген, % интегрированного клеток % вектора, % pLA-MSCV от 0,5 до 78% 70% dsRed-H pLA-CMV от 0,8 до 84% 51% СopGFP-H Также при анализе результатов этих экспериментов было обнаружено, что в некоторых случаях при одинаковом числе циклов амплификации ДНК, полосы на электрофореграмме, соответствующие отдельным колониям, демонстрировали разное количество продукта ПЦР (рис. 5). Наибольшее количество соответствовало образцам ДНК, выделенным из клеток колоний, в которых доля клеток, экспрессирующих трансген, была максимальной.
Соответственно, образцы ДНК из клеток колоний, в которых доля флуоресцирующих клеток была небольшой, после амплификации давали на электрофореграмме малое количество продукта. По-видимому, эти наблюдения свидетельствуют о том, что не все клетки внутри отдельных колоний содержали трансген.
Подобная мозаичность в клеточном составе колоний, которые, как известно, образованы потомками одной клоногенной клетки [Чертков и соавт., 1976] и, соответственно, должны быть генетически идентичны, была показана и другими исследователями при анализе гемопоэтических колоний, образованных трансдуцированными клетками в метилцеллюлозе [Mikkola et al., 2000]. Авторы объясняют это тем, что окончательное встраивание трансгена в геном клетки происходит не сразу после трансдукции, а лишь по прошествии некоторого времени – уже в организме реципиента. За это время КОЕ-с успевает поделиться некоторое количество раз и в колонии накапливается пул клеток, не несущих трансгена в геноме. После завершения встраивания трансгена в колонии начинают накапливаться клетки, экспрессирующие флуоресцентный белок. Данные о различиях в количестве продукта ПЦР, вероятнее всего, свидетельствуют о том, что встраивание вектора в геном клетки возможно на разных этапах деления и дифференцировки КОЕ-с.
Анализируя результаты этой части работы, можно заключить, что, в целом, оба исследованных вектора продемонстрировали способность эффективно трансдуцировать КОЕ-с10 и КОЕ-с12 in vivo, с последующей экспрессией трансгена потомками этих клеток.
Б А Рис. 4. Селезеночные колонии.
На рисунке А представлены колонии, образовавшиеся через 10 дней после введения Lin-c-kit+- клеток, трансдуцированных вектором pLA-MSCV DsRed-H1. На рисунке Б представлены колонии, образованные Lin-c-kit+ клетками, трансдуцированными вектором pLA-CMV-Сop-GFP-H1 через 12 дней после облучения.
Данные ПЦР-анализа 23 26 28 47% 15% 45% 3% 6% Данные поточной цитофлуориметрии Рис. 5. Репрезентативные данные ПЦР-анализа ДНК, выделенной из индивидуальных селезеночных колоний, образовавшихся в селезенках мышей после введения Lin-c-kit+- клеток, трансдуцированных вектором pLA-CMV-Сop-GFP-H1 на присутствие последовательности proHIV встроившегося в геном вектора.
На рисунке видно, что количество продукта ПЦР (по два повтора каждого образца) после проведения одинакового количества циклов амплификации ДНК, выделенной из отдельных колоний, различается.
Заметно, что количество ДНК, содержащей вектор внутри этих колоний, коррелирует с количеством в них copGFP-положительных клеток (данные цитофлуориметрического анализа клеток этих колоний приведены в рамке под рисунком). Так, наибольшее количество продукта ПЦР соответствует образцам ДНК, выделенной из клеток колоний, в которых доля copGFP-положительных клеток была максимальной (колонии №№ и 37). Соответственно, образцы ДНК, в которых доля copGFP положительных клеток была небольшой (например, колония №26), после амплификации давали на электрофореграмме малое количество продукта.
Гистологическое исследование селезенок Микроскопическое исследование показало, что в селезенках мышей, которым для получения колоний вводили как трансдуцированные так и нетрансдуцированные клетки с фенотипом Lin-c-kit+, большую часть составили эритроидные колонии. В селезенках обеих групп животных встречались также гранулоцитарные, мегакариоцитарные и смешанные колонии (рис. 6). Эти результаты с большой долей вероятности позволяют предположить, что процесс трансдукции не повлиял на способность КОЕ-с формировать колонии разных типов.
Рис. 6. Срезы селезенок летально облученных самок-реципиентов после трансплантации трансдуцированных донорских клеток костного мозга самца с фенотипом Lin-c-kit+. На рисунке приведены различные типы образовавшихся в селезенках колоний: эритроидная (А), мегакариоцитарная (Б), гранулоцитарная (В) и смешанная (Г). Окраска гематоксилин-эозином.
А Б 20µ 20µ Г В 20µ 20µ Длительное восстановление кроветворения у летально облученных мышей Для тестирования результатов трансдукции in vivo, нами наряду с методом селезеночных колоний был применен также метод длительного восстановления кроветворения у летально облученных мышей. Для реализации этой части работы клетки костного мозга самца с фенотипами Lin-c-Kit+, Lin-c Kit+Sca-1+ или CD105+Sca-1+, прошедшие in vitro трансдукцию HIV-вектором, кодирующим ген dsRed под контролем MSCV-промотора, трансплантировали летально облученным самкам. Затем, в разные сроки после трансплантации проводили анализ экспрессии репортерного белка dsRed клетками костного мозга и крови химер и выявляли наличие интегрированного вектора в геноме этих клеток.
Было показано, что все три субпопуляции трансдуцированных клеток способны к восстановлению кроветворения летально облученных мышей сроком как минимум на один год.
Данные, полученные после проведения цитофлуориметрического и ПЦР анализов клеток костного мозга химер, приведены в таблице 2.
Присутствие встроенного вектора в геноме клеток костного мозга химер, кроветворение которых было восстановлено Lin-c-Kit+-клетками, было выявлено как в ранние (1,5-4 мес), так и в поздние (8-12 мес) сроки после облучения. Эти данные позволили заключить, что использованная в работе генетическая конструкция способна трансдуцировать стволовые и прогениторные клетки костного мозга, как длительно, так и кратковременно репопулирующие кроветворные органы летально облученных мышей. Анализ данных по длительному восстановлению кроветворения у животных, которым Табл. 2. Сводная таблица данных, полученных после проведения цитофлуориметрического и ПЦР-анализов клеток костного мозга химерных мышей в разные сроки после облучения Доля химер, у Доля химер, у Субпопуляция которых в которых в Доля клеток, клеток, которую костном мозге костном мозге экспрессирую вводили для был обнаружен была обнаружена щих трансген, восстановления интегрированный экспрессия % кроветворения вектор, %, трансгена, %, Lin-c-Kit+ от 0,5 до 65 Lin-c-Kit+Sca-1+ 0, 31 CD105+Sca-1+ 0, 23 вводили Lin-c-Kit+Sca-1+- или CD105+Sca-1+-клетки, показал присутствие интегрированного вектора в геноме клеток костного мозга химер в поздние сроки после облучения (8-12 мес и 5, 10 мес, соответственно), что свидетельствовало о том, что в этих экспериментах были трансдуцированы стволовые клетки, способные длительно репопулировать кроветворные органы летально облученных мышей.
Отсутствие экспрессии трансгена у мышей, в клетках костного мозга которых содержался интегрированный вектор, возможно, свидетельствует о функционировании в клетке эпигенетических механизмов инактивации генов.
Ранее было показано выключение экспрессии генов, доставленных в клетку с помощью лентивирусных векторов, посредством деацетилирования гистонов [Yao et al., 2004]. Возможной причиной отсутствия экспрессии трансгена также может быть встраивание последнего в участки гетерохроматина [Punzon et al., 2004].
В наших исследованиях эффективность трансдукции клеток костного мозга ex vivo была выше, когда для восстановления кроветворения облученных мышей использовали клетки с фенотипом Lin-c-Kit+. Известно, что субпопуляция с фенотипом Lin-c-Kit+ в отличие от субпопуляций Lin-c-Kit+Sca 1+ и CD105+Sca-1+, кроме стволовых, содержит клетки, которые обеспечивают кратковременное восстановление кроветворения у летально облученных животных, а также коммитированные клетки-предшественники [Okada et al., 1991, Okada et al., 1992, Chen et al., 2003]. Такие клетки значительно легче трансдуцировать из-за отсутствия в них защитных механизмов. Кроме того, многие из этих клеток находятся в клеточном цикле, что также повышает вероятность интеграции вектора в клетку-«мишень».
Таким образом, полученные в экспериментах по длительному восстановлению кроветворения данные, свидетельствуют о том, что использованная в работе генетическая конструкция на основе лентивируса HIV 1, способна трансдуцировать ex vivo клетки-предшественники костного мозга, находящиеся на разных ступенях иерархии гемопоэтических клеток, в том числе и стволовые. При этом процесс трансдукции не влияет на потенциал гемопоэтических стволовых клеток репопулировать кроветворные органы летально облученных животных.
Иммуноцитохимическое исследование клеток костного мозга химер Наконец, в заключительной части работы для идентификации типов клеток, которые экспрессировали dsRed в костном мозге химерных животных, а также для оценки процессов восстановления кроветворения, был применен иммуноцитохимический анализ. Клетки костного мозга окрашивали моноклональными антителами против антигенов, экспрессирующихся на поверхности клеток разных ростков гемопоэза (эритроидного, лимфоидного или миелоидного), а также против маркеров низкодифференцированных клеток.
Из-за невысокой доли клеток, экспрессирующих трансген, разрешающая способность метода поточной цитофлуориметрии не позволила точно определить их принадлежность к определенному типу клеток гемопоэтического ряда. Однако было четко показано, что во всех проанализированных случаях большая часть dsRed-положительных клеток несла на поверхности антиген миелоидных клеток и моноцитов костного мозга Gr-1.
Сравнение значений долей клеток, экспрессирующих маркеры малодифференцированных клеток CD34, с-kit, Sca-1, а также Т-лимфоцитов, миелоидных клеток и моноцитов, клеток эритроидного ряда и В-лимфоцитов, практически не выявило отличий в костном мозге химер и нормальной мыши.
Эти данные свидетельствуют об успешном восстановлении кроветворения у всех групп животных (рис. 7).
Полученные в этой части работы данные позволяют сделать вывод об отсутствии цитотоксического влияния использованных лентивирусных конструкций на процессы гемопоэза.
Доля клеток, экспрессирующих маркер CD 34 Sca-1 CD3 (Т- Gr-1 Ter 119 B 220 (В с-kit лимфоциты) (миелоидные (клетки лимфоциты) клетки и эритроидного моноциты) ряда) Маркеры клеток костного мозга Рис. 7. Доли клеток, экспрессирующих маркеры малодифференцированных клеток CD34, c-kit, Sca-1 а также антигены разных ростков гемопоэза CD3, Gr-1, Ter119 и B220 в костном мозге у химерных и у нормальных мышей.
Условные обозначения:
- нормальные мыши;
- химерные мыши, кроветворение которых было восстановлено трансдуцированными Lin-c-Kit+-клетками;
- химерные мыши, кроветворение которых было восстановлено трансдуцированными Lin-c-Kit+Sca-1 +-клетками;
- химерные мыши, кроветворение которых было восстановлено трансдуцированными CD105+Sca-1+-клетками.
ВЫВОДЫ лентивирусный способен эффективно 1. In vitro HIV-вектор трансдуцировать клетки костного мозга, тогда как FIV-вектор оказывает токсический эффект на эти клетки. HIV-вектор с промотором MSCV, в отличие от такового с промотором CMV, обеспечивает лучшую экспрессию трансгена в культуре клеток костного мозга.
2. Показана стабильная экспрессия (в течение 3-х мес.) трансгенов в фибробластах мыши NIH/3T3, трансдуцированных с помощью лентивирусных HIV-векторов.
3. Впервые методом селезеночных колоний показано, что лентивирусные HIV-векторы способны с высокой эффективностью трансдуцировать КОЕ-с ex vivo и в составе генома передаваться их потомкам. Морфологический анализ клеток селезеночных колоний не выявил различий в таковых, образованных трансдуцированными и нетрансдуцированными клетками костного мозга. Это свидетельствует об отсутствии выраженного негативного влияния использованных векторов на процесс гемопоэза в колониях.
4. Лентивирусный HIV-вектор способен трансдуцировать ex vivo костномозговые клетки-предшественники, находящиеся на разных ступенях иерархии гемопоэтических клеток, в том числе и стволовые. При этом процесс трансдукции не влияет на потенциал гемопоэтических стволовых клеток репопулировать костный мозг и кровь летально облученных животных.
Трансген, доставленный в клетки костного мозга с помощью HIV-вектора, сохраняется в геноме клеток-«мишеней» как минимум в течение одного года.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. N. Radukhina, O. Ilyinskaya, P. Rutkevich, T. Vlasik, T. Aref’eva, I.
Rybalkin, M. Peklo, E. Janushevskaja, E. Tararak. Stable transduction of murine bone marrow Lin-c-kit+ subpopulation with HIV-based pseudoviral particles. XIV International Symposium on Atherosclerosis, Rome, Italy. Atherosclerosis. – 2006. №3. – P. 96.
2. N. Radukhina, O. Ilyinskaya, A. Kozlov, P. Rutkevich, T. Vlasik, T.
Arefieva, I. Rybalkin, T. Gurskaya, A. Shevelev, M. Slinkin, E. Tararak. Lentiviral transduction of bone marrow hemopoietic progenitor cells ex vivo. 46th Annual Meeting of the American Society for Cell Biology, San Diego, USA. Molecular Biology of the Cell. – 2006. – №3. – P. 57.
Радюхина Н.В., Руткевич П.Н., Арефьева Т.И., Гурская Т.Х., 3.
Рыбалкин И.Н., Шевелев А.Я., Слинкин М.А., Власик Т.Н., Ильинская О.П., Тарарак Э.М. Лентивирусная трансдукция костномозговых гемопоэтических клеток-предшественников с фенотипом Lin-c-Kit+ ex vivo // Бюлл. Эксп. Биол.
Мед. – 2007. – №6. – С. 667-671.
4. N.Radukhina, O. Ilyinskaya, T. Vlasik, T. Arefieva, P. Rutkevich, A.
Kozlov, I. Rybalkin, T. Gurskaya, V. Shishkina, A. Shevelev and E. Tararak.
Reconstitution of hematopoiesis in lethally irradiated mice by lentivirally transduced bone marrow progenitor cells // In: New Horizons in Coronary Artery Disease. Eds.
B.S. Lewis, D.A. Halon, M.Y. Flugelman, «MEDIMOND», Bologna, Italy, 2007. – P. 89-93.
5. N. Radukhina, O. Ilyinskaya, A. Kozlov, P. Rutkevich, T. Vlasik, T.
Arefieva, I. Rybalkin, T. Gurskaya, A. Shevelev, E. Tararak. Transduction of bone marrow hemopoietic progenitor cells with HIV-based pseudoviral particles ex vivo.
76th European Atherosclerosis Society Congress, Helsinki, Finland. Atherosclerosis.
– 2007. - №1. – P. 64.
6. N. Radukhina, O. Ilyinskaya, T. Vlasik, T. Aref’eva, A. Kozlov, I.Rybalkin, T. Gurskaya, V. Shishkina, P. Rutkevich, A. Shevelev, E. Tararak. Long term reconstitution of lethally irradiated mice by transduced bone marrow progenitor cells. 7-th International congress on coronary artery disease, Venice, Italy. J.
Coronary Artery Disease. – 2007. - №1. – P. 35.
Н.В. Радюхина, П.Н. Руткевич, Т.И. Арефьева, А.В. Козлов, Т.Х.
7.
Гурская, А.Я. Шевелев, И.Н. Рыбалкин, Т.Н. Власик, О.П. Ильинская, Э.М.
Тарарак. Лентивирусная трансдукция малодифференцированных костномозговых клеток-предшественников ex vivo // Кардиологический Вестник. – 2007. – №2. – С. 37-42.
Радюхина Н.В., Ильинская О.П., Власик Т.Н., Козлов А.В., 8.
Арефьева Т.И., Руткевич П.Н., Рыбалкин И.Н., Гурская Т.Х., Шевелев А.Я., Шишкина В.С., Тарарак Э.М. Трансдукция ex vivo клеток костного мозга мыши генетической конструкцией на основе лентивируса HIV. Российский национальный конгресс кардиологов. Конгресс кардиологов стран СНГ, Москва, Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2007. - №5. – С. 256 257.
Тарарак Э.М., Ильинская О.П., Мишина В.А., Антропова Ю.Г., 9.
Радюхина Н.В., Андреева Е.Р. Происхождение клеток неоинтимы у химерных крыс с генетически маркированными клетками костного мозга.
Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2007. - №5. – С. 300.
10. Э.М. Тарарак, Н.В. Радюхина, О.П. Ильинская, Т.Н. Власик, Т.И.
Арефьева, И.Н. Рыбалкин, Т.Х. Гурская, П.Н. Руткевич, Е.Р.Андреева, А.В.
Козлов, А.А. Бухарков, B.C. Шишкина, О.О. Ударцева, С.В. Гуськова. Создание и апробация генетических конструкций для модификации клеток сосудистой стенки и их предшественников с целью разработки новых методов профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Сборник тезисов Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», 2007, стр. 61.
11. Радюхина Н.В. «Длительное восстановление кроветворения у летально облученных мышей клетками костного мозга, прошедшими лентивирусную трансдукцию in vitro.» V конференция молодых ученых России:
«Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2008.
Электронный сборник тезисов конференции, стр. 355-356.
Работа выполнена в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 2049), гранта РФФИ (07-04-01456-а) и гранта Президента РФ НШ 7675.2006.7.