Особенности микробного пейзажа, эндотоксинемии и показателей гемостаза у женщин с бактериальным вагинозом
На правах рукописи
ГАЙСИНА ЮЛИЯ РАМИЛЕВНА ОСОБЕННОСТИ МИКРОБНОГО ПЕЙЗАЖА, ЭНДОТОКСИНЕМИИ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА У ЖЕНЩИН С БАКТЕРИАЛЬНЫМ ВАГИНОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 03.01.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Уфа – 2013
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный меди цинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович доктор медицинских наук, профессор Гильманов Александр Жанович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Оренбургский научный центр РАМН, зав. лабораторией клеточного симбиоза Гриценко Виктор Александрович доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцраз вития России, зав. кафедрой биохимии Галян Сергей Леонидович
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учрежде ние высшего профессионального образования «Казанский государственный ме дицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Защита состоится «» 2013 года в «_» часов на заседании Диссертаци онного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государст венная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Фе дерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского 64.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челя бинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Автореферат разослан «_»2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцент Л.С. Латюшина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблема дисбиотического нарушения микро биоценоза влагалища ввиду его широкой распространенности считается одной из наиболее актуальных в акушерской и гинекологической практике. Частота бакте риального вагиноза (БВ) у беременных составляет в среднем 14-20 %, а в группах повышенного риска она возрастает до 30-38% (Анкирская А.С., 2005). Изменение микробиоты влагалища у хирургических больных в гинекологических стациона рах наблюдается в 45-86% случаев и является основой послеоперационных ин фекционных осложнений. В патогенезе последних нередко наблюдаются рас стройства микроциркуляции, связанные чаще всего с нарушениями в системе ге мостаза (Ness R.B. et al., 2005).
Поскольку одним из факторов патогенности грамотрицательных бактерий является капсульный липополисахарид (ЛПС), можно предположить определен ную роль микробных эндотоксинов в развитии указанных выше осложнений.
Учитывая такие особенности патогенеза бактериального вагиноза, как дезинте грация эпителиального слоя слизистой протеолитическими ферментами, незавер шенность фагоцитоза (Кира Е.Ф., 2001), возможно проникновение ЛПС грамот рицательных бактерий через влагалищную стенку в венозные и лимфатические сосуды паравагинальной клетчатки и попадание в дальнейшем в системный кро воток. Предположительные изменения гемостаза при БВ еще очень мало изучены, а имеющиеся сведения разрознены и не имеют интегрированного обобщения.
Цель исследования. Определить особенности микробного пейзажа влага лища, выраженность эндотоксинемии и ассоциированных с ней сдвигов гемостаза у женщин с вагинальным дисбиозом.
Задачи исследования.
1. Оценить встречаемость бактериального вагиноза и состояние вагиналь ной микрофлоры у женщин репродуктивного возраста.
2. Изучить уровень эндотоксинемии, выраженность острофазового ответа и антиэндотоксинового иммунитета у женщин с дисбиозом влагалища.
3. Определить состояние системы гемостаза, антикоагулянтной системы и параметров дисфункции эндотелия в связи с особенностями клинической и мик робиологической картины вагиноза и эндотоксинемии у женщин репродуктивно го возраста.
4. Обозначить патогенетическое значение обнаруженных сдвигов, опреде лить необходимость и направление подходов их коррекции.
Научная новизна исследования. Установлено, что влагалищная микро биота женщин при бактериальном вагинозе характеризуется повышением общей микробной обсемененности на фоне существенного уменьшения концентрации Lactobacillus spp., с превалированием аэробных и факультативно-анаэробных гра мотрицательных бактерий. Определена этиологическая роль представителей се мейства Mycoplasmataceae, в частности М. hominis и U. urealyticum в развитии бактериального вагиноза.
У женщин с бактериальным вагинозом выявлено умеренное повышение уровня ЛПС грамотрицательных бактерий в системном кровотоке, сопровождаю щееся активацией неспецифического иммунитета, с существенным повышением уровня провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-), увеличением плазмен ной концентрации главного острофазового реактанта - С-реактивного белка, уро вень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза. Осо бенностью специфического иммунного ответа при БВ является увеличение выра ботки антител к core-региону ЛПС и тенденция к активации синтеза ЛПС связывающего белка – LBP на начальных этапах БВ и их снижением при утяже лении дисбиоза.
При БВ в условиях системной эндотоксинемии впервые показаны: развитие слабых гипокоагуляционных сдвигов (незначительное удлинение АЧТВ и ПВ, не изменность уровня фибриногена, D-димера и РФМК), тенденция к активации ан тикоагулянтного звена с увеличением уровня плазменного антитромбина и про теина С, коррелирующая с выраженностью дисбиоза. Реакция эндотелиальной системы проявлялась умеренно выраженной тенденцией к нарастанию уровня эн дотелина, адгезивных молекул sPECAM-1 и sVCAM-1 и снижению концентрации фактора Виллебранда по мере утяжеления дисбиотического процесса. В целом отклик системы гемостаза носил адаптивный характер и свидетельствовал о ком пенсированности эндотоксинового воздействия, вместе с тем, допуская возмож ность выхода из-под контроля при продолжающейся эндотоксической агрессии и развития осложнений вплоть до ДВС крови.
Теоретическая и практическая значимость работы. Определены подхо ды к оценке значимости выявления этиологического фактора при вагинозах у женщин репродуктивного возраста, диагностическая значимость определения уровня циркулирующих эндотоксинов и компонентов антиэндотоксиновой защи ты, а также сдвигов параметров гемостаза. На основании обнаруженных измене ний сформулированы подходы к выявлению и коррекции сдвигов гемостаза и эн дотелиальной дисфункции на фоне эндотоксинемии при бактериальном вагинозе, предполагающие контроль состояния гемостаза при декомпенсации БВ и, при не обходимости, принятие коррегирующих мер.
Положения, выносимые на защиту:
1. Бактериальный вагиноз у женщин возрастной категории 20-29 лет обнаружен в 65% случаев. Видовой и количественный состав влагалищной микрофлоры при вагинозе характеризуется повышением общей микробной обсемененности на фо не снижения количества Lactobacillus spp. и преобладания аэробных и факульта тивно-анаэробных грамотрицательных бактерий;
во всех случаях наблюдаются ассоциации микроорганизмов. Грамотрицательная микрофлора при бактериаль ном вагинозе в основном представлена бактериями семейства Enterobacteriaceae.
2. При прогрессировании бактериального вагиноза наблюдается тенденция к на растанию уровня липополисахарида грамотрицательных бактерий в плазме крови пациентов.
Бактериальный вагиноз сопровождается активацией неспецифического им 3.
мунитета с повышением уровня провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-) и плазменной концентрации С-реактивного белка, уровень которого четко корре лирует с выраженностью вагинального дисбиоза. Специфический иммунный от вет организма на начальных этапах бактериального вагиноза проявляется умерен ным повышением концентрации липополисахарид-связывающего белка и нарас танием титров антител к core-региону липополисахарида с последующим их снижением при утяжелении дисбиоза.
При бактериальном вагинозе отмечается умеренно выраженная тенденция к 4.
гипокоагуляции - незначительное удлинение активированного частичного тром бопластинового времени и протромбинового времени на фоне неизменного уров ня фибриногена и отсутствия маркеров активации свертывания крови. Реакция антикоагулянтного звена заключается в тенденции к увеличению плазменной ан титромбиновой активности и возрастанию уровня протеина С.
В условиях дисбиоза отмечается вовлеченность клеток сосудистого эндоте 5.
лия в антиэндотоксиновые реакции с относительным ростом уровня молекул ад гезии sPECAM-1 и sVCAM-1 и фазными изменениями уровня маркеров эндотели альной дисфункции (эндотелин-1, фактор Виллебранда).
Поступление липополисахарида грамотрицательных бактерий в организм 6.
при бактериальном вагинозе в целом не вызывает иммунопатогенного эффекта, не выходит за рамки «физиологической системной эндотоксинемии» и может слу жить фактором поддержания иммунного гомеостаза организма.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследова ния внедрены в работу женской консультации и гинекологического отделения МУ «Городская клиническая больница № 21» города Уфы, а также в учебный процесс кафедры лабораторной диагностики ИПО ГБОУ ВПО «Башкирский Государст венный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.
Апробация. Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях (IV междуна родный конгресс «Проблемы репродукции» (Москва, 2010);
II ежегодный Всерос сийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2010);
IV региональный научный форум «Мать и дитя» (Екатеринбург, 2010);
IX Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (Москва, 2007);
I региональный научный форум «Мать и дитя» (Казань, 2007);
21 конгресс Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины (Берлин, 2011). Апробация работы состоялась на со вместном заседании сотрудников кафедр лабораторной диагностики ИПО, фун даментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государст венный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание уче ной степени кандидата медицинских наук.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 18 рисунков, включает введение, об зор литературы, описание материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список использованной литературы, включающий 98 отечествен ных и 103 зарубежных авторов.
Конкурсная поддержка работы. Работа выполнена при поддержке феде ральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инноваци онной России» на 2009–2013 гг., в рамках реализации мероприятия 1.2.1 «Государ ственный контракт № П385 от 30 июля 2009 г.» СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились женщин репродуктивного возраста, обратившиеся в женскую консультацию МУ «Городская клиническая больница № 21» города Уфы в 2009-2010 годы. Из них 183 здоровых составили контрольную группу;
у 122 женщин, составивших основ ную группу наблюдения, был поставлен диагноз БВ. Проводили анкетирование (возраст, характер профессии, некоторые социально-демографические сведения), регистрировали данные акушерско-гинекологического анамнеза, жалобы на мо мент поступления, данные объективного и вагинального осмотров, результаты клинико-лабораторных и специальных исследований.
Для оценки микроскопической картины влагалищного биоценоза проводили световую микроскопию окрашенных по Граму мазков (микроскоп Люмам-Р8, ЛОМО, г. Санкт-Петербург). Степень дисбиоза влагалища определялась микро скопически по критериям, предложенным Мавзютовым А.Р. и соавт. (2001). Ко личественно и качественно влагалищный микробиоценоз характеризовали куль туральным методом у 45 женщин основной группы и 26 клинически здоровых женщин на соответствующих питательных средах. Для культивирования исполь зовались сухие коммерческие питательные среды производства НПО «Питатель ные среды» (г. Махачкала) и фирмы «Вio-Merieux» (Франция). Микроорганизмы культивировали в термостате при 37оС, дрожжеподобные грибы - при 22оС. Мик роаэрофилы (G. vaginalis, Lactobacillus spp.) выращивали в эксикаторах с исполь зованием газ–паков GEN Bag Anaer фирмы «Bio-Merieux», Франция. По оконча нии инкубации производился подсчет всех выросших колоний (КОЕ) и пересчет на 1 мл клинического материала. Результаты бактериологического исследования выражали в КОЕ/мл и рассчитывали десятичный логарифм колониеобразующих единиц – lg КОЕ/мл (логарифмическое микробное число). В качестве критериев нормоценоза учитывали микробную обсемененность 106-108 КОЕ/мл. а условно патогенными микроорганизмами - не более 104 КОЕ/мл Микроорганизмы иден тифицировали по биохимическим признакам с использованием коммерческих тест-систем «ЛАХЕМА», Чехия (Strepto-test, Stafi-test, Entero-test, EnteroRapid test, Neferm-test);
«Bio Merieux», Франция (ID 32 E, ID 32 Staf, ID 32 Strep, ID GN, ID 32 Cand, ID 32 A);
НПО «Диагностические системы», г. Н.Новгород (ПБДЕ, ПБДС). Методом ПЦР определялись специфические фрагменты ДНК Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae с использова нием стандартных наборов («Интерлабсервис», «Литех», «ДНК-технология», Рос сия) на амплификаторе «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия). Этиологи ческую значимость M. hominis и U. urealyticum оценивали методом ИФА с ис пользованием тест-систем фирмы «Вектор-Бест» (Россия).
Для оценки уровня эндотоксина в плазме крови и выраженности антиэндо токсинового иммунитета у 122 женщин с БВ (основная группа) и 183 здоровых женщин из группы контроля в сыворотке крови были определены концентрации липополисахаридов, липополисахарид-связывающего белка (LBP) и титров IgG к соre-региону липополисахарида (IgG EndoCab) в плазме крови. Пациентки из ос новной группы по выраженности БВ были разделены на три подгруппы: 1-ю под группу составили 26 (21%) женщин с первой степенью дисбиоза;
2-ю - 10 (8%) пациенток со второй степенью;
86 (70%) с 3-й степенью дисбиоза влагалища – 3 ю подгруппу наблюдения. Для определения уровня ЛПС использовали тест-набор ENDOSAFE® ENDOCHROME™ («HyСult biotechnology», Голландия). Предел чувствительности метода - 0,01 EU/мл, диапазон измеряемых концентраций - от 0,01 до 10 EU/мл. Тест основан на способности липополисахарида вызывать коа гуляцию белковых фракций гемолимфы амебоцитов краба Limulus polyphemus.
Количественное определение человеческого LBP и IgG EndoCab-антител в плазме крови осуществляли иммуноферментным методом при помощи наборов Hbt hu man LBP ELISA и Hbt EndoCab ELISA («HyСult biotechnology», Голландия).
Концентрации в плазме крови TNF-, IL -1, IL-2, IL-6, IL-8 и противовос палительных цитокинов (IL- 4, IL - 10) определяли методом ИФА («Вектор-Бест», Россия), СРБ - при помощи набора hsCRP ELISA, («Biomerica», Австрия).
Для определения скрининговых параметров плазменного звена гемостаза (АЧТВ, ПВ, уровень фибриногена) использовали клоттинговый метод. Материа лом служила свежая цитратная плазма, исследование проводили с помощью коа гулометра АСКа-2-01 фирмы «Астра» (Россия) с использованием тест-наборов фирмы «Технология Стандарт» (Россия). Определение маркеров дисфункции эн дотелия (фактор Виллебранда, большой эндотелин-1, sPECAM-1, sVCAM-1) в плазме крови применялся ИФА-метод с использованием наборов: Technozym vWF Ag ELISА, производства «Technoclone» (Австрия);
BIG ENDOTHELIN («Biomedi ca Gruppe», Австрия);
«Bender MedSystems». При определении маркеров актива ции свертывания (РФМК, D-димер) применялся метод экспресс-оценки содержа ния в плазме крови РФМК - паракоагуляционный о-фенантролиновый тест (НПО «РЕНАМ», Россия);
полуколичественный метод латекс-агглютинации с использо ванием стандартных тест-систем «Tulip Diad», (Индия) для D-димера. Для опре деления концентрации факторов антикоагулянтной системы (АТ-III, протеин С) в плазме крови использовали количественный ИФА-набор Technozym Protein C ELISA, фирмы «Technoclone» (Австрия) и тест-систему Аntithrombin ELISA (фирма Siemens, Германия). Иммуноферментные исследования проводились на ИФА-анализаторе «BioRad iMark» (США).
Обработка данных осуществлялась с применением современных пакетов прикладных программ математико-статистического анализа (Реброва О.Ю., 2003).
Характер распределения количественных признаков оценивался по критерию Колмогорова-Смирнова. Если показатель имел нормальное распределение, то применялись методы параметрической статистики (расчет средней арифметиче ской и ее стандартной ошибки, критерия Стьюдента, коэффициента линейной корреляции Пирсона). Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялась медиана и проводился ранговый анализ по методу Краскела Уоллиса. Достоверность различий количественных показателей оценивалась по критерию Манна-Уитни, а относительных показателей - по 2-критерию Пирсона.
С целью проверки гипотезы о влиянии степени дисбиоза влагалища на уровень эндотоксина (LAL) и иммунного ответа (LBP и антитела к сore-региону) нами был использован метод однофакторного дисперсионного анализа. Результаты анализа выражались через коэффициент силы влияния фактора, показывающий долю (в %) вариации исследуемого признака под действием контролируемых факторов, и критерии достоверности влияния - критерий F, и его уровень значимости p. Влия ние фактора менее 5% в расчет не принималось. Результаты дисперсионного ана лиза по Фишеру интерпретировались по значению r - коэффициента корреляции количественного признака с качественным или категориальным;
в роли фактора выступали как количественные, так и качественные переменные. Результаты так же представлялись в виде «отклика» переменной на действие фактора или сочета ний факторов – средних значений переменных (с указанием границ их вариации) при различных градациях фактора. Для сравнения отдельных средних значений использовался критерий Fd (Гареев Е.М., 2009).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Возраст пациенток основной группы составил в среднем 28,1±0,6 лет, жен щин контрольной группы - 26,4±0,3 лет (р0,05). Доля женщин с БВ в возрастной категории 20-29 лет достигала 64%, тогда как в возрасте 30-39 лет и 40-49 лет 25% (р0,001) - 12% (р0,0001), соответственно.
На обильные выделения из половых путей указывали 90% женщин основ ной группы, на зуд, жжение во влагалище и в области гениталий - каждая вторая пациентка. Женщины с бактериальным вагинозом чаще отмечали наличие «спе цифического» запаха влагалищного отделяемого (р0,001). Положительный аминный тест имел место у 45 % женщин с БВ. При этом были выявлены стати стически достоверные различия между показателями рН содержимого влагалища у женщин основной и контрольной групп (соответственно 5,67±0,04 и 3,89±0,03, р0,001). Присутствие ключевых клеток было обнаружено в 85% влагалищных мазков основной группы и полностью отсутствовали у здоровых пациенток. Ре зультаты бактериоскопического исследования мазков влагалищного отделяемого соответствовали 1-й степени дисбиоза (компенсация) в 21% случаев, 2-й степени дисбиоза (субкомпенсация) и 3-й степени (декомпенсация) - в 8 % и 71 % соответ ственно.
При бактериологическом исследовании вагинального секрета у женщин обеих сравниваемых групп было выявлено значимое повышение уровня микроб ной обсемененности влагалища в условиях дисбиоза до 11,2±1,32 1g КОЕ/мл про тив 8,23±0,74 1g КОЕ/мл в группе контроля (р0,0001). В 64,5% посевов у паци енток с БВ регистрировалось наличие Lactobacillus spp. в средней концентрации 3,53±0,56 lg КОЕ/мл (в норме 7-8 lg КОЕ/мл). Между степенью дисбиоза и уров нем колонизации Lactobacillus spp. имелась обратная корреляционная связь (r= 0,6;
р0,01). В 100% случаев у женщин с БВ микроорганизмы выявлялись в ассо циациях;
среднее количество видов-ассоциантов составляло 2,75±0,08. Напротив, в условиях влагалищного нормоценоза в 69% случаев выделялись монокультуры бактерий при среднем количестве высеваемых штаммов условно-патогенных микроорганизмов 1,73±0,13 (р0,001). Спектр микроорганизмов, выделенных при БВ, отличался большим разнообразием и включал в себя представителей семейст ва Streptococcасеае, бактерии рода Staphylococcus, Clostridium spp. В каждом третьем случае у женщин с дисбиотическими нарушениями влагалищного микро биоценоза были выделены дрожжеподобные грибы рода Candida Степень обсемененности влагалища аэробными и факультативно анаэробными грамотрицательными бактериями при дисбиозе в 2,5 раза превыша ла данные контрольной группы (p0,0001).
Видовая идентификация микрофлоры во влагалище женщин с БВ показала превалирование Enterobacteriaceae (E. coli, E. agglomerans, E. aerogenes, K.
cryocrescens, H. alvei, S. odorifera, K. ozaenae), которые были обнаружены в 38% случаев. У женщин с дисбиозом влагалища в 4,4% случаев выделены нефермен тирующие грамотрицательные диплококки - Moraxella (Branhamella) catarrhalis и Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia (уровень обсемененности 6 и 2 lg КОЕ/мл соответственно), в то время, как у здоровых женщин флора в каждом пя том случае была представлена исключительно бактериями рода Escherichia (табл.1).
Таблица Частота выделения и концентрация условно-патогенных грамотрицательных бак терий в вагинальном секрете женщин с бактериальным вагинозом и здоровых женщин Бактериальный вагиноз Нормоценоз Частота Среднее Частота вы- Среднее Вид микроорганизма выделения, % содержание, деления, % содержание, (абс. число lg КОЕ/мл (абс. число lg КОЕ/мл случаев) (М±Se) случаев) (М±Se) Stenotrophomonas maltophilia 2,20 (1) 2,00 - Branhamella catarrhalis 2,20 (1) 6,00 - Enterobacter agglomerans 2,20 (1) 11,00 - Enterobacter aerogenes 2,20 (1) 9,00 - Escherichia coli 22,00 (10) 6,10±0,80 23,30 (5) 2,60±1, Klebsiella ozaenae 2,20 (1) 2,00 - Kluyvera cryocrescens 2,20 (1) 4,00 - Hafnia alvei 4,40 (2) 7,90±0,60 - Serratia odorifera 2,20 (1) 11,00 - Итого 42,20 (19) - 23,30 (5) U. urealyticum методом ПЦР были выявлены у 6,6 % пациенток основной группы и у 7,6 % здоровых женщин, M. hominis - у каждой третьей женщины с БВ (31 %) и у 15 % пациенток с влагалищным нормоценозом. В 6,6 % образцов ваги нального отделяемого при БВ одновременно обнаруживались M. hominis и U.
urealyticum. В 67 % случаев при этом методом ИФА было выявлено превышение пороговых титров антиуреаплазменных IgG в 2-8 раз (в среднем в 4 раза). Среди пациенток основной группы, во влагалищном отделяемом которых присутствова ли M. hominis, в 100% случаев отмечалось превышение концентрации антимико плазменных IgG в среднем в 3,5 раза. У 6,6 % обследованных пациенток БВ раз вивался на фоне урогенитального хламидиоза.
Уровень ЛПС в образцах плазмы обеих исследуемых групп находился в пределах физиологической концентрации (норма 0-1 ЕU/ мл) и статистически значимо не различался, составив в среднем 0,43±0,03 EU/мл у здоровых женщин и 0,54±0,52 EU/мл у пациенток с БВ (р0,05). Однако при этом выявлено статисти чески значимое (F=5,7, p0,001), но относительно слабое (=10%;
r*=0,32) влия ние на уровень ЛПС степени дисбиоза влагалища. Так, при третьей степени БВ средний уровень ЛПС (0,688±0,56 ЕU/ мл) оказался достоверно (p0,001) выше, чем при первой и второй степенях (0,37±0,22 ЕU/ мл и 0,38±0,33 ЕU/ мл, соответ ственно) (рис.1). При дисбиозе третьей степени мера внутригрупповой случайной вариации уровня ЛПС (Sd) была статистически значимо выше (p0,003), чем при первых двух степенях дисбиотического процесса. Критерий Краскела-Уоллиса подтвердил, что наблюдаемые тенденции статистически значимы (Hk=8,1, p0,05), равно как и различие третьей степени дисбиоза с первой и второй по кри терию Манна-Уитни (U200, p0,03).
Рис. 1. Средние значения концентрации липополисахарида при различных степе нях вагинального дисбиоза. По оси абсцисс – степень дисбиоза, по оси ординат – концентрация ЛПС в ЕU/мл, ГДИ - границы доверительных интервалов для сред них значений, СО – стандартная ошибка средней.
Концентрации липополисахаридсвязывающего белка (LBP) в крови пациен ток с БВ и здоровых женщин (33,4±1,9 мкг/мл и 36,5±1,2 мкг/мл;
р0,05) значимо не различались, но зависели от степени дисбиотических изменений во влагалищ ном биотопе. Влияние этого фактора достоверным, но слабым (=7%, F=3. p0,02). Тем не менее, средний уровень LBP при третьей степени бактериального вагиноза (23,3±16,5 мкг/мл) оказался значимо (p0,02, Нk=7,3) ниже показателя при первых двух степенях (34,5±10,9 мкг/мл и 31,8±12,7 мкг/мл, соответственно), которые, в свою очередь, достоверно не различались (p0,3).
Уровень LBP при третьей степени БВ достоверно (p0,05) отличался от первых двух степеней дисбиоза влагалища, тенденции различия показателей по подгруппам 1 и 3 были статистически значимыми (Hk=7,3;
p0,05). Отмечалось некоторое снижение однородности пациенток (увеличение Sd) по уровню LBP при третьей степени дисбиоза.
При оценке уровня антител класса IgG к core-региону липополисахарида было констатировано их увеличение в 2,3 раза в плазме крови женщин с БВ по сравнению с контролем (0,78±0,39 MU/мл и 0,34±0,17 MU/мл;
р=0,0015).
Уровень anti-core IgG зависел от степени БВ (=32%, r*=0,56;
F=22,6;
p0,0001): был выше при первой степени БВ (1,15±0,81 MU/мл) в сравнении со второй (0,56±0,28 MU/мл) и третьей (0,45±0,27 MU/мл) степенями;
различия по следних не были выраженными (p0,3).
Рост уровня IgG к core-региону при первой степени дисбиоза влагалища со провождался 3-4-кратным статистически значимым (p0,001) ростом межиндиви дуальной вариации (Hk=35,2;
p0,0001).
Для определения возможных корреляций уровня липополисахарида мы провели определение концентрации ряда цитокинов различной направленности.
Плазменная концентрация TNF- в основной группе в 2 раза превышала уровень контроля. При вагинальном дисбиозе отмечалось статистически значимое повышение уровня IL-2 (5,77±0,87 пг/мл у больных и 3,1±0,48 пг/мл у здоровых) и IL-6 (0,88±0,1 пг/мл и 0,48±0,043 пг/мл, соответственно, р0,001). В то же время концентрация IL-10 почти вдвое превышала среднестатистическую норму в обеих группах. Установлена взаимосвязь между уровнями цитокинов различной направ ленности и степенью тяжести дисбиотического процесса, что проявлялось тен денцией к уменьшению концентрации TNF-, IL-1 и IL-8 по мере усугубления дисбиоза. Косвенным подтверждением этому были иные тенденции изменений уровня IL-2 и IL-6 (существенное повышение при БВ 2-й степени и некоторое снижение в дальнейшем). Уровень противовоспалительного IL-4, напротив, имел тенденцию только к повышению, а IL-10 изменялся мало.
Корреляционный анализ выявил наличие, в основном, небольшой сопря женности показателей уровня эндотоксина (LAL-тест), антиэндотоксинового им мунитета и цитокинов различной функциональной направленности у пациенток с БВ (табл. 2). Установлена статистически значимая слабая прямая корреляционная связь между уровнем эндотоксина и концентрацией IL-2 и IL-10 (р0,05), а также обратная связь средней силы между уровнем LBP в крови и концентрацией IL-4.
Уровень LBP и содержание IL-1 также имели слабую прямую корреляционную взаимозависимость, LBP и TNF- – слабую обратную взаимосвязь. При повыше нии уровня антител класса IgG к core-региону ЛПС проявлялась статистически не очень отчетливая тенденция к снижению уровня IL-4.
Таблица Корреляция уровня липополисахарида и связывающих его белков с плазменной концентрацией различных цитокинов у женщин с БВ Связь с уровнем ли Связь с уровнем Связь с уровнем Показатели: пополисахарида (LAL LBP anti-core IgG тест) r = 0,138 r = -0,233 R = 0, TNF- P = 0,153 P = 0,022* P = 0, r = 0,139 r = 0,232 R = 0, IL- P = 0,153 P = 0,022* P = 0, r = 0,218 r = -0,406** r = 0, IL- P = 0,023* P 0,001 P = 0, r = -0,001 r = 0,046 r = -0, IL- P = 0,986 P = 0,658 P = 0, r = 0,122 r = -0,007 r = 0, IL- P = 0,247 P = 0,944 P = 0, r = 0,170 r = -0,192 r = -0, IL- P = 0,078 P = 0,061 P = 0, r = 0,282 r = -0,108 r = -0, IL- P = 0,004* P = 0,305 P = 0, Примечание: * - достоверная корреляционная связь любой степени, ** - достоверная корреля ционная связь средней степени Концентрация С-реактивного белка была статистически значимо выше у женщин с БВ в сравнении с контролем (р0,0001). Средний уровень СРБ в плазме крови пациенток при 1-й степени дисбиоза составил 0,47±0,17 мг/л, при 2-й сте пени - 0,78±0,36 мг/л, при 3-й - 3,12±0,53 мг/л соответственно. Таким образом, за метна тенденция к возрастанию уровня СРБ по мере прогрессирования дисбиоти ческого процесса (р0,05).
У пациенток с БВ отмечена тенденция к удлинению АЧТВ (37,8±0,7 сек). В контрольной группе этот показатель составил 32,7±2,1 сек (референтные пределы 21-35 сек);
отличия не были статистически значимыми (р0,05). Показатель про тромбинового времени (ПВ) у пациенток с БВ также имел тенденцию к возраста нию, составив 14,3±0,7 сек против 12,8±2,4 сек в контрольной группе (референт ный интервал - 10-14 сек). Уровень фибриногена в плазме крови пациенток с БВ и здоровых женщин практически не различался, составив 2,70±0,06 г/л и 2,71±0, г/л соответственно (референтные пределы 2,0 - 4,0 г/л).
У женщин как с дисбиозом влагалища, так и с нормоценозом влагалищного биотопа результаты исследования РФМК в плазме крови были отрицательными (уровень РФМК не превышал физиологических значений 4,0 мг/л). Концентрация D-димера в обеих группах не превосходила 0,2 нг/мл, что также соответствовало его физиологическому уровню в крови.
Существенным явилось обнаружение (в 1,3 раза;
р0,001) увеличение кон центрации протеина С в плазме крови женщин основной группы по сравнению с контролем, причем по мере усугубления дисбиоза влагалища прослеживается тенденция к нарастанию уровня протеина С в плазме крови.
В результате проведенных исследований выявлено, что активность АТ III в плазме крови пациенток с БВ и здоровых женщин составила 98,6 и 94,5 % от уровня референтной пулированной плазмы соответственно (табл. 6). В целом ан титромбиновая активность при БВ укладывалась в границы референтного кори дора (75-125 %) и лишь слегка превышала уровень контроля, что можно связать с небольшим ускорением его синтеза ввиду слабого «раздражения» ткани печени циркулирующим эндотоксином, либо цитокинами. В ходе исследования проявля лась легкая тенденция к снижению активности АТ III у пациенток по мере усу губления дисбиоза влагалища.
Для оценки степени раздражения или повреждения тромбоцитов у пациен ток с БВ определялся уровень sPECAM-1 - эндотелиальной молекулы адгезии тромбоцитов (СD13). В ходе экспериментов нами было выявлено, что у женщин с дисбиозом влагалища и в контрольной группе концентрация sPECAM-1 сохраня лась в референтных пределах (42,8 - 91,0 нг/мл). Однако отмечалось ее достовер ное увеличение у пациенток с БВ III степени по сравнению со всеми остальными группами, что указывает на активацию клеток эндотелия с экспрессией CD13 на их поверхности и, соответственно, на более высокую степень «готовности» к ад гезии и агрегации тромбоцитов.
При оценке уровня плазменной концентрации эндотелина-1 у пациенток с БВ и здоровых женщин контрольной группы он не превышал предела физиологи ческой нормы (1 пг/мл), но вместе с тем наблюдалась некоторая тенденция к по вышению его уровня при БВ. Были установлены статистически значимые разли чия исследуемого показателя по мере прогрессирования дисбиотического процес са: уровень эндотелина-1 был выше в 1,7 раза у женщин с 3-й степенью дисбиоза по сравнению со 2-й степенью тяжести дисбиотического процесса, и в 1,4 раза выше по сравнению с 1-й степенью БВ (р=0,03).
Обнаружена недостоверная тенденция к возрастанию не менее важного маркера дисфункции эндотелия - фактора Виллебранда у женщин с БВ (р0,05). В зависимости от степени дисбиоза влагалища у пациенток статистически значимых различий уровня vWF выявлено не было, хотя его уровень несколько снижался при утяжелении БВ (р0,05).
Определение уровня sVCAM-1 - сосудистой молекулы адгезии (CD106) вы явило, что у пациенток с дисбиозом влагалища не выходил за референтные преде лы (675-1693 нг/мл), но прослеживается его рост по мере утяжеления бактериаль ного вагиноза: при I степени – на 19 %, при II степени – на 28,2 %, при III степени – на 39,6 %, причем у 16 % пациенток показатель превысил референтный предел.
Различия между контрольной группой и группами пациенток с бактериальным ва гинозом были статистически значимыми (р=0,021, р=0,05 и р=0,037 соответствен но). Полученные данные свидетельствовали о значимой активации лейкоцитарно го звена при вагинальном дисбиозе.
ВЫВОДЫ У женщин в возрастной категории 20-29 лет бактериальный вагиноз диагно 1.
стируется в 65% случаев, что в три раза превышает показатели в возрасте 30- лет и в пять раз - в возрастной категории 40-49 лет. При этом бактериальный ва гиноз характеризуется повышением общей микробной микробной обсемененно сти до 11,2±1,32 lg КОЕ/мл (в контроле - 8,23±0,74 lg КОЕ/мл) на фоне снижения количества Lactobacillus spp. до 3,53±0,56 lg КОЕ/мл (в контроле - 6,67±0,46 lg КОЕ/мл). Преобладающую часть микрофлоры (61,2 – 82,3%) составляют аэроб ные и факультативно-анаэробные грамотрицательные бактерии;
в 100% случаев обнаруживаются ассоциации микроорганизмов со средним количеством видов ассоциантов 2,75±0,08.
Среди представителей влагалищной грамотрицательной микрофлоры при 2.
бактериальном вагинозе превалируют бактерии семейства Enterobacteriaceae (38% случаев). Дисбиоз различной степени тяжести не сопровождается значимыми из менениями уровня липополисахарида грамотрицательных бактерий в плазме кро ви пациенток, но наблюдается тенденция к нарастанию концентрации эндотокси на при прогрессировании дисбиотического процесса во влагалище.
3. Вагинальный дисбиоз сопровождается активацией неспецифического имму нитета и сдвигами цитокинового баланса с существенным повышением уровня провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-) в плазме крови пациенток.
Следствием цитокиновой стимуляции является выраженный рост плазменной концентрации главного острофазового реактанта - С-реактивного белка, уровень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза. В то же время специфический иммунный ответ организма на начальных этапах бактери ального вагиноза проявляется умеренным повышением концентрации липополи сахарид-связывающего белка и нарастания титров антител к core-региону липопо лисахарида с последующим их снижением при утяжелении дисбиоза.
4. У женщин с дисбиозом влагалища отмечается умеренно выраженная тенден ция к гипокоагуляции, проявляющаяся незначительным удлинением активиро ванного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени на фоне неизменного уровня фибриногена и отсутствия маркеров активации сверты вания крови (растворимые фибрин-мономерные комплексы, D-димер). Реакция антикоагулянтного звена заключается в тенденции к увеличению плазменной ан титромбиновой активности и статистически значимому возрастанию уровня про теина С.
5. В условиях бактериального вагиноза отмечается вовлеченность клеток сосу дистого эндотелия в патогенетический процесс, проявляющаяся относительным ростом уровня молекул адгезии sPECAM-1 и sVCAM-1 в плазме крови пациенток и неотчетливыми фазными изменениями уровня маркеров эндотелиальной дис функции (эндотелин-1, фактор Виллебранда).
6. Поступление липополисахарида грамотрицательных микробов в организм при бактериальном вагинозе, в целом, не вызывает выраженного иммунопатогенного эффекта, не выходит за рамки физиологической системной эндотоксинемии и может служить фактором поддержания иммунного гомеостаза организма. Реак цию иммунной системы и системы гемостаза в ответ на поступление липополиса харида при вагинальном дисбиозе можно расценить как адаптивную, но способ ную при наличии отягчающих факторов перерасти в патологическую.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для повышения информативности лабораторных исследований при 1.
бактериальном вагинозе необходимо учитывать наиболее показательные количе ственные изменения микрофлоры при дифференцировании дисбиотических со стояний вагинального микробиоценоза по степени тяжести.
Для выявления специфических вариантов дисбиоза влагалища, ассо 2.
циированных с M.hominis и U.urealyticum, необходимо определение уровней со ответствующих видоспецифических IgG и учет в качестве диагностически значи мого признака лишь их выявления у женщин с дисбиозом влагалища 3 степени (декомпенсированного).
При декомпенсированных вариантах дисбиоза влагалища для оценки 3.
степени вовлеченности иммунной системы и системы гемостаза рекомендуется дополнительное определение концентрации липополисахарида, уровня липополи сахарид-связывающего белка, антител к core-региону ЛПС в плазме крови, а так же мониторинг показателей плазменного и эндотелиального звеньев системы ге мостаза для адекватного реагирования на выявленные изменения посредством проведения дезинтоксикации и соответствующей иммунокоррекции.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1 Бондаренко, К.Р. Социально-гигиеническая и эпидемиологическая харак теристика женщин с бактериальным вагинозом / К.Р. Бондаренко, Ю.Р. Гайсина // Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике: сборник научных трудов, посвященный 70-летию кафедры инфекционных болезней. - Уфа, 2006. – С. 126-128.
2 Гайсина, Ю.Р. Бактериальный вагиноз и течение беременности, ее исходы, послеродовый период / Ю.Р. Гайсина, К.Р. Бондаренко, Л.Н. Гараева, С.Г. Хасано ва, Г.Ф. Хасанова, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы первого регионально го научного форума. – Казань, 2007. – С. 30-31.
3 Бондаренко, К.Р. Клинико-лабораторные особенности бактериального ва гиноза у женщин репродуктивного возраста / К.Р. Бондаренко, Л.Н. Гараева, Ю.Р.
Гайсина, С.Г. Хасанова, Г.Ф. Хасанова, А.О. Акбашева, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы первого регионального научного форума. – Казань, 2007. – С. 204 205.
4 Аглямова, Д.Р. Акушерские и перинатальные осложнения у беременных, страдающих бактериальным вагинозом / Д.Р. Аглямова, К.Р. Бондаренко, Ю.Р.
Гайсина, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы девятого всероссийского науч ного форума. – М., 2007. – С. 7-8.
5 Гайсина, Ю.Р. Концентрация липополисахаридсвязывающего белка и некоторые параметры гемостаза при бактериальном вагинозе / Ю.Р. Гайсина, Д.Р. Аглямова, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2008. – № 9. – С. 25.
6 Гайсина, Ю.Р. Уровень липополисахарид-связывающего белка и некото рые особенности системы гемостаза при бактериальном вагинозе / Ю.Р. Гайсина, К.Р. Бондаренко, А.Н. Еникеев, А.З. Муллагалина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Проблемы репродукции: материалы четвертого международного конгресса по репродуктивной медицине. – М., 2010. – С. 173.
7 Хамадьянов, У.Р. Анализ особенностей течения беременности и послеро дового периода у женщин с высоким инфекционным риском / У.Р. Хамадьянов, А.Р. Мавзютов, А.Н. Еникеев, Ю.Р. Гайсина, К.Р. Бондаренко // Проблемы репро дукции: материалы четвертого международного конгресса по репродуктивной ме дицине. – М., 2010. – С. 133.
8 Бондаренко, К.Р. Оценка эффективности применения сорбента «Энтерос гель» в лечении бактериального вагиноза / К.Р. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.Р.
Гайсина, А.З. Муллагалина, А.Р. Мавзютов // Проблемы репродукции: материалы четвертого международного конгресса по репродуктивной медицине. – М., 2010. – С. 171-172.
9 Бондаренко, К.Р. Противомикробный антиэндотоксиновый иммунитет у женщин при бактериальном вагинозе / К.Р. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.Р. Гайси на, А.Р. Мавзютов // Материалы Второго ежегодного всероссийского конгресса по инфекционным болезням. – М., 2010. – С. 44.
10 Бондаренко, К.Р. ПС-ассоциированные иммунопатогенетические осо бенности урогенитального хламидиоза / К.Р. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.Р.
Гайсина, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2010. – № 9. – С. 33-34.
11 Бондаренко, К.Р. Некоторые иммунопатогенетические особенности бакте риального вагиноза в период беременности / К.Р. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.Р.
Гайсина, Р.М. Муллагулова, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы четвертого регионального научного форума. – Екатеринбург, 2010. – С. 43-44.
12 Ахмадуллина, Ю.А. Параметры гемограммы при бактериальном ва гинозе у женщин репродуктивного возраста / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайси на, К.Р. Бондаренко, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабора торная диагностика. – 2010. – № 10. – С. 19.
13 Гайсина, Ю.Р. Взаимосвязи параметров гемостаза и клинических про явлений бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста / Ю.Р.
Гайсина, К.Р. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильма нов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2010. – № 10.
– С. 20.
14 Гайсина, Ю.Р. Эндотоксинемия и влияние микробных липополиса харидов на систему гемостаза у женщин с бактериальным вагинозом / Ю.Р.
Гайсина, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Медицин ский вестник Башкортостана. – 2011. – Т. 6, № 3. - С. 155-158.
15 Гайсина, Ю.Р. Об исследовании сывороточных иммуноглобулинов у женщин репродуктивного возраста при дисбиозе влагалища / Ю.Р. Гайсина, К.Р. Бондаренко, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Кли ническая лабораторная диагностика. – 2011. – № 10. – С. 6.
16 Ахмадуллина, Ю.А. Адгезивные молекулы, эндотелин и фактор Виллеб ранда как показатели реакции эндотелия на эндотоксическое воздействие при бак териальном вагинозе / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, Г.А. Идрисова, А.Р. Мав зютов, А.Ж. Гильманов // Современная лаборатория№4. Медицинский алфавит – 2011. - № 22. – С. 22-23.
17 Ахмадуллина, Ю.А. Маркеры эндотоксинемии и эндотелиальной дисфунк ции у женщин с бактериальным вагинозом / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, А.Р. Мавзютов, А.Ж. Гильманов // Медицинская биохимия и клиническая лабора торная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований: мате риалы Всероссийской научно–практической конференции биохимиков и специали стов по лабораторной диагностике. - Омск, 2011. – С. 36-40.
18 Бондаренко, К.Р. Иммунопатогенетические эффекты липополисахаридов грамотрицательных бактерий при бактериальном вагинозе / К.Р. Бондаренко, Ю.Р.
Гайсина, Ю.А. Ахмадуллина, А.А. Мавзютова, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: ма териалы V регионального научного форума. – Геленджик, 2011. - С. 185-186.
19 Ahmadullina, Yu. Hemostasis and CBC shifts caused by entotoxicosis at vaginal dysbiosis / Yu. Ahmadullina, Yu. Gaisina, K. Bondarenko, A. Mavzjutov, A. Gilmanov // 21 International congress of clinical chemistry and laboratory medicine. - Berlin, 2011. Р.- S605.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ В АВТОРЕФЕРАТЕ:
АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время ПВ – протромбиновое время АТ III - антитромбин III РФМК – растворимые фибрин-мономерные комплексы БВ - бактериальный вагиноз ИФА – иммуноферментный анализ ЛПС – липополисахарид EndoCAb - endotoxin-core antibody / антитела к core-региону липополисаха рида IgG – immunoglobulin G /иммуноглобулины класса G LBP – lipopolysaccharide binding protein / липополисахарид-связывающий бе лок vWF – von Willebrand factor / фактор Виллебранда ГАЙСИНА ЮЛИЯ РАМИЛЕВНА ОСОБЕННОСТИ МИКРОБНОГО ПЕЙЗАЖА, ЭНДОТОКСИНЕМИИ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА У ЖЕНЩИН С БАКТЕРИАЛЬНЫМ ВАГИНОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук