Особенности оксидативного стресса при нарушениях адаптации новорожденных
На правах рукописи
Хасанова Валентина Владимировна ОСОБЕННОСТИ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА ПРИ НАРУШЕНИЯХ АДАПТАЦИИ НОВОРОЖДЕННЫХ 03.01.04 – Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Челябинск – 2013
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
Цейликман Вадим Эдуардович
Официальные оппоненты: Камилов Феликс Хусаинович доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России Шаповалов Петр Яковлевич доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гигиены с основами экологии ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздрава России
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Защита состоится «»_2013 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России (454092, г.
Челябинск, ул. Воровского, 64).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии Автореферат разослан "" 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Н.В. Тишевская Актуальность Охрана здоровья матери и ребенка – приоритетное направление российского здравоохранения. Успехи в его решении во многом связаны со снижением заболеваемости и смертности, особенно в раннем постнатальном периоде. В то же время, не в полной мере в последние годы уделяется внимание проблемам раннего неонатального периода. Многие вопросы, связанные с данной тематикой, освещены недостаточно полно и требуют пристального внимания исследователей (Червакова Т.В., 2000;
Фролова О.Г., 2005).
Имеются серьезные проблемы, связанные с качеством здоровья плода и новорожденного, а показатели младенческой смертности в РФ, в сравнении с экономически развитыми странами, остаются на высоких цифрах (Шарапова О.В., 2003;
Володин Н.Н., 2003). Так по данным ВОЗ в РФ в 2011 году младенческая смертность составила 7, 3‰, тогда как в странах Европы этот показатель колеблется от 2‰ до 3,7‰. До 70% инвалидности детства является результатом патологии перинатального периода (Ивановская Т.Е., 1987;
Барашнев Ю.И., 2007;
Жарлыкасинова М.Б., 2009).
Важно акцентировать внимание на актуальных проблемах педиатрии, которые ставят наиболее острые задачи перед современной диагностикой. На сегодняшний день актуальным является выявление нарушений еще до появления клинически выраженных признаков болезни (Царегородцев А.Д., Сухоруков В.С., 2006).
Состояния новорожденных, отражающие процесс адаптации к родам, к новым условиям жизни, называют переходными (пограничными, транзиторными, физиологическими), которые появляются в родах или после рождения, и имеют транзиторный характер (Баранов А.А., Шиляев Р.Р., Каганов Б.С., 2005). Пограничными они называются потому, что обычно физиологичные для новорожденных, при определенных условиях могут принимать патологические черты (Дементьева Г.М., Вельтищев Ю.Е., 2003).
Переходу пограничных состояний в патологию нередко способствуют самые разные причины: осложненное течение беременности и родов, стрессовые условия в момент родоразрешения и после рождения плода (Rajabi M.,2007).
Особенно проблематично прогнозировать развитие сочетаний синдромов дезадаптации, когда у новорожденного к одному из характерных синдромов присоединяется дополнительные. Так, в клинической практике достаточно часто встречаются новорожденные, у которых срыгивание или гипервозбудимость сочетаются с болевым синдромом (Крупицкая Л.И. и соавт., 2010). Возникающие при этом сложности во многом связаны с отсутствием наджных критериев предикторного характера. Для их поиска следует принять во внимание присутствие гипоксических расстройств как типового патологического процесса в патохимии любого синдрома новорожденных (Косов М.Н. и соавт., 2002;
Чернышов В.Н. и соавт., 2008).
На клеточном уровне гипоксия провоцирует изменения редокс потенциала клетки с последующим развитием окислительного стресса, который часто проявляется в виде усиления липопероксидации и снижения антиоксидантной защиты (Дубинина Е.Е.,2006). К сожалению, до сих пор не изучены особенности окислительного стресса и состояние антиоксидантной защиты, предшествующие развитию различных сочетаний синдромов дезадаптации новорожденных.
Цель исследования: изучить изменение соотношения между уровнем липопероксидации и антиоксидантной защиты, предшествующее развитию моносиндромов срыгивания, гипервозбудимости, асфиксии и болевого синдрома, а также их сочетаниям у новорожденных, и установить возможность использования полученных показателей в качестве предикторных в диагностике развития нарушений адаптации новорожденных.
Задачи исследования:
1. Изучить изменение соотношения между активностью ксантиноксидазы и содержанием церулоплазмина в пуповинной крови, предшествующее развитию моносиндромов дезадаптации новорожденных (срыгивания, гипервозбудимости, асфиксии и болевого), а также их сочетаниям.
2. Определить уровень глутатионпероксидазной активности в пуповинной крови, предшествующий развитию рассматриваемых синдромов и их сочетаний у новорожденных.
3. Исследовать изменение активности супероксиддисмутазы в пуповинной крови, предшествующее развитию изучаемых синдромов и их сочетаний у новорожденных.
4. Оценить изменение уровня окисляемости липидов в пуповинной крови, предшествующее развитию вышеуказанных синдромов и их сочетаний у новорожденных.
5. Изучить изменения уровня липопероксидации в пуповинной крови, предшествующие развитию исследуемых синдромов и их сочетаний у новорожденных.
Научная новизна Установлено, что сочетания синдромов дезадаптации у новорожденных сопровождаются дисбалансом между прооксидантными и антиоксидантными системами и усилением липопероксидации в пуповинной крови. Показано, что развитию моносиндромов дезадаптации новорожденных (за исключением болевого синдрома) предшествует прирост ксантиноксидазной активности в пуповинной крови. Наибольшее усиление ферментативной активности наблюдалось при синдроме гипервозбудимости. Развитию сочетаний синдромов предшествовало дополнительное усиление ксантиноксидазной активности. Для сочетаний синдромов дезадаптации, сформировавшихся на основе синдрома гипервозбудимости и асфиксии, прирост ксантиноксидазной активности менее выражен, чем при соответствующих «чистых» синдромах (моносиндромах).
Выявлено, что развитию моносиндромов дезадаптации новорожденных предшествует усиление активности супероксиддисмутазы в пуповинной крови по сравнению с контрольными значениями, а развитию сочетаний двух синдромов – снижение ее активности. Обнаружено, что при сочетании двух синдромов дезадаптации «отменяется» компенсаторное усиление активности глутатионпероксидазы в пуповинной крови, характерное для «чистых» синдромов. Исключение составил синдром асфиксии, где зафиксировано выраженное снижение глутатионпероксидазной активности. Показано, что развитию моносиндромов дезадаптации новорожденных предшествует увеличение содержания церулоплазмина в пуповинной крови (за исключением болевого синдрома), а сочетанию двух синдромов дезадаптации - разнонаправленное изменение содержания данного фермента.
Таким образом, установлено, что развитию моносиндромов дезадаптации новорожденных предшествует активация антиоксидантной защиты пуповинной крови, а их сочетанию – снижение.
Обнаружено, что развитию моносиндромов дезадаптации и их сочетаниям предшествует снижение окисляемости липидов в пуповинной крови, что проявляется уменьшением содержания изопропанол растворимых диеновых конъюгатов в ответ на индукцию.
Установлено, что при сочетании синдромов дезадаптации, по сравнению с «чистыми» синдромами, усиление липопероксидации в пуповинной крови проявляется увеличением содержания изопропанол растворимых кетодиенов и сопряжнных триенов при сохранении повышенного уровня гептан- и изопроанол - растворимых диеновых конъюгатов, а также гептан-растворимых кетодиенов и сопряжнных триенов.
Теоретическая и практическая значимость Проведенное исследование позволяет расширить научные знания об особенностях процессов липопероксидации, активности про- и антиоксидантных ферментов, их соотношении при моносиндромах дезадаптации новорожденных и различных вариантах их сочетания.
На основании полученных результатов можно говорить о перспективности использования показателей липопероксидации и антиоксидантной защиты, а также активности ксантиноксидазы в пуповинной крови в качестве предикторных для прогнозирования развития нарушений адаптации новорожденных. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры биохимии ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития России.
Положения, выносимые на защиту:
1. Развитию моносиндромов дезадаптации новорожденных предшествует активация антиоксидантной защиты в пуповинной крови, а их сочетанию – снижение.
2. Развитию синдромов дезадаптации новорожденных предшествует изменение активности ксантиноксидазы в пуповинной крови, сопряженное с изменением содержания церулоплазмина.
3. Развитию нарушений адаптации новорожденных предшествует снижение окисляемости липидов в пуповинной крови.
Апробация работы:
Основные положения работы изложены и представлены на Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лившица, приуроченной к 65-летию Челябинской государственной медицинской академии «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009);
I конгрессе акушеров-гинекологов Урала с международным участием «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2009);
Конгрессе терапевтов «Урал – 2009» к 100-летнему юбилею Российского научного медицинского общества терапевтов. «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (Тюмень, 2009);
IV Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Екатеринбург, 2010);
XI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2010);
XV Юбилейной всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием), (Санкт Петербург, 2012).
Публикации По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 в рецензируемых журналах по перечню ВАК РФ (Медицинская наука и образование Урала;
Современные проблемы науки и образования;
Вестник Уральской медицинской академической науки).
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов.
Библиографический указатель включает 215 источников: 124 – на русском языке и 91 – иностранный. Работа содержит 18 таблиц, 22 рисунка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика обследованных новорожденных В условиях акушерского отделения городской клинической больницы №6 г. Челябинска проведено проспективное, когортное, рандомизированное, двойное слепое обследование 460 доношенных новорожденных, родившихся от здоровых неинфицированных матерей через естественные родовые пути, с оценкой по шкале Апгар не ниже 5-8 баллов, среди которых 103 выписаны с диагнозом «здоров» (контрольная группа).
Из исследования были исключены новорожденные, родившиеся путем операции кесарева сечения, с оценкой по шкале Апгар менее 5 баллов, с развившимся гемолитическим конфликтом, с врожденными пороками развития, с родовой травмой, с кровоизлияниями в кожу, с сочетанием трех и более синдромов дезадаптации, а также с положительным бактериальным посевом с плаценты и / или с головки новорожденного.
Исследование одобрено этическим комитетом как соответствующее этическим нормам (выписка из протокола заседания Этического комитета ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития РФ №14 от 08.12.2011 г.).
Для биохимического исследования производили взятие пуповинной крови в пробирку в объеме 10 мл со стабилизатором (гепарин) сразу после рождения плода и пересечения пуповины, до отделения плаценты. В цельной крови и плазме, полученной из нее, определяли маркры окислительного стресса и антиоксидантной защиты. Наблюдали за состоянием новорожденных до седьмых суток и фиксировали развитие синдромов дезадаптации. В соответствии с этим, новорожденные, у которых не развился тот или иной синдром, или их сочетания, составили контрольную группу, а остальные, с развившимися синдромами, распределены по группам:
Моносиндромы дезадаптации:
Синдром срыгивания (Р92.1 по МКБ-10) – Синдром гипервозбудимости (Р91.3 по МКБ-10) – Болевой синдром (Р91.8 по МКБ-10) – Синдром асфиксии (Р21 по МКБ-10) – Сочетание двух синдромов дезадаптации:
Синдром срыгивания + Болевой синдром – Синдром срыгивания + Синдром гипервозбудимости – Синдром срыгивания + Синдром асфиксии – Болевой синдром + Синдром гипервозбудимости – Синдром асфиксии + Болевой синдром – Синдром асфиксии + Синдром гипервозбудимости – 15.
Биохимические методы исследования:
Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей по методике Волчегорского И.А. и др. (1989). Определение содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов производилось спектрофотометрическим методом по Львовской Е.И. с соавт. (1991), малонового диальдегида в крови (ТБК – реактивные продукты) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Камышников В.С., 2004).
Интенсивность аскорбат-индуцированного ПОЛ изучали по методу Львовской Е.И. (1998). Активность супероксиддисмутазы оценивали по методу С. Чевари и соавт. (1985), активность ксантиноксидазы - по методу Hashimoto (1974). Определение активности глутатионпероксидазы в гемолизатах эритроцитов проводили по методу, описанному Власовой С.Н., Шабуниной Е.И., Переслегиной И.А. (1990). Содержание церулоплазмина в сыворотке крови изучали модифицированным методом Равина (Камышников В.С., 2000). Каталазную активность крови оценивали по методу М.А.
Королюк и соавт. (1988). Содержание глюкозы в плазме крови определяли глюкозооксидазным методом (тест-системы “Вектор Бэст”), липидов – фосфоваинилиновым методом (наборы SPINREACT (Испания)).
Статистическая обработка результатов Результаты обрабатывались общепринятыми методами дискриптивной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и е стандартной ошибки (m). Статистически значимые различия определяли с использованием критериев непараметрической статистики: Манна-Уитни (U), Вальда-Вольфовица (WW), а также параметрического критерия Стьюдента (t - тест) (после проверки изучаемой выборки на нормальность распределения (критерий Шапиро-Уилкса) и равенство дисперсий (критерий Левина)). Для обработки результатов исследования использован пакет прикладных программ Statistica 6.0 for Windows.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Попадая в условия острой гипоксии, организм новорожденного включает множество срочных адаптивных механизмов, перераспределяющих субстраты окисления в пользу жизненно важных органов. На системном уровне гипоксия провоцирует стресс, и через глюкокортикоиды и катехоламины, усиливается гликолиз, гликогенолиз, глюконеогенез и транспорт глюкозы в наиболее важные органы и ткани. Если экстренная адаптация организма к экстремальным факторам окажется неэффективной, то прогрессирующий дефицит энергии может вызвать клинику экстремальных состояний. Применительно к новорожденным, это проявляется в развитии таких синдромов дезадаптации как гипервозбудимость, асфиксия, болевой синдром, синдром срыгивания и их всевозможные сочетания.
При дефиците кислорода использование глюкозы в аэробном гликолизе чревато увеличением уровня активных форм кислорода, которые представляют собой химически реакционноспособные молекулы, способные повреждать любую клеточную ультраструктуру. Помимо дыхательной цепи активные формы кислорода могут генерироваться и в некоторых ферментативных реакциях. Они возникают в реакциях с оксидазами, переносящими 1 или 2 электрона на молекулярный кислород с образованием супероксиданиона и перекиси водорода. Прежде всего, речь идт о ксантиоксидазе (КО), считающейся основным ферментом, определяющим стационарный уровень супероксиданиона в клетке. Для данного фермента характерна высокая чувствительность к острой гипоксии. Имеются данные о предикторной роли КО в развитии некоторых синдромов новорожденных. В частности показано резкое усиление е активности при синдромах гипервозбудимости, срыгивании, кровоизлияниях под кожу, токсической эритеме, а также при асфиксии (Крупицкая Л.И. и соавт., 2008).
1. Активность ксантиноксидазы и содержание церулоплазмина в пуповинной крови при нарушениях адаптации новорожденных Нами установлено, что развитию синдромов дезадаптации новорожденных предшествует изменение активности КО в пуповинной крови, сопряженное с изменениями содержания церулоплазмина. Активация прооксидантных систем, проявляющаяся увеличением ксантионксидазной активности, предшествовала развитию всех рассматриваемых моносиндромов дезадаптации, за исключением болевого синдрома, при котором фермент свою активность не изменял (рис. 1).
Рисунок Изменение активности ксантиноксидазы (ЕД/л), сопряженное с изменением содержания церулоплазмина (мг/л) в пуповинной крови, предшествующее развитию синдромов дезадаптации у новорожденных мг/л ЕД/л * 3, ** * 3 * * ** * 2,5 ** * 2 ** * * * 1,5 * * ** * * * * * ** 1 ** ** ** 0,5 0.+ ГВ ры +Г В.
сф г.
ГВ В г.
БС ль С.+ ГВ С В.
сф г.
ГВ сф В г.
С ль С С сф ры +Г ры Б Б +Б +Г ры +Г ры Б сф.+ Б +Б ро сф.+.+ ро А.+ С г.
А сф А С г.
г.
С А сф С г.
С С нт ры Б нт ры ры А ко А А ко С А С С С Ксантиноксидаза Церулоплазмин Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы;
** статистически значимые отличия между группами новорожденных с простыми синдромами дезадаптации, и группами с сочетанием синдромов. К – контроль;
Срыг.- срыгивание;
ГВ – гипервозбудимость;
БС – болевой синдром;
Асф. – асфиксия.
Наибольший прирост ферментативной активности наблюдался при синдроме гипервозбудимости - в 8 раз в сравнении с контролем. Так, активность КО у новорожденных, страдающих гипервозбудимостью, более чем в 2 раза превысила активность при синдроме срыгивания и в 3,5 раза превысила активность при синдроме асфиксии. Кроме этого, одновременно наблюдалось увеличение содержания церулоплазмина (ЦП), обладающего антиоксидантными свойствами. Так повышение его содержания в 1,2 раза предшествовало развитию синдрома срыгивания, в 1,16 раза - синдрома гипервозбудимости и в 2 раза - синдрома асфиксии в сравнении с контролем, что создат определнные условия для смягчения последствий окислительного стресса, так как копродуктом ксантиноксидазной реакции является супероксиданион, а для ЦП характерно наличие супероксиддисмутазной активности. Исключение составил болевой синдром, где содержание ЦП было ниже контрольного уровня (рис. 1).
Развитию сочетания синдромов срыгивания и гипервозбудимости предшествовало шестикратное увеличение активности КО в сравнении с контролем при одновременном снижении содержания ЦП в 2 раза. Развитию сочетания синдромов асфиксии и гипервозбудимости предшествовало повышение активности КО в 3 раза по сравнению с контролем. Тем не менее, за счт возрастания содержания ЦП в 1,8 раза при данном сочетании синдромов дезадаптации выражен дисбаланс между ферментом, генерирующим супероксиданион (КО) и белком, его нейтрализующим (ЦП).
Развитию гипервозбудимости на фоне асфиксии предшествовал более низкий уровень ксантиноксидазной активности в пуповинной крови по сравнению с гипервозбудимыми новорожденными, не страдающими при этом асфиксией.
Существенным адаптивным моментом у новорожденных с сочетанием синдромов гипервозбудимости и асфиксии можно считать прирост содержания ЦП в 1,6 раза в крови по сравнению с младенцами, у которых диагностирован синдром гипервозбудимости (рис. 1). Следует отметить, что столь заметный прирост содержания данного антиоксиданта сопровождается снижением активности глутатионпероксидазы (ГП) (табл. №1), что может существенно ограничить эффективность антиоксидантной защиты. Это предположение основано на особенности осуществляемой ЦП супероксидисмутазной реакции, в ходе которой происходит конверсия супероксиданиона в пероксид водорода. Логично предположить, что повышенный уровень ЦП имеет непосредственное отношение к продукции перекиси водорода, которая в условиях дефицита ГП превращается в гидроксильный радикал в ходе реакции Фентона или реакции Хабер-Вейса (Дубинина Е.Е., 2006). В свою очередь, гидроксильный радикал может непосредственно атаковать фосфолипидный бислой клеточной мембраны, инициируя при этом липопероксидацию. Рассматриваемые факторы антиоксидантной защиты являются превентивными в силу того, что они блокируют инициаторные стадии активации свободно-радикального окисления.
Также установлено, что помимо сочетания синдромов асфиксии и гипервозбудимости, есть другие синдромы дезадаптации, возникшие на фоне асфиксии, развитию которых предшествует увеличение ксантиноксидазной активности: «асфиксия + срыгивание» (в 1,5 раза), что сопровождалось возрастанием содержания ЦП в 2,4 раза;
«асфиксия + болевой синдром» (в 1,9 раза) при сниженном уровне содержания ЦП в 1,13 раза в пуповинной крови (рис. 1).
Интересен тот факт, что присоединению любого другого синдрома к болевому синдрому, предшествовал прирост ксантиноксидазной активности крови по сравнению с болевым синдромом: при сочетании синдромов асфиксии и болевого синдрома в 1,8 раза, болевого синдрома и гипервозбудимости в 2 раза, срыгивания и болевого синдрома в 4 раза. Кроме этого, во всех случаях развитию данных синдромов дезадаптации в сравнении с болевым синдромом предшествовало увеличение содержания ЦП в крови (рис. 1).
2. Активность антиоксидантной системы при нарушениях адаптации новорожденных Первой линией защиты в борьбе с активными формами кислорода является супероксиддисмутаза (СОД), т.к. супероксидный радикал образуется первым из активных форм кислорода при утечке электронов из дыхательной цепи. Согласно полученным данным, повышение активности СОД предшествовало развитию моносиндромов срыгивания – на 12%, гипервозбудимости – на 1%, болевого синдрома – на 12% и асфиксии – на 9% относительно контроля (табл. 1). Тем не менее, снижение уровня ЦП в крови, предшествующее развитию болевого синдрома (на 19% относительно контроля), смягчалось увеличением активности СОД крови - его функционального «дублра» по нейтрализации супероксиданиона.
Однако, развитию синдрома асфиксии на фоне прироста уровня ЦП (в раза) и минимального увеличения активности СОД крови предшествовало значительное снижение активности ГП крови (на 46%) – фермента «второго эшелона» антиоксидантной защиты, предназначенного для нейтрализации перекиси водорода. Следовательно, в условиях асфиксии превентивная антиоксидантная защита осуществляется в основном за счт ЦП. В случае моносиндромов срыгивания, гипервозбудимости и болевого синдрома нейтрализация перекиси водорода осуществляется в основном за счт прироста активности ГП крови на 72%, - 75%, - 90% соответственно относительно общего контроля (табл. 1).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что развитию синдрома срыгивания на фоне гипервозбудимости предшествовал срыв характерного для синдрома гипервозбудимости усиления превентивной антиоксидантной активности, направленной на ограничение характерного для моносиндрома «гипервозбудимость» резкого прироста ксантиноксидазной активности (рис.
1).
Таблица Активность антиоксидантных ферментов и содержание церулоплазмина в пуповинной крови, предшествующие развитию моносиндромов дезадаптации и их сочетаниям у новорожденных Супероксиддисмутаза Церулоплазмин Глутатионпероксидаза Синдромы усл. ед./мл эр. / мин мг/мл ммоль/мл/мин 264,5±13,6 119,3±3,7 0,506±0, Контроль n = 24 n = 103 n = 297,8±22,5 146,3±13,3 0,872±0, n = 18 n = 67 n= Срыгивание Р1,2 = 0,032 U Р1,2 0,001U P1,2=0,005WW 268,0±51,7 137,4±12,4 0,89±0, n = 10 n = 27 n= Гипервозбудимость Р1,3 0,001U P1,3=0,015WW P1,3=0,025WW 297,0±10,32 97,4±6,28 0,962±0, n = 20 n = 43 n= Болевой синдром P1,4=0,027WW P1,4=0,025WW P1,4=0,005WW 251,2±28,7 0,275±0, 290,8±15, n = 67 n= Асфиксия n = Р1,5 0,05 t Р1,5 0,001U 59,1±5,1 0,387±0, 6 176,88±20, n=34 n= Срыгивание+ n= Р2,6=0,0005U Р2,6=0,0005U Р2,6=0,0018U Гипервозбудимость Р3,6=0,0005U Р3,6=0,0005U 161,88±15,3 0,579±0, 152,3±8, n=9 n= Срыгивание+ n= Р2,4=0,003U Р2,4=0,0014U Р3,4=0,001U болевой синдром Р3,4=0,003U Р3,4=0,001U Гипервозбудимость 260,00 51,4 117,568 6,2 0,571 0, + n= 12 n=12 n= болевой синдром 198,33±39, 104,5±6,58 0,53±0, n= Асфиксия + n=15 n= Р5,9=0,006WW Р 4,9=0,038WW Р 4,9=0,031U болевой синдром Р4,9=0,033U 198,75±39,2 0,50±0, 217,76±16, Асфиксия + n=9 n= n= Р 3,10=0,014U Р 5,10=0,046U Гипервозбудимость Р 3,10=0,006U 287,8±16, 0,48±0, 224,37±16,07 n= Асфиксия+ n= Р5,11=0,006U n= Р2,11=0,024U Срыгивание Р2,11=0,016U Примечание: n – объем выборки;
U – критерий Манна – Уитни;
t – критерий Стьюдента;
WW – критерий Вальда – Вольфовица.
Данный факт проявлялся в снижении содержания ЦП в пуповинной крови на 57%, снижении активности СОД крови на 35% и снижении активности ГП крови на 57% (табл. 1). Возникновению сочетания синдромов срыгивания и болевого синдрома предшествовало снижение активности СОД крови на 39% на фоне увеличения содержания ЦП на 27% в сравнении с общим контролем. Однако, в сравнении с соответствующими «чистыми» синдромами развитию сочетания синдромов срыгивания и болевого предшествовало угнетение антиоксидантных систем крови новорожденных, что проявлялось в снижении активностей ГП и СОД в пуповинной крови (табл. 1).
При сочетании синдрома гипервозбудимости и болевого синдрома содержание ЦП и активность всех исследованных антиоксидантных ферментов крови не отличались статистически значимо от контрольных значений. Однако, если принять во внимание характерное для синдрома гипервозбудимости усиление превентивной антиоксидантной защиты, то можно констатировать купирование данных адаптивных изменений вследствие «наслоения» дополнительного болевого синдрома.
Правомерность этого положения отражает более низкий уровень активности ГП в крови (на 36%), предшествующий появлению сочетания синдромов гипервозбудимости и болевого синдрома по сравнению с синдромом «гипервозбудимость» (табл. 1). Наряду с этим следует отметить, что купирование, характерного для новорожденных, страдающих синдромом гипервозбодимости, усиления антиоксидантной защиты реализовалось на фоне относительного снижения ксантиноксидазной активности (рис. 1).
Возникновению сочетания синдромов асфиксии и срыгивания предшествовало снижением глутатионпероксидазной и супероксиддисмутазной активности в крови как в сравнении с контрольной группой (на 6% и на 16% соответственно), так и с синдромом срыгивания (на 45% и на 25% соответственно). У новорожденных развитию сочетания синдромов асфиксии и болевого по сравнению с контролем предшествовало снижение содержания ЦП в крови (на 13%), а также уменьшение супероксиддисмутазной активности (на 25%). Активность ГП статистически значимо не изменена. При сопоставлении между собой групп «асфиксия + болевой синдром» и «болевой синдром» обнаружено снижение активности СОД и ГП в пуповинной крови у новорожденных, испытавших болевой синдром на фоне асфиксии (табл. 1). Следует отметить, что активность ГП была снижена до контрольного уровня. Таким образом, уместно отметить об «отмене» в условиях асфиксии характерной для болевого синдрома компенсаторной реакции, проявлявшейся в увеличении активности ГП.
Существенным адаптивным моментом у новорожденных с сочетанием синдромов гипервозбудимости и асфиксии можно считать предшествующий развитию данного синдрома прирост содержания ЦП в крови по сравнению с младенцами, у которых диагностирован синдром гипервозбудимости (на 58%). Следует отметить, что столь заметный прирост содержания этого антиоксиданта сопровождается снижением активности ГП (на 44%) и СОД (на 26%) в пуповинной крови, что может существенно ограничить эффективность антиоксидантной защиты (табл. 1). Это предположение основано на особенности осуществляемой ЦП супероксидисмутазной реакции, в ходе которой происходит конверсия супероксиданиона в пероксид водорода. Тем не менее, на фоне асфиксии купируется характерный для моносиндрома гипервозбудимости прирост глутатионпероксидазной активности. Однако, снижение уровня антиоксидантной защиты при сочетании синдромов гипервозбудимости и асфиксии компенсируется снижением уровня ксантиноксидазной активности по сравнению с синдромом гипервозбудимости.
Вместе с тем, косвенно определить эффективность действия липофильных антиоксидантов возможно по уровню индуцированного in vitro ПОЛ (Львовская Е.И., 1998). В системе Fe+2/аскорбат - индуцированного ПОЛ переокислению подвергаются те ненасыщенные связи, которые не подвергались свободно-радикальному окислению в отсутствии индуктора во многом благодаря их защите липофильными антиоксидантами. Поэтому по содержанию первичных молекулярных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в ответ на индукцию судят об окисляемости липидов. В свою очередь, высокий уровень окисляемости поддерживается напряжением липофильных антиоксидантов. Соответственно, имеются основания по уровню Fe+2/аскорбат индуцированного ПОЛ дать интегральную оценку состояния липофильной антиоксидантной защиты.
3. Содержание продуктов ПОЛ в пуповинной крови при нарушениях адаптации новорожденных Fe+2/аскорбат Наиболее выраженное снижение уровня индуцированного ПОЛ в пуповинной крови предшествовало синдрому асфиксии – в 2,6 раза. Снижение содержания ПОЛ при индукции Fe+2/аскорбат предшествовало также моносиндромам гипервозбудимости – в 2 раза и срыгивания – в 1,6 раза в сравнении с контролем. На фоне показателей Fe+2/аскорбат - индуцированного ПОЛ, сопоставимых с контрольными развивался только болевой синдром (рис. 2).
Рисунок + Уровень Fе /аскорбат - индуцированного ПОЛ пуповинной крови, предшествующий развитию моносиндромов дезадаптации и их сочетаниям у новорожденных 70,2 ** срыгивание+гипервозбудимость ** 62, болевой синдром+срыгивание болевой 58,06 ** синдром+гипервозбудимость 57,55 ** гипервозбудимость+асфиксия 54,31 ** боевой синдром+асфиксия ** 71, срыгивание+асфиксия * 69, срыгивание 88, болевой синдром * 45, гипервозбудимость * 35, асфиксия контроль 0 20 40 60 80 % Примечание: все данные представлены в процентах от соответствующих показателей контрольной группы. * - статистически значимые отличия от контрольной группы. ** - статистически значимые отличия между показателями в группах с сочетанием синдромов и синдромов, сформировавшихся на их основе.
Наслоению на болевой синдром синдрома гипервозбудимости предшествовало ограничение масштабов роста уровня изопропанол растворимых диеновых конъюгатов после индукции. Сочетание болевого синдрома с асфиксией и срыгиванием сопровождались аналогичными изменениями (рис. 2). Таким образом, присоединение к болевому синдрому других синдромов, для которых характерен сниженный уровень индуцированного ПОЛ приводил к уменьшению эффективности липофильных антиоксидантов.
Противоположная ситуация предшествовала наслоению других синдромов на моносиндромы «гипервозбудимость» и «асфиксия». Так, синдромам «срыгивание+гипервозбудимость», «асфиксия+гипервозбудимость» по сравнению с «чистым» синдромом гипервозбудимости предшествовал более высокий уровень Fe+2/аскорбат индуцированного ПОЛ. Такая же тенденция прослеживается при сочетании синдромов срыгивания и асфиксии по сравнению с синдромом «асфиксия».
Тем не менее, уровень Fe+2/аскорбат-индуцированного ПОЛ был ниже контрольного уровня, что свидетельствует о снижении эффективности липофильной антиоксидантной защиты при рассмотренных сочетаниях синдромов. Вследствие этого, у новорожденных с моносиндромами «гипервозбудимость», «срыгивание», «болевой синдром», «асфиксия», а также при их сочетаниях наблюдалось снижение уровня липопероксидации в пуповинной крови в сравнении с контролем (табл. 2).
Однако, в некоторых случаях увеличение содержания одних молекулярных продуктов ПОЛ сочеталось со снижением других.
Новорожденные, у которых впоследствии развивался синдром асфиксии, на фоне повышенного содержания гептан- и изопропанол растворимых Шиффовых оснований (ШО), гептан-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов (КДиСТ) и изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов (ДК), отличались низким уровнем гептан-растворимых ДК, а также изопропанол-растворимых КДиСТ (табл. 2) в пуповинной крови.
Болевому синдрому предшествовало повышение содержания всех категорий гептан-растворимых продуктов ПОЛ и изопропанол-растворимых ДК и ШО, что сочеталось со снижением содержания изопропанол-растворимых КДиСТ (табл. 2). Развитию синдрома гипервозбудимости, который характеризовался наиболее выраженным приростом ксантиноксидазной активности (рис.1), предшествовало увеличение всех категорий молекулярных продуктов ПОЛ (табл. 2). Для синдрома срыгивания повышение содержания всех категорий гептан-растворимых продуктов ПОЛ и изопропанол-растворимых ДК и ШО сочеталось со снижением содержания изопропанол-растворимых КДиСТ (табл. 2).
Таблица Изменения уровня продуктов липопероксидации в пуповинной крови, предшествующие развитию синдромов дезадаптации и их сочетаниям у новорожденных Гептановая фаза липидного экстракта Изопропанольная фаза липидного экстракта Синдром ДК КДиСТ ШО ДК КДиСТ ШО 2,25±0,025 0,134±0,08 0,075±0,005 0,557±0,008 0,252±0,06 0,142±0, 1.Контроль, n= 2.Синдром срыгивания, n=50 2,95±0,124 0,31±0,046 0,156±0,01 0,91±0,045 0,051±0,004 0,631±0, P1,2=0,0017U P1,2=0,0024U P1,2=0,0024U P1,2=0,008U P1,2=0,0024U P1,2=0,0024U 3.Синдром гипервозбудимости, n=38 3,464±0,25 0,169±0,009 0,180±0,016 0,787±0, 0,267±0,011 0,262±0, P1,3=0,0013U P1,3=0,0018U P1,3=0,0018U P1,3=0,0013U 4.Болевой синдром, n=49 3,11±0,15 0,205±0,018 0,19±0,017 0,764±0,038 0,148±0, 0,166±0, P1,4=0,0011U P1,4=0,0018U P1,4=0,0018U P1,4=0,0013U P1,4=0,0018U 5.Синдром асфиксии, n=50 1,755±0,14 0,209±0,028 0,699±0,036 0,2±0,007 0,412±0, 0,162±0, P1,5=0,0017U P1,5=0,0024U P1,5=0,008U P1,5=0,0024U P1,5=0,0024U 6.Синдром срыгивания + 3,14±0,54 0,215±0,02 0,116±0,03 0,730±0,038 0,203±0,021 0,163±0, Болевой синдром, n=26 Р2,6=0,045WW Р2,6=0,023WW Р2,6=0,04WW Р2,6=0,035U Р2,6=0,004U Р2,6=0,004U 7.Синдром срыгивания + 0,046±0, 3,57±0,50 0,234±0,029 0,694±0,052 0,134±0, 0,206±0, Синдром гипервозбудимости, n=15 Р2,7=0,0018U 8.Синдром асфиксии + 0,198±0, 0,252±0, 2,87±0,22 0,196±0,01 0,173±0, Синдром срыгивания, n=11 0,568±0,014 P5,8=0,017U Р2,8=0,015U Р2,8=0,015U Р2,8=0,015U 9.Болевой синдром + 2,954 0,618 0,382 0,141 0,065 0,015 0,719 0,051 0,291 0,036 0,170 0, Синдром гипервозбудимости, n= 10. Синдром асфиксии + 0,311±0, 0,403±0,02 0,137±0,03 0,793±0,038 0,203±0, 3, 13±0, Болевой синдром, n=9 Р4,10 =0,004U 11. Синдром асфиксии + 0,172±0, 3,13±0,54 0,583±0,01 0,10±0, Синдром гипервозбудимости, n=15 0,799±0,058 0,312±0,066 Р3,11 =0,017U Р3,11 0,05 t Р3,11 =0,015U Р5,11 =0,015U Примечание: n – объем выборки;
U – критерий Манна – Уитни;
t – критерий Стьюдента;
WW – критерий Вальда – Вольфовица. ДК - диеновые коньюгаты (первичные продукты ПОЛ), КД и СТ - кетодиены и сопряженные триены (вторичные продукты ПОЛ);
ШО – шиффовы основания (конечные продукты ПОЛ). Содержание продуктов ПОЛ выражено в единицах окислительного индекса.
Развитию синдромов дезадаптации, развившихся на фоне асфиксии, предшествовало увеличение содержания всех молекулярных продуктов ПОЛ, как в гептановую, так и в изопропанольную фазы (табл. 2).
Сочетанию болевого синдрома и гипервозбудимости также предшествовало увеличение содержания всех изопропанол-растворимых и гептан-растворимых молекулярных продуктов ПОЛ, за исключением гептан растворимых ШО в сравнении с контролем (табл. 2).
В случае развития сочетания болевого синдрома и синдрома срыгивания у новорожденных в пуповинной крови было отмечено повышение содержания всех категорий продуктов ПОЛ кроме изопропанол-растворимых КДиСТ по сравнению с контрольной группой (табл. 2). При сопоставлении между собой групп «болевой синдром + синдром срыгивания» и «срыгивание» отмечены неоднозначные изменения содержания изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ. Развитию сочетания синдромов дезадаптации предшествовало увеличение содержания КДиСТ на фоне снижения содержания ДК и ШО по сравнению с контрольной группой.
Возникновению сочетания синдромов срыгивания и гипервозбудимости предшествовало разнонаправленное изменение содержания молекулярных продуктов ПОЛ в пуповинной крови: увеличение содержания гептан растворимых и изопропанол-растворимых ДК и гептан-растворимых КДиСТ на фоне сниженного содержания гептан-растворимых и изопропанол растворимых ШО и изопропанол-растворимых КДиСТ (табл. 2).
Полученные результаты свидетельствуют об универсальных изменениях активностей исследуемых про- и антиоксидантных ферментов, уровней липопероксидации и окисляемости ацильных радикалов, которые предшествуют развитию «чистых» синдромов дезадаптации и их различным сочетаниям у новорожденных. Данный факт делает перспективным использование вышеуказанных показателей в качестве предикторов развития нарушений адаптации новорожденных.
Выводы Развитию моносиндромов гипервозбудимости, срыгивания и асфиксии, а 1.
также их сочетаниям предшествовало усиление активности ксантиноксидазы в крови при одновременном увеличении содержания церулоплазмина.
Появлению «чистых» синдромов дезадаптации предшествовало усиление 2.
глутатионпероксидазной активности крови. Исключение составил синдром асфиксии. Развитию сочетаний синдромов дезадаптации предшествовало уменьшение активности глутатионпероксидазы.
Возникновению моносиндромов дезадаптации предшествовало усиление 3.
супероксиддисмутазной активности крови, а их сочетанию – угнетение активности данного фермента.
Развитию как отдельных синдромов дезадаптации, так и их различным 4.
сочетаниям предшествовало снижение окисляемости ненасыщенных связей в ацильных радикалах, что проявлялось в уменьшении содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов в пуповинной крови в ответ на индукцию в системе Fе 2+/ аскорбат.
Возникновению моносиндромов дезадаптации у новорожденных 5.
предшествовало увеличение содержания гептан-растворимых молекулярных продуктов липопероксидации, а также изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов и Шиффовых оснований. Появлению сочетаний синдромов у новорожденных предшествовало разнонаправленное изменение содержания молекулярных продуктов липопероксидации. Развитию сочетаний синдромов, в сравнении с «чистыми» синдромами, предшествовало усиление липопероксидации.
Практические рекомендации:
1.Для прогнозирования развития нарушений адаптации новорожденных рекомендуется определять в пуповинной крови активность антиоксидантных ферментов, активность ксантиноксидазы (КО), содержание изопропанол растворимых диеновых конъюгатов в ответ на индукцию в системе Fе2+/аскорбат сразу после рождения плода в условиях родильного блока.
2.Вышеуказанные биохимические показатели необходимо использовать в качестве предикторных факторов для скрининга течения периода адаптации в первые дни после рождения, с целью выявления новорожденных, требующих пристального внимания неонатологов.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Хасанова, В.В. Прогностическое значение ксантиноксидазы в развитии 1.
дисиндромов у новорожденных. / В.В. Хасанова, Т.П. Шевлюкова, В.Э. Цейликман, А.С.
Попова // Материалы I конгресса акушеров-гинекологов Урала с международным участием «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребенка». Екатеринбург – 2009. – С.79.
Шевлюкова, Т.П. Применение ксантиноксидазы в качестве предикторного 2.
фактора в развитии дисиндромов у новорожденных. / Т.П. Шевлюкова, В.В.Хасанова, А.С. Попова, Л.И. Крупицкая // Материалы конгресса терапевтов «Урал-2009». К 100 летнему юбилею Российского научного медицинского общества терапевтов. «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов». Тюмень – 2009. – С.129-130.
Хасанова, В.В. Ксантиноксидаза как предикторный показатель 3.
дисиндромов у новорожденных./ В.В. Хасанова, В.Э. Цейликман, Т.П. Шевлюкова, А.С.
Попова // «Актуальные пробемы теоретической и прикладной биохимии». Российская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. Челябинск – 2009. – С.203.
Хасанова, В.В. Современные биохимические исследования в перинатальной 4.
медицине / В.В.Хасанова, Т.П. Шевлюкова, А.С.Попова, Л.И. Крупицкая // Материалы IV Регионального научного форума «Мать и дитя». – Екатеринбург, 2010. – С. 311-312.
Хасанова, В.В. Особенности свободно-радикального окисления при 5.
различных дисиндромах у новорожденных. / В.В. Хасанова //Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя». Под ред. Сухих Г.Т., Баранова И.И..
Москва – 2010. – С.606-607.
Цейликман, В.Э. Состоятельность антиоксидантной системы при 6.
развитии дисиндромов у новорожденных. / В.Э. Цейликман, В.В.Хасанова, Т.П.
Шевлюкова, А.С. Попова, А.Б. Горностаева // Медицинская наука и образование Урала. Тюмень – 2010. – №1 – С.88-91.
Хасанова, В.В. Использование глутатионпероксидазы как предикторного 7.
показателя в развитии дисиндромов у новорожденных./ В.В. Хасанова // Фундаментальная наука и клиническая медицина – Человек и его здоровье.
XV Юбилейная всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей (с международным участием). Санкт-Петербург – 2012. – С.302-303.
Хасанова, В.В. Роль оксидативного стресса в прогнозировании 8.
развития дисиндромов у новорожденных / В.В. Хасанова, А.С. Попова, Л.И.
Крупицкая, Т.П. Шевлюкова, В.Э. Цейликман, О.Б. Цейликман // Современные проблемы науки и образования (электронное научное издание). – 2012. – №4 – URL: http://www.science-education.ru/104- Хасанова, В.В. Особенности окислительного стресса при сочетании 9.
синдромов срыгивания и гипервозбудимости у новорожденных / В.В. Хасанова, Л.И.
Крупицкая, А.С. Попова, Т.П. Шевлюкова, Т.В. Соломатова, А.Б. Горностаева, Д.А.
Козочкин // Вестник уральской медицинской академической науки 2012.- №2(39). С.
83-84.
Цейликман, В.Э. Изменение уровня Fe+2/аскорбат индуцированного 10.
ПОЛ при синдромах асфиксии, гипервозбудимости, срыгивания, болевом синдроме и их сочетаниях у новорожденных / В.Э. Цейликман, В.В. Хасанова, А.С. Попова, Л.И.
Крупицкая, Т.П. Шевлюкова, А.И. Синицкий // Современные проблемы науки и образования (электронное научное издание). – 2012. – №6 – URL: http://www.science education.ru/106-7497.
Список использованных сокращений - ПОЛ – перекисное окисление липидов - КО – ксантиноксидаза - ЦП – церулоплазмин - ГП – глутатионпероксидазы - СОД – супероксиддисмутаза - ШО – Шиффовы основания - ДК – диеновые конъюгаты - КДиСТ – кетодиены и сопряженные триены Работа проведена в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, Соглашение №8275 от 23.10.2012 (НОЦ " Проблемы фундаментальной и клинической медицины ").