Разработка методов очистки белков адсорбционной хроматографией на ионообменниках на примере пероксидазы хрена и лизостафина
На правах рукописи
Смотров Олег Игоревич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА ИОНООБМЕННИКАХ НА ПРИМЕРЕ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА И ЛИЗОСТАФИНА 03.02.03 – микробиология 03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Оболенск – 2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ Научные руководители:
чл.-корр. РАМН, д-р мед. наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич;
д-р биол. наук Суровцев Владимир Иванович
Официальные оппоненты:
Козлов Леонид Васильевич, д-р биол. наук, профессор, Федеральное бюджетное уч реждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микро биологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ, руководитель группы.
Игнатов Сергей Георгиевич, д-р биол. наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», за ведующий лабораторией.
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук «Институт биохимии и физиологии микроорга низмов им. Г.К. Скрябина РАН», г. Пущино
Защита состоится «26» апреля 2012 г. в 13 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу:
142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреж дения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Автореферат разослан «_» марта 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Фурсова Надежда Константиновна
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы:
До середины 1950-х гг. практически единственным широко применяемым методом очистки белков оставалось дробное осаждение сульфатом аммония. Однако к концу 1950-х гг. количество исследований, посвященных разработке новых методов очистки протеинов, значительно возросло. Были опубликованы данные по очистке белков на целлюлозных ионо обменниках – КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах, введены новые носители – сефадексы и сефарозы. К началу 1990-х годов был разработан целый ряд тонких методов очистки белков (аффинная хроматография, гидрофобная хроматография, металлохелатная и хроматография на триази новых красителях, гель-фильтрация и др.). Эти методы очистки были основаны на различиях белковых характеристик: разности молекулярных масс, растворимости, температурной и рН устойчивости, зарядов при различных значениях рН, адсорбции на гидроксилапатите, срод ству к субстратам, ингибиторам, триазиновым красителям и др. Однако существенным огра ничением многих из этих методов является невозможность их использования в условиях большого количества балластных примесей – клеток продуцента, их фрагментов, протеаз, содержащихся в культуральной жидкости. Это приводит к необходимости введения допол нительных этапов очистки. Еще одним ограничением для широкого применения ряда хрома тографических методов является их высокая специфичность. В частности, использование аффинной хроматографии обеспечивает высокую чистоту фермента, ингибитор которого иммобилизован на носителе. Но, с другой стороны, поскольку химическое строение ингиби торов различно, то для отдельно взятого фермента нужно разрабатывать свою отдельную ме тодику иммобилизации ингибиторов.
Универсальным принципом связывания белка является его адсорбция на сорбенте, ос нованная на силах Ван-дер-Ваальса. Однако, среди сил слабого взаимодействия, действую щих в водном растворе, адсорбция является наиболее слабой. Поэтому разработать сорбент, использующий данный принцип, весьма сложно, и к моменту начала работы был разработан только один метод, использующий адсорбционное связывание – хроматография на гидро ксилапатите. Однако применение гидроксилапатита ограничено тем, что этот сорбент требу ет сложного процесса подготовки и не подлежит регенерации. Кроме того, его использова ние возможно только на последней стадии очистки после удаления большинства балластных соединений.
Поэтому целью нашего исследования была разработка метода очистки белков, лишен ного перечисленных выше ограничений, в достаточной степени универсального, масштаби руемого и позволяющего получить белки высокой степени чистоты уже на первых стадиях применения.
Основной задачей нашего исследования была иллюстрация работоспособности и уни версальности метода на модельных белках, имеющих важное промышленное значение, но в настоящее время получаемых трудоемкими способами. В качестве одного их таких фермен тов была выбрана пероксидаза хрена. Этот белок широко используется в биохимических и иммунологических исследованиях и представляет интерес как препарат для лечения лепры и карциномы. Однако выход его ограничивается 0,5-1 г из 100 кг корневищ хрена, и цена дос тигает нескольких тысяч долларов за 1 г.
Другим модельным ферментом был выбран лизостафин. Определяющим критерием выбора стала его способность к лизису клеточной стенки стафилококков. Он был выделен из культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus (Schindler, Schuchardt, 1964) и, как было показано, лизировал клетки стафилококковых штаммов, в том числе анти биотикорезистентных. Лизис бактериальной клетки обусловлен тем, что лизостафин являет ся глициназой и гидролизует пентаглициновые мостики, которые входят в состав клеточной стенки любого (в том числе – резистентного к антибиотикам) стафилококка. На этом основа нии данный фермент был отнесен к факторам межмикробного антагонизма, обеспечиваю щим подавление роста других видов стафилококков.
В настоящее время борьба с инфекциями, вызываемыми штаммами антибиотикорези стентных бактерий является актуальной проблемой медицины. Бактерии рода Staphylococcus занимают в этом ряду одно из главных мест. Так, в США ежегодно фиксируется 500 случаев заболеваний, вызываемых стафилококками, из которых около 100 000 случаев были вызваны антибиотикорезистентными штаммами. Таким образом, на сегодняшний день пред ставляется важной задача поиска новых лекарственных средств, альтернативных антибиоти кам, а также необходимость разработки новых эффективных подходов к лечению стафило кокковых инфекций. В этом свете возможность применения лизостафина в клинической и ветеринарной практике выглядит перспективной, тем более что показания для лечения неко торых инфекций, вызываемых стафилококками, уже встречались в литературе. (Bramley, Foster, 1990).
Описанные методы выделения лизостафина не пригодны для наработки препаративных и промышленных количеств препарата, поскольку существующие методы включают, как правило, очистку в три-четыре этапа;
выращивание штамма-продуцента осуществляется на дорогих или малодоступных питательных средах (Iversen, Grov, 1973);
в целом процесс ока зывается экономически высокозатратным.
Таким образом, в настоящее время не существует промышленного производства препа ратов, содержащих фермент лизостафин, и работа в данном направлении является актуаль ной и перспективной для медицины, ветеринарии и биотехнологии. Поэтому заключитель ным этапом нашей работы явилось изучение очищенного с помощью разработанного нами метода лизостафина, позволяющее получить важную информацию о его физико-химических и биологических свойствах.
Цель исследования – Разработать адсорбционные хроматографические методы очист ки белков на ионообменниках, использовать их для препаративной очистки лизостафина и пероксидазы хрена, изучить некоторые физико-химические и биологические свойства очи щенного лизостафина.
Задачи исследования:
1. Разработать методы препаративной адсорбционной хроматографии белков на целлю лозных (КМ-ДЭАЭ-целлюлозах) и кремниевых (силохром C-80) ионообменниках.
2. Использовать эти методы для получения препаративных количеств лизостафина и пероксидазы хрена.
3. Подобрать оптимальные условия культивирования штамма S. simulans biovar staphylolyticus – продуцента лизостафина.
4. Разработать кинетико-термодинамический метод определения ионогенных групп, входящих в каталитический центр макромолекулы лизостафина.
5. Показать возможность использования полученного препарата лизостафина для лече ния стафилококковых инфекций у домашних и сельскохозяйственных животных.
Научная новизна:
1. Впервые разработан метод адсорбционной хроматографии белков на ионообменни ках, применение которого позволяет существенно сократить количество этапов очистки.
2. Впервые предложен кинетико-термодинамический метод для определения ионоген ных групп активного центра ферментов, катализирующих гидролиз поверхностных структур клеточной стенки бактерий (лизостафин, лизоцим).
Практическая значимость и внедрение результатов:
1. Разработан новый способ получения лизостафина на основе адсорбционного метода очистки, защищенный патентом на изобретение РФ: №2342431.
2. Предложенный метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках может ис пользоваться для очистки препаративных количеств других белков.
3. Предложены эффективные схемы применения лизостафина для лечения стафилокок ковых инфекций домашних животных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках позволяет получать пре паративные количества высокоочищенных препаратов лизостафина и пероксидазы хрена.
2. Разработка условий культивирования штамма-продуцента лизостафина S. simulans позволяет обеспечить высокий выход целевого продукта.
3. Метод кинетико-термодинамического анализа позволяет определять ионогенные группы активного центра ферментов без использования рентгеноструктурного анализа.
4. Препарат лизостафина, полученный из культуральной жидкости S. simulans методом адсорбционной хроматографии на силохроме, эффективен против стафилококковых инфек ций у животных.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ.
Апробация работы. Результаты работы доложены на двух научно-практических шко лах-конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия челове ка, Оболенск, 2009 г. и 2010 г.
Публикации. Основное содержание работы
отражено в 6 научных публикациях, вклю чая 3 статьи в реферируемых научных журналах и 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машино писного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выво дов и списка литературы, включающего 30 работ отечественных и 95 работ зарубежных ав торов. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 6 таблицами.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования Штаммы микроорганизмов. В работе использованы штаммы Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus №1030, Staphylococcus aureus FDA 209P №4441 и Micrococcus lysodeicticus №4405, полученные из ГКПМ ГНЦ ПМБ.
Микробиологические методы. Для культивирования S. aureus использовали агар, при готовленный на основе панкреатического гидролизата рыбокостной муки. Для культивиро вания S. simulans №1030 использовали жидкие и плотные питательные среды на основе пан креатического гидролизата рыбокостной муки, пептона, панкреатического гидролизата ка зеина, панкреатического гидролизата мяса, панкреатического гидролизата крови (Оболенск, Россия). Культивирование на жидких питательных средах проводили в качалочных колбах при скорости 200 об/мин при температуре 37 C в течение 16 ч. Штамм S. simulans для полу чения биомассы культивировали на жидкой питательной среде на основе панкреатического гидролизата рыбокостной муки при температуре 34 °С в биореакторе «Magnaferm Fermentor» (New Brunswick Scientific, США). Для проведения кинетико-термодинамических исследова ний штамм M. lysodeicticus культивировали на плотной питательной среде на основе пан креатического гидролизата рыбокостной муки и высушивали в сублимационной камере «Genesis» (Virtis, США). Определение гемолитической активности проводили на чашках Петри с 5 %-ным кровяным агаром.
Биохимические методы. В качестве сорбентов использовали силохром С-80 с разме ром пор 520 (Ставропольский завод люминофоров и красителей, Россия);
ДЭАЭ целлюлозу и КМ-целлюлозу (Fluka, США). В работах по получению белков использовали хроматографическую систему Monitor UVis-920 (GE healthcare, США). Определение концен трации белка проводили методом Bradford (1976) или Lowry (1951). Измерение активности пероксидазы проводили по описанному методу (Worthington, 1978). Определение активности лизостафина проводили методом Шиндлера-Шухардта (Schindler, Schuhardt, 1964). Кинети ческие эксперименты проводили с использованием суспензии бактериальных клеток при ис следуемых температурах в термостатируемой кювете спектрофотометра Ultraspec (Amersham-Biosciences, Швеция).
Биологические методы. Опыты по использованию лизостафина для лечения животных проводили в ЗАО «Сельские зори» Воронежской области и в ветеринарных клиниках ООО «Лесси» и ООО «Сэнди» г. Москвы. В качестве объектов лечения использовали собак (груп па из 20 животных) со стафилококковым отитом и коров (группа из 17 животных) со стафи лококковым маститом.
Результаты исследований Первоначальным этапом наших исследований была разработка простого, экономичного и в достаточной степени универсального метода, пригодного для масштабирования.
В водном растворе действуют различные силы слабого взаимодействия, на основе ко торых можно проводить связывание белка с сорбентом: ионное, гидрофобное и адсорбцион ное. Хотя в воде ионное взаимодействие весьма слабо (в 80 раз меньше, чем в вакууме), но оно обратно пропорционально квадрату расстояния между зарядами, тогда как силы Ван дер-Ваальса, от которых и зависит главным образом величина адсорбции, обратно пропор циональны расстоянию в шестой степени, то есть силы Ван-дер-Ваальса в водном растворе значительно слабее электростатических сил. Адсорбционное связывание также значительно слабее гидрофобного. Но адсорбция – самопроизвольное увеличение концентрации белка на сорбенте – общее явление и поэтому ее мы попытались использовать для очистки белков, надеясь, что число таких белков может быть велико. Для этого необходимо создать условия, чтобы адсорбция являлась определяющей для связывания белка с сорбентом.
Что касается сорбента, то, во-первых, он должен быть таким, чтобы эффективная очи стка могла быть проведена уже на первой или на одной из первых стадий, например, из куль туральной жидкости. Во-вторых, процесс можно бы было масштабировать, для чего сорбент должен обладать, прежде всего, хорошими проточными характеристиками. В-третьих, ад сорбированный целевой белок можно было бы легко удалять с колонки в условиях, когда балластные белки либо удалялись раньше, либо оставались на колонке, либо двигались по ней, но со скоростью отличной от скорости движения целевого белка. Кроме того, сорбент должен обладать химической устойчивостью, и его можно было бы использовать многократ но. Поэтому в качестве сорбентов были выбраны очень слабый (в нейтральных условиях) ка тионит силохром и слабые ионообменники КМ- и ДЭАЭ-целлюлозы.
Использование для адсорбционной хроматографии силохрома основано на следующем.
Изоэлектрическая точка кремнеземных сорбентов лежит в пределах рН 2,5 – 3,0, а значение рК~9,0. При рН=7, как следует из уравнения Хендерсона-Хассельбаха A pH pK lg, HA где HA – сопряженная кислота, A- – сопряженное основание;
например SiOHSiO +H+), это очень слабые катионообменники, и для сорбции белков ионные связи не могут быть определяющими в нейтральной области. Многие кислые белки (с pI7) связываются на кремнеземных сорбентах при нейтральных значениях рН и не десорбируются из колонки при значениях рНpI вплоть до рН=8,0. Из этого же уравнения следует, что при повышении pH концентрация зарядов на поверхности силохрома растет, то есть сила его, как ионообменни ка, увеличивается и белки, имеющие низкое значение изоточки будут удаляться с поверхно сти этого ионообменника. Наиболее удерживаемыми будут белки с самым высоким значени ем изоточки, которые выйдут в последнюю очередь и, таким образом, будут очищены от балластных белков.
На рис. 1 показана хроматограмма очистки лизостафина (pI-9,5) на силохроме. Пик «Б» показывает элюцию балластных белков, имеющих величину рК9 при действии глицинового буфера с рН-9,0. Пик «В» - выход лизостафина при действии глицинового буфера pH 10,0.
А-посадка материала Б-элюция балластных белков (рН-9,0) В-элюция лизостафина (рН-10,0) Рисунок 1 - Хроматограмма очистки лизостафина на силохроме Как видно из результатов, представленных в табл. 1, выход целевого продукта состав ляет 71 % со специфической активностью по расщеплению стафилококка 1535 ед/мг белка.
Чистота белка определялась методом электрофореза (рис. 2).
Рисунок 2 – SDS-PAGE электрофореграмма лизостафина Таблица 1 - Результаты очистки лизостафина*.
Стадия Объем, л Активность, Концентрация Удельная Выход, % ед/мл белка, очистки активность, мг/мл ед/мг Культуральная 10 5,5 0,08 64,4 жидкость Элюат 0,5 75 0,1 1535 *Приведены данные одного из пяти репрезентативных экспериментов.
КМ- и ДЭАЭ-целлюлозы - более сильные ионообменники, чем силохром, и при ней тральных значениях рН белки могут удерживаться на них благодаря ионному взаимодейст вию. Для того чтобы была возможна очистка белка адсорбционной хроматографией, необхо димо, чтобы на нужный белок не действовали электростатические силы. Это может быть в случае, если адсорбент-ионообменник уравновешивается буфером с рH, соответствующим pI нужного белка. Тогда, в зависимости от заряда, часть балластных белков останется на колон ке, часть будет быстро двигаться вниз, за счет одинакового заряда сорбента и белка, а целе вой белок будет адсорбироваться на каждой частице носителя и десорбироваться, если ком поненты буфера будут конкурировать с ним за адсорбент. Лишь балластные белки, имеющие значения pI, близкие к pI данного белка (в пределах нескольких десятых единиц рН), могут двигаться по принципу адсорбции–десорбции и снижать тем самым степень очистки. Таким образом, необходимым условием успешного использования этого метода адсорбционной хроматографии является отсутствие подобных балластных белков, присутствие их в минор ных количествах или удаление на предыдущих или последующих стадиях, а также хорошая растворимость белка в области pI (некоторые белки, например люцифераза, практически не растворимы в этой области).
Элюирующий буфер должен обеспечить десорбцию адсорбируемого белка, а также движение части балластных белков (остальные удерживаются вследствие ионного обмена), причем скорость движения этого белка вниз по колонке должна быть меньше скорости бал ластных белков. Такие условия выполняются при использовании буфера, кислая часть кото рого либо состоит из одноосновной алифатической или сульфоновой кислот (RCOOH, RSO3H), либо заряжена по типу R3NH+. Радикалы (незаряженные части) компонентов буфера обеспечивают конкуренцию с адсорбируемым на целлюлозе белком и его десорбцию, а ионы буфера, находящиеся на поверхности макромолекулы, заряд которой противоположен заряду ионообменника, связывают контрионы (соответственно Cl- или Na+), обеспечивая тем самым ионный обмен балластных белков.
Для доказательства возможности эффективного использования этого метода была очи щена пероксидаза хрена, широко применяемая в биохимии и биотехнологии. Пероксидаза – фермент, имеющий pI 7,2 (вернее несколько изоферментов с близкими значениями pI) и мо лекулярную массу 40 кДа. Ранее фермент был очищен (высокоочищенной считается перок сидаза с RZ3,1) методами, среди которых один из основных – ионообменная хроматогра фия. Она, однако, не может обеспечить требуемую чистоту, и потому этот процесс является многостадийным. Так, описано получение пероксидазы из низкоочищенного препарата (RZ0,2) ионообменной хроматографией на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозах и гель-фильтрацией на сефадексе G-100. Из 1 г препарата получено 50 мг высокоочищенной пероксидазы (Березин и др., 1975).
Результаты очистки пероксидазы адсорбционной хроматографией на ДЭАЭ- и КМ целлюлозах из такого же начального материала даны в табл. 2. Выход пероксидазы при ад сорбционном методе повышается в два раза, возможно вести работу с большим количеством белка без использования дополнительных стадий. Время очистки составляет примерно 2 ч, тогда как при ионообменной хроматографии - несколько суток. Кроме того, пероксидаза бы ла очищена тем же методом из сока хрена после предварительного осаждения белка сульфа том аммония. Из 100 кг корневищ было получено 3,5 г очищенного фермента (RZ 3,35), то гда как в ранее опубликованной работе (Рини патент Венгрии №172872, 1990) из того же ко личества сырья получали 0,6 г фермента с RZ 2,7.
Таблица 2 - Очистка пероксидазы адсорбционной хроматографией Стадия Степень Количество Удельная Выход, % белка, очистки активность, ед/мг очистки от г балластных белков, % Исходный 13,3 148 препарат Адсорбционная 86 1,85 979 хроматография на ДЭАЭЦ Адсорбционная 88 1,58 1050 хроматография на КМЦ *Приведены данные одного из трех репрезентативных экспериментов.
Таким образом получили высокоочищенный фермент со средним значением RZ 3,35 и специфической активностью 1000–1100 ед/мг (субстрат 4-аминоантипирин). Этот фермент соответствует типу 12 (наиболее очищенному препарату) пероксидазы производства фирмы Sigma (рис. 3).
Рисунок 3 – SDS-PAGE электрофореграмма пероксидазы хрена Одной из основных задач было определение оптимальных условий культивирования штамма-продуцента лизостафина S. simulans biovar staphylolyticus №1030, которые бы обес печивали повышенный выход целевого продукта. Поэтому на первом этапе исследований было проведено сравнение ростовых свойств питательных сред, используемых для выращи вания S. simulans. В качестве основ питательных сред для промышленного выделения мы ис пользовали следующие ферментативные гидролизаты:
- панкреатический гидролизат рыбокостной муки – ПГРМ;
- панкреатический гидролизат казеина – ПГК;
- панкреатический гидролизат мяса – ПГМ;
- панкреатический гидролизат крови – ПГКр;
- пептон.
На основе этих гидролизатов готовили питательные среды с содержанием аминного азота 0,15%. Культивирование проводили в качалочных колбах при скорости 200 об/мин при температуре 37 C в течение 16 часов. Результаты испытаний различных гидролизатов в трех независимых экспериментах при культивировании S. simulans представлены в табл. 3.
Таблица 3 - Испытание различных гидролизатов при культивировании S. simulans на колбах Питатель- № Максимальная Литическая Средняя ная среда опыта оптическая активность, литическая плотность, 540 нм ед/мл активность, ед/мл ПГРМ 1 6,9 5, 2 6,8 7,7 7,6 1, 3 7,7 9, ПГКр 1 1,9 0, 2 2,2 0,4 0,370, 3 2,4 0, ПГМ 1 3,6 5, 2 5,7 7,9 7,3 1, 3 5,4 8, ПГК 1 4,8 8, 2 5,0 8,7 8,21, 3 4,0 7, Пептон 1 1,0 3, 2 1,0 2,8 3,0 0, 3 1,6 3, В результате экспериментов было показано, что наилучшими ростовыми свойствами обладают среды, приготовленные на основе панкреатического гидролизата казеина, рыбного и мясного гидролизатов. Образование лизостафина происходило при росте стафилококка на всех испытанных средах, но активность целевого продукта существенно отличалась. Из трех вышеназванных сред среда на основе ПГРМ является наиболее дешевой и доступной, поэто му ее использование экономически оправдано.
Следующим этапом исследований было определение оптимальных условий культиви рования штамма-продуцента S. simulans №1030, при которых наблюдается максимальная ли тическая активность культуральной жидкости (время культивирования, pH питательной сре ды и концентрация питательных веществ). Культивирование проводили на жидкой среде, на основе ПГРМ в качалочных колбах при скорости 200 об/мин при температуре 37 C в тече ние 16 ч. Для оценки влияния кислотности питательной среды на рост штамма-продуцента и синтез лизостафина, культивирование проводили при различных значениях pH. Результаты исследований представлены на рис. 4, 5.
Рисунок 4 – Динамика роста Рисунок 5 – Динамика ферментативной S. simulans в процессе культивиро- активности лизостафина (ед/мл) в вания при различных рН процессе культивирования S. simulans при различных рН Было показано, что наилучшая секреция лизостафина наблюдалась при значениях рН культуральной жидкости 7,5 и времени культивирования 12 ч. При сравнении динамики рос та S. simulans с изменением литической активности культуральной жидкости видно, что оп тическая плотность культуры в процессе роста коррелировала с активностью лизостафина.
Показатель литической активности супернатанта достигал максимума в фазе замедления роста бактериальной культуры.
Другим важным фактором, определяющим процесс роста культуры, является концен трация питательных веществ в культуральной среде, интегральным параметром которого может служить содержание аминного азота. Чтобы выявить влияние этого параметра, было проведено культивирование S. simulans в среде на основе ПГРМ, содержащей различное ко личество аминного азота. Оценку результатов определяли по двум показателям: литической активности и удельной литической активности, рассчитываемой как литическая активность в расчете на 0,1 % аминного азота. Результаты экспериментов представлены на рис. 6.
Литическая активность, ед/мл 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0, Концентрация аминного азота, % максимальное значение литической активности удельная литическая активность Рисунок 6 – Зависимость стафилолитической активности культуры S. simulans 1030 от концентрации аминного азота в питательной среде. Приведены данные одного из пяти репрезентативных экспериментов.
Литическая активность культуральной жидкости зависела от содержания аминного азо та в питательной среде – увеличение концентрации аминного азота приводило к повышению литической активности. Однако эта зависимость не была линейной: двукратное повышение аминного азота не приводило к двукратному повышению литической активности. Таким об разом, из графика видно, что максимальная удельная литическая активность наблюдалась при концентрации аминного азота 0,03 %. Это наиболее «экономичная» точка, где расход питательных веществ на получение единицы литической активности лизостафина в процессе культивирования минимален. Однако следует иметь в виду, что использование низких «эко номичных» концентраций аминного азота существенно увеличивает объем культуральной жидкости, поэтому реально целесообразная концентрация питательных веществ в среде оп ределяется возможностями применяемого оборудования.
В качестве источника углерода и энергии в опытах на колбах использовали глюкозу.
Однако на биореакторе было показано, что однократное введение глюкозы часто приводит к хорошему росту культуры, но к низкой активности фермента. Лучшие результаты были дос тигнуты при дробном введении глюкозы, причём общее количество её было ниже, чем при однократном введении. Эти результаты объясняются тем, что при добавлении небольшого количества глюкозы она используется как источник углерода и энергии, а при дальнейшем добавлении действует как ингибитор синтеза лизостафина. Поэтому в дальнейшем в качестве источника углерода и энергии использовали глицерин, в концентрации такой же, как и при однократном введении глюкозы без каких-либо последствий для уровня активности при вы ращивании как на колбах, так и в биореакторе.
Известно, что культивирование бактерий в биореакторе осложняется таким процессом как пенообразование. Одним из распространенных методов уменьшения пенообразования при культивировании микроорганизмов является добавление в культуральную среду пенога сителей. Наиболее часто в качестве пеногасителей используются гидрофобные вещества растительные масла - образующие в водной среде отдельную фазу, на границе которой дей ствуют значительные силы межфазового натяжения, вызывающие необратимую денатура цию белка. По этой причине добавление масла может приводить к резкому снижению выхо да целевого продукта. Поэтому одной из задач успешного масштабирования процесса куль тивирования является поиск «нетравмирующего» фермент пеногасителя. В качестве альтер нативы масляным пеногасителям мы использовали технический пеногаситель «Пента 465», относящийся к классу кремнийорганических соединений. Результаты сравнения свойств ку курузного масла и пеногасителя «Пента 465» представлены в табл. 4.
Таблица 4 - Влияние добавок пеногасителей на ферментативную активность лизо стафина при культивировании S. simulans Пеногаситель Без добавки пе- Кукурузное Пента ногасителя масло 0,1% 1,5% 0,01% 0,15% cредняя ферм. активность, ед/мл 6,51,5 20,5 1,50,4 61 5,51, % от исходной активности 100 31 23 92 Как видно из таблицы, применение кукурузного масла приводит к трех- четырехкрат ному снижению литической активности культуральной жидкости в результате значительной денатурации лизостафина. В то же время после применения «Пента 465» выход целевого продукта составлял не менее 85 % от исходного, то есть денатурация лизостафина была не более 15 %. Таким образом, эксперименты показали высокую эффективность пеногасителя «Пента 465» при отсутствии значительного инактивирующего воздействия на лизостафин.
Таким образом, были определены оптимальные условия культивирования штамма S. simulans 1030 в биореакторе. Было показано, что при культивировании культуры в пита тельной среде на основе ПГРМ, содержащей 0,03 % аминного азота в течение 12 ч происхо дит максимальное накопление лизостафина в супернатанте, а применение пеногасителя «Пента 465» обеспечивает высокую эффективность пеногашения и незначительную денату рацию целевого фермента.
Следующей задачей данной работы было изучение физико-химических свойств фер мента лизостафина. Ранее было установлено, что это Zn2+- содержащая глицилглициновая пептидаза, обладающая также эластазной активностью. Интересно, что фермент катализиру ет также реакцию транспептидации глициновых пептидов с образованием имино-, а не ацил ферментов, как в подавляющем большинстве случаев.
(Gly)3+E (Gly)2+E-NH-Gly;
RCONH-(Gly)2+E-NH-Gly RCONH-(Gly)3 + E.
Однако для установления механизма ферментативной реакции необходимо знать, какие группы входят в состав каталитического центра. До начала нашей работы эти группы были неизвестны. Для их определения при использовании клеточно иммобилизованного субстрата нами предложен кинетико-термодинамический метод. Суть его заключается в том, что опре деляются значения pK групп каталитического центра при двух различных температурах, а также величина Hион, получаемая из уравнения Вант-Гоффа:
2,303R pK aT 1T H ион T 2 T1.
Хотя на значение Hион и pK групп влияют соседние аминокислотные остатки, тем не менее, отличия от этих величин, даваемых для свободных аминокислот, таковы, что, учиты вая и другие данные по белку (первичную структуру, данные по химической модификации различных остатков и др.), можно точно определить принадлежность того или иного остатка к каталитическому центру. Но для ферментов, осуществляющих лизис клеток, существует дополнительная трудность, связанная с тем, что все кинетические и равновесные константы относятся к растворимому субстрату, тогда как в опыте мы определяем только лизис клеток.
Поэтому было показано, что определяемые из лизиса константы пропорциональны констан там для истинного (пентаглициновых мостиков) значения. Кроме того оказалось, что вели чина Hион указывает на одни остатки, а величины pK - на другие. Для определения истин ных остатков мы обратились к другому ферменту, лизирующему клетки - лизоциму, который катализирует гидролиз чередующегося сополимера NAG-NAM (N-ацетилглюкозамин – N ацетилмурамовая кислота). По данным рентгеноструктурного анализа, в активный центр это го фермента входят остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот со значениями pK 4,0 и 6,0 в случае низкомолекулярных субстратов и незаряженного полимерного субстрата – хити на. Однако в случае лизиса клеток M. lysodeicticus эти значения оказались равными 5,0 и 9,2.
Такое повышение значений pK (особенно в случае pKb) до нашей работы было неясным.
Нам удалось показать, что такое несоответствие между значениями pK для клеточного и остальных субстратов объясняется сильным отрицательным зарядом клеток, возникающим из-за наличия N-ацетилмурамовой кислоты. Концентрация ионов водорода у поверхности клетки в результате оказывается выше, чем в растворе, значение pH которого фиксирует pH метр и создается неравновесная концентрация ионов водорода между клеткой и объемным раствором. В результате кривая pH-зависимости в случае M. lysodeicticus сдвигается в ще лочную область и фиксируется не истинное, а кажущееся значение pK (рис. 7).
Рисунок 7 - Зависимость логарифма константы скорости второго порядка лизиса стафилококков под действием лизостафина от рН Однако величина pK, определяемая из двух значений температуры, оказалась такой, что для лизоцима можно однозначно определить наличие в актином центре двух кислых аминокислотных остатков, относящихся либо к аспарагиновой, либо к глутаминовой кисло те. Дополнительные данные по свойствам фермента могут их однозначно дифференцировать.
Поэтому для клеточных субстратов (в случае сильного заряда клетки) определение групп, входящих в состав активного центра, следует делать по величине Hион. А в случае низкомолекулярных или полимерных незаряженных субстратов по величине Hион и pK.
В дальнейшем определение ионогенных групп активного центра фермента с использо ванием уравнения Вант-Гоффа было проведено для лизостафина. Идентифицированными группами оказались карбоксильная и имидазол гистидина. Кроме того, используя данные по Zn2+-содержащим ферментам удалось показать, что карбоксильная группа принадлежит ос татку глутаминовой кислоты, а используя данные по эластазной активности показали, что этот остаток находится в пятом положении. Опубликованные рентгеноструктурные данные полностью подтвердили эти результаты.
Заключительным этапом наших исследований была оценка биологических свойств ли зостафина как потенциального терапевтического агента при лечении стафилококкозов.
Ранее было показано, что добавление 10 мкг лизостафина к 1 мл инфицированного зо лотистым стафилококком молока через 30 мин снижает количество жизнеспособных клеток на 5-6 порядков. Ясно выраженным был также стафилолитический эффект in vivo. Однократ ное введение в молочную железу лактирующих мышей 10 мкг лизостафина сразу после ин трамаммарного инфицирования клетками S. aureus в дозе 108 КОЕ/мышь позволило снизить бактериальную обсемененность пораженных тканей на 2-3 порядка (Bramley, Foster, 1990). В данной работе количество фермента было выражено не в единицах специфической активно сти, а в весовых единицах малоочищенного фермента, поэтому трудно установить эффек тивность его действия. Тем не менее, полученные данные указывают на то, что лизостафин обладает стафилолитическими свойствами.
В настоящей работе мы использовали очищенный лизостафин для лечения стафилокок козов у домашних (собаки) и сельскохозяйственных (коровы) животных. Группе из 20 собак с диагнозом стафилококковый отит трижды в течение трех дней вводили очищенный лизо стафин в дозе 3-5 ед/кг веса животного. Период наблюдения составил семь дней. Явное улучшение у всех животных наблюдалось уже на второй день после первого введения препа рата: регистрировалось уменьшение гнойного выделения из ушной раковины, уменьшение болезненности, значительное снижение покраснения ушной раковины. Окончательное вы здоровление этих животных наблюдали на 3-4 день после начала применения лизостафина. У пяти животных, владельцы которых ранее проводили лечение антибиотиками и мазями, по ложительный эффект проявлялся позже, и выздоровление наступало на 7-8 день лечения. Та ким образом, все животные были излечены. Побочное действие лизостафина или повышен ная чувствительность к нему ни в одном случае не были выявлены. Следует отметить, что отсутствие побочных эффектов позволяет применять лизостафин для животных всех возрас тных групп и в любом физическом состоянии.
Опытной группе коров (17 животных), страдающим стафилококковым маститом, пре парат вводили трехкратно с периодичностью день-день-через день. Период наблюдения со ставил 14 дней. Через неделю после последнего введения происходило уменьшение отека вымени и исчезновение гнойных выделений. Полное выздоровление наблюдалось через две недели после окончания курса лечения. Бактериологический контроль молока проводился трехкратно: перед началом лечения, на следующий день после последнего введения препара та и через две недели уже у клинически здоровых животных. У всех животных после лечения клетки S. aureus в молоке отсутствовали. Побочные явления не отмечались. Следует отме тить, что у одной коровы в молоке были обнаружены стрептококки и диагноз был изменен на стрептококковый мастит. Это еще раз указывает на узкую специфичность лизостафина, который расщепляет только клетки стафилококков.
Таким образом, в результате наших исследований были разработаны адсорбционные методы очистки лизостафина и других промышленно важных белков, с помощью этих мето дов получен очищенный препарат лизостафина, изучены некоторые его физико-химические свойства и оценен терапевтический эффект применения лизостафина при лечении стафило кокковых инфекций домашних животных.
Выводы.
1. Разработан адсорбционный метод выделения белков на силохроме, с помощью кото рого получен высокоактивный (1535 ед/мг) препарат лизостафина. Метод может быть ис пользован для масштабирования процесса очистки.
2. Разработан адсорбционный метод выделения белков на КМЦ и ДЭАЭЦ, позволяю щий получать высокоочищенную пероксидазу хрена с RZ 3,35-3,40. Метод применим для масштабного получения фермента.
3. Оптимизированы условия культивирования штамма-продуцента S. simulans biovar staphylolyticus. Подобрана экономически выгодная среда на основе ПГРМ. Определено зна чение pH, концентрации аминного азота и времени культивирования, позволяющие получать лизостафин с активностью до 6 ед/мл. Предложено при культивировании использовать гли церин в качестве источника углерода и силиконовый пеногаситель Пента-465, не оказываю щий денатурирующего действия на целевой белок.
4. Разработан кинетико-термодинамический метод определения ионогенных групп ка талитического центра ферментов, который позволяет идентифицировать их без использова ния рентгеноструктурного анализа. Этим методом получены данные о каталитически актив ных группах активного центра, входящих в состав макромолекул лизостафина и лизоцима.
5. Показана возможность использования полученного разработанными методами высо коочищенного нативного препарата лизостафина для лечения стафилококковых заболеваний у домашних и сельскохозяйственных животных (отита у собак и мастита у коров).
Список опубликованных по теме диссертации работ а) в изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Ионогенные группы в активном центре лизостафина. Сравнение кинетико термодинамических и рентгеноструктурных данных / В.И. Суровцев, В.М. Борзенков, Т.В.
Федоров, О.И. Смотров // Биохимия – 2007 – Т. 72. – Вып. 9. – С. 1214 – 1219.
2. Применение лизостафина для лечения животных при стафилококкозах / О.И. Смот ров, В.И. Суровцев, В.М. Борзенков, Ю.И. Хатюшин // Ветеринария. – 2010. – №11. – С. 24 – 27.
3. Причина аномальной кислотности ионогенных групп активного центра лизоцима при лизисе клеточной стенки Micrococcus lysodeicticus / О.И. Смотров, В.М. Борзенков, В.И. Су ровцев // Биоорганическая химия. – 2011. - №5. – С. 631-636.
б) в патентах 1. Способ получения лизостафина / В.И. Суровцев, В.М. Борзенков, Т.В. Федоров, О.И.
Смотров // Патент РФ №2342431. – Бюл. 2008. – № 36.
в) в материалах конференций 1. Адсорбционная хроматография белков на ионообменниках / О.И. Смотров // научно практическая конференция молодых ученых и специалистов научно-исследовательских уч реждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире»: Тезисы докладов. – Оболенск, 2009. – С. 2. Модификация метода ионообменной очистки лизостафина на силохроме / О.И.
Смотров // научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов научно исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности»: Тезисы докладов. – Оболенск, 2010. – С. Список сокращений и условных обозначений ГКПМ – Государственная коллекция патогенных микроорганизмов ГНЦ ПМБ – Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехно логии ДЭАЭЦ – диэтиламиноэтилцеллюлоза КМЦ – карбоксиметилцеллюлоза КОЕ – колониеобразующая единица ПГРМ – панкреатический гидролизат рыбокостной муки ПГКр – панкреатический гидролизат крови ПГМ – панкреатический гидролизат мяса ПГК – панкреатический гидролизат казеина in vivo – эксперимент на животных NAG-NAM – N-ацетилглюкозамин – N-ацетилмурамовая кислота pI – значение изоэлектрической точки рК – значение рН, при котором заряжено 50% групп RZ – от Reinheitszahl, критерий очистки А403/А Hион – значение энтальпии ионизации Благодарности Приношу искреннюю благодарность моим научным руководителям чл.-корр. РАМН, доктору мед. наук, профессору Дятлову Ивану Алексеевичу и доктору биол. наук Суровцеву Владимиру Ивановичу, за неизменно высокий вклад и огромную помощь в формировании концепции научной работы.
Приношу благодарность всем членам диссертационного совета, а также моим научным рецензентам канд. хим. наук Жиглецовой С.К. и канд. мед. наук Евсегнееву С.И. за тщатель ную проработку моей диссертационной работы и ценные замечания, которые будут учтены и исправлены при проведении дальнейших исследований.
Считаю своей приятной обязанностью выразить искреннюю благодарность Борзенкову В.М., Хатюшину Ю.И., Бахтеевой И.В., а также всем моим соавторам и сотрудникам ГНЦ ПМБ, принимавшим непосредственное участие в планировании и проведении эксперимен тов, обсуждении их результатов и оказании помощи в оформлении диссертации.
Приношу искреннюю благодарность моим неофициальным рецензентам настоящей ра боты, за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.