Экспрессия гена snca и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови при болезни паркинсона, обусловленной мутациями гена lrrk2

На правах рукописи

ЕМЕЛЬЯНОВ Антон Константинович ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА SNCA И УРОВЕНЬ БЕЛКА АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА, ОБУСЛОВЛЕННОЙ МУТАЦИЯМИ ГЕНА LRRK2 Специальность:

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Учреждения Российской академии наук "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН

Научный консультант: кандидат биологических наук Пчелина Софья Николаевна.

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Горбунова Виктория Николаевна, Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Санкт-Петербург, доктор биологических наук, профессор Иващенко Татьяна Эдуардовна НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, г. Санкт-Петербург.

Учреждение Российской академии Ведущее учреждение:

медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН.

Защита состоится « » 2011 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «_» _ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.212.232. доктор биологических наук Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Болезнь Паркинсона является распространенным (БП) нейродегенеративным заболеванием среди лиц среднего и пожилого возрастов.

Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 60 лет составляет 1-2 % (Brooks et al., 2002). Развитие симптомов (ригидность мускулатуры, тремор, брадикинезия, нарушение позы) коррелирует с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) мозга, приводя к снижению концентрации дофамина в полосатом теле. Следует отметить, что симптомы БП проявляются при гибели 50–80 % дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Механизм гибели дофаминергических нейронов ЧС при БП остаётся неясным. По этой причине не существует лабораторных диагностических тестов БП и доля случаев неправильной постановки диагноза достигает 25 % (Bennett et al., 1996;

Bower et al., 2002). Выяснение механизма гибели дофаминергических нейронов при БП является важной задачей не только для понимания общего патогенеза заболевания, но и для разработки превентивной терапии. При этом важным подходом для изучения молекулярно генетических основ БП представляется исследование моногенных форм заболевания с известной этиологией.

Семейные формы БП составляют 10-15 % всех случаев БП (Gasser et.al., 2007). В настоящее время описано шесть генов, мутации в которых приводят к развитию наследственных форм БП (Lesage et al., 2009). Наиболее частой причиной развития наследственных форм БП являются мутации в гене обогащённой лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), приводящие к аутосомно-доминантной форме заболевания (Farrer et al., 2006). Шесть мутаций в гене LRRK2 в настоящее время признаны определенно патогенными: G6055A (G2019S), C4321T (R1441C), C4321G (R1441G), G4322A (R1441H), A5096G (Y1699C) и T6059C (I2020T), из которых наиболее распространенной является мутация G6055A (G2019S) (85 % от всех LRRK2-ассоциированных случаев БП).

На втором месте по частоте выявления – мутация C4321T (R1441C) (около 10 %) (Giasson et al., 2008). В зависимости от популяции G6055A (G2019S) ассоциированная БП встречается в 5–40 % случаев семейной БП (Di Fonzo et al., 2005). В Европе мутация G6055A (G2019S) выявляется также в 1 % случаев спорадической БП (Giasson et al., 2008).

Ранее нами было показано, что частота LRRK2-ассоциированной БП среди пациентов с семейной формой БП в северо-западном регионе России составляет 6 %. В пяти семьях была выявлена G6055A (G2019S) ассоциированная БП, в одной семье описана новая мутация T4838C (V1613A), приводящая к развитию БП с преобладающим тремором (Иванова, 2008).

Выявление LRRK2-ассоциированной БП впервые дает возможность создания репрезентативной группы пациентов с однородной этиологией БП. Такая группа пациентов может быть использована как для исследования молекулярных механизмов развития БП, так и для выявления биомаркеров развития более общих форм заболевания.

В настоящее время считается, что в основе молекулярных механизмов БП лежит нарушение фолдинга и полимеризация белка альфа-синуклеина (ген SNCA) (Singleton et al., 2005;

Cookson, van der Brug, 2008). Альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви, как при наследственных, так и при спорадических формах БП (сБП) (Spillantini et al., 1997;

Hasegawa et al., 2006;

Periquet et al., 2007). Точечные мутации в гене SNCA (Polymeropoulos et al., 1997;

Conway et al., 1998;

Fredenburg et al., 2007), а также дупликация и трипликация гена SNCA приводят к развитию наследственных форм БП (Miller et al., 2004);

нейротоксичность агрегатов альфа-синуклеина была многократно продемонстрирована in vitro, а также на трансгенных животных (мыши и дрозофила) (Conway et al., 1998;

Waxman et al., 2008;

Feany et al., 2000).

Известно, что фосфориллирование альфа-синуклеина повышает его нейротоксичность (Anderson et al., 2006).

В большинстве случаев при LRRK2-ассоциированной БП наблюдается классическая картина нейродегенерации с формированием телец Леви (Hernandez et al., 2005), в которых LRRK2 обнаруживается наряду с альфа синуклеином (Perry et al., 2008). Показано, что мутация G6055A (G2019S) приводит к повышению киназной активности LRRK2 (Jaleel et al., 2007). При этом физиологические субстраты LRRK2 и механизмы, лежащие в основе развития БП при мутациях в гене LRRK2, остаются неизвестными. Неизвестно также, оказывают ли влияние мутации гена LRRK2 на метаболизм альфа синуклеина.

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования Исследование уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП.

Задачи исследования 1. Определение частоты мутаций G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C), T4838C (V1613A) гена LRRK2 у пациентов с БП в северо-западном регионе России.

2. Анализ уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП, у пациентов со спорадической БП и лиц с отсутствием неврологических заболеваний.

3. Оценка влияния возраста, пола и приема Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень белка альфа-синуклеина в исследуемых группах.

4. Анализ уровня мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП, у пациентов со спорадической БП и лиц с отсутствием неврологических заболеваний.

5. Оценка влияния возраста, пола и приема Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК гена SNCA в исследуемых группах.

Научная новизна Впервые у пациентов с LRRK2-ассоциированной формой БП проведено исследование уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови. Впервые показано снижение уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП по сравнению с группой пациентов со спорадической БП и контролем. Впервые оценено влияние возраста, пола, возраста начала заболевания, длительности заболевания, приема Л-ДОФА содержащих препаратов на уровень мРНК и альфа-синуклеина среди пациентов с БП в России.

Практическая значимость работы Изучение механизма нейродегенерации при моногенных формах БП, в частности при LRRK2-ассоциированной форме заболевания, позволит ближе подойти к пониманию патогенеза более распространенных спорадических форм БП. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных основ патогенеза LRRK2-ассоциированной БП. Разработанный метод генотипирования наиболее распространенной среди семейных случаев БП мутации G6055A (G2019S) гена LRRK2 может быть использован в клинической практике при выявлении LRRK2-ассоциированных форм БП. Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей пациентов с данной формой заболевания и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутации до начала проявления клинических симптомов заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Частота мутации G6055A (G2019S) гена LRRK2 выше среди пациентов с семейной формой БП (7 %), чем среди пациентов со спорадической формой заболевания (0,4 %). Частота мутации С4321Т (R1441C) среди спорадических случаев БП в северо-западном регионе России составляет 0,4 %.

2. Уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови снижен в группе пациентов с LRRK2-ассоциированной БП по сравнению с пациентами со спорадической БП и лицами с отсутствием неврологических заболеваний.

3. Пациенты с ранней формой БП (начало до 50 лет) характеризуются высоким уровнем белка альфа-синуклеина по сравнению с пациентами с более поздним дебютом заболевания.

4. У лиц с отсутствием неврологических заболеваний наблюдается увеличение уровня мРНК гена SNCA с возрастом.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации Осмотр пациентов, забор у них периферической крови осуществлялся д.м.н., профессором А. Ф. Якимовским. Разработка методов ПЦР и рестрикционного анализа проведены совместно с О. Н. Ивановой. Скрининг мутаций в группе пациентов с БП выполнен автором лично. Измерение уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови пациентов с БП, обусловленной мутациями гена LRRK2, пациентов со сБП и в контроле проведены автором лично. Оценка мультипликаций гена SNCA была проведена автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы Предложенные к защите результаты были доложены на конференции «Человек и здоровье–2007», Санкт-Петербургская медицинская академия им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург (2007);

европейской конференции по генетике человека, Ницца, Франция (2007);

12-м конгрессе европейской федерации неврологических ассоциаций, Мадрид, Испания (2008);

I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008);

V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2009);

9-й международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона, Прага, Чехия (2009);

14-й международной Пущинской школе-конференции молодых учёных, Пущино (2010);

VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону (2010).

Публикации Результаты диссертационной работы отражены в 20 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 6 статей, из них 4 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы (198 наименований). Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами, 26 рисунками и фотографиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика групп В ходе проведения исследования был расширен имеющийся банк ДНК пациентов с БП. Дополнительно обследовано 35 пациентов с семейной формой БП и 230 пациентов со сБП, прошедших неврологическое обследование в консультативно-диагностическом центре Санкт-Петербургского государствен ного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова. Критериями отбора служило сочетание хотя бы двух фенотипических проявлений, характерных для БП: гипокинезия, ригидность, тремор покоя, постуральная неустойчивость. Все пациенты с семейной формой БП имели аутосомно-доминантный тип наследования. Характер наследования определялся при проведении клинико генеалогического исследования.

При исследовании уровня экспрессии альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови у пациентов с БП в контрольную группу было включено 23 человека, не являющихся близкими родственниками, с отсутствием неврологических заболеваний и состоящих на учёте в СПб городском гериатрическом центре. Все члены контрольной группы проходили обследование невролога с целью исключения диагноза БП и других нейродегенеративных заболеваний. Данная выборка является случайной и принадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц с БП.

Во всех обследованных группах был осуществлён забор крови для последующего проведения молекулярно-генетического анализа и создания банка лимфоцитов периферической крови. Данная работа одобрена этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова.

Экспериментальные методы Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984).

С целью выявления LRRK2-ассоциированной БП нами проведен скрининг мутаций G6055A (G2019S), C4321T (R1441C), T4838C (V1613A) гена LRRK среди пациентов с БП. Нами разработаны методы идентификации вышеуказанных мутаций на основе ПЦР с введением сайтов рестрикции для соответствующих эндонуклеаз. ПЦР проводили на автоматическом термоциклере Терцик (ДНК-Технология, Москва). Нормальный и мутантный аллели различали по длине рестрикционных фрагментов, используя электрофорез в ПААГ с окраской раствором бромистого этидия. Выявленные мутации G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C) были подтверждены методом прямого секвенирования на приборе ABI 377.

Для оценки мультипликаций гена SNCA был использован метод «дозы гена» на основе проведения количественной ПЦР в режиме реального времени с зондами TaqMan на приборе ABI7000 Prism (Nishioka et al., 2006). В качестве референс-гена был использован однокопийный ген HBB (бета-глобин).

Лимфоциты периферической крови выделяли методом градиентного центрифугирования при 1600 об./мин. в растворе Фиколла (р = 1,077, БиоЛот, Санкт-Петербург). Тотальная РНК была выделена с использованием набора для выделения РНК AquaPure RNA Isolation Kit, (Bio-Rad, USA). 10 нг РНК использовали для получения кДНК методом обратной транскрипции с использованием набора iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, USA) согласно условиям производителя сразу после выделения РНК.

Определение уровня мРНК гена SNCA и референс-гена проводилось методом количественной ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентными зондами TaqMan на приборе ABI7000 Prism с использованием разработанных нами праймеров и зондов TaqMan. В качестве референс-гена был использован ген GNB2L1 (guanine nucleotide binding protein (G белок)). Зонды отжигались на кДНК в местах экзон-экзонных стыков с целью исключения амплификации геномной ДНК. В качестве флуоресцентной метки зонда для кДНК гена GNB2L1 использовался краситель R6G, зонда для кДНК гена SNCA – FAM. В результате проведения ПЦР с использованием зонда на кДНК гена SNCA и соответствующего референс-гена получали кинетические кривые, отображающие накопление ПЦР-продукта. Для построения стандартной кривой использовались следующие разведения контрольной кДНК: 1, 1/8, 1/32.

Стандартная кривая строилась в каждом эксперименте как для гена SNCA, так и референс-гена.

Для измерения количества альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови лимфоциты лизировали в растворе (10 мM Tris pH 7,4;

2 % додецилсульфат (TX-100)), включающем ингибиторы протеаз (Sigma P8340). Количество общего белка определяли по методу Лоури с использованием соответствующего набора Россия) на (Синтакон, спектрофотометре SmartSpecTMPlus (BioRad, США). Для измерения содержания альфа-синуклеина был использован метод вестерн блоттинга.

Количество исследуемого белка было нормировано сравнением с бета-актином.

Для этого были использованы следующие антитела: к альфа-синуклеину – BD Transduction Labs, США в разведении 1:1000, для бета-актина – Abcam, Великобритания в разведении 1:5000) и «вторичные антитела», конъюгированные с пероксидазой: для альфа-синуклеина – „rabbit anti-mouse” 1:5000, Amersham Pharmacia Biotech, США;

для бета-актина – „goat anti-rabbit” Великобритания. Результаты IgG-H&L; (HRP) 1:3000, Abcam, TM идентифицировали с использованием набора Lumigen PS-3 (GE Healthcare UK Limited, Великобритания) с использованием фотоплёнки KODAK BioMax.

Данные вестерн блотинга анализировали с помощью программы ImageJ (версия 1.38a для Windows, http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Статистический анализ был проведен с использованием программы SPSS, версия 17.0. Соответствие полученных данных нормальному распределению проверялось с использованием критерия Шапиро-Уилка. Сравнение вариационных рядов исследуемых групп проведено с использованием критерия Крускал-Уоллеса и Манна-Уитни. Значения Р 0,05 считались статистически значимыми. Данные представлены в виде среднего ± ст. ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выявление пациентов с LRRK2-ассоциированной БП Мутация G6055A (G2019S) обнаружена в двух семьях с БП (родословные PD6, PD7) (рис. 1). В семье PD6 мутация G6055A (G2019S) выявлена только у пробанда (II-1, муж, начало заболевания в возрасте 65 лет). В семье PD данная мутация была обнаружена у пробанда (II-1, жен., начало заболевания в возрасте 74 лет) и ее сестры (II-2), также больной БП (начало заболевания в лет). Все трое ранее не описанных пациентов с мутацией G6055A (G2019S) имели БП с классической триадой симптомов (акинетико-ригидно-треморная форма) с поздним началом заболевания. Также было выявлено два спорадических случая с мутациями G6055A (G2019S) и С4321Т (R1441C), имеющие классическую картину идиопатической БП.

Таким образом, описанная ранее (Иванова, 2008) частота случаев БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) среди пациентов с семейной формой БП в северо-западном регионе России была уточнена и составила 7 % (7/100), что сопоставимо с данными, полученными для европейских популяций.

Частота мутации G6055A (G2019S) среди пациентов со сБП составила 0,4 % (1/230). Аналогичная частота получена для мутации С4321Т (R1441C).

Мутации T4838C (V1613A) в исследуемых группах обнаружено не было.

260 п.н.

114 п.н.

160 п.н.

87 п.н.

100 п.н.

Рис. 1. а) Результаты секвенирования фрагмента ДНК, содержащего транзицию G6055A (G2019S);

б) Идентификация мутации G6055A (G2019S): 1 – маркер молекулярного веса pBR322/BsuRI, 2 – ПЦР-продукт, 3, 4 – гетерозиготное носительство мутации G6055A (G2019S), 5 – норма;

в) Родословные семей PD6, PD7 с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) (внизу элементов указаны: генотип (m-мутация в гетерозиготном состоянии), возраст обследования, в скобках – возраст начала заболевания);

г) Результаты секвенирования фрагмента ДНК, содержащего транзицию C4321T (R1441C). Приведен сиквенс антисмысловой цепи;

д) Идентификация мутации С4321Т (R1441C): 1 – маркер молекулярного веса pBR322/BsuRI, 2 – ПЦР-продукт, 3 – гетерозиготное носительство мутации С4321Т (R1441C), 4 – норма Полученные результаты предполагают, что для выявления LRRK2 ассоциированной БП в первую очередь целесообразно проводить скрининг мутации G6055A (G2019S) у пациентов с семейной формой БП. При этом разработанный нами метод идентификации мутации G6055A (G2019S) может быть широко использован в клинической практике, что позволит выявлять случаи LRRK2-ассоциированной БП и проводить доклиническую диагностику БП в семьях с выявленной молекулярной этиологией заболевания.

В последующее исследование была включена группа согласившихся на исследование пациентов с LRRK2-ассоциированной БП (6 – с мутацией G6055A (G2019S), и 2 – с T4838C (V1613A)).

Уровень мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови В настоящем исследовании у всех пациентов с БП была исключена мультипликация гена SNCA. Полученные нами результаты можно объяснить невысокой частотой встречаемости мультипликаций данного гена (1-1,5 %) среди пациентов с БП (Hope et al., 2004;

Williams-Gray et al., 2006). В недавней работе Е. Семёновой и соавторов при исследовании 52 пациентов из Москвы с аутосомно-доминантной формой БП мультипликаций гена SNCA также обнаружено не было (Semenova et al., 2009).

Уровень мРНК гена SNCA определяли в лимфоцитах периферической крови 7 пациентов с LRRK2-ассоциированной БП, 15 пациентов со сБП и 15 индивидуумов контрольной группы. Полученные значения уровня мРНК гена SNCA в группе пациентов с LRRK2-ассоциированной БП достоверно не отличались, как от группы со сБП (p = 0,17), так и от контроля (p = 0,31) (рис. 2).

Рис. 2. Средний уровень мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови в группах:

пациенты с LRRK2-ассоциированной БП (n = 7), пациенты с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) (n = 6), со сБП (n = 15) и в контроле (n = 15) Также различий не было выявлено при исследовании отдельно пациентов с мутацией G6055A (G2019S).

Уровень мРНК гена SNCA в группе с LRRK2-ассоциированной БП измерялся впервые. Для пациентов со сБП в ряде предыдущих исследований также не выявлено различий в уровне мРНК гена SNCA по сравнению с контролем (Tan et al., 2005;

Fuchs et al., 2008).

Уровень альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови Измерение белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови было проведено в следующих группах: пациенты с LRRK2-ассоциированной формой БП (n = 8), пациенты со сБП (n = 34) и в контроле (n = 23). На всех блотах наблюдали один специфичный бенд, соответствующий мономерному альфа-синуклеину с молекулярной массой 19 кДа (рис. 3).

Рис. 3. Результаты вестерн блоттинга: 1 – носитель мутации G6055A (G2019S);

2 – пациент со сБП;

3 – индивидуум контрольной группы;

4 – рекомбинантный белок альфа-синуклеин Нами выявлено достоверное снижение альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в группе пациентов с LRRK2-ассоциированной БП по сравнению как с группой сБП (p = 0,03), так и с контролем (p = 0,01) (рис. 4).

Рис. 4. Относительный уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в исследуемых группах: пациенты с LRRK2-ассоциированной БП (n = 8), с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) (n = 6), со сБП (n = 34) и в контроле (n = 23) (ось абсцисс – исследуемые группы;

ось ординат – относительное среднее количество белка (о.е.)) При этом значения среднего уровня белка между группами сБП и контроля не отличались (p = 0,5). Отдельно был исследован уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови пациентов с мутацией G6055A (G2019S). Было выявлено его достоверное снижение в данной группе пациентов по сравнению как с группой сБП (p = 0,02), так и с контролем (p = 0,03) (рис. 4).

Исследования уровня альфа-синуклеина в однородной по этиологии группе пациентов с БП проведено нами впервые. В ранее опубликованные исследования по изучению уровня альфа-синуклеина клеток крови входили гетерогенные группы пациентов со сБП неизвестной этиологии. Несколько групп исследователей предположили, что уровень периферического альфа синуклеина может служить маркером развития БП. Так, сниженный уровень альфа-синуклеина плазмы крови пациентов с БП был выявлен в работе Li X. с соавторами (Li et al., 2007). Однако в работе Fuch J. с соавторами уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови не отличался у пациентов со сБП при сравнении с контролем (Fuchs et al., 2008). В работе Kim S. с соавторами было показано увеличение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов со сБП (Kim et al., 2004).

Полученные нами показатели уровня альфа-синуклеина для групп сБП и контроля были крайне вариабельны. В работе Michell A. с соавт. альфа синуклеин тромбоцитов пациентов с БП демонстрировал также крайне вариабельные значения и не отличался от контрольной группы (Michell et al., 2005). Аналогичные результаты были недавно получены при сопоставлении альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в группе сБП и в контроле американскими исследователями (Brighina et al., 2010). Результаты нашего исследования не позволяют рассматривать уровнь альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в качестве прогностического маркера развития БП.

Мы впервые показали снижение альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП по сравнению с пациентами со сБП и контролем. Ранее группа пациентов c LRRK2-ассоциированной БП была исследована с целью выявления нарушений в работе киназного каскада при этой форме заболевания (White et al., 2007).

Белок LRRK2 имеет киназный домен, обладающий гомологией с MAPKKK киназами, которые задействованы в различных процессах, таких как пролиферация, дифференцировка и др. (Miloso et al., 2008;

Sweatt et al., 2004).

MAPKKK-киназы являются ферментами, часто выступающими в качестве инициаторов сигнальных каскадов, являясь регуляторами транскрипции (Yang et al., 2003). Недавно Carballo-Carbajal и соавторы показали in vitro способность белка LRRK2 регулировать транскрипцию гена SNCA (Carballo-Carbajal et al., 2010). Выявленное нами снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2 нельзя объяснить влиянием LRRK2 на транскрипцию гена SNCA, поскольку мы не наблюдали снижения уровня мРНК гена SNCA у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП. Полученные результаты скорее позволяют предположить изменения на посттрансляционном уровне.

Известно, что альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви, которые являются нейропатологическим признаком различных нейродегенеративных заболеваний, в том числе и БП. В большинстве случаев при LRRK2-ассоциированной БП наблюдается классическая картина нейродегенерации с формированием телец Леви (Hernandez et al., 2005), в которых белок LRRK2 оказывается колокализован с альфа-синуклеином (Perry et al., 2008). В то же время появились первые результаты, указывающие на вовлеченность LRRK2 в непосредственное взаимодействие с альфа синуклеином (Qing et al., 2009). В системе in vitro было продемонстрировано участие LRRK2 в фосфорилировании альфа-синуклеина по серину в 129 положении. При этом было также показано, что уровень фосфорилирования в случае LRRK2 дикого типа ниже, чем в случае LRRK2 с мутацией G6055A (G2019S). Необходимо отметить, что ранее многократно показана повышенная киназная активность LRRK2 при мутации G6055A (G2019S) гена LRRK2 (West et al., 2005;

Greggio et al., 2006;

MacLeod et al., 2006;

Smith et al., 2006).

В нашем исследовании мы использовали антитела к альфа-синуклеину человека (BD Transduction Labs, США), иммуногенные к 15– аминокислотам, позволяя выявлять формы альфа-синуклеина, содержащие все известные на сегодняшний день сайты фосфорилирования (y125, s129, y133, s136), кроме белка, фосфорилированного по серину в позиции 87 (s87). Нами выявлено снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2, на фоне неизменённого уровня мРНК гена SNCA, что не исключает накопление фосфорилированной формы s87 альфа-синуклеина у этих пациентов.

В настоящее время основная гипотеза гибели дофаминергических нейронов ЧС связана с агрегацией альфа-синуклеина. В нашем исследовании бэндов с изменённой подвижностью, свидетельствующих о наличии олигомерных форм белка, в лимфоцитах периферической крови пациентов с LRRK2-ассоциированной БП обнаружено не было. Нельзя, однако, исключать отсутствие иммуногенности используемых антител к агрегированным формам альфа-синуклеина.

Снижение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови пациентов с LRRK2-ассоциированной БП, выявленное в нашем исследовании, может приводить к нарушению его функций, в частности, как ингибитора тирозин-гидроксилазы, вызывая увеличение свободного дофамина в клетке, развитие окислительного стресса и запуск каскада апоптоза. Мы полагаем, что выявленное нами снижение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП по сравнению с группой со сБП и контроля, может отражать нарушение общих обменных механизмов при данной форме заболевания.

Суммируя результаты зарубежных исследований и настоящей работы, можно предположить, что уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови зависит от этиологии заболевания и не может быть использован как прогностический маркер развития БП.

Влияние клинических характеристик пациентов со сБП и лиц контрольной группы на уровень мРНК гена SNCA и белка альфа синуклеина В настоящем исследовании было изучено влияние возраста, пола, возраста начала заболевания, длительности заболевания, а также приема Л ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК гена SNCA и белка альфа синуклеина лимфоцитов периферической крови пациентов со сБП. В контрольной группе оценивалось влияние возраста и пола.

В результате исследования влияния пола на уровень мРНК гена SNCA и альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови пациентов со сБП и индивидуумов контрольной группы достоверных различий выявлено не было, что согласуется с ранее полученными данными (Li et al., 2007;

Tan et al., 2005;

Kim et al., 2004;

Fuch еt al., 2008). Следует, однако, отметить исследование Brighina L. и соавторов, где было показано повышение уровня альфа синуклеина лимфоцитов периферической крови у мужчин по сравнению с женщинами контрольной группы (Brighina et al., 2010).

При изучении влияния возраста на уровень мРНК гена SNCA и альфа синуклеина у лиц контрольной группы старше 70 лет было выявлено двукратное увеличение уровня мРНК гена SNCA по сравнению с лицами моложе 70 лет (p = 0,04). Подобная тенденция отмечалась также в группе пациентов со сБП (р = 0,059). Возрастание уровня мРНК гена SNCA с возрастом было показано ранее (Kim et al., 2004). В другом исследовании с возрастом отмечалось увеличение белка (Brighina et al., 2010), не отмеченное в настоящем исследовании.

Нами также выявлен повышенный уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов со сБП с возрастом начала заболевания до 50 лет по сравнению с пациентами с началом заболевания старше 50 лет (р = 0,013). Интересно отметить, что при сопоставлении длительности заболевания у пациентов с ранним и поздним началом БП выявлено достоверное увеличение длительности БП в группе пациентов с началом заболевания до 50 лет по сравнению с пациентами с более поздним началом заболевания (p = 0,006).

Таким образом, выявленное увеличение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в группе пациентов с началом заболевания до 50 лет может объясняться более длительным течением заболевания у этих пациентов. Важно отметить, что в работе Fuch J. и соавторов показана прямая корреляция уровня альфа-синуклеина периферической крови и длительностью течения заболевания у пациентов со сБП (Fuch et al., 2008).

При сопоставлении приёма Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК гена SNCA были выявлены достоверные различия между группами пациентов со сБП, принимающих и не принимающих Л-ДОФА-содержащие препараты (р = 0,037). Следует отметить, что ранее было показано, что уровень дофамина лимфоцитов периферической крови у пациентов со сБП, принимающих Л-ДОФА-содержащие препараты, повышен (Rajda et al., 2005).

Последние исследования in vitro выявили прямое влияние уровня дофамина на экспрессию гена SNCA с участием транскрипционного фактора NF-kB (Alberio et al., 2010).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате исследования нами была уточнена частота случаев G6055A (G2019S)-ассоциированной БП в северо-западном регионе России (7 % – среди семейных форм БП, 0,4 % – среди спорадических), а также впервые в России описана частота С4321Т (R1441C)-ассоциированной БП (0,4 % – среди спорадической БП). Полученные результаты указывают на целесообразность скрининга мутации G6055A (G2019S) среди пациентов с семейной формой БП.

Впервые измерен уровень белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в однородной по этиологии группе пациентов с БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2 и показано снижение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови в группе пациентов с LRRK2 ассоциированной БП при отсутствии изменений в уровне мРНК гена SNCA.

Полученные данные предполагают, что уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови зависит от этиологии заболевания и не может быть использован для диагностики БП.

ВЫВОДЫ 1. В северо-западном регионе России частота мутации G6055A (G2019S) гена LRRK2 среди пациентов с семейной формой БП составляет 7 % (7/100), среди спорадических случаев заболевания – 0,4 % (1/230).

Частота мутации С4321Т (R1441C) составляет 0,4 % (1/230) среди пациентов со спорадической БП.

2. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене LRRK2, характеризуется снижением уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови по сравнению со спорадической БП и лицами без неврологических заболеваний при отсутствии изменений уровня мРНК гена SNCA.

3. Уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови выше в группе пациентов со спорадической БП с ранним началом заболевания (до 50 лет) по сравнению с пациентами с более поздним развитием заболевания.

4. Уровень мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови у лиц с отсутствием неврологических заболеваний увеличивается с возрастом.

5. Уровень мРНК гена SNCA у пациентов со спорадической БП, проходящих терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами, выше по сравнению с пациентами, не принимающими данных препаратов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК МОН России 1. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Ivanova O.N., Emelianov A.K., Zakharchuk A.H., Schwarzman A.L. G2019S LRRK2 Mutation in Familial and Sporadic Parkinson’s Disease in Russia // Movement Disorders. – 2006. – Vol. 21. – № 12. – P. 2234–2236.

2. Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К., Якимовский А.Ф., Шварцман А.Л. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России // Медицинская генетика. – 2006. – Т. 5. – № 2. – С. 48–51.

3. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Emelyanov A.K., Ivanova O.N., Schwarzman A.L., Singleton A.B. Screening for LRRK2 Mutations in Patients with Parkinson's Disease in Russia: Identification of a Novel LRRK2 Variant // Eur J Neurol. – 2008. – Vol. 5. – P. 692–696.

4. Пчелина С.Н., Емельянов А.К., Якимовский А.Ф., Миллер Д.В., Шабалина И.Г., Дроздова А.С., Шварцман А.Л. Сниженный уровень альфа-синуклеина в лейкоцитах периферической крови у пациентов с болезнью Паркинсона Бюллетень LRRK2-ассоциированной // экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 150. – № 12. – С. 619–621.

Публикации в других изданиях 5. Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К., Якимовский А.Ф. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене LRRK2 // Молекулярно биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А.Б. Масленникова, Новосибирск: Альфа Виста Н. – 2008. – Выпуск 12. – С. 191.

6. Емельянов А.К., Пчелина С.Н. Альфа-синуклеин и его роль в патогенезе болезни Паркинсона // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А.Б. Масленникова, Новосибирск: АртЛайн. – 2010. – Выпуск 14. – С. 65–81.

Список тезисов 7. Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К., Соловьева А.В., Якимовский А.Ф. Молекулярная диагностика болезни Паркинсона // Конференция «Фундаментальные науки – медицине»: сборник тезисов. – Москва. – 2006. – С. 24-25.

8. Иванова О.Н., Емельянов А.К., Соловьева А.В., Якимовский А.Ф., Пчелина С.Н. Исследование распространения мажорных мутаций в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России // Сосудистые заболевания нервной системы у блокадников, лиц пожилого и старческого возраста: cборник тезисов. – Санкт-Петербург. – 2006. – Выпуск 3. – С. 26.

9. Емельянов А.К., Соловьева А.В., Смирнова Е.Ю. Рук. Пчелина С.Н.

Уровень экспрессии гена SNCA у больных с семейной формой болезни Паркинсона // Человек и здоровье–2007: сборник тезисов. – Санкт Петербург. – 2007. – С. 64-65.

10. Емельянов А.К., Смирнова Е.Ю., Соловьёва А.В. Молекулярная диагностика болезни Паркинсона // 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных: сборник тезисов. – Пущино. – 2007. – С.78-79.

11. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Taraskina A.E., Emelianov A.K., Ivanova O.N., Smirnova E.Yu., Solovieva A.V., Schwarzman A.L. Expression of Alpha-Synuclein in Patients with Parkinson’s Disease Caused by Mutations in the LRRK2 Gene // J Eur College Neuropsyhopharmacology. – 2007. – Vol. 17. – № 4. – P. S536-537 (Abstract).

12. Emelianov A.K., Taraskina A.E., Ivanova O.N., Smirnova E.Y., Solovieva A.V., Yakimovskii A.F., Pchelina S.N. LRRK2 Mutations and Alpha-Synuclein Level in Patients with Familial Parkinson’s Disease // European Human Genetics Conference, France, June 16–9. – 2007. – Vol. 1. – № 15. – P. 219 (Abstract).

13. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Taraskina A.E., Emelianov A.K., Ivanova O.N., Smirnova E.Yu., Solovieva A.V., Schwarzman A.L. Expression of Alpha-Synuclein in Patients with Parkinson’s Disease Caused by Mutations in the LRRK2 Gene // J Eur College Neuropsyhopharmacology. – 2007. – Vol. 17. – № 4. – P. S536-537 (Abstract).

14. Емельянов А.К., Соловьева А.В., Смирнова Е.Ю. Уровень экспрессии гена SNCA у больных с семейной формой болезни Паркинсона // Человек и здоровье–2007: cборник тезисов. – Санкт-Петербург. – 2007. – С. 64-65.

15. Emelyanov A.K., Yakimovsky A.F, Shabalina I.G., Schwarzman A.L., Pchelina S.N. Alpha-Synuclein Blood Levels in Parkinson’s Disease Caused by the G2019S Mutation // Eur J Neurol. – 2008. – Vol. 15. – № 3. – P. (Abstract).

16. Емельянов А.К., Якимовский А.Ф., Шабалина И.Г., Пчелина С.Н.

Исследование уровня альфа-синуклеина и лимфоцитов периферической крови у больных с болезнью Паркинсона, обусловленной мутациями в гене LRRK2 // I национальный конгресс по болезни Паркинсона и расстройствам движений: сборник тезисов. – Москва. – 2008. – C. 358.

17. Pchelina S.N., Emelyanov A.K., Ivanova O.N., Yakimovskii A.F., Schwarzman A.L. Molecular Markers of Parkinson’s Disease: LRRK Mutations and Alpha-Synuclein Level // 2nd World Congress on Controversies in Neurology, Greece, October 23–26. – 2008. – P. A-91 (Abstract).

18. Емельянов А.К., Якимовский А.Ф., Дроздова А.С., Шварцман А.Л., Пчелина С.Н. Пониженный уровень альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона, обусловленной мутациями в гене LRRK2 // V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров: сборник тезисов. – Москва. – 2009. – С. 420.

19. Emelyanov A.K., Yakimovskii A.F., Drosdova A.S., Schwarzman A.L., Pchelina S.N. Decreased Alpha-Synuclein Lymphocytes Level in Patients with LRRK2-Associated Parkinson’s Disease // 9th International Conference Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases: Advances, Concepts and New Challenges. Neurodegenerative Diseases. – 2009. – Vol. 6. – № 1. – P. (Abstract).

20. Пчелина С.Н., Емельянов А.К., Усенко Т.С., Боганькова Н.А., Вавилова Т.В., Якимовский А.Ф., Шварцман А.Л. Экспрессия синуклеина и уровень апоптоза в лимфоцитах периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной болезнью Паркинсона // Журнал медицинской генетики. VI съезд Российского общества медицинских генетиков: сборник тезисов. – Ростов-на-Дону. – 2010. – С. 150.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БП – болезнь Паркинсона сБП – спорадическая форма БП ЧС – черная субстанция Л-ДОФА – L-диоксифенилаланин ПЦР – полимеразная цепная реакция ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК – комплиментарная дезоксирибонуклеиновая кислота мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота LRRK2 – ген обогащённой лейциновыми повторами киназы SNCA – ген альфа-синуклеина о.е. – относительные единицы