Выживание и гибель кардиомиоцитов при генетически обусловленной миодистрофии мышей mdx
На правах рукописи
Веженкова Ирина Владимировна ВЫЖИВАНИЕ И ГИБЕЛЬ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННОЙ МИОДИСТРОФИИ МЫШЕЙ MDX 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2008
Работа выполнена в Институте цитологии РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Михайлов Вячеслав Михайлович Институт цитологии РАН
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович Институт цитологии РАН доктор медицинских наук Гудкова Александра Яковлевна Институт сердечно-сосудистых заболеваний Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад.
И.П.Павлова
Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета
Защита состоится 21 марта 2008 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4. Электронная почта: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.
Автореферат разослан _ февраля 2008г.
Ученый секретарь кандидат биологических наук Диссертационного совета Е.В. Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Изучение механизмов дифференцировки клеток и регенерации тканей, в частности механизмов миогенеза и регенерации мышц – одна из важнейших проблем клеточной биологии и биологии развития (Румянцев, 1982). Многоклеточные организмы сформированы из множества специализированных клеточных популяций. По наличию клеточного обновления популяции были разделены на обновляющиеся, растущие и статические. К последним были отнесены нейроны и кардиомиоциты млекопитающих (Leblond, 1964). Эта классификация подвергается уточнениям. У грызунов возможна реактивация синтеза ДНК в кардиомиоцитах желудочков сердца в пределах 0.1-0.5 % через 3-30 сут после инфаркта миокарда (Румянцев, 1982). У людей описаны митозы кардиомиоцитов в околоинфарктной зоне (Beltrami et al., 2003).
Кардиомиоциты взрослых млекопитающих – это высокодифференцированные, высокоорганизованные клетки, специализированные для выполнения функции сокращения.
Ограниченная способность сердечных миоцитов (особенно желудочковых) к пролиферации в постнатальном кардиомиогенезе позволяет многим авторам определять кардиомиоциты млекопитающих как популяцию некамбиального типа. В то же время кардиомиоциты способны к довольно быстрой и эффективной реорганизации своей внутренней структуры при изменении условий существования (например, при гиперфункции органа или снижении притока пластических веществ) за счет усиления или снижения процессов внутриклеточной регенерации (Саркисов, 1977).
Способность кардиомиоцитов млекопитающих к такого рода изменениям их составляющих делает эти клетки удобной моделью для изучения характера адаптивно компенсаторных реакций в клетках, способных к реактивации митотического цикла в очень ограниченной степени. Это не позволяет отнести ни одну из разновидностей кардиомиоцитов (желудочковые, предсердные, проводящей системы), даже у взрослых млекопитающих, к чисто статической (необратимо постмитотической) популяции клеток (Румянцев, 1982). Это обстоятельство так же, как и способность кардиомиоцитов некоторых видов млекопитающих (грызуны, приматы, человек) к полиплоидизации, определяет особенности регенерации сердечных миоцитов.
В настоящее время накапливаются данные об участии стволовых клеток в регенерации миокарда (Dawn et al., 2005;
Kajstura et al., 2005;
Torella et al., 2007). Точная оценка вклада так называемых стволовых клеток или клеток-предшественников кардиомиоцитов в поддержание и обновление клеточного состава миокарда требует дополнительных исследований (Flugelman, Lewis, 2004;
Liao et al., 2007). Однако независимо от результатов решения вопроса об отнесении кардиомиоцитов к популяции обновляющегося типа не вызывает сомнения, что основную массу клеток миокарда представляют терминально дифференцированные кардиомиоциты «с достаточно жесткой репрессией синтеза ДНК и митозов» (Румянцев, 1982).
Так как обновление и тем более скорость обновления кардиомиоцитов пока остаются неизвестными, будем придерживаться мнения, что терминально-дифференцированные кардиомиоциты млекопитающих функционируют в миокарде неопределенно продолжительное время. Следовательно, встает вопрос о выживаемости этих клеток. Одним из подходов к анализу выживаемости кардиомиоцитов может быть использование животных с генетическим дефектом – мышей mdx. Отсутствие в сократительных клетках мутантных мышей mdx синтеза белка дистрофина сопровождается развитием в них окислительного стресса, вызывающего гибель клеток.
Таким образом, сократительные клетки мышей mdx являются моделью выживания клеточных популяций в условиях окислительного стресса. Исходя из этого, изучение цитохимических особенностей кардиомиоцитов при генетически обусловленной кардиомиодистрофии на модели мышей mdx приобретает несомненную актуальность.
Цель и задачи исследования Цель работы заключалась в выяснении цитологических механизмов выживания и гибели кардиомиоцитов при генетически обусловленной миодистрофии мышей mdx методами авторадиографии, иммуноморфологии и морфометрии после динамического стресса.
Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. Изучение включения Н-тимидина в кардиомиоциты мышей mdx и С57Bl до и после стресса.
2. Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57Bl до и после динамического стресса.
3. Анализ динамики экспрессии гена р53 до и после динамического стресса.
4. Морфометрический подсчет изменений концентраций кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx и С57Bl до и после стресса с целью вычисления клеточной потери кардиомиоцитов мышей mdx и С57Bl, вызываемой динамическим стрессом.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Кардиомиоциты мышей С57В1 характеризуются низким уровнем частоты обнаружения двунитевых разрывов ДНК (ДрДНК). Динамический стресс в сочетании с охлаждением организма усиливает образование ДрДНК. Через 1 сут после стресса частота обнаружения ДрДНК в нормальных кардиомиоцитах уменьшается до контрольного уровня.
2. Частота обнаружения ДрДНК в кардиомиоцитах мышей mdx при обычных условиях содержания животных превосходит таковую в кардиомиоцитах мышей. Динамический стресс усиливает образование ДрДНК. Через сутки после стресса частота обнаружения ДрДНК в кардиомиоцитах мышей mdx уменьшается до исходного уровня.
3. После динамического стресса кардиомиоциты мышей mdx включают 3Н-тимидин в ядра.
4. Динамический стресс усиливает экспрессию белка р53 в кардиомиоцитах мышей С57Bl и mdx. Динамика экспрессии белка р53 мышей mdx коррелирует с динамикой появления ДрДНК.
5. Концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx ниже, чем в миокарде мышей C57Bl, а суточная потеря кардиомиоцитов у мышей mdx после динамического стресса превышает таковую у мышей C57Bl.
6. Репарация ДрДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx после динамического стресса.
Научная новизна работы Впервые исследована частота обнаружения ДрДНК у кардиомиоцитов мышей C57В1 и mdx в условиях динамического стресса в сочетании с охлаждением организма. Впервые произведен подсчет частоты включения 3Н-тимидина у кардиомиоцитов мышей C57В1 и mdx в условиях динамического стресса в сочетании с охлаждением организма. Впервые изучена экспрессия белка р53 в кардиомиоцитах мышей C57В1 и mdx в отсутствие динамического стресса, через час и через 24 ч после стресса. Впервые определено, что динамика экспрессии белка р53 в кардиомиоцитах мышей mdx коррелирует с динамикой появления ДрДНК. Впервые с использованием усовершенствованного метода морфометрии подсчитана концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей C57Bl и mdx. Впервые произведен учет суточного снижения концентрации кардиомиоцитов у мышей C57Bl и mdx после динамического стресса.
Теоретическое и практическое значение работы Представление о «достаточно жесткой репрессии синтеза ДНК и митозов» основной массы терминально дифференцированных кардиомиоцитов миокарда млекопитающих сделало одной из основных задач теоретической и практической биологии кардиомиоцитов изучение их выживания и гибели при неблагоприятных ситуациях, возникающих в миокарде в случае патологии. В нашем случае неблагоприятными ситуациями были состояние окислительного стресса мутантных кардиомиоцитов мышей mdx и плавание при низкой температуре, усиливающие состояние окислительного стресса. Сопоставление динамики ДрДНК и уровня клеточной потери позволило заключить, что репарация ДрДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx после динамического стресса. Кроме того, положительная корреляция динамики ДрДНК и экспрессии гена р53 указывает на участие активности гена р53 в регуляции гибели и выживания кардиомиоцитов. Этот результат свидетельствует о том, что по механизму регуляции выживания и гибели кардиомиоциты млекопитающих соответствуют клеткам обновляющихся клеточных популяций. В совокупности представленные результаты показывают, что миокард мышей mdx является экспериментальной моделью кардиомиопатии. Полученные результаты и методы могут быть с успехом использованы для изучения кардиомиоцитов человека при различных формах сердечной патологии.
Материалы диссертации также могут быть включены в курсы лекций по клеточной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений.
Апробация работы В ходе выполнения работы ее результаты регулярно обсуждались на совместных семинарах Группы генетики клеточных популяций и Лаборатории патологии клетки Института цитологии РАН. Материалы работы представлены на следующих научных собраниях: Съезд Общества клеточной биологии, (Санкт-Петербург, октябрь 2003);
Международный симпозиум “Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия” (Санкт Петербург, октябрь 2004);
ХV Всероссийское совещание “Структура и функции клеточного ядра” (Санкт-Петербург, октябрь 2005);
Международная конференция “Acute Cardiac Care” Европейского Общества Кардиологов, (Prague, Czech Republic, October 2006);
Политехнический симпозиум, конференция "Молекулярная и структурная биология", (Санкт-Петербург, декабрь 2006);
2-й съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт Петербург, октябрь 2007);
Всероссийский национальный конгресс кардиологов (Москва, октябрь 2007) Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 5 статей в отечественных и зарубежных профильных журналах, а также тезисы 8 докладов на всероссийских и международных конференциях и съездах.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, использованных в работе, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 142 ссылки. Материалы диссертации изложены на 120 страницах текста и иллюстрированы 22 рисунками и 11 таблицами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Объектами исследования был миокард левых желудочков сердец двух групп мышей – C57Bl и mdx массой 20±0.5г. Мыши C57Bl были получены из питомника "Рапполово".
Мыши mdx были представлены д-ром Т. Партриджем (Hammersmith Hospital, London) и получены для содержания от чл.-корр. РАМН, проф. В.С. Баранова (НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН, Санкт-Петербург).
Две подгруппы мышей (C57Bl st(+) и mdx st(+)) подвергали умеренному динамическому стрессу – плаванию в течение 5 мин в воде при температуре 12 °С. Такая нагрузка не вызывала гибели животных. Другие 2 подгруппы мышей (C57Bl st(-) и mdx st(-)) не плавали и служили контролем.
Сердца для анализа брали у мышей под диэтиловым эфирным наркозом через час и через сутки после введения 3Н-тимидина. Срезы толщиной 7 мкм получали на криостате Bright Сo LTD (Великобритания), фиксировали двумя способами: часть срезов - смесью этанола и метанола 1:1 в течение 3 мин при –20 0С, часть - в 10%-ном растворе формалина. Для авторадиографического исследования кусочки миокарда заливали в твердый парафин при 70 0С (Sigma, США) и готовили срезы толщиной 5 мкм.
Метод авторадиографии (Жинкин, 1959) В работе была использована жидкая фотоэмульсия типа М или Р производства НИИХИМФОТОПРОЕКТ, Москва. Современные фотоэмульсии содержат все необходимые для нанесения инградиенты (дубитель и пластификатор). Для приведения в рабочее состояние эмульсии необходимо только развести дистиллированной водой в соответствующее число раз. Депарафинированные срезы помещали в дистиллированную воду на 1-2 мин. Дальнейшая работа велась в темной комнате при желто-зеленом свете фонаря. Стекло со срезом опускали на несколько секунд в стаканчик с эмульсией, стоящий на водяной бане. Затем стекла просушивали 2-3 ч, складывали в светонепроницаемые коробки и убирали в холодильник. Стекла экспонировали в течение месяца или более.
Проявление вели в проявителе Д-19 при температуре 19-20 С в течение 6 мин. Затем переносили стекла в фиксатор: 40%-ный раствор гипосульфита при температуре +12 С.
Срезы держали 6 мин до полного просветления эмульсии, а затем переносили в воду.
Проводили обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации и в двух порциях ксилола. В последней порции оставляли на ночь. Заключали в бальзам. Докрашивали препараты гематоксилином Майера или красителем Гимза.
Метод (ПАП). (Полак, 1987) В работе использован кроличий растворимый комплекс пероксидаза-антипероксидаза (ПАП). Депарафинированные срезы помещали в дистиллированную воду на 1-2 мин.
Споласкивали срезы в растворе PBS (фосфатно-солевой буфер), pH – 7.3. Инкубировали срезы в 0.1%-ном растворе трипсина в PBS в течение 10 мин. Споласкивали срезы в растворе PBS, pH – 7.3. Инкубировали срезы в 1%-ном растворе яичного альбумина в PBS в течение 20 мин. Споласкивали срезы в растворе PBS, pH – 7.3. При использовании непрямого иммуноморфологического метода использовали кроличьи моноклональные антитела к синтетическому карбокситерминальному пептиду CKATQAS(PO4)QEY гистона -Н2АХ (Stressgene, США) и моноклональные антитела к -саркомерному актину в разведении 1: (Sigma, clone 5C5, США). Оставляли на ночь при температуре +10 С. Отмывали срезы в трех сменах PBS по 2 мин. Наносили раствор вторых антител (АТ к Ig G мыши) на один час при комнатной температуре. Отмывали срезы в PBS в течение 30 мин. Наносили ПАП комплекс и оставляли срезы на ночь. Отмывали срезы в PBS в течение 15 мин. Окраску срезов проводили в следующем растворе: 10 мг диаминобензидина растворяли в 10 мл PBS и смешивали с 0.5 мл 0.13%-ного раствора перекиси водорода в PBS. Окраска проводилась до покоричневения. Развитие окраски отслеживали при помощи светового микроскопа. Затем срезы промывали в проточной и дистиллированной воде по 2 мин. Проводили обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации и в двух порциях ксилола. В последней порции оставляли на ночь. Заключали в бальзам.
Для выявления экспрессии гена р53 при помощи определения его продукта – белка р были использованы поликлональные антитела к р53 (Novocastra Lab. Ltd, UK) и кроличий ПАП (Sigma-Aldrich, USA).
Метод морфометрии Каждое сердце было визуально разделено на 3 зоны – верхушку, середину и основание. В пределах каждой зоны было сделано по 15 срезов. Таким образом, для оценки концентрации кардиомиоцитов каждого сердца предварительные подсчеты были выполнены на 45 срезах.
Подсчет клеток осуществляли во всех полях зрения среза, используя объектив 60х.
Для того чтобы посчитать максимально точно площадь каждого среза, была изготовлена печатная плата с нанесенным на нее квадратом с точно заданной площадью – 1 мм2 (ООО «Резонит» Санкт-Петербург). После этого каждый срез был сфотографирован на одном уровне с печатной платой и, с помощью программы ImageJ, подсчитана площадь среза и выражена в пикселях в единице площади среза.
Подсчитав таким образом пиксели на фотографии платы с 1 мм2 и среза, через обычную пропорцию получили площадь среза. Подобным способом обрабатывали фотографию каждого среза с печатной платой. Для вычисления объема среза площадь каждого среза умножали на 7 мкм. Через отношение количества клеток в каждом срезе к объему каждого среза получили концентрацию, т.е. количество кардиомиоцитов и немышечных клеток в 1 мм3 для каждой зоны сердца каждой подгруппы мышей. Для вычисления клеточной потери концентрацию клеток через 1 ч после динамического стресса принимали за 100%. Зная концентрацию клеток через ч после стресса, вычисляли при помощи пропорции ее процентный эквивалент.
Разница между концентрациями клеток через 1 ч и 24 ч после динамического стресса, выраженная в процентах и есть клеточная потеря через 24 ч после динамического стресса.
Для измерения площадей исследуемых срезов и для статистического анализа были использованы программы ImageJ и Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ранее было установлено, что гибель кардиомиоцитов мышей mdx, в противоположность миокарду больных миодистрофией Дюшенна, стандартными методами световой микроскопии не выявляется. Но означает ли это, что ее вообще нет? В попытках разобраться в этом вопросе была проведена целая серия работ (Михайлов и др., 1998, 2001), в результате которых была установлены некоторые особенности миокарда мышей mdx при обычном содержании животных и после динамического стресса. Было выявлено, что очаговая гибель кардиомиоцитов мышей mdx начинает регистрироваться через сутки после динамического стресса - 5-минутного плавания. Между тем, у мышей mdx, содержащихся при обычных условиях, в миокарде имеются проявления развивающегося апоптоза.
Признаками апоптоза являются постоянное присутствие в экстракте ДНК миокарда фрагмента размером 65 т.п.н. и сниженная удельная плотность митохондрий кардиомиоцитов по сравнению с удельной плотностью митохондрий кардиомиоцитов мышей C57Bl, “дикого” аналога мышей mdx.
Мерой развития апоптоза также является степень инвагинированности ядерной мембраны. Оказалось, что по этому признаку 30% ядер кардиомиоцитов мышей mdx могут быть классифицированы как патологические. Для включения финальной или деструктивной стадии апоптоза необходимо усиление состояния окислительного стресса что и достигается динамическим стрессом. Через 1 ч после стресса начинает определяться низкомолекулярный распад ДНК (Казаков, Михайлов, 2001). Через 1 сут после стресса доля патологических ядер уменьшается в 2 раза, до 15%. Таким образом, значительная часть кардиомиоцитов мышей mdx постоянно находятся на начальной стадии апоптоза, избегая, однако, вступления во вторую, деструктивную, стадию апоптоза.
Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx Было выдвинуто предположение, что в выживании кардиомиоцитов мышей mdx участвует механизм репарации ДНК.
Для выявления ДрДНК в настоящей работе использовали антитела к фосфорилированной форме гистона Н2АХ (гистон -Н2АХ, основываясь на том, что при возникновении ДР ДНК запускается фосфорилирование С-концевого отдела гистона Н2АХ по Ser139 (Rogakou et al., 1998;
Vilenchik et al., 1998). Функция -Н2АХ гистона состоит в фиксации свободных концов ДР ДНК (Томилин, 2002, 2005).
По результатам данного эксперимента было обнаружено, что в миокарде левого желудочка у мышей C57Bl/6 доля ядер с положительной окраской на гистон -Н2АХ в отсутствие стресса очень незначительна (рис.1) и составляет 0.05 ± 0.1 % (табл. 1). После динамического стресса доля ядер с положительной окраской на гистон -Н2АХ увеличивается примерно в 20 раз, достигая величины 1.0 ± 0.02 % (табл. 1), что указывает на возникновение ДР в ДНК в миокарде мышей C57Bl. Согласно данным из литературы, ишемия сердца повреждает ДНК с образованием ДР, что, в свою очередь, индуцирует фосфорилирование гистона Н2АХ и увеличение уровня экспрессии белков р53/р21 ( Corbucci et al., 2004).
У мышей mdx динамический стресс вызывает 7-кратное увеличения доли ядер кардиомиоцитов, имеющих ДР в ДНК, а именно до 41.7±11.4 %, (табл.1 рис.3,4). Большая часть меченых ядер относится к кардиомиоцитам.
Рис. 1 Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей C57Bl при помощи кроличьих моноклональных антител к синтетическому карбокситерминальному пептиду CKATQAS(PO4)QEY фосфорилированной формы гистона H2AX (Stressgene, США) и моноклональных антител к - саркомерному актину (Sigma, clone 5C5, США) в отсутствие динамического стресса.
Табл.1. Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57Bl при помощи кроличьих моноклональных антител к синтетическому карбокситерминальному пептиду CKATQAS(PO4)QEY фосфорилированной формы гистона H2AX (Stressgene, США) и моноклональных антител к - саркомерному актину (Sigma, clone 5C5,США) через 1 ч и ч после стресса.
Группы Доли меченых ядер клеток миокарда через 1 и 24 ч живот- после динамического стресса, %, X±sx ных 1ч 24 ч кардиомио- немышечные кардиомио- немышечные циты клетки циты клетки, С57Bl 0.00±0.5 0.00±0.5 0.00±0. 0.05±0. st(-) С57Bl 0.00±0.5 0.00±0.5 0.00±0. 1.01±0. st(+) mdx 1.56±0. 6.75±0.2 2.05±0.1 5.75±0. st(-) mdx 1.77±0. 41.76±11.4 9.01±0.4 5.21±0. st(+) Рис. 2. Регистрация двунитевых разрывов Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57Bl при помощи антител к гистону -H2AX через 1 ч и 24 ч после стресса.
ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57Bl при помощи кроличьих моноклональных антител к синтетическому Без стресса Через 1 ч. после стресса карбокситерминальному пептиду 30 Через 24 часа после стресса CKATQAS(PO4)QEY фосфорилированной формы гистона H2AX (Stressgene, США) и C57Bl mdx моноклональных антител к - саркомерному актину (Sigma, clone 5C5,США) через 1 ч и 24 ч после стресса.
Рис.3. Рис.4.
Рис. 3,4. Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx при помощи кроличьих моноклональных антител к синтетическому карбокситерминальному пептиду CKATQAS(PO4)QEY фосфорилированной формы гистона H2AX (Stressgene, США) и моноклональных антител к - саркомерному актину (Sigma, clone 5C5,США) через 1 ч после стресса.
Появление ДР в ДНК в миокарде как мышей С57Bl, так и мышей mdx через 1 ч после стресса коррелирует с появлением в миокарде низкомолекулярных фрагментов ДНК. Через 24 ч после стресса распад ДНК в миокарде мышей С57Bl уже не обнаруживается, тогда как в миокарде мышей mdx продолжают присутствовать низкомолекулярные фрагменты ДНК (Михайлов и др. 1998;
Казаков, Михайлов, 2001).
Высокая доля ядер кардиомиоцитов с ДР в ДНК (41.7±11.4%) у мышей mdx после динамического стресса соответствует уровню образования ДрДНК в кардиомиоцитах мышей C57Bl после рентгеновского облучения в дозе 3-5 Гр. (Гаврилов, Веженкова и др., 2005).
Через 24 ч после динамического стресса у мышей mdx доля ядер кардиомиоцитов с ДР в ДНК уменьшилась до 5.2 ± 0.4 %, что не противоречит электрофоретическим данным о присутствии в миокарде низкомолекулярных фрагментов ДНК (Казаков, Михайлов, 2001), (табл.1, рис.2).
Такая динамика поведения ДР в ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx после динамического стресса не совпадает с поведением ДР в ДНК кардиомиоцитов мышей C57BL, когда через 24 ч после рентгеновского облучения 20 % ядер клеток миокарда мышей C57Bl сохраняют ДР в ДНК. (Гаврилов, Веженкова и др., 2005). Основная часть меченых клеток была кардиомиоцитами. Как и в случае миокарда мышей C57Bl после рентгеновского облучения, исчезновение меченных антителами к фосфорилированной форме гистона Н2АХ ядер кардиомиоцитов у мышей mdx через 24 ч после динамического стресса может быть объяснено как репарацией ДНК, так и гибелью клеток с мечеными ядрами. Считается, что ДР в ДНК репарируются в клетках двумя способами - гомологичной рекомбинацией и негомологичным соединением концов. При этом допускается, что в постмитотических клетках позвоночных используется главным образом второй способ (Томилин, 1982, 2002;
2005;
Takata et al., 1998).
Включение 3Н-тимидина в ядра клеток миокарда мышей Для характеристики свойств мутантных кардиомиоцитов мышей mdx представляет интерес изучение возможности реактивации синтеза ДНК после динамического стресса.
Данные первой серии экспериментов с использованием 3Н-тимидина показали, что при введении предшественника и регистрации через 1 ч после стресса имеет место включение предшественника в ядра кардиомиоцитов. Доля меченых ядер кардиомиоцитов у мышей mdx после динамического стресса составила 2.0±0.6 %. При введении предшественника через ч и 24 ч после динамического стресса и учете результатов через 1 ч после введения Н-тимидина мечеными были 0.3±0.05 % кардиомиоцитов мышей mdx. Эти данные показывают, что включение предшественника в ядра кардиомиоцитов мышей mdx происходит в ближайшее время после стресса (Mikhailov et al., 1999). Попытка обнаружить накопление митозов (при помощи колхицина) через 24 ч после стресса была неудачной (Михайлов и др. 2003). Данные из литературы показывают, что активация синтеза ДНК у кардиомиоцитов нормальных животных происходит не раньше, чем через 1-3 сут после развития инфаркта миокарда (Румянцев, 1982). Таким образом, наиболее вероятно, что обнаруженное нами включение 3Н-тимидина в ядра кардиомиоцитов мышей mdx при введении предшественника в ближайшее время после стресса отражает проявление репаративного синтеза ДНК. Включение 3Н-тимидина в ядра кардиомиоцитов не связано с их вступлением в митотический цикл.
В рамках данной работы, для того чтобы выявить дальнейшую судьбу ДНК синтезирующих кардиомиоцитов через 24 ч после стресса, была поставлена серия экспериментов с введением 3Н-тимидина через 1 ч и регистрацией включения через 1 и часа после стресса. Полученные результаты представлены в табл. 2.
Как видно из полученных данных, не удалось зарегистрировать усиления включения 3Н тимидина в кардиомиоциты мышей C57Bl через 1 ч после стресса. Исходный уровень включения Н-тимидина у мышей mdx не отличался от уровня включения у кардиомиоцитов мышей C57Bl. У мышей mdx через 1 ч после динамического стресса около 3% ядер кардиомиоцитов включают 3Н-тимидин, (табл.2, рис.5) Этот результат повторяет данные первой серии экспериментов (Mikhailov et al., 1999).
Через 1 сут после стресса и введения 3Н-тимидина было обнаружено почти десятикратное уменьшение доли меченных Н-тимидином кардиомиоцитов у мышей mdx (табл.2).
Исчезновение меченных Н-тимидином кардиомиоцитов может быть объяснено только гибелью клеток. Таким образом, суточная потеря кардиомиоцитов, оцениваемая по исчезновению из миокарда тимидиновой метки, составила 2.5 %.
Рис.5. Включение 3Н-тимидина в ядрах клеток миокарда мышей mdx st(+), через 1 ч после введения 3Н-тимидина.
Табл.2. Включение 3Н-тимидина в ядрах клеток миокарда мышей С57Bl st(+), С57Bl st(-) и mdx st(+), mdx st(-) через 1 ч и через 24 ч после введения 3Н-тимидина.
Группы Время после введения тимидина Живот- 1ч 24 ч ных доля меченых доля меченых доля меченых доля меченых кардио- немышечных кардио- немышечных миоцитов, % клеток, % миоцитов, % клеток, % c57bl st(-) 0.23±0.3 0.21±0.6 0.25±0.8 0.23±0. c57bl st(+) 0.35±0.2 0.31±0.5 0.29±0.4 0.37±0. mdx st(-) 0.31±0.3 0.38±0.3 0.31±0.4 0.36±0. mdx st(+) 2.90±0.5 2.22±0.7 0.41±0.2 0.79±0. Этот результат не соответствует нашим ранее полученным электронно-микроскопическим данным о том, что у мышей mdx через 1 сут после стресса доля кардиомиоцитов с апоптотической морфологией ядер в миокарде уменьшается в 2 раза, с 30 до 15 %.
Несоответствие данных анализа срезов миокарда на светооптическом уровне данным анализа ультраструктуры ядер апоптотических кардиомиоцитов можно объяснить малой выборкой изученных электронограмм кардиомиоцитов (331 изображение - Михайлов и др., 2001) по сравнению с многотысячной выборкой клеток на светооптическом уровне. Кроме того, возможно также и улучшение морфологии ядер кардиомиоцитов из-за репарации ДНК.
Наиболее вероятно, что исчезновение в течение 1 сут из миокарда кардиомиоцитов, меченных 3Н-тимидином, соответствует уровню клеточной потери после динамического стресса у мышей mdx. Учитывая величину клеточной потери, можно заключить, что уменьшение доли кардиомиоцитов с ДР в ДНК, с 41.7±11.4 до 5.2±0.4 % происходит не только за счет гибели кардиомиоцитов, но и за счет репарации их ДНК и последующего выведения гистона -Н2АХ из состава хроматина. Даже если принять уровень суточной потери кардиомиоцитов за 15 %, то и в этом случае придется согласиться с тем, что суточное уменьшение доли ядер с ДР в ДНК происходит, в том числе, и за счет репарации ДНК.
Считается, что при репарации ДНК гистон -Н2АХ исчезает из ядер клеток под действием белков, участвующих в перестройках хроматина (Kusch et al., 2004 Kruhlak et al., 2006).
Обращает на себя внимание неизменность доли меченных Н-тимидином немышечных клеток мышей mdx через сут после стресса. Это свидетельствует или о более высокой резистентности немышечных клеток к динамическому стрессу, или о том, что немышечные клетки вступают в клеточный цикл. Кроме того, существует возможность инфильтрации миокарда мышей mdx меченными 3Н-тимидином клетками из крови.
Встает вопрос о том, что если включение 3Н-тимидина является репаративным, то почему наблюдается такая большая разница между частотой клеток, включивших 3Н тимидин (2.9 %), и частотой клеток, меченных иммунной антисывороткой к гистону -Н2АХ (42 %). Наиболее вероятно, что в основе такого расхождения лежит различная чувствительность методов регистрации ДР в ДНК при помощи антител к гистону -Н2АХ и авторадиографического способа регистрации включения 3Н-тимидина при репарации ДНК.
Роль p53 в процессе репарации кардиомиоцитов мышей mdx В качестве еще одной попытки подтвердить или опровергнуть участие репарации ДНК в выживании кардиомиоцитов была проведена серия опытов по регистрации экспрессии гена р53 после динамического стресса при помощи антител к белку p53.
Наиболее разносторонняя форма репарации ДНК, NER (нуклеотид-эксцизионная репарация), оперирует с поврежденными основаниями и нарушенным спариванием оснований, вызываемым УФ лучами или оксидативными повреждениями, которые ведут к изменениям в структуре дуплексной ДНК. NER распознает широкий круг разнообразных повреждений ДНК, включая индуцированные УФ лучами циклобутан-пиримидиновые димеры (CPDs) и пиримидин-пиримидоновые продукты, фотопродукты.
Влияет ли p53 на NER in vivo? Потеря p53 в клетках человека вызывает снижение репарации индуцированных УФЛ повреждений ДНК. Интактные клетки, которые гетерозиготны по мутации p53 обнаруживают нормальную репарацию фотопродуктов, но пониженную инициальную скорость удаления CPD по сравнению с нормальными клетками.
Следовательно, возможно, что p53 затрагивает NER in vivo, оказывая влияние на функцию (или функции) белков, которые вовлечены в этот процесс (Sengupta, Harris, 2005).
Результаты проведенных нами экспериментов показали, что доля р53-положительных кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx значительно выше, чем в миокарде мышей C57Bl, (рис.6). Более высокий уровень экспрессии гена р53 объясняется тем, что миокарде мышей mdx постоянно регистрируется фрагментация ДНК. В течение 1 ч после стресса доля меченых антителами к белку р53 ядер кардиомиоцитов у мышей mdx вырастает с 22% (контроль) до 63%. А доля меченых ядер кардиомиоцитов мышей C57Bl вырастает c 3% (контроль) до 11%.
Через 24 ч после динамического стресса в миокарде мышей mdx оставались окрашенными 13% ядер кардиомиоцитов, а в миокарде мышей C57Bl - 5% ядер (рис.6).
Рис 6. Регистрация экспрессии белка р53 в Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57Bl при помощи антител к ф осф орилированной ф орме белка р53 через 1 ч и 24 ч после стресса.
кардиомиоцитах мышей mdx и С57Bl при помощи антител к фосфорилированной форме белка р53 через 1 ч и 24 ч после Без стресса стресса.
Через 1 ч после стресса 30 Через 24 ч после стресса C57Bl mdx Динамика экспрессии гена р53 коррелирует с динамикой появления и исчезновения двунитевых разрывов ДНК в реакции с антителами к гистону Н2Ах.
Таким образом, динамический стресс вызывает образование ДР в ДНК в кардиомиоцитах и немышечных клетках миокарда как у мышей C57Bl, так и у мышей mdx. Образование ДР в ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx после динамического стресса происходит в несколько раз интенсивнее, чем в кардиомиоцитах мышей C57Bl. Как в случае миокарда мышей C57Bl, так и особенно в случае мышей mdx ДНК кардиомиоцитов повреждается сильнее, чем ДНК немышечных клеток. Не вызывает сомнения, что ДрДНК являются причиной гибели кардиомиоцитов мышей mdx.
Сам факт изменения количества определяемых двунитевых разрывов ДНК не позволяет судить о реальном вкладе репарации ДНК в выживание кардиомиоцитов. Отсутствие морфологических данных о гибели или выживании клеток миокарда и, особенно кардиомиоцитов, после динамического стресса не позволяет точно судить о связи выживания кардиомиоцитов и репарации ДНК. Имеющиеся данные об уменьшении в популяции доли кардиомиоцитов с апоптотическими ядрами через 1 сут после динамического стресса не дают ответа на поставленный вопрос как из-за незначительного размера изученной популяции, так и из-за возможности объяснить исчезновение апоптотических ядер репарацией ДНК. После динамического стресса мы не наблюдали гибели мышей mdx (Михайлов и др., 2001). Данные об исчезновении из миокарда меченных Н-тимидином клеток также не дают ответа на поставленный вопрос из-за отсутствия объяснения возникновения меченных 3Н-тимидином клеток миокарда 2-3% после однократного введения предшественника (Веженкова, Михайлов, 2005;
Михайлов, Веженкова, 2007).
В связи с этим завершающим этапом данной работы являлся морфометрический подсчет изменений концентраций кардиомиоцитов мышей mdx и C57Bl до и после стресса с целью вычисления потери кардиомиоцитов мышей mdx и C57Bl, вызываемой динамическим стрессом.
Для оценки количества кардиомиоцитов в миокарде и сердце используют различные методы, такие, как морфометрия (Hort, 1953;
Black-Schaffer, Turner, 1958;
Ерохина, 1968б;
Anversa, 1980), биохимическое определение количества ДНК в миокарде и последующий пересчет данных на число ядер, исходя из диплоидного эквивалента – 6х10-12 г ДНК (Petersen, Baserga, 1965;
Adler, 1972), и подсчет числа клеток, высвобождаемых из миокарда с помощью протеолитических ферментов (De Haan et al., 1971) или 50%-ной КОН (Белов и др., 1977).
Нами был выбран морфометрический анализ, так как он более других методов подходит для поставленной нами цели определения концентрации клеток. Кроме того, например, при обработке миокарда концентрированной щелочью возможно резкое занижение оценки количества мышечных ядер из-за разрушения значительной части кардиомиоцитов.
В ряде работ не уделено должного внимания разграничению мышечных и немышечных клеток: данные расчетов, по-видимому, относятся к их совокупности (Enesco, Leblond, 1962;
De Haan et al., 1971). В данной работе было проведено разграничение между кардиомиоцитами и немышечными клетками при помощи моноклональных антител к саркомерному актину.
Результаты морфометрического анализа представлены на рис 7-12.
mdx st c57Bl st Верхушка Верх ушка 50000 Середина 50000 Середина 40000 Основание Основание 30000 20000 10000 Конц. всего Конц. Кмц Конц. Нмк Конц. всего Конц. Кмц Конц. Нмк Рис. 7. Концентрация кардиомиоцитов (КМЦ) и Рис. 8. Концентрация кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток (НМК) в различных зонах немышечных клеток в различных зонах сердца мышей c57Bl st- через 1 ч, сердца мышей mdx st-, через 1 ч после стресса, кл/мм3, X±sx..
после стресса, кл/мм, X±sx.
c57Bl st+ 1h mdxst+ 1h 100000 90000 80000 70000 60000 Верхушка Верхушка 50000 Середина 50000 Середина 40000 Основание 40000 Основание 30000 20000 10000 0 Конц. всего Конц. Кмц Конц. Нмк Конц. всего Конц. Кмц Конц. Нмк Рис. 9. Концентрация кардиомиоцитов (КМЦ) и Рис. 10. Концентрация кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток (НМК) в различных зонах немышечных клеток (НМК) в различных зонах сердца мышей c57Bl st+ через 1 ч, сердца мышей mdx st+, через 1 ч после стресса, кл/мм3, X±sx. после стресса, кл/мм3, X±sx..
Клеточная потеря c57Bl st+ 24h Клеточная потеря mdxst+ 24h 4,5 4, 4 3,5 3, 3 Верхушка Верхушка 2,5 2, Середина Середина 2 Основание Основание 1,5 1, 1 0,5 0, 0 Потеря всего Потеря Кмц Потеря Нмк Потеря всего Потеря Кмц Потеря Нмк Рис. 11. Клеточная потеря кардиомиоцитов (КМЦ) и Рис. 12. Клеточная потеря кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток (НМК) в различных зонах немышечных клеток (НМК) в различных зонах сердца мышей c57Bl st+ через 24 ч, сердца мышей mdx st+, через 24 ч после стресса, %, X±sx. после стресса, %, X±sx..
Изначально следует отметить значительную разницу концентраций клеток миокарда у мышей С57Bl и мышей mdx. Как видно на рис. 7 и 8, концентрация всех клеток миокарда и в частности кардиомиоцитов у мышей С57Bl выше на 20-40%. Причем различия в наибольшей степени выражены на верхушке сердца. Это явление наблюдается как у контрольных животных, так и через час после динамического стресса.
Это указывает на постоянную медленную потерю кардиомиоцитов миокардом мышей mdx в течение предшествующей жизни. Данный вывод не противоречит ранее сделанному заключению о том, что кардиомиоциты мышей mdx постоянно находятся в первой, начальной стадии апоптоза, избегая, однако, вступления в деструктивную стадию апоптоза (Казаков, Михайлов, 2001;
Михайлов и др., 2001).
Динамики концентраций Кмц и Нмк через 1 ч после динамического стресса по сравнению с контролем не наблюдается (рис.7-10).
После проведенных подсчетов было установлено (рис 12), что клеточная потеря кардиомиоцитов у мышей mdx через 24 ч после стресса варьирует в пределах от 2.4 до 2.5%.
Полученные результаты имеют высокую степень корреляции с полученными нами ранее сведениями о включении 3Н-тимидина в ядра кардиомиоцитов. Как было уже отмечено выше, через 1 ч после динамического стресса 2.9±0.5 % ядер кардиомиоцитов мышей mdx включают Н-тимидин.
Потеря Нмк у мышей С57Bl через 24 ч после стресса незначительна (рис. 11).
В свете полученных данных представляет большой интерес выяснение участия репарации ДНК в выживании кардиомиоцитов у больных миодистрофией Дюшенна, так как считается, что у человека миодистрофия Дюшенна приводит к летальному исходу из-за остановки сердца примерно в 50 % случаев.
Выводы 1. Плавание в холодной воде (динамический стресс) усиливает образование двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах «диких» мышей С57Вl (примерно в 20 раз) и в значительно большей степени усиливает накопление двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мутантных мышей mdx (примерно в 700 раз в сравнении с мышами С57В1). Через 1 сут после стресса уровень двунитевых разрывов ДНК уменьшается до исходного уровня.
2. При обычном состоянии животных экспрессия гена р53 регистрируется в кардиомиоцитах у мышей С57Вl и особенно интенсивно в кардиомиоцитах мышей mdx. Динамический стресс усиливает экспрессию гена р53 в кардиомиоцитах обоих типов мышей примерно в 3 раза. Суточная динамика экспрессии гена р коррелирует с суточной динамикой регистрации двунитевых разрывов ДНК.
3. Корреляция экспрессии гена р53 с уровнем двунитевых разрывов ДНК показывает, что повреждение ДНК кардиомиоцитов после динамического стресса в свою очередь включает стартовые регуляторные механизмы выживания клеток, характерные для обновляющихся клеточных популяций.
4. Концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx ниже, чем в миокарде мышей C57Bl.
5. Суточная потеря кардиомиоцитов у мышей mdx после динамического стресса превышает таковую у мышей C57BL почти в 10 раз.
6. Сопоставление суточной динамики регистрации двунитевых разрывов ДНК и уровня клеточной потери позволяет заключить, что репарация двунитевых разрывов ДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx после динамического стресса.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Gavrilov B. А., Vezhenkova I.V. et al. 2006. Slow elimination of phosphorylated histone -H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochemical and Biophysical Research Communications. 347: 1048-1052.
2. Михайлов В.М., Веженкова И.В. 2007. Двунитевые разрывы ДНК кардиомиоцитов мышей С57BL и mdx после динамического стресса. Цитология. 49(6): 491-496.
3. Mikhailov V.M., Vezhenkova I.V. 2007. Double strand breaks of DNA of C57BL and mdx mouse cardiomyocytes after dynamic stress. Cell and Tissue Biology. 1(4): 328-333.
4. Гаврилов Б.А., Фирсанов Д.В., Веженкова И.В. и др. 2007. Выявление фосфорилированного гистона H2Ax в дифференцированных клетках после рентгеновского облучения. ДАН, 414(1): 123-125.
5. Веженкова И. В., Михайлов В.М. 2007. Выживание кардиомиоцитов и репарация ДНК в миокарде мышей C57BL/6 и mdx после динамического стресса. Цитология, 50(4): 287-292.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Белов Л.Н., Леонтьева Т.А., Коган М.Е. 1977. Количественная характеристика размножения мышечных клеток в течение постнатального кардиомиогенеза у мышей. Онтогенез. 8(5): 442 450.
Веженкова И.В., Михайлов В.М. 2005. Репаративный синтез ДНК как один из механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx при динамическом стрессе. Цитология. 47(5): 800.
Гаврилов Б.А., Михайлов В. М., Томилин Н. В. 2005. Динамика репарации двунитевых разрывов ДНК в постмитотических клеточных популяциях у мышей после рентгеновского облучения. Цитология. 47(5): 802.
Ерохина И.Л. 1968. Динамика пролиферации клеточных элементов дифференцирующегося миокарда мыши. Цитология. 10(11):1391-1409.
Жинкин Л.Н. 1959. Радиоактивные индикаторы в гистологии. Л.:ИЭМ АМН СССР, 206с.
Казаков В.И., Михайлов В.М. 2001. Фрагментация ДНК кардиомиоцитов мышей mdx и c57Bl после стресса. Цитология. 43(1): 72-75.
Михайлов В. М. и др. 1998. Дифференцировка мышечных волокон мышей mdx после баллистической трансфекции кДНК гена дистрофина человека. Цитология. 40(5): 394-400.
Михайлов В.М., Веженкова И.В. 2007. Двунитевые разрывы ДНК кардиомиоцитов мышей С57BL и mdx после динамического стресса. Цитология. 49(6): 491-496.
Михайлов В.М., Комаров С.А. и др. 2001. Ультраструктурный и морфометрический анализ стадий апоптоза кардиомиоцитов мышей mdx. Цитология. 43(8): 729-733.
Полак Д., Ван Норден С. 1987. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М: Мир, 78с.
Румянцев П.П. 1982. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. Л.: Наука,, 288с.
Томилин Н. В. 2002. Репарация двунитевых разрывов ДНК и стабильность хромосом в клетках высших эукариот. В кн: Бреслеровские чтения. Санкт-Петербург: Изд-во Российской А Наук., 70-84.
Томилин Н. В. 2005. Репарация ДНК и её роль в канцерогенезе. В кн.: IX Российский онкологический конгресс. М. Изд. Российской академии государственной службы при президенте РФ, 72-75.
Томилин Н.В. 1983. Генетическая стабильность клетки. Л: Наука. 156с.
Adler A.J., Langan T.A., Fasman G.D.1972. Complexes of deoxyribonucleic acid with lysine-rich (f1) histone phosphorylated at two separate sites: circular dichroism studies. Arch. Biochem.
Biophys. 153(2):769-77.
Anversa P, Olivetti G, Loud AV. 1980. Morphometric study of early postnatal development in the left and right ventricular myocardium of the rat. I. Hypertrophy, hyperplasia, and binucleation of myocytes. Circ Res. 46(4):495- Beltrami E, Plescia J, Wilkinson JC, Duckett CS, Altieri DC. 2004. Acute ablation of survivin uncovers p53-dependent mitotic checkpoint functions and control of mitochondrial apoptosis. J Biol Chem. 279(3):2077-84.
Black-Schaffer B., Turner M.E. 1958. Hyperplastic infantile cardiomegaly;
a form of idiopathic hypertrophy with orwithout endocardial fibroelastosis;
and a comment on cardiac atrophy. Am J Pathol. 34(4):745- Corbucci, G. G., C. Perrino, G. Donato, A. Ricchi, B. Lettieri, G. Troncone, C. Indolfi, M.
Chiariello, Avvedimento E. V. 2004. Transient and reversible deoxyribonucleic acid damage in human left ventricle under controlled ischemia and reperfusion. J Am Coll Cardiol. 43:1992-1999.
Dawn B, Stein AB, Urbanek K, Rota M, Whang B, Rastaldo R, Torella D, Tang XL, Rezazadeh A, Kajstura J, Leri A, Hunt G, Varma J, Prabhu SD, Anversa P, Bolli R. 2005. Cardiac stem cells delivered intravascularly traverse the vessel barrier, regenerate infarcted myocardium, and improve cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 102(10):3766-71.
De Haan R.L., Duning J.O. 1971. Mitotic growth of the cardiac myocytes. Carnegie Inst Yearb. 70:
1384- Flugelman MY, 2004. Lewis BS. The promise of myocardial repair--towards a better understanding. Eur Heart J. 17:1483-5.
Hort W.1953. Quantitative histological studies on growing heart. Virchows Arch. 323(2):223- Kajstura J, Rota M, Whang B, Cascapera S, Hosoda T, Bearzi C, Nurzynska D, Kasahara H, Zias E, Bonaf M, Nadal-Ginard B, Torella D, Nascimbene A, Quaini F, Urbanek K, Leri A, Anversa P.
2005. Bone marrow cells differentiate in cardiac cell lineages after infarction independently of cell fusion. Circ Res. 96(1):127-37.
Kruhlak M.J., Celeste A., Dellaire G., Fernandez-Capetillo O., Muller W.G., McNally J.G., Bazett Jones D.P., Nussenzweig A. 2006. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. J. Cell Biol. 172: 823-34.
Kusch T., L. Florens, W.H. Macdonald, S.K. Swanson, R.L. Glaser, J.R. Yates 3rd, S.M. Abmayr, M. P. Washburn, Workman J.L. 2004. Acetylation by Tip60 is required for selective histone variant exchange at DNA lesions. Science. 306: 2084-2087.
Leblond C. 1964. Classification of cell populations on the basis of their proliferative behaviour.
Natl Cancer Inst Monogr. 14:119-50.
Liao R., Pfister O., Jain M., and Mouquet F. 2007. The bone marrow – cardiac axis of myocardial regeneration. Prog. Cardiovasc. Dis. 50(1): 18-30.
Mikhailov V. M., Kazakov V. I., Komarov S. A., Nilova V. K., Stein G. I., Baranov V. S. 1999.
DNA destruction and DNA synthesis by myocardial cells of mdx mice. In: The XXVIII European Muscle Congress. Abstracts. York, UK: 189.
Petersen R.O., Baserga R. 1965. Nucleic acid and protein synthesis in cardiac muscle of growing and adult mice. Exp Cell Res. 40(2):340- Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM. 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. V.273(10):5858-68.
Sarkisov DS. 1970. News concerning the study of regeneration and several problems of clinical medicine. Klin. Med. 48(11):14- Sengupta S, Harris C. 2005. p53: traffic cop at the crossroads of DNA repair and recombination.Nat Rev Mol Cell Biol. 6(1):44-55.
Takata M.M. S. Sasaki, E. Sonoda, C. Morrison, M. Hashimoto, H. Utsumi, Y. Yamaguchi-Iwai, A.
Shinohara and Takeda S. 1998. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. The EMBO. 17:5497-5508.
Torella D., Ellison G. M., Karakikes I., Nadal-Ginard B. 2007. Growth-factor-mediated cardiac stem cell activation in myocardial regeneration. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine.
V.4: S46-S51.
Vilenchik M. M., Knudson A. G. 2003. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100:12871-12876.
Лицензия ЛР №020593 от 07.08. Подписано в печать 15.02.2008. Формат 60х84/16. Печать цифровая.
Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 2636b.
Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета.
195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29.
Тел.: 550-40- Тел./факс: 297-57-