Регуляция устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза phytophthora infestans (mont.) de bary салициловой и жасмоновой кислотами
На правах рукописи
СОРОКАНЬ АНТОНИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА РЕГУЛЯЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФИТОФТОРОЗА Phytophthora infestans (MONT.) DE BARY САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТАМИ 03.01.04. – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2013 1
Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук
Научный консультант:
Максимов Игорь Владимирович Доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Ибрагимов Ринат Исмагилович Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский Государственный Университет Доктор биологических наук, заведующий Топунов Алексей Федорович лабораторией ФГБУН Института биохимии им.
А.Н. Баха Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное
Ведущая организация:
учреждение науки Институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук
Защита диссертации состоится «_» _ 201 г. в «» часов на заседании диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:
450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71;
с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН:
ibg.anrb.ru e-mail: [email protected].
Автореферат разослан «_» 2013г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н С.М. Бикбулатова ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследований. Современные интенсивные технологии сельского хозяйства требуют эффективных способов защиты растений от повреждений патогенами. Химические средства защиты растений в основной массе являются одними из опаснейших поллютантов, кроме того, в популяциях патогенов идет отбор наиболее резистентных к ним форм, что приводит к потере их эффективности. Поэтому поиск альтернативных, экологически чистых путей решения проблемы защиты растений, направленных не на уничтожение биологического разнообразия агроценоза, а на биохимическую регуляцию иммунного потенциала растений и формирование целевой устойчивости к патогенам является актуальной задачей. В литературе широко обсуждается участие салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот в механизмах системной устойчивости, однако многие данные крайне противоречивы [Pieterse, 2012;
Robert-Senialitz, 2011;
Denance et al., 2013]. Считается, что СК индуцирует в растениях биохимические процессы, приводящие к устойчивость против биотрофных патогенов, а ЖК - против фитофагов и некротрофов [Pieterse, 2012]. Неоднократно отмечалось, что эти соединения, индуцируя соответствующие сигнальные пути, способны подавлять защитноое действие друг друга, что выражается в подавлении устойчивости растений к патогенам, связанном с отсутствием патоген-специфической экспрессии всего спектра генов, кодирующих защитные белки, либо только СК- или ЖК- зависимых генов [Boatwright et al., 2013].
Возбудитель фитофтороза картофеля являясь - Phytophthora infestans, гемибиотрофным паразитом, сочетает в своем жизненном цикле биотрофную и некротрофную стратегии патогенеза. Следовательно, растения для своей защиты от этого патогена должны комбинировать защитные стратегии. Следует задаться вопросом, возможна ли в этих условиях одновременная активация СК- и ЖК индуцируемых защитных реакций, в том числе - связанных с окислительным взрывом и активностью оксидоредуктаз?
Пероксидазы представляют собой обширное семейство белков, различающихся по спектру окисляемых субстратов и роли в онтогенезе, что связано с многообразием их молекулярных форм. Это требует от исследователей идентификации физиологических функций отдельных изоформ этого фермента [Cosio, Dunand, 2009;
Mathe et al., 2010]. Например, в отношении ряда изопероксидаз, в особенности анионных, выдвигаются предположения об их причастности к формированию устойчивости растений к патогенам [Dowd, Lagrimini, 2006;
Maksimov et al., 2011;
Van Loon, 2006].
Цель исследования: выявление сигнальной роли салициловой и жасмоновой кислот в регуляции защитного ответа растений картофеля в ответ на инфицирование возбудителем фитофтороза связанного с системой про-/анти P. infestans, оксидантного статуса.
Задачи исследований:
1) Изучить вклад салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот в формирование устойчивости растений картофеля к фитофторозу;
2) Оценить характер изменения содержания перекиси водорода и активности пероксидаз в растениях картофеля под влиянием СК, ЖК и инфицирования;
3) Провести анализ локализации лигнина, фенольных соединений и активности пероксидаз в обработанных СК и ЖК растениях картофеля в ходе инфицирования;
4) Выявить в растениях картофеля изопероксидазы, взаимодействующие с хитином и полисахаридами клеточных стенок возбудителя фитофтороза;
5) Изучить транскрипционную активность генов картофеля, кодирующих пероксидазу М21334, белки PR-1 и PR-6 в качестве маркеров салицилат- и жасмонат индуцируемых защитных реакций;
6) Для оценки роли изопероксидазы М21334 в защите растений картофеля от фитофтороза создать растения с подавленной экспрессией ее гена.
Научная новизна. Выявлено, что одновременное совместное воздействие салициловой и жасмоновой кислот увеличивает устойчивость растений картофеля к фитофторозу, повышая активность пероксидаз, усиливая накопление активных форм кислорода и интенсифицируя отложение фенольных соединений и лигнина в тканях инфицированных растений. Тогда как при последовательном применении СК после ЖК, напротив, прослеживается значительное подавление транскрипции защитных белков - изопероксидазы М21334 и ингибитора протеиназ (PR-6), что ведет к восприимчивости растений к возбудителю фитофтороза. Впервые определены полисахарид-специфичные изопероксидазы картофеля с изоэлектрическими точками (pI) ~ 3.5, ~ 3.7 и ~ 9.3, активирующиеся при инфицировании и под действием ЖК.
Для оценки роли изопероксидазы М21334 в защите растений картофеля от фитофтороза подобраны условия для агробактериальной трансформации и органогенеза пробирочных растений картофеля сорта Невский. На основе полученных с использованием генно-инженерной конструкции гена пероксидазы М21334 в антисмысловой ориентации растениях картофеля обнаружена подавленная активность изоформы pI ~ 3.5, что приводило в последующем к снижению интенсивности лигнификации растительных клеточных стенок в зоне инфицирования и повышению восприимчивости к фитофторозу. Показана ведущая роль ЖК в защитном ответе картофеля против возбудителя фитофтороза, в котором задействованы полисахарид-специфичные изопероксидазы.
Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных расширяет современные представления о биохимических и молекулярных механизмах регуляции устойчивости растений к патогенам с участием СК и ЖК.
Предложенный способ культивирования безвирусных пробирочных растений картофеля на средах, содержащих защитные соединения, может способствовать получению посадочного материала с индуцированной устойчивостью к фитофторозу.
Показана возможность регламентирования применения композиций сигнальных молекул СК и ЖК в качестве средств защиты растений природного происхождения для индуцирования в растениях картофеля выработанной за длительный период эволюционного взаимодействия между хозяином и патогеном системной приобретенной и системной индуцированной устойчивости. Изопероксидазы с pI ~ 3.5, кодируемая геном М21334, и ~ 9.3 могут быть использованы в качестве биохимических маркеров при проведении скрининга современных средств защиты растений с иммуноиндуцирующим эффектом, а также при разработке новых сортов картофеля, устойчивых к возбудителю фитофтороза и чувствительных к подобным иммуномодулирующим соединениям.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международных конференциях «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008), "Стратегия взаимодействия микроорганзмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008), "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера" (Апатиты, 2009), «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2010), «Растения и микроорганизмы» (Казань.
2011), «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (Пушкин, 2012);
II (X) Ботанической конференции (Санкт-Петербург, 2012). На Всероссийских конференциях «Биостимуляторы в медицине и сельском хозяйстве» (Уфа, 2010), «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2011), VI съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011), «Экология:
традиции и инновации» (Екатеринбург, 2012), III съезде микологов России (Москва, 2012). Результаты так же были представлены на Всероссийских 2-й и 3-ей школах конференциях по физико-химической биологии и биотехнологии «БИОМИКА – наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), на зарубежных конференциях “Symbiose” (Eskiehir, 2010) и «International symposium on secondary metabolites» (Denisli, 2011).
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье 10-04-97021, государственным контрактом Министерства образования и науки № П339 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. и АЦВП «Развитие научного потенциала высшей школы» № 2.1.1./5676.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в журналах «Перечня ВАК» и 3 статьи в тематических сборниках зарубежного издания.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего источников. Работа изложена на 153страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 29 рисунками.
Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Сурину О.Б., к.б.н. Черепанову Е.А., к.б.н.
Бурханову Г.Ф., к.б.н. Машкова О.И., а также с.н.с. лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Б.Р. Кулуева за помощь при выполнении и обсуждении работы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В экспериментах использованы пробирочные стерильные растения картофеля, полученные методом микроклонирования из верхушечной меристемы клубней [Винклер, Бутенко, 1970]. Для физиологических исследований использован восприимчивый к фитофторозу сорт Ранняя Роза, для создания растений с подавленным синтезом пероксидазы – сорт Невский, обладающий более высоким морфогенетическим потенциалом в каллусной культуре. Растения выращивали на модифицированной среде Мурасиге-Скуга при 20-22С в климатокамере КС-200 СПУ (Россия) с 16-ти часовым светопериодом, освещенностью 12-16 тыс. люкс. Культура оомицета P. infestans (штамм 1.2) была любезно предоставлена проф. Ю.Т. Дьяковым (МГУ), а бактериальная культура Agrobacterium tumefaciens штамма AGLO – сотрудником лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Кулуевым Б.Р.
В опытах растения после 30 сут культивирования на средах с СК, ЖК и их композициями заражали нанесением на каждый лист по 5 мкл суспензии зооспор патогена (105 спор/мл). В экспериментах с последовательным воздействием СК и ЖК растения выращивали 30 суток на СК либо ЖК, затем на листья наносили растворы ЖК либо СК, в зависимости от варианта опыта, и через 24 часа инфицировали.
Растительные экстракты, содержащие свободно-растворимую и связанную с клеточной стенкой пероксидазы, получали согласно [Bireska и Miller, 1974].
Активность пероксидазы измеряли микрометодом [Хайруллин и др., 2001].
Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) белков проводили с использованием 7%-ного ПААГ и 2,5% амфолитов рН 3.0-10.0 ("BioRad", США). ПААГ проявляли на пероксидазную активность в растворе 0.01% 3.3 - диаминобензидина (ДАБ) и 0.016% Н2О2 в 0.1 М фосфатном буфере (ФБ). Концентрацию Н2О2 измеряли с использованием красителя ксиленоловый оранжевый [Bindschelder et al., 2001].
Оптическую плотность измеряли на приборе Bencmark Mikroplate Reader ("BioRad", США) при 490 нм. Активность изоформ анализировали при помощи компьютерной программы TotalLab (США). Для цитохимического выявления активности пероксидаз использовали раствор ДАБ, фенольных соединений – краситель толуидиновый синий [Mellersh et al., 2002];
лигнин определяли по автофлуоресценции [Высоцкая и др., 2011]. Исследования проводили с использованием микроскопа Axio Imager M (“CarlZeiss”, Германия).
Тотальную РНК выделяли с помощью препарата «Тризол» согласно протоколу фирмы-поставщика (Molecular Research Center, Inc, США). Синтез кДНК проводили с использованием праймеров и фермента M-MLV обратной транскриптазы по протоколу фирмы-поставщика (Fermentas, США). Одноцепочечную кДНК использовали в реакции амплификации с праймерами к генам пероксидазы картофеля М21334, PR-1 и PR-6.
Агробактериальную трансформацию растений картофеля проводили с использованием бактерий Agrobacterium tumefaciens [Newell et al., 1991], несущих плазмиду pCambia 1305.1. «Тупые» концы плазмиды были получены с помощьюТ4 ДНК-полимеразы. Вектор был модифицирован антисенс-конструкцией фрагмента гена М21334. Оптимальные условия для трансформации и органогенеза были подобраны экспериментально, для регенерации трансформантов использовали 1,5 мг/л транс зеатина, 0,5 мг/л ИУК и 0.1 мг/л феруловой кислоты. Экспланты после трансформации помещали на среды, содержащие 100 мкг/л гигромицина и 700 мг/л препарата «Аугментин» Было получено 26 морфологически UK).
(GlaxoSmithKline, полноценных регенерантов (25% эксплантов). Регенеранты размножали методом микроклонирования по методу, предложенному акад. Р.Г. Бутенко с коллегами [1982].
В работе анализировали биоматериал каждого из трех повторов одного варианта опыта. Статистическая обработка проводилась компьютерной программой Statistica 6.0 (Stat Soft).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Подбор оптимальной индуцирующей устойчивость к P. infestans 1.
концентрации салициловой и жасмоновой кислот для обработки растений картофеля Известно, что воздействие гормонов на различные процессы в растениях зависит его соотношения с другими гормонами [Denanc 2013]. Поиск комбинации СК и ЖК, обладающей иммуностимулирующим эффектом на растениях картофеля выявил формирование относительной устойчивости пробирочных растений картофеля под действием комбинации сигнальных молекул - 1 µМ СК с 0, µМ ЖК, а также 0,1 µМ СК с 0,01 µМ ЖК. Важно при этом заметить, что наибольшей устойчивостью к фитофторозу характеризовались пробирочные растения картофеля, испытывающие воздействие смеси 1 µМ СК с 0,1 µМ ЖК. В этом варианте достаточно рано (на 1-2 сут после инфицирования) наблюдалось появление на листьях картофеля в местах контакта со спорами P. infestans множества мелких темных точек из погибших растительных клеток, окруженных светлым кольцом.
Приведенные концентрации сигнальных молекул в отдельности и в композиции были использованы для проведения дальнейших исследований.
2. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на содержание Н2О2 в растениях картофеля в норме и при инфицировании Так как развитие защитного ответа растений сопровождается окислительным взрывом [Fu, Dong, 2013], проведенный нами анализ содержания перекиси водорода в тканях растений показал, что СК и ЖК как по отдельности, так и в композиции значительно повышали ее уровень (рис. 1). Под воздействием СК уровень перекиси водорода повышался на 30% относительно контроля, а в обработанных ЖК растениях – более чем двукратно при инфицировании. Максимальное накопление перекиси водорода наблюдалось как в инфицированных, так и в незараженных растениях при совместном применении СК и ЖК. Таким образом, в растениях картофеля наиболее эффективным соединением, индуцирующим наиболее высокий уровень перекиси водорода, является жасмоновая кислота Рис 1. Концентрация H2O2 в растениях картофеля под воздействием СК и ЖК и через 48 часов после инфицирования.
1- контроль;
2 - контроль+ P. infestans;
3 - СК;
4 - СК + P. infestans;
5 - ЖК;
6 - ЖК + P. infestans;
7 - СК/ЖК;
8 - СК/ЖК + P.infestans.
Согласно исследованиям Mur с коллегами [2008], совместная обработка растений СК и ЖК в малых концентрациях так же приводила к увеличению содержания перекиси водорода, большему, чем в случае применения этих соединений в отдельности. Исходя из полученных нами данных, можно предположить, что именно присутствие ЖК как в отдельности, так и в комбинации с СК, способствовало более интенсивному накоплению перекиси водорода. Известно, что трансгенный картофель, в котором была увеличена продукция перекиси водорода, обладал большей устойчивостью к P. infestans, чем растения дикого типа [Wu et al., 1995], что согласуется с нашими данными о снижении площади поражений на листьях в вариантах, где концентрация перекиси водорода была высока даже в отсутствие инфицирования.
Рис. 2. Активность свободно-растворимых (а), ионно-связанных (б) и ковалентно связанных (в) с клеточной стенкой пероксидаз в растениях картофеля под воздействием СК и ЖК и через 48 часов после инфицирования P. infestans.
1- контроль;
2 - контроль+ P. infestans;
3 - СК;
4 - СК + P. infestans;
5 - ЖК;
6 - ЖК + P. infestans;
7 - СК/ЖК;
8 - СК/ЖК + P. infestans.
3. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на изоферментный спектр картофеля в норме и при инфицировании P. infestans Перекись водорода используется пероксидазами в реакциях, приводящих к синтезу лигнина [Almagro et al., 2009]. Под воздействием СК и ЖК активность пероксидазы в свободно-растворимой фракции возрастала, а воздействие ЖК увеличивало ее так же в ионно- и ковалентно-связанных с клеточными стенками растений фракциях (рис. 2). Пероксидазы растений характеризуются широким спектром изоформ [Passardi, 2005], ряд из которых обладает способностью связываться с полисахаридами без потери каталитической активности [Максимов и др., 2005;
Pchenichnov et al., 2011]. Нами было выявлено, что с хитином связывались анионные изопероксидазы картофеля с pI ~ 3.5, ~ 3.7 и катионные с pI ~ 8,8 и ~ 9.3. На препарате целлюлозо-глюканового комплекса клеточных стенок мицелия оомицета P. infestans сорбировалась изоформа c pI ~ 9.3 (рис. 3).
Рис. 3. Многообразие изопероксидаз картофеля и их сродство к хитину (А) и клеточным стенкам оомицета P.
infestans (Б):
1 – не связавшиеся изоформы;
2 – изоформы, элюированные 1 М NaCl;
Э – грубый экстракт;
М – маркер.
Анализ изменения изоферментного спектра пероксидаз картофеля в свободно растворимой фракции белков выявил, что инфицирование индуцировало активности обладающих сродством к полисахаридам клеточной стенки оомицета P. infestans и хитину изопероксидаз с с pI ~ 9.3 (рис. 4 а), а также конститутивно синтезирующихся изоформ с pI ~ 3.5 и 3.7. (рис. 4б). Важно заметить, что если в контрольных неинфицированных растениях изопероксидаза с pI ~ 9.3 не проявлялась, то инфицирование и добавление в среду культивирования ЖК способствовали ее активации. В то же время СК таким эффектом не обладала. Важно подчеркнуть, что цитологические исследования показали наличие пероксидазной активности на поверхности инфекционных гиф возбудителя фитофтороза (рис. 4 а). Мицелий P.
infestans, выросший на питательной среде, не обнаруживал соответствующей окраски.
Анализ изоферментного состава пероксидаз показал, что наряду с катионными, в растениях на инфицирование и воздействие сигнальных молекул активно реагируют конститутивно синтезирующиеся связывающиеся с хитином анионные изоформы с pI ~ 3.5 и pI ~ 3.7. В инфицированных растениях картофеля, растущих на среде с добавлением смеси СК и ЖК, активность анионных изоформ была выше, чем в вариантах с использованием СК и ЖК в отдельности (рис. 4 б). Причем, как видно, эти изопероксидазы были более чувствительны к воздействию ЖК, чем СК. Кроме того, нами в этом эксперименте практически не обнаружено интерферирующего эффекта в изменении активности изопероксидаз в условиях совместного использования СК и ЖК.
а б Рис. 4. Влияние СК и ЖК на активность катионной (а) и анионной (б) части изоферментного спектра пероксидаз картофеля в норме и через 48 часов после инфицирования и их концентрирование на поверхности гиф P. infestans.
1- контроль;
2 - контроль+ P. infestans;
3 - СК;
4 - СК + P. infestans;
5 - ЖК;
6 - ЖК + P. infestans;
7 - СК/ЖК;
8 – СК/ЖК + P. infestans. Отмечена полисахарид специфичная пероксидаза с pI ~ 9.3.
Полученные данные свидетельствуют в пользу, с одной стороны, определяющей роли ЖК в передаче сигнала при регуляции активности изопероксидаз картофеля с pI ~ 3.5, ~ 3.7 и ~ 9.3., а с другой - о взаимном аддитивном эффекте изученных соединений на активность как анионных, так и катионных изопероксидаз.
Локализация пероксидаз, накопление фенольных соединений и лигнина в 4.
листьях инфицированных растений под влиянием СК и ЖК Согласно литературным данным, в развитии локального иммунитета важную роль играют пероксидазы. Так, P. Bolwell с коллегами [2001] показали, что пероксидазы выявляются в межклеточных пространствах вблизи инфекционного сайта, что коррелирует сокращением размера некротизированных участков на листьях фасоли, инфицированых Colletotrichum lindemuthianum.
Как видно из рис. 5, накопление фенольных соединений, лигнина и активация пероксидазы, происходящие в зоне замыкающих клеток устьиц, свидетельствуют об усилении защитных процессов именно в местах, где происходит преимущественное проникновение патогена P. infestans в ткани листа картофеля [Морозов, 1987, Kamoun et al., 2000].
Рис. 5. Локализация лигнина вокруг некротизированного участка (а), лигнина (б), пероксидазной активности (в) и фенольных соединений (г) в зоне замыкающих клеток устьиц на листьях инфицированных растений (48 часов после инфицирования).
Как нами было показано ранее, ЖК играет ключевую роль в активации пероксидаз клеточных стенок, а СК – в накоплении фенольных соединений, в том числе – необходимых для синтеза лигнина [Сорокань и др., 2011]. Таким образом, следует предположить, что для эффективной лигнификации пораженных тканей необходимо действие двух этих антистрессовых гормонов.
5. Изменение уровня мРНК защитных генов картофеля под влиянием салициловой и жасмоновой кислот В работах Roberts et al., [1988] путем пептидного секвенирования была выявлена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего чувствительную к поранению изопероксидазу картофеля М21334. Ранее нами были подобраны праймеры к относительно вариабельной зоне гена М21334, близкой по структуре к фрагменту генов изопероксидаз из других растений, кодирующих полисахарид специфичный сайт [Максимов и др., 2010]. Анализ содержания транскриптов гена М21334 в растениях картофеля, подвергнутых инфицированию и обработке СК и ЖК выявил, что при инфицировании P. infestans их уровень значительно возрастал (рис. 6).
В инфицированных растениях картофеля, обработанных СК или ЖК, интенсивность транскрипции гена М21334 значительно превышала показатели в инфицированных контрольных растениях. При совместном применении СК и ЖК а также использование ЖК после СК значительно увеличивало содержание мРНК гена М21334.
Рис. 6. Воздействие 1 µМ СК (3, 4) и 0,1 µМ ЖК (5, 6), их смеси (7, 8) и последовательного использования (9-12) на содержание мРНК генов, кодирующих пероксидазу М21334, белки PR-1 и PR-6 в здоровых и инфицированных фитофторозом растениях картофеля (48 часов после инфицирования):
1 – необработанный незараженный контроль;
2 – инфицирование P. infestans;
3 – обработка СК;
4 – обработка СК + P. infestans;
5 – обработка ЖК;
6 – обработка ЖК + P. infestans;
7 – обработка смесью СК и ЖК;
8 – обработка смесью СК и ЖК + P. infestans;
9 – «ЖК после СК»;
10 – «ЖК после СК» + P. infestans;
11 – «СК после ЖК»;
12 –«СК после ЖК» + P. infestans. Цифрами указана нормализованная относительно активности гена актина транскрипционная активность генов в % от контроля.
Последовательное применение СК после ЖК снижало содержание транскриптов гена М21334, что предполагает формирование интерференции между сигнальными путями запуска экспрессии гена в этом случае (рис. 6). Важно, что в вариантах с наибольшей активностью гена наблюдалось наименьшее развитие симптомов фитофтороза и, наоборот, в растениях, где активность гена была наименьшей, степень развития болезни была наибольшей.
Известно, что в растениях обработка СК и ЖК запускает стандартные и специфические пути формирования защитного ответа, что впоследствии может определять их устойчивость к патогену [Pieterse., 2012]. В связи с этим была проведена серия экспериментов, где анализировали дополнительно содержание мРНК генов, кодирующих защитные белки PR-1 и PR-6, проявляющих себя как соответствующие маркеры СК и ЖК индуцируемых сигнальных путей развития системной приобретенной или системной индуцированной устойчивости.
В контрольных растениях картофеля накопления транскриптов гена, кодирующего белок PR-1, не происходило (рис. 6). Активация этого процесса наблюдалась при инфицировании растений, а так же под воздействием СК.
Интересно, что в варианте с одновременным применением СК и ЖК содержание транскриптов гена PR-1 была выше, по сравнению с другими вариантами опыта, но только в инфицированных растениях. При использовании ЖК после СК транскриптов этого гена в анализированном после электрофореза геле практически не наблюдалось, как в неинфицированных, так инфицированных растениях. В то же время, при применении СК после ЖК напротив, содержание транскриптов этого гена было высоким в инфицированных растениях.
Выявлено почти двукратное повышение содержания мРНК гена PR-6 под действием ЖК как в неинфицированных, так и в инфицированных растениях.
Присутствие в среде культивирования СК приводило к повышению содержания мРНК гена PR-6 только в зараженных спорами P. infestans растениях картофеля.
Полученные данные предполагают, что развитие защитных реакций картофеля против этого патогена связано со способностью растений в условиях инфицирования синтезировать ЖК и через этот механизм усиливать активность транскрипции гена PR-6. Интересно, что одновременное воздействие ЖК и СК вызывало более значительное накопление его транскриптов, чем ЖК в отдельности. Как и следовало ожидать, предварительная обработка растений СК не препятствовала высокому содержанию транскриптов гена PR-6 в растениях, впоследствии обработанных ЖК, чего не происходило при использовании СК для обработки растений, длительно испытывающих воздействие ЖК. В варианте с обработкой СК после ЖК транскрипты гена PR-6 не проявлялись как в неинфицированных, так и в инфицированных растениях, что предполагает негативный салицилатный контроль над экспрессией этого гена, точно также как и гена М21334.
ИЭФ пероксидаз картофеля, проведенное на 2 сутки после инфицирования, продемонстрировало, что активность патоген-чувствительных изоформ с pI ~ 3.5 и ~ 3.7 коррелировала с содержанием транскриптов гена М21334, и, как было показано ранее (рис. 4 б), была максимальна в случае длительного совместного воздействия СК и ЖК в инфицированных растениях. В растениях варианта «ЖК после СК» активность рассматриваемых изоформ была соизмерима с этим показателем в последнем случае (рис. 7). Обработка «СК после ЖК», напротив, препятствовала увеличению активности двух анионных пероксидаз – и в неинфицированных, и в инфицированных растениях этот показатель оставался на уровне неинфицированных и необработанных СК и ЖК контрольных растений.
~ 3.5 ~ 3.7 ~ 4. Рис. 7. Влияние последовательной обработки СК и ЖК на активность пероксидаз анионной части спектра в норме и через 48 часов после инфицирования:
1 – контроль;
2 – P. infestans;
3 – «ЖК после СК»;
4 – «ЖК после СК» + P. infestans;
5 – «СК после ЖК»;
6 – «СК после ЖК» + P. infestans.
Таким образом, следует предположить, что ведущую роль в регуляции активности анионной пероксидазы играет ЖК. При этом данный механизм защиты представляется весьма важным, так как снижение ее активности коррелировало со снижением устойчивости картофеля к фитофторозу. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы провели работы по получению растений картофеля, несущих антисенс конструкцию гена пероксидазы М21334.
Исследование морфолого-физиологической роли полисахарид 6.
специфичных пероксидаз картофеля при помощи антисенс-конструкций фрагмента гена М Наиболее эффективным методом идентификации продуктов определенных генов может быть создание трансгенных растений, гиперсинтезирующих конкретные пероксидазы или, наоборот, содержащие нокаут-фрагменты [Heggie et al., 2005;
Bindschedler et al., 2006].
Основываясь на имеющихся данных о возможности изучения роли того или иного гена в морфолого-физиологических процессах в растении с помощью антисмысловых РНК, мы получили генно-инженерную конструкцию гена М21334, содержащую последовательность, предположительно кодирующую полисахарид сязывающий домен одной из изопероксидаз картофеля (рис. 8).
Рис. 8. Клонирование фрагмента гена пероксидазы М21334 картофеля в “антисмысловой” ориентации в векторе pCambia 1305.1. Km – ген устойчивости к канамицину;
35S промотор – промотор вируса мозаики цветной капусты;
промотор ВМГ – промотор вируса мозаики георгина;
SmaI, BamHI, XbaI – сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, polyA – сайт полиаденилирования.
После сокультивации с агробактериями, несущими целевую антисенс конструкцию, нами было получено 26 регенерантов, жизнеспособных и не имеющих морфологических отклонений. Растения были размножены методом микрочеренкования и в полученных клонах был проведен анализ транскрипции гена пероксидазы М21334 и его антисенс-конструкции (рис. 8 б). Было показано, что количество транскриптов этого гена в трансформированных растениях сравнимо с данным показателем в растениях дикого типа. Использование праймеров, подобранных к антисенс-последовательности гена М21334, внедренной в геном растений, подтвердило, что в растениях дикого типа транскрипция этой последовательности отсутствует. В трансформированных же растениях клона № (4р) наблюдалась его максимальная транскрипционная активность. Данная линия показала также наибольшее снижение активности анионной пероксидазы с pI~3. (рис. 9 а). Итак, при использовании антисенс-технологии нами показано, что индуцирующаяся при пораненении изопероксидаза [Roberts et al., 1988] является анионной изоформой, отвечающей на инфицирование возбудителем фитофтороза и обладающей высокой чувствительностью к воздействию ЖК.
а б Рис. 9. а: Изменение активности изоферментов пероксидаз в трансформированных растениях картофеля, несущих антисенс-конструкцию участка гена пероксидазы картофеля М21334. б: накопление транскриптов гена М21334 и его антисенс- конструкции в растениях картофеля дикого типа (wt) и растениях регенерантах после сокультивации с A. tumefaciens (4p).
1- контроль (wt);
2 - растения-регенеранты без целевой генно-инженерной конструкции;
3 – растения регенеранты с антисенс генно-инженерной конструкцией (4p).
В последующем мы проанализировали развитие симптомов фитофтороза на листьях растений клона 4р. На 10 сутки после инфицирования различия между двумя вариантами были наиболее заметны – так, максимальные повреждение контрольных растений составляло до 50% площади листовой пластинки, а листья трансформированных растений были практически полностью некротизированы (рис. 10).
По-видимому, столь заметное снижение устойчивости к фитофторозу растений картофеля, несущих антисенс-конструкцию гена М21334, объясняется недостаточным накоплением пероксидаз в клеточных стенках в местах внедрения патогена. Так, из рис. 11 видно, что окрашивание диаминобензидином (ДАБ), выявляющее пероксидазную активность, наблюдается на участках, занимающих более 20 клеток эпидермиса вокруг устьиц, через которые происходит проникновение патогена в ткани. В то же время, на листьях трансформированных растений интенсивное ДАБ окрашивание отмечается в нескольких прилегающих к устьицам клетках, либо – довольно слабое только в замыкающих клетках устьиц.
Рис. 10. Развитие фитофтороза на листьях картофеля дикого типа (WT) и несущих антисенс-конструкцию гена пероксидазы М21334 на 10 сутки после инфицирования.
Рис. 11. Накопление пероксидазы в листьях контрольных (а) и трансформированных растений картофеля со сниженной активностью пероксидазы М21334 (б) через 48 часов после инфицирования возбудителем фитофтороза.
Присутствие пероксидаз необходимо для полимеризации монолигнолов в молекулу лигнина [Blee et al., 2003]. Цитохимические исследования показали, что в листьях инфицированных возбудителем фитофтороза трансформированных растений фенольные соединения, к которым относятся, в том числе, и мономеры лигнина, аккумулируются в той же степени, что и в инфицированных листьях картофеля дикого типа (рис. 12 а, б), так же определяясь в замыкающих устьичных клетках.
Однако накопление лигнина в клеточных стенках трансформированных растений при инфицировании происходит менее интенсивно (рис. 12 в, г), что, вероятно, объясняется отсутствием пероксидазы М21334 с pI~3.5, катализирующей этот процесс, что позволяет считать ее ключевой функцией участие в синтезе лигнина. Так как недостаток активности изопероксидазы М21334 с pI~3.5, как показано, в трансгенных растениях приводит к столь драматическому снижению устойчивости растений к фитофторозу, а в растениях картофеля дикого типа экспрессия этой изоформы регулируется ЖК, следует признать ведущую роль этого соединения в устойчивости картофеля к фитофторозу.
Рис. 12. Накопление фенольных соединений (а, б) и синтез лигнина (в, г) в листьях картофеля через 48 часов после инфицирования контрольных (а, в) и трансформированных растений (б, г).
Таким образом, в нашей работе выявлена возможность применения композиции ЖК и СК для индуцирования устойчивости растений. Путем внедрения в растения картофеля антисенс-конструкции гена М21334 было показано, что он кодирует анионную пероксидазу с pI~3.5. Сайленсинг этого гена вызывает существенное снижение устойчивости картофеля к фитофторозу из-за нарушения развития механического барьера на пути проникновения патогена.
ВЫВОДЫ 1. Показана эффективность применения салициловой и жасмоновой кислот в защите растений картофеля от фитофтороза при одновременном применении, однако салициловая кислота оказывает негативное действие на защитные реакции растений, длительно испытывающих воздействие жасмоновой кислоты.
2. Цитохимические исследования показали, что салициловая и жасмоновая кислоты увеличивают локальную активность пероксидаз, фенольных соединений и лигнина в месте инфицирования.
3. Выявлено, что пероксидазы картофеля с pI ~ 3.5, ~ 3.7, ~ 8.8 и ~ 9.3 являются хитин-специфичными, изопероксидаза с pI ~ 9.3 способна связываться и с клеточными стенками мицелия P. infestans.
4. Обнаружено, что жасмоновая кислота как в отдельности, так и в комбинации с салициловой кислотой стимулирует накопление в инфицированных растениях пероксида водорода и активирует изопероксидазу с pI ~ 9.3, индуцирующуюся при инфицировании и проявляющую сродство к хитину и клеточным стенкам возбудителя фитофтороза.
5. Выявлено, что важный вклад в проявление протекторного действия ЖК на растениях картофеля вносит ее способность индуцировать экспрессию анионной хитин-специфичной пероксидазы с pI ~ 3.5.
6. Показано подавление активности анионной изопероксидазы с pI ~ 3.5 по механизму РНК-сайленсинга.с использованием полученных в работе трансгенных растений картофеля, содержащих антисмысловую конструкцию гена М21334.
7. Обнаружено, что активное развитие возбудителя фитофтороза P. infestans на растениях картофеля с подавленной активностью анионной пероксидазы связано с недостаточной лигнификацией клеточных стенок в местах внедрения патогена, что указывает на ключевую роль этого фермента в защите картофеля от данного патогена.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Максимов, И.В. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на компоненты про-/антиоксидантной системы картофеля при фитофторозе / И.В. Максимов, А.В.
Сорокань, Е.А. Черепанова, О.Б. Сурина, Н.Б. Трошина, Л.Г. Яруллина // Физиология растений. 2011. Т. 57. № 2. С. 299 - 306.
2. Максимов, И.В. Структурно – функциональные особенности изопероксидаз растений / И.В. Максимов, Е.А. Черепанова, Г. Ф. Бурханова, А.В. Сорокань, О.И.
Кузьмина // Биохимия. 2011. Т. 76, вып. 6. С. 749 – 763.
Статьи в коллективных монографиях 3. Sorokan’, A. V. The interplay between salicylic and jasmonic acid during phytopathogenesis / A. V. Sorokan, G. F. Burkhanova, I. V. Maksimov // Salycilic acid: a plant hormone. Eds. S. Hayat. Springer-Verlag. Berlin. Heidelberg. 2013. P. 277-297.
4. Maksimov, I.V. Polysaccharide-specific isoperoxidases as an important component of the Plant Defence System / I.V. Maksimov, E.A. Cherepanova, A.V. Sorokan’ // Products and applications of biopolymers. InTech. Rijeka. 2012. P. 201-220.
5. Sorokan’ A.V., Maksimov I.V. Plant Peroxidases: Functions and Regulation during Pathogenesis / A.V. Sorokan’, I.V. Maksimov // Peroxidases: Biochemical Characteristics, Functions and Potential Applications. Eds. Bogaert L., Coppens N. Nova Publishers. 2013. ISBN: 978-1-62808-262-3. P. 55-74.
Публикации в других изданиях 6. Maksimov, I.V. Effects of salicylic and jasmonic acids on the phenolic compounds accumulation in potato plants infected with late blight / I.V. Maksimov, Sorokan A.V., Troshina N.B., Surina O.B. //
Abstract
book of Internat. symp. on secondary metabolites.
Denisli, Turkey. 2011. P. 49.
7. Burchanova, G.F. Salicylic acid and jasmonic acid-depending signaling pathways regulation of potato plant resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary / G.F.
Burchanova, A. V. Sorokan, I. V. Maksimov // Abstract book of conference “Symbiose”.
Eskiehir. 2010. P. 20 – 22.
8. Сорокань, А.В. Полисахарид-специфичные пероксидазы в регуляции устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза / А.В. Сорокань, Г.Ф.
Бурханова, Е.А. Черепанова, И.В. Максимов // Мат. XVII молодежной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар. 2011. C. 267-269.
9. Сорокань, А. В.Регуляция устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза Phytophthora infestans (Mont) de Bary салициловой и жасмоновой кислотами / А. В. Сорокань, А. Ш. Валеев, Н. Б. Трошина, И. В. Максимов // Вестник уральской медицинской академической науки (тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии). 2011. № 4/1 (38). C. 117-118.
Сорокань, А.В. Совместные культуры как модель для изучения 10.
взаимоотношений растение-патоген. Современные методы и подходы в биологии и экологии» / А.В. Сорокань, И.В. Максимов // Аграрная Россия, 2009. спец выпуск. C. 9.
11. Максимов, И.В. Регуляция системной устойчивости растений картофеля к возбудителю фитофтороза под влиянием эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26Д и сигнальных молекул / И.В. Максимов, Р.Р. Абизгильдина, А.В. Сорокань, Г.Ф.
Бурханова // Сборник трудов I-ой Международной интернет – конф. «Растения и микроорганизмы». Казань. 2011. C. 82 – 87.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АФК - активные формы кислорода;
ДАБ – диаминобензидин;
ЖК жасмоновая кислота;
ИЭФ – изоэлекто-фокусирование;
ПААГ - полиакриламидный гель;
СВЧ - сверхчувствительная реакция;
СК - салициловая кислота;
ФБ фосфатный буфер;
pI - изоэлектрическая точка.