Диагностика черной ножки картофеля, вызываемой бактериями рода dickeya и генетический полиморфизм штаммов возбудителей
На правах рукописи
КАРЛОВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ ДИАГНОСТИКА ЧЕРНОЙ НОЖКИ КАРТОФЕЛЯ, ВЫЗЫВАЕМОЙ БАКТЕРИЯМИ РОДА DICKEYA И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ Специальности: 06.01.07 – защита растений 03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2011 3
Работа выполнена в лаборатории защиты растений Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева доктор биологических наук, профессор Научные руководители:
Джалилов Февзи Сеид-Умерович доктор биологических наук Игнатов Александр Николаевич
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук Сидоренко Олег Дмитриевич кандидат биологических наук Соболев Владимир Васильевич
Ведущая организация: Российский университет дружбы народов
Защита диссертации состоится «22» декабря 2011 г. в 15:00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.04 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева.
Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49. Ученый совет РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Н.И. Железнова РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан «15» ноября 2011 года и размещён в сети Интернет на сайте университета www.timacad.ru и направлен на сайт ВАК [email protected] Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А. Н.Смирнов Актуальность проблемы. Картофель выращивают в 130 странах, где проживает 75% населения планеты. Это пятый по значению после пшеницы, кукурузы, риса и ячменя источник калорий в рационе современного человека. В среднем в мире производится более 325 миллионов тонн картофеля в год, большая часть производства приходится на страны Европы и Азии (около 80% мирового производства картофеля) (van der Zaag, Horton, 1983).
Доля России в мировом производстве этой культуры по посевным площадям и валовому сбору составляет около 10%. Экспорт картофеля оценивается на уровне 100 тыс. т. в год, а импорт 400 – 500 тыс. т. (более 1,5 % его валового производства) (Симаков и др., 2010). Так как Россия импортирует немалое количество картофеля, в том числе и семенного, возникает опасность ввоза и распространения с посадочным материалом возбудителей новых болезней. Прежде всего, это те болезни, возбудитель которых сохраняется непосредственно в семенах и в последующем является главным источником инфекции. В нашей стране эта опасность, также может увеличиться в связи с предстоящим вступлением в ВТО и как следствие увеличением потока посадочного материала, произведенного в других странах, зачастую с другим, чем в России набором возбудителей болезней. Среди болезней картофеля, важное место принадлежит бактериозам, которые распространены повсеместно и уносят от 10 до 25 % урожая, а в некоторых районах страны во влажные годы потери урожая могут достигать 50 % (Катаева, 1972). К числу наиболее распространенных и вредоносных бактериальных болезней картофеля относится черная ножка (Лазарев, Базлеева, 1994;
Лазарев, 1985). Это заболевание вызывают три самостоятельных, но близкородственных вида пектолитических бактерий из семейства Enterobacteriaceae: Pectobacterium atrosepticum, P. carotovorum subsp. carotovorum и Erwinia chrysanthemi, которые вызывают симптомы на растениях в период вегетации и на клубнях при хранении. Однако, сравнительно недавно в 1982 году вид E. chrysanthemi, был включен в список карантинных объектов для стран Европейского Союза и по ряду признаков выделен в новый род, который назвали Dickeya. Начиная с года, этот патоген стремительно стал распространяться по Европе, причиняя значительные экономические потери. Кроме того, появляются сведения об обнаружении нового, более агрессивного вида D. solani (Tsror et al., 2008, Slawiak et al., 2009). В Голландии в 2007 году экономический ущерб от этого заболевания составил 25 млн. евро. Многие страны закрыли свой рынок для картофеля, не имеющего сертификата на отсутствие Dickeya. Очевидно, что патоген распространяется с посадочным материалом.
Возбудитель болезни на клубнях чаще всего находится в латентной форме.
Поэтому, большое значение для борьбы с этим новым заболеванием имеет тестирование посадочного материала на зараженность. Достоверная диагностика является важным условием для предотвращения распространения заболевания. Наиболее перспективным является использование современных серологических и молекулярно – генетических методов, таких как ИФА (иммуноферментный анализ) и ПЦР (полимеразная цепная реакция).
Необходимым условием для успешного применения молекулярно-генетических методов диагностики является изучение генетического полиморфизма видов и штаммов Dickeya. К началу выполнения настоящей работы отсутствовали сведения о распространении Dickeya на картофеле в Российской Федерации.
Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлось усовершенствование методов диагностики возбудителя черной ножки картофеля из рода Dickeya и изучение генетического полиморфизма российской коллекции штаммов патогена.
Для достижения этой цели планировалось решение следующих задач:
1. Выделение возбудителей черной ножки картофеля из рода Dickeya, создание коллекции штаммов, изучение их биохимических свойств и круга растений–хозяев.
2. Усовершенствование диагностики Dickeya spp. методами ИФА, ПЦР и ПЦР в реальном времени.
3. Изучение генетического полиморфизма коллекции штаммов Dickeya, выделенных из картофеля в России.
Научная новизна. Впервые в России выделены D. dianthicola и D. solani как возбудители черной ножки картофеля. Показано, что в список известных растений-хозяев D. dianthicola и D. solani следует включить табак и ирис.
Впервые определены последовательности 7 генов для D. solani, выявлено, что наибольшее генетическое расстояние между D. solani и D. dianthicola имелось для генов pelD, mdh и dnaX что указывает на возможность использования их для разработки молекулярного маркера для D. solani.
Практическая значимость. Создана коллекция российских штаммов D.
solani и D. dianthicola (15 штаммов). Разработан ИФА – диагностикум, позволяющий выявлять бактерии D. dianthicola в клубневом экстракте.
Показана перспективность использования Био–ИФА с целью повышения чувствительности диагностики. Подобрана флуоресцентная проба, которая вместе с парой праймеров ADE1/ADE2 выявляет присутствие бактерий рода Dickeya методом ПЦР в реальном времени.
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева (г. Москва, 1 – 2 июня 2011г.) и на Научно практической конференции, посвященной 145-летию РГАУ-МСХА имени К.А.
Тимирязева «Адаптация сельского хозяйства России к меняющимся погодно климатическим условиям» (7-10 декабря 2010 г.).
Публикации по теме диссертации.
По материалам диссертации опубликовано 3 работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и обьем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, 4 глав экспериментальной части, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Обьем работы составляет 129 страниц. В диссертации содержится 24 рисунка и 28 таблиц. Список использованной литературы содержит 140 источников, в том числе 129 иностранных авторов.
Автор искренне признателен ведущему научному сотруднику ВНИИКХ им. А.Г. Лорха к.б.н. Варицеву Ю.А., заведующему лабораторией молекулярных методов диагностики ВНИИКР к.б.н. Мазурину Е.С., научным сотрудникам ВНИИФ к.б.н. Пехтеревой Э.Ш. и Корневу К.П., научному сотруднику Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Зотову В.С., руководителю Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, д.б.н. Карлову Г.И. и с.н.с. И.А.Фесенко за большую помощь в выполнении работы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК П2380, ГК 02.740.11.0286 и «Молодежного бизнес – инкубатора САО» по программе «Умник».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение. Обоснована актуальность темы исследования, сформулированы основная цель и задачи исследования.
Глава I. Обзор литературы В этой главе рассмотрены биологические свойства и особенности патогенеза основных возбудителей черной ножки картофеля. Приведены сведения о видовом составе, круге растений–хозяев, распространении и вредоносности новых бактериальных патогенов картофеля Dickeya dianthicola и D. solani. Рассмотрены основные методы диагностики возбудителей.
Глава II. Методы и материалы Работа была выполнена в 2008 – 2011 гг. в лаборатории защиты растений РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева. Отдельные эксперименты проводили в Центре молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА, во ВНИИ фитопатологии, ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха, Всероссийском центре карантина растений (ВНИИКР).
Растительный материал для изоляции патогена был собран в различных областях РФ. Выделение бактерий проводили методом посева на картофельный агар (КА) или питательный бульон с дрожжевым экстрактом (NBY), а также использовали селективную для пектолитических бактерий среду Логана. Видовую идентификацию изолятов проводили по физиологическим признакам и с использованием ПЦР метода. Для этого, единичные колонии суточной культуры каждого изолята суспендировали в 100 мл стерильной дистиллированной воды и выделяли ДНК с использованием набора «Проба-ГС» («ДНК-Технология», Москва) согласно рекомендациям производителя. ПЦР проводили с праймерами ADE1/ADE2 специфичными к фрагменту гена pelD бактерий рода Dickeya. Стандартная реакционная смесь ПЦР содержала 75 мкМ Трис – HCl, pH 8,8;
20 мкМ (NH4)2SO4;
0,01% Твин 20;
200 мкМ каждого dNTP;
20 пМ каждого праймера;
2 мкМ MgCl2;
1 единицу Smar Tag ДНК полимеразы (Диалат, Москва) и 2 нг целевой ДНК. Окончательный обьем смеси составлял 25 мкл. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» (ДНК – Технология, Москва) при следующих температурно – временных параметрах:
начальная денатурация (950С, 15 мин);
последующие 35 циклов денатурация (950С, 1,5 мин), отжиг (500С, 60 сек) и элонгация (720С, 1 мин);
завершающая элонгация (720С, 15 мин). После окончания амплификации 10 мкл амплифицированных продуктов разделяли в 1,5 % агарозном геле с бромистым этидием в буфере TBE 0,5X и документировали при помощи системы UVP (Великобритания). Выделенные и проанализированные штаммы Dickeya spp.
хранили в 15%-ном глицерине при – 70оС и в стерильной воде при комнатной температуре в четырехкратной повторности.
Биохимический анализ штаммов проводили с использованием тест – системы стрип АPI 20Е (производство bioMrieux, Франция). Для определения вирулентных свойств бактерий проводили инокуляцию 17 растений из различных семейств. Заражение растений проводили уколом в пазуху листа, в концентрации бактерий 108 кл/мл. Антибактериальную активность фитобактериомицина по отношению к штамму D9 D. dianthicola оценивали in vitro. В стерильную 96-ти луночную планшету для ИФА вносили среду D-PEM, фитобактериомицин в различных концентрациях и бактерии в концентрации 102 кл/мл. Инкубацию проводили в течение 17 часов при температуре 270С, регистрируя каждый час оптическую плотность суспензии бактерий.
Для получения иммуноглобулинов проводили иммунизацию кроликов породы «Шиншилла» бактериальной суспензией D. dianthicola штаммов D9 и D17. Иммунизацию проводили по схеме, применяемой в отделе биотехнологии ГНУ ВНИИКХ для получения антисывороток к бактериальным антигенам.
Титр полученных антисывороток определяли методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием ослиных антител против глобулинов кролика, меченых пероксидазой производства НИИЭМ им. Н.Ф.
Гамалея (г. Москва). Коньюгаты получали с использованием перйодатного метода. При постановке ИФА использовали методику, адаптированную для идентификации бактерий (Варицев и др., 2003). При постановке Био – ИФА перед внесением антигенов в лунки вносили селективную среду D – PEM, с последующим нанесением на ее поверхность 20 мкл минерального масла, с целью создания анаэробных условий. Оптическую плотность продуктов ферментативной реакции в ИФА измеряли с помощью вертикального микропланшетного фотометра (Bio-Rad, модель 680) при длине волны 450 нм.
Реакцию двойной иммунодиффузии в агаре проводили по стандартной методике (Воробьева, 2006).
При проведении ПЦР в реальном времени использовали праймеры ADE1/ADE2 (Darrasse et al., 1994) и подобранную нами пробу ADE3. Реакцию проводили с использованием набора MasterMix (ООО «Диалат Лтд», Москва) и детектирующего амплификатора «iCycler iQ5» (Bio-Rad Laboratories, США).
Температурно-временной профиль составлял: первый цикл: начальная денатурация – 960С, 5 мин;
последующие 35 циклов: денатурация – 950С, сек, отжиг – 57,70С, 45 сек (анализ результатов в реальном времени на каждом цикле), элонгация 720С – 1мин. Для повышения достоверности диагностики методом ПЦР в реальном времени, в процессе пробоподготовки использовали краситель пропидиум моноазид (PMA, Biotium Inc, Hayward, Калифорния, США, кат. номер 89139-058), способный связывать ДНК мертвых клеток бактерий после фотоактивации, тем самым препятствуя амплификации.
Для проведения анализа секвенирования и изучения генетического полиморфизма бактерий рода Dickeya была использована коллекция штаммов выделенных нами из различных областей России. Анализ штаммов методом мультилокусного секвенирования (MLST) проводили с использованием восьми различных генов. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом генетическом анализаторе DNA Analyser 3730 (фирмы Applied Biosystems) c использованием набора BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (фирмы Applied Biosystems), согласно рекомендациям производителя.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Straz, SPSS 15 и Statistica 5.5.
Глава III. Выделение и идентификация возбудителей черной ножки из рода Dickeya.
3.1. Выделение и идентификация штаммов возбудителей методом ПЦР со специфичными праймерами Из растений, имеющих типичные симптомы черной ножки, полученных из различных областей РФ, было выделено более 500 бактериальных изолятов.
На среде КА с генцианвиолетом ряд колоний имели вид сгустка бледно - белого цвета в центре с прозрачной слизистой каймой. В случае выделения на среду NBY колонии были плоскими и практически прозрачными. Имеющие такой внешний вид колонии отсевали на среду Логана с полипектатом натрия.
Бактерии, образовавшие лунки в пектатном геле в основном принадлежали к роду Pectobacterium, но в результате проведения дальнейших тестов были также обнаружены колонии бактерий, принадлежавшие роду Dickeya.
В результате проведенного ПЦР анализа (рис. 1) со специфичными праймерами, было показано, что 15 изолятов, выделенных из клубней картофеля полученных из Московской, Воронежской и Нижегородской областей, принадлежат к роду Dickeya. Они были использованы для определения видовой принадлежности, а также проведения дальнейших экспериментов.
Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК изолятов Dickeya spp. со специфичными праймерами ADE1;
ADE2. 1 – штаммы D9, D8, D17, D33, D1, D9Tr, D9B, DFil, D231, D232, D233, D234, D3B1, D3B2, D3B3 соответственно, 16 – отрицательный контроль (Еса 393, Pectobacterium atrosepticum), 17 – положительный контроль (штамм 2116 D.
dianthicola, коллекция Plant Research International, Нидерланды). 3.2. Биохимические свойства штаммов Dickeya spp. В результате проведенных реакций было установлено, что все используемые штаммы имели положительную реакцию на пектолитическую активность, –галактозидазу, утилизацию цитрата, образование ацетоина. Отрицательная реакция у всех штаммов наблюдалась в реакции на окрашивание по Граму, лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу, образование сероводорода, уреазу. Все штаммы имели свойство образования кислоты из D-глюкозы, D маннита, L-рамнозы, D-сахарозы, амигдалина, L-арабинозы. При постановке реакции на аргининдигидролазу штаммы D. dianthicola D1, D9B, D17, 3B2, D9, D9Tr, 3B1, D33, в том числе и штамм D. solani DFil имели отрицательную реакцию, а штаммы D. dianthicola D8 и 3B3 реагировали положительно. В реакции на триптофандизаминазу положительный результат был установлен со штаммом D8, реакция с остальными штаммами была отрицательной. Штаммы D. dianthicola D17, D8, D9, 3B2, D9, D9Tr, 3B1, 3B3, D33 образовывали индол, а штаммы D. solani D Fil и D. dianthicola D1, D9B – нет. Способность к гидролизу желатина наблюдалась у всех штаммов, кроме трех штаммов D. dianthicola D17, D33 и 3B1. Четыре штамма D. dianthicola D9B, D17, D9Tr, D33 имели способность к образованию NO2. Cпособностью к образованию кислоты из инозита обладали два штамма D. dianthicola D8 и D17, из D-сорбита три штамма D. dianthicola D1, D9B, D9Tr и штамм D. solani D Fil. Штаммы 3B1, 3B2, D9 образовывали кислоту из D-мелибиозы.
Таким образом, нами изучены основные физиологические свойства российской коллекции штаммов D. dianthicola и D. solani. Вариабельность штаммовых реакций не позволяют выделить физиологические тесты, которые можно надежно использовать для видовой идентификации. Основным методом для достижения этой цели является молекулярно-генетический метод.
3.3. Определение круга растений - хозяев D. dianthicola и D. solani Искусственное заражение таких растений как гвоздика, георгин, ячмень, пшеница, клевер, лен, люпин, овес, вика, рапс, тритикале не дало каких либо видимых симптомов поражения как при заражении растений штаммами D.
dianthicola, так и при заражении штаммом D. solani.
Растения ириса и картофеля поражались штаммами D9, D33, D Fil и Eca 393. На растениях картофеля через 4 – 5 дней в месте инокуляции формировалось темное расплывающееся по стеблю пятно. В случае заражения растений штаммом вида D. solani распространение патогена происходило намного интенсивнее. Растения ириса, во всех случаях заражения, за исключением контроля, в месте введения суспензии через 2 – 3 дня чернели с образованием бактериального экссудата. Растения томата и табака не поражались штаммом Eca 393, но поражались штаммами D9, D33, D Fil. На растениях томата при заражении штаммами D. dianthicola в том месте, где производили инокуляцию, растение ломалось и увядало. При заражении штаммом D. solani вследствие закупорки сосудов формировались воздушные корни. На растениях табака, при заражении штаммами D9, D33 и D Fil через 3 – 4 дня стебель темнел и терял тургор параллельно с распространением бактерий от места укола к его верхней части.
Полученные нами результаты позволяют включить в список известных растений-хозяев для D. dianthicola и D. solani табак и ирис. Это расширяет наши представления о циркуляции патогена и показывает целесообразность пространственной изоляции картофеля от указанных выше видов растений.
3.4. Оценка антибактериального действия фитобактериомицина по отношению к бактериям рода Dickeya Биопрепарат фитолавин, ВРК (действующее вещество - антибиотик фитобактериомицин, ФБМ) зарегистрирован на картофеле против черной ножки (возбудитель – P. atrosepticum). Представляло интерес оценить антибактериальную активность ФБМ (Бушкова, Лазарев, 1984) по отношению к D. dianthicola.
Культивирование бактерий D. dianthicola (штамм D9) в жидкой питательной среде D-PEM содержащей ФБМ в различных концентрациях позволило установить, что при концентрациях 160, 80 и 40 мг/л в течение всего времени инкубации (17 часов) оптическая плотность суспензии бактерий оставалась на уровне фоновых значений, то есть происходило сдерживание размножения бактериального патогена (рис. 2). При концентрациях менее мг/л сдерживание роста бактерий происходило в меньшей степени, либо оптическая плотность не отличалась от контроля.
0, Оптическая плотность, OD 160 мг/л 0, 80 мг/л 0, 40 "мг/л" 0, 20 мг/л 0, 10 мг/л 0, 5 мг/л 0, 2,5 мг/л 0, 1,25 мг/л 0, 0 мг/л 123 456 78 9 10 11 12 13 14 15 16 Период инкубации, часы Рис. 2. Рост культуры D. dianthicola, штамм D9 в жидкой среде D-PEM при различных концентрациях фитобактериомицина Полученные данные позволяют предполагать, что рекомендованный для защиты картофеля от P. atrosepticum препарат фитолавин, ВРК (д.в. – фитобактериомицин), будет также эффективен против новых патогенов черной ножки – D. dianthicola и D. solani. Это предположение, конечно, требует дальнейшей экспериментальной проверки в вегетационных и полевых опытах.
Глава IV. Диагностика возбудителя черной ножки Dickeya spp.
серологическим методом.
4.1 Получение иммуноглобулинов гомологичных бактериальным штаммам D. dianthicola и создание на их основе ИФА – диагностикума.
В результате проведения серии подкожных и внутримышечных инъекций кроликам нами были получены иммуноглобулины и пероксидазные конъюгаты к штаммам D. dianthicola D9 и D17. Для использования иммуноглобулинов в целях практической диагностики оценивали реакцию двух видов антител в концентрациях против 4 штаммов Dickeya в трех повторностях.
Иммуноглобулины к штамму D9 в среднем обеспечивали большую оптическую плотность продукта ИФА (о.п. – 0,999), по сравнению с антителами к штамму D17 (о.п. – 0,682).
В среднем оба диагностикума достоверно отделяли 4 штамма D.
dianthicola от двух других видов фитопатогенных бактерий C. michiganensis sbsp. sepedonicus и P.carotovorum subsp. carotovorum паразитирующих на картофеле. Между реакцией 4-х штаммов Dickeya имелись определенные различия, так при тестировании в качестве антигена штамма D17 оптическая плотность продукта ИФА была достоверно выше при использовании обоих видов антител, чем у трех других штаммов. Было показано, что оптимальной концентрацией иммуноглобулинов является 3 мкг/мл.
В другом эксперименте штаммы D. dianthicola, P. atrosepticum, P.
carotovorum subsp. carotovorum тестировали в ИФА с диагностикумами к D.
dianthicola и P. atrosepticum. Результаты ИФА показали, что D. dianthicola, Pa и Pcc являются серологически обособленными видами. Так, штаммы D.
Dianthicola и Pa реагировали лишь с гомологичными диагностикумами и не давали перекрестных реакций. Штаммы Pcc не давали положительных результатов с двумя вышеназванными антителами (табл. 1).
Таким образом, было показано, что три различных возбудителя черной ножки картофеля могут быть легко различимы с помощью ИФА.
Порог чувствительности ИФА при диагностике D. dianthicola в буфере и в клубневом экстракте не различался и был на уровне 2х104-105 кл/мл. Это свидетельствовало о высокой специфичности иммуноглобулинов, т.е. не наблюдалось повышение «фона» реакции за счет взаимодействия иммуноглобулинов и антигенов сапротрофной микробиоты клубневого экстракта, а также об отсутствии в экстрактах клубней веществ ингибирующих прохождение реакции. Полученные данные свидетельствуют о возможности диагностики Dickeya spp. методом ИФА непосредственно в клубневом экстракте не прибегая к трудоемкому процессу выделения бактерий в чистую культуру.
Таблица Реакция возбудителей черной ножки картофеля с различными ИФА - диагностикумами (оптическая плотность продукта при 450 нм) Вид Штамм ИФА – диагностикум к штамму D. dianthicola P. atrosepticum D9 D17 Eca 393 Eca 31a Eca D. dianthicola D9 0,832c 0,657b 0,026a 0,016 a 0,018 abc D8 0,871d 0,638b 0,021a 0,021 a 0,015 ab D17 0,759b 0,662b 0,020a 0,015 a 0,010 ab D33 0,827c 0,650b 0,025a 0,028 a 0,026 abc P. atrosepticum Eca 21 0,020 0,023a 0,300b 0,118 c 0,229 d Eca 393 0,030 0,020a 0,841c 0,300 d 0,546 e Eca 31 0,047 0,017a 0,320b 0,128 c 0,256 d P. carotovorum P39 0,013 0,013a 0,008a 0,009 ab 0,009 a subsp. carotovorum P3-2 0,038 0,023a 0,030a 0,053 a 0,010 ab P3-3 0,030 0,020a 0,026a 0,014 ab 0,015 ab Отрицательный Cms204 0,037a 0,019a 0,024a 0,034 ab 0,021 abc контроль C.m.sepedonicus Примечание: Между вариантами, обозначенными одинаковыми буквами при сравнении в пределах столбцов нет статистически достоверных различий по критерию Дункана при 95%- м уровне вероятности.
Качественные антигенные различия между штаммами D. dianthicola и D.
solani оценивали по характеру дуг преципитации в реакции двойной иммунодиффузии в агаре. Результаты показали практически во всех комбинациях антиген-антитело реакцию полной идентичности. Антитела к D.
dianthicola давали реакцию с D. solani. Таким образом, в результате проведенных исследований наличие у патогенов серологических групп установлено не было.
4.2 Усовершенствование метода иммуноферментного анализа для диагностики клубневой инфекции Dickeya spp.
Использование БИО-ИФА показало, что, так же как и в варианте с обычным ИФА не наблюдалось различий оптической плотности продукта при внесении бактерий в буфере и клубневом экстракте. Чувствительность БИО ИФА по сравнению с обычным вариантом «сэндвич-метода» была на 4 порядка выше (табл. 2).
Таким образом, использование БИО-ИФА позволяет значительно повысить чувствительность диагностики зараженности клубней картофеля возбудителями «черной ножки» из рода Dickeya непосредственно в экстракте клубней без предварительного выделения на питательные среды. Так как, инфекция в семенном материале чаще всего находится в латентной форме, использование данного метода позволит повысить достоверность результатов.
Таблица Тестирование D. dianthicola, штамм D9 в ИФА Концентрация Оптическая плотность продукта ИФА, 450 нм патогена, кл/мл Обычный ИФА Био - ИФА 2х107 х 2,932х 3, 2х106 2,993х 2,898х 2х105 2,987х 3,020х 2х104 0,854х 2,831х 2х103 2,819х 0, 2х102 2,713х 0, 2х101 2,697х 0, 2х100 2,474х 0, Фон/Среда 0,336 0, Отрицательный контроль Eca21 0,308 0, Отрицательный контроль Отрицательный контроль - 0,310 0, X.c. Dach Порог достоверности 0,477 0, положительных результатов (Хсред. фона + 3Е) Примечание: «х» - значения выше порога достоверности положительных результатов Глава V. Диагностика D. dianthicola методом ПЦР в реальном времени 5.1 Подбор праймеров и пробы, оптимизация условий проведения реакции Для проведения ПЦР в реальном времени использовали праймеры ADE1/ADE2 специфичные к фрагменту гена pelD Dickeya spp. и разработанную нами пробу ADE3. При оптимизации условий реакции было установлено, что оптимальной температурой отжига являлось значение, 57,70С. Наилучшие результаты были получены при использовании концентрации пробы 5 пкмоль в расчете на одну реакцию.
В результате определения зависимости порогового значения цикла в ПЦР в реальном времени от концентрации клеток было показано, что с увеличением концентрации клеток D. dianthicola происходило уменьшение пороговых значений цикла (Сt). Полученные данные позволили построить калибровочную кривую зависимости Сt от концентрации клеток патогена (рис. 3).
Пороговые значения циклов, Сt y = -3,37X + 45, y =2-3,37X + 45, R = 0, R2 = 0, Log КОЕ/мл Рис. 3. Зависимость порогового значения цикла (Сt) от исходной концентрации клеток D. dianthicola Эффективность предложенной диагностической системы ПЦР в реальном времени рассчитанная по формуле Е = 101/a, где 1/a – показывает, на сколько порядков изменится количество ДНК за один цикл реакции (Ребриков Д.В., и др., 2009) составила 1,98, что свидетельствовало об увеличении количества копий ДНК за каждый цикл в 1,98 раза. Это является достаточно высоким значением и свидетельствует о перспективности данной тест-системы для практического применения.
Чувствительность и специфичность разработанной пробы ADE была оценена в тестах с ДНК бактерий различных видов рода Dickeya голландской коллекции, любезно предоставленных д-ром van der Volf (Plant Research International, Wageningen, the Netherlands) и штаммов Pectobacterium spp.
используемых в качестве отрицательного контроля (Ecc 3, Ecc 36 и Eca 393).
Достоверное превышение фонового уровня флуоресценции происходило на 22 м цикле ПЦР реакции. При использовании ДНК 20 типовых штаммов рода Dickeya и штамма D9 D. dianthicola, наблюдалась родоспецифичная реакция.
В результате проведенного эксперимента показано, что проба ADE3 в сочетании с праймерами ADE1/ADE2 может быть использована для достоверного выявления бактерий рода Dickeya, а в дальнейшем для создания на ее основе диагностической системы для практического применения.
5.2 Изучение возможности повышения достоверности диагностики Dickeya dianthicola При идентификации бактерий методом ПЦР, в случае положительной реакции выделение патогена в чистую культуру на питательную среду удается не всегда. Причиной таких «ложноположительных» результатов может быть ДНК мертвых клеток, которая амплифицируется в ПЦР также как и ДНК живых клеток. Это ограничивает применение ПЦР при проведении фитосанитарной экспертизы, требующей подтверждения жизнеспособности патогена.
Недавно для предотвращения амплификации ДНК мертвых клеток было предложено использование красителя пропидиум моноазида (PMA), способного к связыванию ДНК (Nocker et al., 2007). Это вещество, проникая лишь через поврежденные мембраны мертвых клеток, после обработки интенсивным светом связывает цепи ДНК ковалентной связью. Это делает затруднительным амплификацию ДНК при ПЦР в реальном времени, что выражается в увеличении значения порогового цикла Ct. Различия реакции живых и мертвых клеток в ПЦР в реальном времени выражают в Сt = Сt мертвых клеток - Сt живых клеток (Kobayashi et al., 2010). Этот подход был апробирован для разделения живых и мертвых клеток Listeria monocytogenes (Rudi et al., 2005), Salmonella enterica (Nocker, Camper, 2006).
На первом этапе исследований живые и мертвые клетки бактерий при пробоподготовке до выделения ДНК подвергали воздействию различных концентраций РМА. Наибольшие значения Сt (Сt мертвых клеток - Сt живых клеток) наблюдали при концентрациях РМА 25мМ и выше. Отсутствие достоверных различий между 25 мМ, 50 мМ и 100 мМ позволило выбрать концентрацию 25 мМ как оптимальную (табл. 3). Анализ Ct при обработке РМА живых клеток, показал, что разница количества циклов в сравнении с контролем была не существенна.
Таблица Изменение значений порогового цикла (Ct) при использовании различных концентраций РМА Концентрация Ct Ct РМА жив.
РМА (PMAмертв. (PMAмертв. – ДМСО жив.
– PMA жив.) – ДМСО жив.) 5мМ 0,24 a 0a 0,4 а 10мМ 5,71 b 2,67 b 0,4 а 25мМ 11,11 c 11,30 cd 1,07 а 50мМ 11,49 c 12,54 cd 1,94 а 100мМ 11,09 c 10,20 c 0,94 а Испытание различной продолжительности фотоактивации (табл. 4), показало, что наибольшие значения Ct были установлены при экспозиции минут. Увеличение и уменьшение времени экспозиции приводило к снижению Ct. Таким образом, экспозиция 5 минут может быть рекомендована для дальнейшего использования. Таблица Значения порогового цикла Ct в ПЦР в реальном времени при тестировании живых и термоинактивированных клеток D.dianthicola при различных экспозициях фотоактивации PMA Период Ct Ct Ct (PMAмертв.– (PMAмертв. (PMAмертв.
фотоактивации ДМСО мертв.) – ДМСО жив.) – PMA жив.) PMA, мин 1,5 6,14a 5,58a 7,00a 5,0 9,58b 9,97b 12,06b 10,0 7,74a 8,94b 8,81a Таким образом, показано, что при проведении ПЦР в реальном времени сравнение Ct для обработанных и необработанных РМА в процессе пробоподготовки двух частей растительного образца позволяет установить наличие жизнеспособного возбудителя черной ножки картофеля D. dianthicola.
Глава VI. Генетический полиморфизм видов и штаммов Dickeya В результате секвенирования были расшифрованы последовательности ДНК российской коллекции бактерий рода Dickeya по восьми изучаемым генам. Все последовательности были выровнены и проанализированы на сходство с использованием сервера BLAST.
При проведении филогенетического анализа всех штаммов Российской коллекции по изученным генам (ген аконитатгидралазы 1 (aconitate hydrase 1 acnA), глицеральдегидфосфатдегидрогеназы А (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A - gapA), изоцитратдегидрогеназы (isocitrate dehydrogenase icdA), малатдегидрогеназы (malate dehydrogenase - mdh), маннитолфосфатдегидрогеназы (mannitol-1-phosphate dehydrogenase - mtID), глюкозофосфатизомеразы (glucose-6-phosphate isomerase - pgi), ген Тау и гамма субъединиц ДНК полимеразы 3 (DNA polymerase III tau and gamma subunits dnaX), ген пектатлиазы (pectat lyase - pelD)), было установлено, что все штаммы, кроме DsFil и Dd9L, тесно кластеризовались с представительными последовательностями известных штаммов D. dianthicola, в том числе со штаммом Ech600, ошибочно указанным в Генбанке как D. dadantii.
Анализ последовательностей фрагментов гена dnaX (рис. 4), показал, что штамм DsFil кластеризовался со штаммами группы “solani”, выделенными в Европе, а по последовательностям фрагментов других генов (для которых не было доступных последовательностей “solani”) – находился между D.
dianthicola и D. dadantii.
Таким образом, мы впервые определили последовательности 7 генов для группы “solani”, которые могут быть использованы для разработки специфичных праймеров для ПЦР диагностики этого опасного вида бактерий.
D. dianthicola D. " solani" D. dieffenbachiae 67 D. zeae 87 D. dadantii 62 D sp. IPO D. chrysanthemi D. zeae D. paradisiaca P atrosepticum IPO P atrosepticum IPO 0. Рис. 4. Филогенетическое дерево для последовательностей фрагментов гена dnaX показывающее все геномовиды рода Dickeya Эволюционная история определена с помощью метода ближнего соседа (Saitou, Nei, 1987). Процент повторяющихся деревьев с совместной группировкой таксонов указан по результатам бутстреп анализа возле соответствующих узлов дерева (Felsenstein, 1985). Эволюционные расстояния определены при помощи метода максимального сложного правдоподобия (Maximum Composite Likelihood) (Tamura, Nei, Kumar, 2004). Филогенетический анализ проведен с помощью пакета программ MEGA4 (Tamura, Dudley, Nei, Kumar, 2007) В зависимости от анализируемого гена группа“solani” c видами рода Dickeya имеет разное генетическое родство. Так, для генов icdA, mdh, mtID, pgi, pelD, группа “solani” является сестринской для одной или более групп вида D.
dadantii. Для генов dnaX, ancA группа “solani” является сестринской для вида D.
dianthicola. Эти данные свидетельствуют о том, что группа “solani” могла появиться в результате горизонтального переноса части генов от штамма D.
dianthicola к D. dadantii при совместном заражении картофеля. Наибольшее генетическое расстояние между группой “solani” и видами D. dianthicola и D.
dadantii было найдено для фрагментов генов pelD (рис. 5), mdh (рис. 6) и dnaX, что указывает на эти гены, как на кандидаты для выбора молекулярного маркера группы “solani”.
D.dianthicola D D.dianthicola D D.dianthicola D9b D.dianthicola D9L D.dianthicola D33(2) D.dianthicola D3b D.dianthicola D3b D.dianthicola D3b D.dianthicola D23- D.dianthicola D23- D.dianthicola D23- D.dianthicola D D.dianthicola D D.dianthicola D D.dianthicola D23- 306526293 Dickeya dadantii X17284.1 Erwinia chrysanthemi AJ132101.1 Erwinia chrysanthemi(strai...
D.solani DFil 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0. Рис. 5. Филогенетическое дерево для последовательностей 19 фрагментов гена pelD D. dianthicola D3b EF550805.1 D. dadantii Ech GQ891984.1 D. dianthicola CFBP: D. dianthicola D3b D. dianthicola D3b D. dianthicola D23- D. dianthicola D23- D. dianthicola D23- D. dianthicola D9b D. dianthicola D9TR D. dianthicola D D. dianthicola D D. dianthicola D D. dianthicola D D. dianthicola D EF550758.1 D. dadantii Ech CP002038.1 D. dadantii GQ891978.1 D. dadantii CFBP: GQ891979.1 D. dadantii CFBP: GQ144380.1 Dickeya sp. ICMP 96 GQ891981.1 D dieffenbachiae CFBP: GQ891973.1 Dickeya sp. CITA A EF550766.1 Brenneria lupinicola EluW3L EF550765.1 D. dadantii Ech EF550763.1 D. dadantii Ech GQ891975.1 Dickeya sp. CITA Q GQ891974.1Dickeya sp. CITA Q D. solani DFil EF550774.1 D. dadantii Ech 74 CP001655.1 D. zeae Ech GQ891972.1 Dickeya sp. CFBP EF550764.1 D. dadantii Ech GQ891980.1 Dickeya sp. CFBP EF550773.1 D. dadantii Ech FJ895839.1 E. chrysanthemi ATCC EF550762.1 D. dadantii Ech GQ144382.1 Dickeya sp. ICMP 49609491 E. car. subsp. atr. SCRI HM114269.1 Pectobacterium sp. IR-KA HM114271.1 Pectobacterium sp. IR-S 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0. Рис. 6. Филогенетическое дерево для последовательностей 40 фрагментов гена mdh Штаммы D. dianthicola отличались высоким внутривидовым генетическим сходством не только для Российской популяции, но и для всех последовательностей, помещенных в Генбанк. Показатель эволюционного (генетического) расстояния для данного вида находился в пределах от 0 до 0,004.
Штаммы D. dadantii имели внутривидовое генетическое расстояние от 0,002 до 0,100, соизмеримое с межвидовым расстоянием между D. dianthicola и D. dadantii. Эволюционные расстояния между этими двумя видами и группой “solani” находились в тех же пределах, подтверждая, таким образом, видовой статус данной группы.
Только некоторые последовательности изученных генов показали незначительное разнообразие среди штаммов D. dianthicola выделенных в России, с высоким сходством со штаммом Ech600 из батата, выделенным проф.
Дикеем (Dickey) в США. Малое разнообразие среди штаммов этого вида позволяет сделать предположение о недавней интродукции патогена как клональной группы штаммов. Вероятнее всего, они распространялись с посадочным материалом картофеля без перехода на дополнительные растения хозяева.
Малое значение коэффициента дифференциации для всех генов (от 0, до 0,300), кроме pelD (0,901) и dnaX (0,528) указывает на то, что видовая структура данного рода недостаточно определена, и в пределах одного вида, могут быть штаммы, имеющие эволюционное расстояние сопоставимое с межвидовым.
ВЫВОДЫ 1. В результате бактериологического анализа образцов картофеля пораженных черной ножкой из различных регионов нами впервые в РФ обнаружены фитопатогены D. dianthicola и D. solani.
2. Результаты искусственного заражения показали, что D. dianthicola и D. solani поражают помимо известных видов растений-хозяев (картофель, гвоздика, томат, цикорий, артишок, георгина, каланхоэ) табак и ирис. Это указывает на целесообразность пространственной изоляции картофеля от указанных выше видов растений.
3. Испытание биохимических свойств штаммов D. dianthicola и D.
solani не позволило выделить тесты, пригодные для видовой идентификации.
4. Разработанный ИФА – диагностикум позволяет выявлять бактерии D. dianthicola в клубневом экстракте. Нижний порог чувствительности варьировал в случае обычного варианта ИФА в пределах от 105 до 2х104 кл/мл, а для Био–ИФА – достигал 2х100 кл/мл.
5. Подобрана флуоресцентная проба для проведения количественной оценки присутствия в анализируемом образце бактерий рода Dickeya методом ПЦР в реальном времени.
6. Использование при пробоподготовке вещества пропидиум моноазид (PMA) позволяет определять методом ПЦР в реальном времени наличие в образце жизнеспособного возбудителя D. dianthicola, что в дальнейшем может быть использовано для повышения достоверности практической ДНК-диагностики.
7. Анализ коллекции штаммов Dickeya по восьми различным генам, показал, что штаммы D. dianthicola имеют высокое генетическое сходство, как среди российской популяции, так и среди последовательностей размещенных в Генбанке, что позволяет предположить преимущественное распространение патогена как гомогенной клональной группы с посадочным материалом картофеля.
8. Впервые были определены последовательности 7 генов для D.
solani, которые могут быть использованы для разработки специфичных праймеров для ПЦР диагностики этого опасного вида бактерий.
9. Наибольшее генетическое расстояние между группами D. solani и D. dianthicola, D. dadantii выявлено для генов pelD, mdh и dnaX что указывает на возможность использования их для разработки молекулярного маркера «D.
solani».
10. Фитобактериомицин в концентрациях свыше 40 мг/л при культивировании in vitro достоверно снижал оптическую плотность бактериальной суспензии D. dianthicola по отношению к контролю, что позволяет рекомендовать его для дальнейших вегетационных и полевых опытов с целью защиты картофеля от черной ножки, вызванной видами Dickeya.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для оценки реальной распространенности в России возбудителей черной ножки картофеля D. solani и D. dianthicola необходим широкий мониторинг, для чего рекомендуется использовать ИФА-диагностикумы, ПЦР в реальном времени и секвенирование генов pelD, mdh и dnaX.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Игнатов А.Н. Основные направления развития методов диагностики фитопатогенных микроорганизмов / Игнатов А.Н., Корнев К.П., Пунина Н.В., Мокрякова М.В., Мазурин Е.С., Карлов А.Н. // Доклады ТСХА, Рос. гос. аграр.
ун-т - МСХА им. К.А. Тимирязева. Москва, 2009. Вып. 281. – С. 22-24.
2. Карлов А. Н. Dickeya dianthicola - новый для России бактериальный патоген картофеля / Карлов А.Н., Зотов В.С., Пехтерева Э.Ш., Матвеева Е.В., Джалилов Ф.С., Фесенко И.А., Карлов Г. И., Игнатов А.Н. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2010. Вып. 3.-С.134-141.
3. Карлов А.Н. Диагностика бактериального патогена картофеля Dickeya dianthicola / Карлов А.Н., Игнатов А.Н., Карлов Г.И., Пехтерева Э.Ш., Матвеева Е.В., Шаад Н.В., Варицев Ю.А., Джалилов Ф.С. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2011. Вып. 3.-С.38-48.