Размножения и поддержания жизнеспособности phytophthora infestans в иранском голестане и москве при применении фунгицидов и растительных экстрактов

На правах рукописи

ЗОЛФАГАРИ АМИР СТРАТЕГИИ РАЗМНОЖЕНИЯ И ПОДДЕРЖАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ PHYTOPHTHORA INFESTANS В ИРАНСКОМ ГОЛЕСТАНЕ И МОСКВЕ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ФУНГИЦИДОВ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 03.02.12 – микология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева Научный Доктор биологических наук, профессор кафедры защиты растений РГАУ–МСХА имени К.А.Тимирязева руководитель:

Смирнов Алексей Николаевич Официальные Доктор сельскохозяйственных наук, заведующая отделом защиты растений и грибов ГНУ ВПО ВНИИ оппоненты:

овощеводства Алексеева Ксения Леонидовна Кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела защиты картофеля от болезней и вредителей ГНУ ВПО ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха Деревягина Марина Константиновна Ведущая организация Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится 28 июня 2012 г. в 13 00 на заседании диссертационного совета Д 220.043.04 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Учёный совет РГАУ – МСХА, тел/факс 8(499) 976–24–92.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Н.И. Железнова РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан «25» мая 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, д.б.н., профессор В.В. Гриценко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В Иране оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary способен вызывать потери урожая картофеля от фитофтороза 20%, в эпифитотийные годы– до 80% (Zargarzadeh et al., 2008). Тем не менее, о фитофторозе в Иране почти ничего не известно, поэтому изучение фитофтороза картофеля и томата в этой стране имеет существенное значение также как и для России. В Иране необходимо уточнять инфекционный цикл патогена, его вредоносность по сравнению с другими болезнями картофеля и томата для оптимизации защитных мероприятий. Для России полученные в жарких Иранских условиях данные могут использоваться как модельные, чтобы оценивать фитофторозную опасность в годы с аномально жарким климатом.

В настоящее время во многих развитых и развивающихся странах приходят к выводу о необходимости экологизации защиты растений.

Применение биопестицидов растительного происхождения может быть очень перспективно в этом направлении.

Новизна. Впервые показано, что у Иранских полевых популяций возбудителя реализуются бесполые стратегии размножения с различной интенсивностью образования зооспорангиев и проявления агрессивности.

Впервые для Ирана выявлены оба типа спаривания патогена Ph. infestans, методики введения и поддержание их в чистой культуре. Усовершенствована методика определения и классификация ооспор Ph. infestans типичной и нетипичной морфологии по размеру, толщине клеточной стенки, наличию антеридия, форме оогония. Впервые обоснована высокая биологическая (до 90,11%) и хозяйственная (до 82,72%) эффективность против фитофтороза экстрактов из растений семейства Маковые (чистотела большого и мачка купноцветкового).

Практическая ценность работы. Эстракты чистотела большого и мачка крупноцветкового на 27,4–53,9% снижают развитие фитофтороза.

Предложенная методология оценки стратегий размножения и агрессивности полевых популяций возбудителя фитофтороза позволяет оптимизировать применение средств защиты на посадках картофеля в России и Иране.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 4–ой международной научной конференции «Микология, Микотоксикозы и Микозы» (апрель, 2011 г., Сербия, г. Нови Сад), на международной научной конференции молодых учённых и специалистов РГАУ–МСХА имени К.А.

Тимирязева (июнь, 2011 г.), на научной практической конференции в РГАУ– МСХА имени К.А. Тимирязева «Проблемы развития АПК и сельских территорий в ХХI веке» (декабрь, 2011 г.) и на 2–ом научно–практическом совещании «Генетические и агротехнологические ресурсы повышения качества продовольственного и технического картофеля» в МГУ (март, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

-1 Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей главы «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы» (53 источника – на русском языке, 74 источника – на английском языке, 43 источника – на фарси и других языках). Общий объем рукописи 239 стр., содержит 51 таблицу, 54 рисунка.

Цель работы – определение стратегий размножения и поддержания жизнеспособности оомицета Ph. infestans на территории Иранского Голестана и лаборатории защиты растений (ЛЗР) РГАУ–МСХА имени К.А. Тимирязева для оптимизации защитных мероприятий против фитофтороза картофеля и томата.

Для установления поставленной цели решали следующие задачи:

1. Определить стратегии размножения и поддержания жизнеспособности полевых популяций Ph. infestans на картофеле и томате в Иранском Голестане, против которых применяли фунгициды Equation Pro (ВДГ), Ридомил Голд (СП, ВДГ), Манкоцеб (СП) и Хлорокись меди (СП).

2. Определить типы спаривания, способность к формированию ооспор различной морфологии, устойчивость к металаксилу и агрессивность изолятов Ph. infestans в Иранском Голестане.

3. Провести оценку эффективности экстрактов из растений семейства Маковые чистотела (Chelidonium majus) и мачка (виды рода Glaucium) на посадках картофеля в ЛЗР от фитофтороза.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Рассмотрены основные болезни картофеля и томата в Иране, с учетом географических и климатических особенностей провинций этой страны.

Подробно проанализированы жизненный и инфекционный циклы Ph. infestans на картофеле и томате. Даны критерии оценки морфологии половой стадии – ооспор. Приведены данные по применению экстрактов растений из семейства Маковые для защиты картофеля от фитофтороза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы. Места сбора образцов. В 2009–2011 годах всего 3 255 образцов листьев картофеля и томата, поражённых фитофторозом (2 картофельных и 805 томатных листьев), собрали с полей (0,4–4 га) 7 районов в провинции Голестан в Иране (рис. 1, 2).

-2 Рисунок 1. Распространение фитофтороза картофеля в провинциях Ирана;

Г – Голестан;

А – Ардебиль;

Х – Иранский западный Азербайджан, город Хой;

Д – Хузестан, город Дизфуль.

Рисунок 2. Карта провинции Голестан в Иране. Районы распространения фитофтороза картофеля и томата указаны красными кругами. Y – Yassaghi, K – Kafshgiri, G – Gorgan, S – Sorkhankalate, V – Valikabad, F – Fazelabad, A – Aliabad. Y, K – регионы распространения фитофтороза томата;

G, S, V, F, A – регионы распространения фитофтороза картофеля (http://en.wikipedia.org/wiki/File:Golestan_Map.gif).

В 2011 г. 360 образцов листьев картофеля, поражённых фитофторозом, собрали в полевых мелкоделяночных исследованиях на территории лаборатории защиты растений РГАУ–МСХА имени К.А. Тимирязева.

Для оценки влияния растительных экстрактов на возбудителя -3 фитофтороза картофеля в исследовании использовали 4 экстракта, полученные из видов растений семейства Papaveraceae (Маковые) – Chelidonium majus L.

(чистотел большой), Glaucium grandiflorum Boiss. et Huett (глауциум (мачок) крупноцветковый), G. сontortuplicatum Boiss. (русского названия нет), G. oxylobum Boiss. et Buhse (глауциум остролопастный) в 2009 г. в Иране.

Полевые методы. Маршрутные обследования на картофельных и томатных полях проводили 3 раза за вегетационный период: 1) в период бутонизации (смыкания ботвы в рядках);

2) в конце цветения;

3) перед уборкой урожая. Наблюдения на стационарных участках в Голестане и на территории лаборатории защиты растений (ЛЗР) РГАУ–МСХА имени К.А. Тимирязева в 2011 г. проводили систематически в течение вегетационного периода растений, через каждые 10 суток. В провинции Голестан на картофельных полях – с апреля по 1 июня и на томатных полях – с 1 мая по 1 июля. Результаты учёта фитофтороза картофеля и томата выражали унифицированно в следующих общепринятых показателях: распространённость болезни (Р);

развитие болезни или индекс развития болезни (ИР).

Влияние растительных экстрактов из чистотела (Ch. majus) и мачка (G. grandiflorum) на возбудителя фитофтороза картофеля изучали на территории ЛЗР РГАУ–МСХА имени К.А. Тимирязева в 2011 г. на сортах картофеля Ильинский и Удача на естественном фоне патогена (значительном на территории ЛЗР). В качестве контроля использовали варианты без обработки экстрактами. Для сравнения использовали сходные данные М.Н.С. Аль–Саади с использованием экстрактов Psiadia arabica (растения из сем. Asteraceae;

Аль– Саади М.Н.С, 2009). Определяли распространённость (Р) и развитие (индекс развития болезни, ИР). Для опытных вариантов определяли биологическую и хозяйственную эффективность (Попкова К.В. и др., 1976).

Лабораторные методы. Для определения встречаемости ооспор и зооспорангиев Ph. infestans в листьях картофеля и томата, а также плодах томата использовали метод по обесцвечиванию тканей (Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., 2006). Подсчитывали индексы встречаемости зооспорангиев (ИЗ) и ооспор (ИО) в полевой популяции патогена.

Приготовление исходных водных экстрактов из указанных растений проводили по апробированной методике (Narwal S.S., Tauro P., 1996;

Narwal S.S., 1999). Полученный экстракт использовали для экспериментов в концентрациях 25%, 50%, 100% и 0% (контроль).

Для определения типов спаривания (типов совместимости) изолятов Ph. infestans использовали общепринятую методику (Shaw D.S., 1987) с использованием тестерных штаммов с известными типами спаривания – А1 и А2.

Оценку морфологии и частоты встречаемости ооспор в скрещиваниях in vitro на агаризованных средах проводили на основании критериев, -4 предложенных в работе А.Н. Смирнова и С.А. Кузнецова (2001).

Анализировали морфологию таких признаков как диаметр ооспор, толщина стенки ооспор, наличие антеридия, форма оогония. Для каждого из 4 признаков определяли градации.

Определение устойчивости изолятов Ph. infestans к металаксилу (д.в.

системного действия фунгицида Ридомил, используется как зависимый популяционный маркер) in vitro проводили по методике Р. Шаттока (Shattock R.C., 1988). Выявляли: 1) чувствительные (S), включая малоустойчивые (S/R);

2) среднеустойчивые (R/S);

3) устойчивые (R) изоляты патогена.

Учёты лабораторных опытов по определению компонентов и итогового индекса агрессивности изолятов Ph. infestans проводили в лаборатории сектора фитопатологии кафедры защиты растений РГАУ–МСХА им. К.А. Тимирязева.

По методике (Троицкая Ю.С., 2007;

Смирнов А.Н., 2010, Смирнов А.Н., Антоненко В.В., 2011) определяли компоненты агрессивности: 1) РН (размер некроза);

2) ИС (интенсивность спороношения);

3) ИП (инкубационный период);

4) ЛП (латентный период или период споруляции). На основе этих показателей подсчитывали ИИА (итоговый индекс агрессивности):

ИИА = (РН ИС) / (ИП ЛП).

Лабораторно–полевые методы. Индекс агрессивности (ИА) полевой популяции подсчитывали на основе показателей:

Ph. infestans распространенность (Р), развитие или индекс развития (ИР), а также индекс образования зооспорангиев (ИЗ) по формуле: ИА = (Р ИР ИЗ) / 10 000.

Определение стратегий размножения и поддержания (СР) жизнеспособности (СПЖ) полевых популяций Ph. infestans проводили на основе работы А.Н. Смирнова и С.А. Кузнецова (2006). Стратегии размножения характеризовались следующими распределениями значений индекса образования зооспорангиев (ИЗ): С (слабые) (0,1–20,0), Б (бесполые) (20,1–100). Подстратегии размножения характеризовались следующими распределениями значений индекса образования зооспорангиев (ИЗ):

С1 (0,1–20,0), Б1 (20,1–40,0), Б4 (40,1–60,0), Б7 (60,1–100). Стратегии поддержания жизнеспособности характеризовались следующими распределениями значений индекса агрессивности (ИА): Н (неагрессивные) Подстратегии поддержания (0–10,0), (агрессивные) (10,1–100).

А жизнеспособности характеризовались следующими распределениями значений индекса агрессивности (ИА): Н1 (0–10,0), А1 (10,1–25,0), А4 (25,1–50,0), А7 (50,1–100).

Статистистическую обработку (дисперсионный и корреляционный анализ) полученных данных проводили посредством программ PASW–SPSS (версия 2.1). Построение (версия 18), MINITAB (версия 16), STRAZ дендрограмм (кластерный анализ) проводили посредством программ PASW– SPSS (версия 18), STATISTICA (версия 8.0.550).

-5 Результаты и обсуждение исследований Стратегии размножения и поддержания жизнеспособности Ph. infestans в Иранском Голестане. В результате проведения исследований выявлено, что все изученные показатели: распространённости болезни (Р), индекс развитии болезни (ИР), индекс образования зооспорангиев (ИЗ) и индекса агрессивности (ИА) в полевых популяциях Ph. infestans в провинции Голестан в Иране вариьировали от небольших до значительных значений:

Р (19,06–72,92), ИР (15,80–79,02), ИЗ (5,98–98,11), ИА (0,23–41,60) (табл. 1).

Все обследованные полевые популяции Ph. infestans в Иранском Голестане размножались бесполым путём и имели разные уровни формирования зооспорангиев – от слабого потенциала до очень значительного (табл. 1). Ооспор не обнаружили, индекс образования ооспор (ИО) был равен нулю, хотя обнаружили оба типа спаривания А1 и А2 (см. ниже).

Максимальные показатели зарегистрировали для необработанных фунгицидами полевых популяций патогена на картофеле и томате. Особенно высоким был (ИА) для полевых популяций Ph. infestans на американском сорте томата Early Girl. Напротив, значения (ИА), полученные для полевых популяций Ph. infestans на картофеле из разных регионов, обработанных фунгицидами Equation pro и Ридомил Голд, были очень низкими (табл. 1).

Кластерный анализ по встречаемости стратегий/подстратегий размножения ясно свидетельствует о присутствии трёх типов полевых популяций Ph. infestans в Иранском Голестане (рис. 3).

Первый тип полевых популяций характеризовался слабой стратегией размножения, подстратегией С1 и включал в себя популяции Ph. infestans на картофеле разных регионов (год сбора, место и сорт). Все эти популяции были обработанные фунгицидами Ридомил Голд (Металаксил и Манкоцеб, СП, ВДГ) или Equation pro (Famoxadone и Cymoxanil, ВДГ).

Второй тип полевых популяций характеризовался сочетанием очень слабой стратегией размножения подстратегией С1 и подстратегиями бесполого размножения Б1 и Б4 в различных соотношениях. Этот тип полевых популяций включает в себя популяции Ph. infestans на картофеле разного происхождения (район, год сбора материала, место и сорт). Все популяции данного типа не обработывали фунгицидами Ридомил Голд или Equation pro. При анализе этой группы можно различать подкластер с двумя группами популяций, которые обрабатывали фунгицидами Манкоцеб (Марганец и Цинк, СП) и ХОМ (Хлорокись меди, СП).

Третий тип полевых популяций характеризовался сильной подстратегией бесполого размножения Б7 и включал в себя только популяции Ph. infestans на томате.

-6 Таблица 1. Характеристики мест сбора образцов листьев сортов картофеля и томата, индексы и стратегии (подстратегии), характеризующие исследуемые полевые популяции Ph. infestans из разных регионов Иранского Голестана Подстратегии поддержа размноже- ния Характеристики Индексы ния жизнеспо (СР) собности (СПЖ) Чис ло Год Фун- ти- ти по- Р, ИР, ИЗ, / Район % % Сорт ИА % % % пу гицид пы пы РХ ля ций Сан Sorkha- Equation С1 Н 10 34,66 43,04 12,53 1,98 100 тэ nkalate pro Аг- Ридомил С1 Н Gorgan 10 53,48 51,02 15,67 4,37 100 рия Голд / Сак- С1 кар- Манкоцеб Н Aliabad 10 53,61 62,31 23,74 7,94 сон Б1 то Мар- Обработк Б Valika- фель А 10 70,51 76,96 35,87 19,56 фона и нет Б bad Мар- Обработк Б1 А Fazela- 60 10 72,92 79,02 37,57 21, фона и нет Б4 А bad 40 Обработк Kafsh- Early Б7 А 13 60,30 70,31 98,11 41,60 100 и нет giri girl / то- Обработк А Yassag- Б Cheff 17 52,22 62,43 86,08 28,44 мат и нет А hi Дра Sorkha- Equation С1 Н 10 37,29 38,77 12,80 1,87 100 га nkalate pro Аг- Ридомил С1 Н Gorgan 5 44,29 46,55 15,20 3,16 100 рия Голд / Сак- С1 кар- ХОМ Н Aliabad 5 53,54 59,99 20,88 6,76 сон Б1 то Мар- Обработк А Valika- фель Б 5 63,49 66,81 30,66 13,24 фона и нет Н bad Мар- Обработк Б Fazela- А 8 69,88 77,07 34,43 18,71 фона и нет Б bad Кон Valika- Equation С1 Н 15 19,06 18,64 6,10 0,29 100 корд bad pro / Мар Fazela- Equation кар- С1 Н 15 30,89 36,19 11,59 1,36 100 фона bad pro то Сан Sorkha- Equation фель С1 Н 10 22,68 15,80 5,98 0,23 100 тэ nkalate pro 2,218 2,852 2,343 1,877 - - - НСР0, -7 Tree Diagram for 15 Variables Ward`s method Euclidean distances 2009 Potato Sorkhankalate Sante Equation Pro 2009 Potato Gorgan Agria Ridomil gold 2010 Potato Sorkhankalate Draga Equation Pro 2010 Potato Gorgan Agria Ridomil Gold 2011 Potato Valikabad Concord Equation Pro 2011 Potato Fazelabad Marfona Equation Pro 2011 Potato Sorkhankalate Sante Equation Pro 2009 Potato Aliabad Saxon Mancozeb 2010 Potato Aliabad Saxon Copravit 2009 Potato Valikabad Marfona No fungicides 2010 Potato Valikabad Marfona No Fungicides 2009 Potato Fazelabad Marfona No Fungicides 2010 Potato Fazelabad Marfona No Fungicides 2009 Tomato Kafshgiri Early girl No Fungicides 2009 Tomato Yassaghi Endemic No Fungicides 0 100 200 300 400 500 600 700 Linkage Distance Рисунок 3. Дендрограмма для групп полевых популяций Ph. infestans в соответствии с их стратегиями размножения (СР).

Tree Diagram for 15 Variables Ward`s method Euclidean distances 2009 Potato Sorkhankalate Sante Equation Pro 2009 Potato Gorgan Agria Ridomil gold 2009 Potato Aliabad Saxon Mancozeb 2010 Potato Sorkhankalate Draga Equation Pro 2010 Potato Gorgan Agria Ridomil Gold 2010 Potato Aliabad Saxon Copravit 2011 Potato Valikabad Concord Equation Pro 2011 Potato Fazelabad Marfona Equation Pro 2011 Potato Sorkhankalate Sante Equation Pro 2009 Potato Valikabad Marfona No fungicides 2010 Potato Fazelabad Marfona No Fungicides 2009 Potato Fazelabad Marfona No Fungicides 2010 Potato Valikabad Marfona No Fungicides 2009 Tomato Kafshgiri Early girl No Fungicides 2009 Tomato Yassaghi Endemic No Fungicides 0 100 200 300 400 500 600 700 Linkage Distance Рисунок 4. Дендрограмма для групп полевых популяций Ph. infestans в соответствии с их стратегиями поддержания жизнеспособности (СПЖ).

Все обследованные полевые популяции Ph. infestans имели относительно разные уровни агрессивности. Полевые популяции со слабыми и агрессивными стратегиями поддержания жизнеспособности показаны в табл. 1. Кластерный анализ по встречаемости стратегий/подстратегий поддержания -8 жизнеспособности ясно свидетельствует о присутствии двух типов полевых популяций Ph. infestans в Иранском Голестане (рис. 4).

Первый тип полевых популяций характеризовался слабой стратегией Н и включал в себя популяции Ph. infestans на картофеле разного происхождения (район, год сбора, место и сорт). Все посадки картофеля с данными популяциями Ph. infestans обрабатывали фунгицидами.

Второй тип полевых популяций характеризовался сочетанием слабой стратегией Н1 и подстратегий А1 и А4 в различных соотношениях. Этот тип включал в себя популяции Ph. infestans на картофеле разного происхождения (регион, год сбора, место и сорт). Все посадки картофеля с данными популяции Ph. infestans не обрабатывали фунгицидами.

Кроме того, очень важно, что импортный сорт томата (Early Girl) по сравнению с местным сортом томата Cheff значительно больше поражался фитофторозом.

В целом, можно сказать, что исследованные Иранские полевые популяции Ph. infestans были r–стратегами. Они характеризовались разными подстратегиями в рамках бесполого размножения и проявления агрессивности, корректируемыми применением фунгицидов. Признаков К–стратегии (для Ph. infestans определяемых в основном образованием гибридных ооспор) не обнаружено.

Морфологические типы ооспор Ph. infestans, полученные при скрещиваниях in vitro. При анализе скрещиваний Иранских и Российских изолятов Ph. infestans обнаружили 19 морфологических типов ооспор.

Морфологические различия выявили по градациям всех четырёх критериев – диаметр ооспор, толщина их клеточной стенки, наличие антеридия и форма оогония (табл. 2, рис. 5).

Установлено, что наиболее часто встречались морфологические типы ооспор 2.1.1.2a, 3.1.1.2a, примерно в 2 раза реже – 3.1.2.2a и 3.3.1.2b.

Остальные морфологические типы ооспор встречались ещё реже.

Далее в нашем исследовании мы изучили некоторые закономерности формирования ооспор in vitro при скрещиваниях между Иранскими и Российскими изолятами патогена.

Только 7 морфологических типов ооспор 2.1.1.2a (T–типичной морфологии, см. ниже), 2.1.1.2b (T), 2.1.2.2a (НT–нетипичной морфологии, см.

ниже), 2.1.2.3a (HT), 2.1.2.2b (НT), 2.2.1.2b (T), 4.3.2.2b (HT) достоверно описали в предшествующем исследовании (Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., 2001), остальные морфологические типы ооспор выявили только в текущем исследовании. Это может быть связано с тем, что: 1) исследовали материал разного географического происхождения;

2) исследовали материал, полученный in vitro и in vivo;

3) при использовании методики обесцвечивания нарушалась целостностность некоторых признаков ооспор.

-9 Таблица 2. Градации морфологических признаков, морфологических типов и встречаемости ооспор, а также размер зоны совместимости, обнаруженных при скрещиваниях Иранских и российских изолятов Ph. infestans Толщина Наличие и Форма Оценка стенки Нали- структура ооспор встречае- Зона Скрещив- Диаметр (соглас ооспоры чие оогония мости совмест ооспоры аемые (согласно (согласно антер- но ооспор имости мкм изоляты (согласно (мм) критер- идия критер- критер иям) иям) иям) критериям) F70F70 – – – – – – F70F72 – – – – – – F70F73 – – – – – – F70V72 – – – – – – Т Ч F70Sm* 2,3 1 1 2а Т Ч F70S6* 2.3 1 1 2а Т,HT Ч F7033* 2,3 1 1 2a,2b,3a F7037 – – – – – – F72F72 – – – – – – F72F73 – – – – – – F72V72 – – – – – – Т У F72Sm* 2,3 1 1 2а Т У F72S6* 2,3 1 1 2а Т,HT Ч F7233* 2,3 1 1 2а,3a F7237 – – – – – – F73F73 – – – – – – F73V72 – – – – – – Т У F73Sm* 2,3 1 1 2а Т У F73S6* 2,3 1 1 2а Т,HT Ч F7333* 2,3 1 1 2a,3a F7337 – – – – – – V72V72 – – – – – – Т У V72Sm* 3 3 1 2b Т У V72S6* 3 3 1 2b Т,HT Ч V7233* 2,3 1 1,2 2а,2b,3a V7237 – – – – – – Т Р Sm*Sm* 2,3 1 2 2а Sm*S6* – – – – – – Р Sm*33* 2,3,4 1 2 2а T,НТ Т Ч Sm*37 2,3 1,2,3 1,2 2а,2b Т Р S6*S6* 2,3 1 2 2а Т,HT Р S6*33* 2,3,4 1 2 2а Т Ч S6*37 2.3 1,2,3 1 2а,2b Т,HT Р G32*V72 3,4 3 1,2 2b Т,HT Р G70*V72 3,4 3 1,2 2b Р A32*V72 4 3 1,2 2b HТ Р A70*V72 4 3 1,2 2b HТ 33*33* – – – – – – 3737 – – – – – – Т Ч 33*37 2.3 1.2 1 2а,2b Примечание к табл. 2. Изоляты, отмечённые звёздочкой, имеют тип спаривания А1, 33 – штамм-тестер с типом спаривания А1, 37 – штамм-тестер с типом спаривания А2, Т – ооспора с типичной морфологией, НТ – ооспора с нетипичной морфологией, Ч – ранг частой встречаемости ооспор, У – ранг умеренной встречаемости ооспор, Р – ранг их редкой встречаемости.

- 10 2.1.1.2b (T) 2.1.2.2a (НT) 2.1.1.2a (T) 2.2.1.2a (T) 2.1.2.3a (HT) 2.1.2.2b (НT) 2.2.1.2b (T) 3.1.1.2a (T) 3.1.1.2b (T) 3.1.1.3a (HT) Начало рисунка 5.

- 11 3.2.1.2a (T) 3.1.2.2a (НT) 3.1.2.3a (HT) 3.3.2.2b (T) 3.2.1.2b (T) 3.3.1.2b (T) 4.3.1.2b (HT) 4.3.2.2b (HT) 4.1.2.2a (HT) Рисунок 5. Морфологические типы ооспор. Цена деления 2,4 мкм.

Частота встречаемости ооспор и размер зоны вегетативной совместимости между колониями также были различными (табл. 3;

рис. 6).

Корреляции между ними не обнаружено, значение коэффициента корреляции Пирсона составило 0,027±0,160.

- 12 Таблица 3. Частота встречаемости ооспор и размер зоны несовместимости, формирующихся при скрещиваниях Иранских изолятов Ph. infestans Скрещивание изолятов с Частота встречаемости ооспор и размер зоны несовместимости (мм) типами спаривания Редко (2, 3), Умеренно (0, 6), Часто (0, 4, 6, 7, 8) A1 A Редко (3, 4) –* (4, 7) A1 A –* (0, 3, 4, 5) A2 A Примечание: –* ооспоры не обнаружены Также мы провели большой объём работы, направленной на уточнение существующих методик по разграничению основных градаций морфологических типов ооспор – прежде всего, ооспор нетипичной и типичной морфологии (табл. 4) (Смирнов А.Н., 2003).

Таблица 4. Оценка морфологии ооспор по уточнённым градациям морфологическим критериям Позиция Признак Градации признака признака не более 20 мкм 1.

21–30 мкм 2.

Диаметр Первая 31–40 мкм 3.

более 40 мкм 4.

тонкая однослойная, до 1,5 мкм 1.

средней толщины, одно-двухслойная, возможно с 2.

Толщина наслоениями, от 1,5 мкм до 3,5 мкм Вторая стенки толстая, более, чем двухслойная, с наслоениями, 3.

от 3,5 мкм Наличие есть 1.

Третья антеридия нет 2.

нет 1.

есть, шаровидный, периплазмы почти нет 2.а.

Наличие и есть, шаровидный, периплазма хорошо выражена 2.b.

структура есть, разнообразной, но не шаровидной формы, 3.а.

Четвёртая оогония периплазмы почти нет есть, разнообразной, но не шаровидной формы, 3.b.

периплазма хорошо выражена Прежде всего, эти результаты удалось выразить в удобной табличной форме (табл. 5 ). В исходную таблицу добавили размерность в мкм по толщине оболочек ооспоры, позволив надежнее определять градации второго признака – толщины клеточной стенки.

- 13 Скрещиваемые Наличие Зона совместимости – есть Зона совместимости – нет изоляты ооспор S6 (A1) F73 (A2) S6 (A1) F72 (A2) + A1 A Sm (A1) 33 (A1) Не найден + A1 A Sm (A1) S6 (A1) Не найден – F72 (A2) F72 (A2) F70 (A2) F70 (A2) – A2 A Рисунок 6. Зоны вегетативной совместимости между колониями при скрещивании изолятов Ph. infestans с определёнными типами спаривания – А и А2.

- 14 Таблица 5. Оценка признаков ооспор для определения градаций их морфологических типов Признаки Морфологический Наличие и Толщина Наличие тип ооспор Диаметр структура стенки антеридия оогония все градации все градации все градации 1/ все градации 2/3 1 2 Нетипичные все градации все градации все градации 3а / 3b 2/3 1/2/3 1 1 / 2а / 2b Типичные 2/3 2/3 2 1/ 2а / 2b Примечание: красным выделены градации признаков, указывающие на нетипичную морфологию ооспор.

Ооспоры стандартного размера от 20 до 40 мкм (градации 2 и 3 первого признака), имеющие тонкую стенку (градация 1 второго признака) и не имеющие антеридия (градация 2 третьего признака) могут указывать на нетипичную морфологию. Это объясняется тем, что ооспоры без антеридия – это уже достаточно зрелые сформировавшиеся ооспоры, которые должны иметь как минимум умеренную или даже толстую стенку. Если это не произошло по мере достижения такого размера, то это значит, что при развитии ооспоры произошли отклонения и соответственно она имеет нетипичную морфологию.

Исходя из вышесказанного, можно заключить формулу ооспор нетипичной морфологии: [1/4, (1, 2), 3a/3b]. Данная формула выражает распределение градаций четырёх признаков, характерных именно для ооспор нетипичной морфологии и их отличие от ооспор типичной морфологии по комбинации этих признаков. Отличие ооспор типичной и нетипичной морфологии помогает анализировать происхождение ооспор – в результате гибридизации, самооплодотворения и партеногенеза. А это очень важно, так как различные по происхождению ооспоры имеют различное эпидемиологическое значение (Смирнов А.Н., 2010).

Для проверки правильности выделения морфологических типов ооспор типичной и нетипичной морфологии применили кластерный анализ (рис. 7). По сходству кластеризовали все выявленные в нашем исследовании морфологических типов ооспор. При анализе дендрограммы (сверху вниз) обнаружили 4 основных кластера.

- 15 Tree Diagram for 19 Cases Ward`s method Euclidean distances 2.1.1.2a(T)** 2.1.1.2b(T) 2.2.1.2a(T) 2.2.1.2b(T) 3.1.1.2a(T)** 3.1.1.2b(T) 3.2.1.2a(T) 3.2.1.2b(T) 2.1.2.2a(HT) 2.1.2.2b(HT) 3.1.2.2a(HT)* 4.1.2.2a(HT) 2.1.2.3a(HT) 3.1.2.3a(HT) 3.1.1.3a(HT) 3.3.1.2b(T)* 3.3.2.2b(T) 4.3.1.2b(HT) 4.3.2.2b(HT) 0 1 2 3 4 5 6 Linkage Distance Рисунок 7. Дендрограмма сравнения морфологических типов ооспор по их сходству (Т – морфологические типы ооспор типичной морфологии, НТ – морфологические типы ооспор нетипичной морфологии). Звездочкой помечены наиболее частые морфологические типы ооспор.

Первый кластер включал в себя морфологические типы ооспор типичной морфологии, второй и третий, объединяющиеся в один гиперкластер, – морфологические типы ооспор нетипичной морфологии, четвертый – морфологические типы ооспор как типичной, так и нетипичной морфологии. В целом, кластерный анализ подтверждает деление морфологических типов ооспор на типичные и нетипичные (Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., 2001).

Полученные данные помогают анализировать генезис ооспор: динамику их образования и происхождение. Нетипичные ооспоры образовывали гиперкластер из двух кластеров. Большинство из них образовывалось при контакте мицелиев с типом спаривания А1, но не А2. Они почти никогда (за одним исключением) не имели антеридия, но имели значительный диаметр при тонкой клеточной стенке. Наличие периплазмы и форма оогония у них варьировали. Крупные тонкостенные ооспоры без антеридия образовывались в результате партеногенеза, такие ооспоры находили и in vivo (Cмирнов А.Н., Кузнецов С.А., 2001;

Смирнов А.Н., 2003). Ооспоры с отклонением в - 16 морфологии, но имеющие антеридий, скорее всего образовывались в результате самооплодотворения (если антеридий функционировал) или партеногенеза (если антеридий не функционировал), так как отклонения в морфологии у гибридных ооспор с антеридием предельно редки. В четвёртом кластере все ооспоры, образовывались при половом процессе, в результате как гибридизации (чаще, до 40 мкм), так и при самооплодотворении (реже, более мкм).

Типы спаривания, устойчивость к металаксилу и проявление агрессивности изолятов Ph. infestans, выделенных в 2010 г. в Иранском Голестане. В Иранском Голестане выявили оба типа спаривания – и А1, и А2.

Все обследованные изоляты давали значительное количество ооспор типичной морфологии с соответствующим штаммом–тестером и не образовывали их с другим штаммом–тестером. Самофертильных и самостерильных изолятов Ph. infestans, а также изолятов, образующих ооспоры со штаммами–тестерами и не образующих их в контроле, не обнаружили.

Почти все обследованные изоляты Ph. infestans из Иранского Голестана были чувствительны к Металаксилу, лишь изолят F73 демонстрировал среднюю устойчивость, F72 и V72 – слабую (рис. 8, табл. 6).

F70 F72 F73 V72 Sm S мкг/мл (контр оль) мкг/мл мкг/мл мкг/мл Рисунок 8. Развитие изолятов Ph. infestans на агаризованной среде с металаксилом c концентрациями 0 (контроль), 1, 10, 100 мкг/мл на 15 сутки инкубирования.

- 17 Таблица 6. Типы спаривания, устойчивость к металаксилу и итоговый индекс агрессивности (ИИА) на клубневых дисках сортов картофеля Ильинский и Удача у исследуемых иранских изолятов Ph. infestans Устойчив Тип Обработка ость к ИИА ИИА Изолят Сорт спар (Ильинский) (Удача) фунгицидом металак ивания силу, ранги Марфона А – S 2‚8 2‚ F Марфона А – S (S/R) 2‚1 2‚ F Марфона А – R/S 2‚1 2‚ F Марфона А – S (S/R) 2‚5 2‚ V Драга А Equation Pro S 1‚8 Sm Драга А Equation Pro S 1‚5 S Саксон ХОМ А1 нт* 0,5 0, A Саксон ХОМ А1 нт 0,5 0, A А1 нт 0,1 G32 Агрия Ридомил Голд А1 нт 0,1 G70 Агрия Ридомил Голд Примечание: нт* – изолят не протестирован из-за потери жизнеспособности Отсутствие устойчивости в данном тесте хорошо согласуется с предшествующими результатами о высокой способности фунгицида Ридомил Голд подавлять развитие фитофтороза в Иранском Голестане.

Все исследованные Иранские изоляты с типом спаривания А2 (F70, F72, F73 и V72) оказались агрессивными к сортам картофеля, а с типом спаривания А1 – малоагрессивными (G32, G70, A32 и A70) или умеренно агрессивными (Sm и S6) (табл. 6). Это можно объяснить действием на агрессивность внешних стрессовых факторов, влияющих на исследуемые изоляты патогена in vivo и по ходу выделения в Иране и Москве. Так, только у изолятов с типом спаривания А2 обнаружили устойчивость к металаксилу, не смотря на то, что их выделили с полей, не обработанных фунгицидами.

Влияние экстрактов из чистотела и мачка на фитофтороз картофеля Лабораторные исследования. Результаты лабораторных исследований (рис. 9;

табл. 7) свидетельствуют о том, что экстракты Ch. majus, G. grandiflorum‚ G. contortuplicatum‚ G. oxylobum значительно подавляли развитие всех изолятов Ph. infestans – в концентрации 25% очень существенно, в концентрации 50% почти полностью, в концентрации 100% полностью.

Полученный результат соответствует эталонным данным по Psiadia arabica и даже несколько превышает их.

- 18 Концентрация экстракта, % 0 25 50 Ch. majus G. grandi florum G. contor tuplicatum G. oxylobum Рисунок 9. Клубневые диски сорта Ильинский, предварительно обработанные экстрактами Ch. majus, G. grandiflorum‚ G. contortuplicatum‚ G. oxylobum в разных концентрациях через 5 суток после заражения иранским изолятом Ph. infestans F72.

Четырёхфакторный дисперсионный анализ не выявил существенных различий между действием экстрактов на Ph. infestans. Наиболее существенным фактором в лабораторном эксперименте была концентрация экстракта. Сорта и изоляты Ph. infestans влияли на ход эксперимента значительно меньше (табл. 7).

- 19 Таблица 7. Влияние экстрактов растений из семейства Маковые в разных концентрациях на проявление агрессивности (по значениям ИИА – итогового индекса агрессивности) исследуемых изолятов Ph. infestans на клубневых дисках сортов картофеля Удача и Ильинский НСР Fф Фактор Градации ( = 0,05) G. G.

gran- con- G.

Ch. ma di- tortu- oxylo jus (1,532) нс flo- plica- bum 0, Экстракт rum tum 0,47 0,47 0,49 0, 0 25 50 Концен (4909,566)*** 0, трация, % 1,87 0,05 0,01 F 73 F 72 F 70 Sm S6 V (53,461)*** 0, Изолят 0,54 0,55 0,60 0,35 0,32 0, Ильин- Уда ский ча (229,208)*** 0, Сорт 0,58 0, Примечания: НСР (=0,05) - для частных различий: 0,2535 нс = не существенны ( = 0,05, F F ), * = существенны ( = 0,05), ** = очень существенны ( = 0,01), *** = очень сильно ф существенны ( = 0,001) Полевые испытания на ЛЗР. Результаты полевых мелкоделяночных испытаний (табл. 8) свидетельствуют о том, что экстракты Ch. majus и G. grandiflorum подавляли развитие Ph. infestans примерно в 5 раз, и бесполое спороношение в 10–20 раз (в зависимости от сорта), а агрессивность примерно в 1000 раз. Существенно, что экстракты не провоцировали образование ооспор патогена. Отметим, что уменьшение всех вышеупомянутых показателей было значительным, существенным и вполне сравнимым с действием современных фунгицидов, применяемых против фитофтороза картофеля (Смирнов А.Н., 2010), при условии не очень значительного развития патогена.

- 20 Таблица 8. Значения распространенности (Р), индекса развития (ИР), индекса образования зооспорангиев (ИЗ), индекса образования ооспор (ИО), индекса агрессивности (ИА) Ph. infestans (естественный фон) для сортов картофеля Ильинский и Удача, обработанных экстрактами из растений Экстракт Сорта картофеля Ильинский Удача Концен Вид рас трация, Р, ИР, ИЗ, ИО, Р, ИР, ИЗ, ИО, тения ИА ИА % % % % % % % % % 52,1 63,6 27,5 0 9,11 39,8 41,3 13,0 0 2, Ch.

10,3 12,8 3,2 0 0,04 6,6 5,4 1,3 0 0, majus 8,52 9,7 1,7 0 0,01 4,1 4,1 0,9 0 0, 52,1 63,6 27,5 0 9,11 39,8 41,3 13,0 0 2, G. gran di- 23,9 25,7 4,8 0 0,30 22,7 20,0 4,0 0 0, florum 19,4 16,2 4,5 0 0,14 15,6 13,9 3,3 0 0, Экстракты из растений семейства Маковые были способны изменять стратегию размножения полевой популяции Ph. infestans с бесполой (Б1) до слабой (С1) только на сорте Ильинский, но не на Удаче (табл. 9).

Таблица 9. Стратегии размножения (СР) и поддержания жизнеспособности (СПЖ) Ph. infestans (естественный фон) для сортов картофеля Ильинский и Удача, обработанных экстрактами из растений Ch. majus и G. grandiflorum Экстракт Сорта картофеля Ильинский Удача Концентрация, Вид растения % СР СПЖ СР СПЖ Б1 Н1 С1 Н С1 Н1 С1 Н Ch. majus С1 Н1 С1 Н Б1 Н1 С1 Н G. grandi С1 Н1 С1 Н florum С1 Н1 С1 Н Вероятно, это связано с более значительным вкладом полевой устойчивости последнего сорта. Однако изменения стратегии поддержания жизнеспособности не зарегистрировали (табл. 9).

Анализ урожайности показал, что в вариантах с обработкой экстрактами урожайность была выше и на сорте Ильинский, и на сорте Удача, чем в контрольных вариантах (табл. 10).

- 21 Таблица 10. Биологическая (БЭ) и хозяйственная (ХЭ) эффективность применения растительных экстрактов для защиты картофеля от фитофтороза (ЛЗР, естественный фон) Экстракт Сорта картофеля Ильинский Удача Концентрация, Вид растения % БЭ* % ХЭ** % БЭ % ХЭ % 79,94 76,67 86,99 74, Ch. majus 84,75 82,72 90,11 81, 59,64 70,83 51,44 64, G. grandiflorum 74,50 79,26 66,46 70, 50,30 52,30 60,70 7, P. arabica (эталон) Анализ данных по биологической и хозяйственной эффективности применения экстрактов из растений видов Ch. majus и G. grandiflorum выявил, что эти показатели превышали эталонные значения по P. arabica (табл. 10).

ВЫВОДЫ 1. В Иранском Голестане стратегии размножения полевых популяций Ph. infestans на разных сортах картофеля и в большей степени на томате были направлены на развитие бесполого спороношения и агрессивности в течение вегетационного сезона с разной интенсивностью (диапазоны значений индекса образования зооспорангиев – от 5,98 до 98,11, значений индекса агрессивности – от 0,23 до 41,60). Наибольшие показатели по интенсивности образования зооспорангиев и агрессивности зарегистрировали для томатных популяций патогена.

2. После применения в Иране фунгицидов Equation pro и Ридомил Голд зарегистрировали низкие значения диапазонов индексов образования зооспорангиев (5,98–15,67) и агрессивности (0,23–4,37) полевых популяций Ph. infestans, в то время как при отсутствии обработок диапазоны значений этих индексов были значительно выше – 30,66–37,57 и 13,24–21, соответственно. Диапазоны значений индексов образования зооспорангиев и агрессивности полевых популяций Ph. infestans после обработок Манкоцебом и Хлорокисью меди составили 20,88–23,74 и 6,76–7, соответственно.

3. Выявлены иранские изоляты Ph. infestans с картофеля с типами спаривания А1 (6 изолятов) и А2 (4 изолята). При скрещиваниях их in vitro обнаружено 19 морфологических типов ооспор. Различия между ооспорами типичной и нетипичной морфологии определяются их размерами, формой оогония, а также толщиной клеточной стенки при наличии/отсутствии антеридия.

Ооспоры, образованные А1 или А1 и А2 с нетипичной морфологией были более 40 мкм или менее 20 мкм в диаметре, имели уклоняющуюся от - 22 шаровидной форму оогония, тонкую клеточную стенку при диаметре от до 40 мкм при отсутствии антеридия.

4. Изоляты Ph. infestans из Иранского Голестана характеризовались разной агрессивностью на клубневых дисках сортов картофеля Ильинский и Удача – от пониженной до высокой. Все наиболее агрессивные изоляты имели тип спаривания А2 и были собраны с картофеля, не обработанного фунгицидами. Менее агрессивные и неагрессивные изоляты имели тип спаривания А1 и были собраны с картофеля, обработанного фунгицидами.

Все исследованные изоляты были чувствительны к металаксилу, и только один (с типом спаривания А2) – среднеустойчив.

5. Экстракты из растений из семейства Маковые: чистотел большой (Chelidonium majus) и мачок (виды рода Glaucium: G. grandiflorum, G. contortuplicatum, G. oxylobum), собранных в Иране, показали высокую эффективность при испытаниях in vitro на клубневых дисках, а также при защите посадок картофеля от фитофтороза (биологическая эффективность до 90,11, хозяйственная эффективность до 82,72). В опытах на территории ЛЗР они существенно влияли на стратегии размножения, уменьшая интенсивность образования зооспорангиев, но не существенно влияли на стратегии поддержания жизнеспособности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. В годы с низким и умеренным ожидаемым развитием фитофтороза в приусадебных и фермерских хозяйствах можно использовать экстракты чистотела большого как экологически безопасное средство для защиты картофеля от фитофтороза. Для получения эффекта подавления фитофтороза концентрированные экстракты из этих растений (10% по сухой массе растительного сырья) следует применять не менее 3 раз в течение вегетационного сезона на картофеле в фазы бутонизации и цветения.

2. В Иране рекомендуется совершенствовать систему фитосанитарного мониторинга фитофтороза как очень опасного заболевания для избежания эпифитотий фитофтороза. Для этого целесообразно рекомендовать министерству сельского хозяйства Ирана методологию оценки способов размножения и агрессивности полевых популяций возбудителя фитофтороза картофеля и томата, апробированную в данной работе в провинции Голестан.

- 23 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Золфагари А. Фитофтороз и альтернариоз картофеля и томата при аномальных погодных условиях в Московской области / А. Золфагари, В.В.

Антоненко, Д.В. Зайцев, А.А. Игнатенкова, А.Г. Мамонов, Р.В. Пенкин, А.Ю.

Поштаренко, А.Н. Смирнов // Защита и карантин растений – 2011. – № 12. – С. 40–42.

2. Золфагари А. Влияние экстрактов из чистотела и мачка на возбудителя фитофтороза картофеля / А. Золфагари, А.Н. Смирнов // Известия ТСХА. – 2011. – Вып. 6 – С. 69–77.

3. Zolfaghary A. Strategies of reproduction and viability support of oomycete Phytophthora infestans in Iran (Стратегия размножения и поддержания жизнеспособности оомицета Phytophthora infestans в Иране) / A. Zolfaghary, A.N. Smirnov // Izvestiya TSKhA. – 2012. – Special issue. – P. 116–123.

4. Antonenko V.V. Effectiveness of fungicide–free approaches to the protection of potato and tomato against late blight (Эффективность безфунгицидных обработок для защиты картофеля и томата против фитофтороза) / A.N. Smirnov, V.V.

Antonenko, A. Zolfaghary, M.N. S. Al–Saadi, A.G. Mamonov, G.V. Kondratyeva, A.A. Ignatenkova, M.A. Shishurjak // Proceedings for Natural Science, Matica sprska, Novi Sad, 2011. – № 120 – C. 137–144.

5. Золфагари А. Развитие фитофтороза на различных сортах картофеля в Иране // А.Н. Смирнов, А. Золфагари // Сборник тезисов второго научно– практического совещания «Генетические и агротехнологические ресурсы повышения качества продовольственного и технического картофеля. – Москва, биофак МГУ имени М. В. Ломоносова, 2012. – С. 12.

6. Смирнов А.Н. Роль сорта в защите картофеля от фитофтороза и альтернариоза / А.Н. Смирнов, А. Золфагари, Р.В. Пенкин, С.А. Кузнецов, В.В. Антоненко // Сборник тезисов второго научно–практического совещания «Генетические и агротехнологические ресурсы повышения качества продовольственного и технического картофеля. – Москва, биофак МГУ имени М.В. Ломоносова, 2012. – С. 20.

7. Золфагари А. Основные грибные болезни картофеля в Иране // А. Золфагари, А.Н. Смирнов // Сборник трудов международной конференции молодых ученых РГАУ–МСХА, 2011. – В печати.

- 24