Гетероферментативные молочнокислые бактерии и перспективы их использования в растениеводстве и кормопроизводстве

На правах рукописи

ЙЫЛДЫРЫМ Елена Александровна ГЕТЕРОФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В РАСТЕНИЕВОДСТВЕ И КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ 03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2009 2

Работа выполнена в лаборатории зоологической микробиологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ГНУ ВНИИСХМ г. Санкт-Петербург)

Научный консультант: кандидат биологических наук Лаптев Георгий Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Умаров Марат Мутагарович доктор биологических наук, Кравченко Лев Витальевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений РАСХН

Защита диссертации состоится « » 2009 г.

в ч мин на заседании объединенного совета ДМ 212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Универ ситетская наб. 7/9, Биолого-почвенный факультет СПбГУ, аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт Петербургского государственного университета.

Для отзывов: факс +7-(812)-466-79-

Автореферат разослан « » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.И. Шарова Актуальность проблемы. Молочнокислые бактерии играют большую роль в ряде отраслей промышленности и сельского хозяйства. Эти микроорганизмы поделены исследователям (Orla-Jensen, 1919;

Nilsson et al., 1956;

Langston et al., 1960;

Whittenbury, 1965;

Whittenbury, 1966;

Axelsson et al., 2004) на две основные категории: гомо- и гетероферментативные. В отличие от гомоферментативных гетероферментативные молочнокислые бактерии обладают более широким набором ферментов и, как следствие, более выраженной способностью к синтезу разнообразных биологически активных веществ (летучих кислот, этилового спирта, углекислоты, диацетила, перекиси водорода, антибиотиков) (Shtz et al., 1984;

Nissen-Meyer, et al., 1997;

Lavermicocca et al., 2003;

Strom et al., 2005). Многие виды молочнокислых бактерий распространены в почвах и, что особенно важно, в ризосфере растений (Квасников 1948, 1956, 1960;

Chen et al.;

2005). К настоящему времени в литературе описано множество штаммов молочнокислых бактерий, обладающих антагонистическими свойствами в отношении различных микроорганизмов, в том числе фитопатогенных (Квасниковым, 1956;

Dodd et al., 1994;

Vescovo et al, 1996;

Valerio et al., 2004). Более того, ряд исследователей (Квасников, 1960;

Ташпулатов и др., 2005;

Kuwaki et al., 2004) обнаружили положительное воздействие на рост и развитие растений со стороны молочнокислых бактерий. Отмечено также стимулирующее влияние карбоновых кислот – продуктов метаболизма молочнокислых бактерий - на всхожесть семян и развитие проростков растений (Kuwaki et al., 2004).

Все вышеперечисленное открывает возможность широкого внедрения в растениеводство микробных препаратов, основой для которых могут являться молочнокислые бактерии, особенно гетероферментативные. Их способность во многих случаях активно заселять ризосферу, а также антимикробные и фитостимулирующие свойства могут быть реализованы наиболее полно в этой отрасли сельского хозяйства. Кроме того, современное направление развития растениеводства ориентировано на сокращение объемов применения азотных и фосфорных удобрений и отказ от пестицидов, небезопасных для здоровья человека и приводящих к проблеме резистентности микроорганизмов.

Аналогичная обстановка, связанная с тенденцией уменьшения применения химических консервантов, складывается и в кормопроизводстве.

Как известно, зеленые корма, предназначенные для силосования, содержат большое количество спонтанных молочнокислых бактерий, которые быстро размножаются в силосе и синтезируют молочную кислоту, поэтому процесс силосования может протекать зачастую и без внесения биологических заквасок и химических консервантов (Лаптев, 2005). Однако при хранении влажного зерна протекающие в нем микробиологические процессы отличаются от таких же процессов при силосовании зеленых кормов: анаэробные условия в первом случае создаются только через 1-2 дня (Киров, 1982), поэтому возникают благоприятные условия для роста нежелательной микрофлоры. Особенно опасно присутствие в корме плесневых грибов, которые не только существенно снижают содержание сухого вещества в зерне, но и способны продуцировать микотоксины, негативно влияющие на здоровье животных и человека. В связи с этим актуальными представляются исследования, направленные на поиск молочнокислых бактерий с широким спектром антимикробной активности для борьбы с нежелательной микрофлорой и накоплением микотоксинов при хранении влажного зерна для получения качественного продукта.

На сегодняшний день зарубежный и отечественный опыт свидетельствует о перспективности практического использования молочнокислых бактерий в качестве основы ряда коммерческих биопрепаратов для консервирования влажного зерна («Биотроф-600», «Biocrimp», «Biograin» и др.). Однако в литературе практически отсутствуют сведения о разработке биопрепаратов антифунгального и одновременно фитостимулирующего действия для комплексного использования в растениеводстве и кормопроизводстве, что инициирует проведение исследований в этом направлении.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение штамма молочнокислых бактерий с высоким спектром антимикробной и фитостимулирующей активности и изучение его физиолого биохимических свойств с целью создания основы биопрепарата для комплексного использования в растениеводстве и кормопроизводстве.

В соответствии с поставленной целью выполнялись следующие задачи:

1. Исследование филло- и ризосферы растений как природного местообитания молочнокислых бактерий;

2. Выделение из филло- и ризосферы растений и осуществление скрининга штамма молочнокислых бактерий с высоким спектром фитостимулирующей активности и антимикробных свойств в отношении патогенных микроорганизмов;

3. Выяснение возможных механизмов антимикробной и фитостимулирующей активности отобранного штамма;

4. Оценка биологической эффективности отобранного штамма в лабораторных и производственных условиях.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что эпифитный штамм гетероферментативной молочнокислой бактерии L. buchneri 600 обладает выраженной антагонистической активностью, подавляя рост многих условно патогенных и патогенных бактерий, а также фитопатогенных грибов.

В условиях вегетационных, микрополевых и полевых опытов экспериментально доказано, что обработка различных сельскохозяйственных культур штаммом L. buchneri 600 позволяет значительно увеличить их урожайность. Этот факт дает возможность предположить, что молочнокислые бактерии, обитающие в ризо- и филлосфере, находятся в мутуалистических взаимоотношениях с растениями. Кроме того, впервые в результате производственных испытаний установлено, что штамм-антагонист L. buсhneri 600 эффективно борется с накоплением микотоксинов при хранении влажного плющеного зерна. Все это в совокупности определяет перспективность использования исследуемого штамма в качестве основы нового биопрепарата комплексного действия.

Изучено влияние интродуцированного штамма L. buchneri 600 на ризосферную микрофлору под посевами различных сельскохозяйственных культур. При этом наблюдалась зависимость увеличения урожайности в вариантах с инокуляцией семян некоторых культур от снижения содержания грибов.

С использованием хроматографического метода выявлены антимикробные метаболиты, продуцируемые штаммом L. buchneri 600. По результатам тестирования обнаружены три фракции с антимикробной активностью, в том числе масляная и валериановая кислоты. Помимо этого, с использованием аналогичного метода показано, что L. buсhneri 600 способен к синтезу фитогормонов - ауксинов. При этом показана зависимость биосинтеза фитогормонов от присутствия в среде L-триптофана.

Установлено, что штамм L. buсhneri 600 обладает способностью к заселению ризосферы растений.

Практическое значение работы. В результате исследований создана коллекция молочнокислых бактерий из рода Lactobacillus, для формирования которой в качестве ключевого критерия была использована антагонистическая активность этих бактерий в отношении условно патогенных и патогенных микроорганизмов.

Помимо этого, результаты исследований, освещенные в диссертационной работе, нашли применение в трех хозяйствах Ленинградской и Новгородской областей, что подтверждено актами о внедрении научных исследований.

Кроме того, полученные данные позволяют рекомендовать штамм L.

buchneri 600 в качестве основы препарата, стимулирующего рост определенного набора сельскохозяйственных культур, для комплексного использования в растениеводстве, а также в кормопроизводстве – для борьбы с нежелательной микрофлорой и накоплением микотоксинов во влажном плющеном зерне при хранении.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты", Санкт-Петербург, 15–16 мая 2007 г., на IV межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 14-16 октября 2008 г., на научной конференции профессорско-преподавательского состава, Санкт-Петербург, Пушкин, 29, 30 января 2009 г., на Postgraduate Course «Applied and fundamental aspects of responses, signaling and developmental process in the root-microbe systems», Saint-Petersburg, June 25 – July 2, 2007 г. и на Международной научно практической конференции «Актуальные проблемы заготовки, хранения и рационального использования кормов», Москва, 19, 20 августа 2009 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, 2 из них – в изданиях, входящих в рекомендованный ВАК список.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы (297 источников). Работа изложена на 201 странице, содержит 16 рисунков и таблиц.

Объекты и методы исследования.

Объектами исследований служили штаммы молочнокислых бактерий, выделенные из ризо- и филлосферы растений, а также коммерческий штамм Lactobacillus buchneri 600, входящий в состав препарата «Биотроф-600», предназначенного для консервирования плющеного зерна.

В качестве тест-объектов для исследования антагонистических свойств штаммов молочнокислых бактерий были использованы мицелиальные грибы и бактерии, которые были получены из Всероссийской коллекции непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ ВНИИСХМ.

Тест-культурами для проведения опытов по ростстимулирующей активности, способности к колонизации растений у штаммов микроорганизмов и выделения ризо- и филлосферных молочнокислых бактерий были выбраны следующие растительные объекты: Anethum graveolens L. – сорт «Грибовский», Barbarea vulgaris L., Beta vulgaris L. – сорт «Ренова», Dactilis glomerata L. – сорт «ВИК 61», Elytrigia repens L., Glycine max L. – сорт «Рекорд Северный», Lactuca sativa L. – сорт «Гейзер», Lepidium sativum L. – сорт «Ажур», Linum usitatissimum L. – сорта «Дашковский», «Призыв 81», Lycopersicon esculentum Mill. – сорта «Земляк», «Мазарини», «Мечта лентяя», «Тяжеловес Сибири», «Чибис», Medicago sativa L. – сорт «Славянская местная», Petroselinum crispum L. – сорт «Бриз», Phleum pratense L. – сорт «ВИК 9», Raphanus sativus L. – сорта «Тогул», «Рудольф», Trifolium pratense L. – сорт «ВИК 84», Triticum aestivum L.

– сорт «Ленинградская 97», Vicia sativa L. – сорт «Луговская 85».

В экспериментальном консервировании использовали зерно овса и зерновую смесь: ячмень, пшеница и тритикале.

Микроорганизмы различных физиологических групп культивировали на селективных агаризованных питательных средах (Теппер, 1975;

Зенова, 2002;

Практикум…, 2004;

Практикум…, 2005). Молочнокислые бактерии выявляли на агаризованной среде, включающей в себя пивное сусло, 0,5% мела и 2% этилового спирта (САМ), или на селективной среде Рогозы. Сапротрофные бактерии выявляли на мясо-пептонном агаре (МПА). Актиномицеты учитывали на крахмало-аммиачном агаре (КАА). Микроскопические грибы культивировали на среде Чапека и среде СА (агаризованное пивное сусло).

Дрожжи культивировали на среде Сабуро. Олигонитрофилы и азотобактер выявляли на среде Эшби.

Для анализа численности микроорганизмов и выделения изолятов молочнокислых бактерий навески проб (10 г) надземной части вегетирующих растений, ризосферы или плющеного зерна помещали в 90 мл стерильной дистиллированной воды и встряхивали на качалке при 120 об/мин в течение мин. Из полученной суспензии готовили серию разведений и сеяли на твердые питательные среды (Методы микробиологических…, 1973;

Методы почвенной …, 1991). Численность микроорганизмов различных физиологических групп в ризосфере, филлосфере и плющеном зерне определяли методом предельных разведений. Для выделения молочнокислых бактерий применяли метод накопительных культур (Теппер, 1975;

Зенова, 2002;

Практикум…, 2004;

Практикум…, 2005).

Антимикробную активность молочнокислых бактерий определяли с использованием метода колодцев (Magnusson, Schnrer, 2001).

Колонизацию бактериями поверхности корня изучали в гнотобиотической системе по методике Симонса (Simons et al., 1996).

Для экстракции антифунгальных метаболитов и фитогормонов (производных ауксина) штамма L. buchneri 600 использовали этилацетат.

Полученные антимикробные вещества анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления с использованием HPLC системы JASCO LC-900 (Jasco International CO., LTD, Japan).

Для выявления биологической активности штаммов молочнокислых бактерий и продуктов их метаболизма (органических кислот) была проведена серия вегетационных, микрополевых и полевых экспериментов (Журбицкий, 1968). Во всех случаях, когда в опытных вариантах проводилась обработка растений культуральной жидкостью штаммов молочнокислых бактерий, в контрольных вариантах проводилась аналогичная обработка растений в питательной среде эквивалентной концентрации без бактерий. В конце вегетации растений проводили учет надземной и подземной биомассы, вес и количество созревших плодов. Оценку эффективности обработки растений штаммом L. buchneri 600 проводили, сравнивая биометрические показатели в контрольном и опытном вариантах. Помимо этого, в конце вегетации производили отбор растений для анализа численности микроорганизмов в ризосферной зоне растений. Полевые эксперименты осуществлялись на полях ОАО Уторгошского льнозавода Шимского района Новгородской области.

Опытные делянки имели площадь 1 га, повторность опыта однократная. Норма высева льна - 100 кг/га. Глубина заделки семян - 2 см (Соловьев, 1978).

Эффективность штамма L. buchneri 600 против возбудителя фузариоза томатов Fusarium oxysporum испытывали в условиях вегетационного опыта на томате сорта «Земляк». Почву дополнительно инфицировали спорами фитопатогенного гриба F. оxysporum (Методические указания…, 1980).

Эффективность штамма L. buchneri 600 определяли при сопоставлении развития фузариоза томатов (Поликсенова, 1987) в опыте и контрольных группах (Методические указания…, 1980). Кроме того, проводили измерения биометрических показателей растений томатов, а также учитывали процент распространения фузариоза в стеблях томатов.

Производственные испытания по консервированию плющеного зерна:

овса и зерновой смеси (ячменя, пшеницы и тритикале) – штаммом L. buchneri 600 были проведены в хозяйствах Ленинградской области: ЗАО «Тельмана» и ЗАО «Копорье». Образцы для анализа качества плющеного зерна, численности микроорганизмов и микотоксинов отбирали в начале эксперимента и через суток. Определяли следующие показатели качества плющеного зерна: общую влажность (ГОСТ 13496.3-92), сухое вещество (ГОСТ 13496.3-80), содержание сырой клетчатки (ГОСТ 13496.2-91), общего азота (ГОСТ Р 51417-99), сырого протеина, растворимых углеводов (ГОСТ 26176-91), обменную энергию и кормовые единицы (ГОСТ Р 23638-90) (Дмитроченко, 1936). Анализ микотоксинов в плющеном зерне проводили с использованием иммуноферментного метода (ГОСТ Р 52471-2005).

Математическая и статистическая обработки результатов проведены стандартными методами дисперсионного анализа (Фишер, 1958;

Доспехов, 1985;

Методические указания…, 1985;

Лакин, 1990) с использованием программного обеспечения EXCEL XP/200.

Результаты и обсуждение Выделение и изучение свойств штаммов молочнокислых бактерий в опытах in vitro В рамках данных исследований было определено содержание молочнокислых бактерий в ризо- и филлосфере растений. Наибольшая численность молочнокислых бактерий была выявлена в ризосфере Petroselinum crispum L. (1,2106 КОЕ/г) (табл. 1). Высокое их содержание было обнаружено в филлосфере Trifolium pratense L. и Vicia sativa L. (105 КОЕ/г). Наличие молочнокислых бактерий в ризосфере Linum usitatissimum L., Glycine max L. и Barbarea vulgaris L. обнаружить не удалось. Численность исследуемых бактерий в ризосфере Medicago sativa L., Elytrigia repens L., Raphanus sativus L., Lactuca sativa L., Beta vulgaris L., Phleum pratense L. и Anethum graveolens L.

варьировала от 102 до 104 КОЕ/г.

Полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что молочнокислые бактерии широко распространены в ризо- и филлосфере высших растений. Факт наличия молочнокислых бактерий в ризо- и филлосфере растений был отмечен ранее рядом исследователей (Гардер и др., 1935;

Макарова, 1962;

Ruschmann et al., 1930;

Arnaudi, 1940;

Chen et al., 2005).

Так, Квасников (Квасников, 1948, 1956, 1958, 1960) на основании проведенных исследований сделал вывод, что почва – это одна из основных и первичных сред обитания молочнокислых бактерий.

При этом приведенные нами данные вступают в определенное противоречие с выводами ряда ученых, считавших, что молочнокислые бактерии либо полностью отсутствуют в ризо- и филлосфере растений, либо выделяются оттуда только в редких случаях (Weigmann et al., 1922;

Httig, 1927;

Barthel, 1937). Таких взглядов, к примеру, придерживался Шлегель (Шлегель, 1987), который утверждал, что молочнокислые бактерии совершенно не встречаются в почве. Возможно, основной причиной, обусловливающей недооценку почвы как среды обитания молочнокислых бактерий, являлось то, что при выявлении данных микроорганизмов применялись методы, обычно принятые при изучении их в молочных продуктах. При этом посторонние микроорганизмы, энергично размножающиеся на используемых средах, подавляли молочнокислые бактерии и не позволяли исследователям обнаружить их.

На следующем этапе работы нами из филло- и ризосферы растений было изолировано около 200 штаммов с характерными признаками молочнокислых бактерий. По результатам первичного отбора для дальнейших исследований были взяты 36 изолятов, проявивших антагонистическую активность. По совокупности результатов дифференциально-диагностического тестирования данные изоляты были отнесены к семейству Lactobacillaceae, роду Lactobacillus.

Таблица Количество молочнокислых бактерий в ризо- и филлосфере некоторых покрытосеменных растений, 103 КОЕ/г *- зеленой массы, * *-почвы Растение Источник Численность молочнокислых бактерий Dactilis glomerata L. филлосфера * 10,0±0, Vicia sativa L. филлосфера 130±4, Trifolium pratense L. филлосфера 110±3, Linum usitatissimum L. ризосфера * * Не обнаружено Medicago sativa L. ризосфера 4±0, Petroselinum crispum L. ризосфера 1200± Elytrigia repens L. ризосфера 1,0±0, Raphanus sativus L. ризосфера 0,8±0, Lactuca sativa L. ризосфера 8,0±0, Beta vulgaris L. ризосфера 40,0±1, Glycine max L. ризосфера Не обнаружено Barbarea vulgaris L. ризосфера Не обнаружено Phleum pratense L. ризосфера 1,0±0, Lycopersicon esculentum Mill. ризосфера 7,0±0, Anethum graveolens L. ризосфера 0,1±0, Изучен спектр антимикробного влияния выделенных изолятов, а также коммерческого штамма производства ООО «Биотроф» L. buchneri 600, используемого в качестве основы препаратов для консервирования плющеного зерна.

Максимальная антимикробная активность в отношении патогенных бактерий, а также фитопатогенных грибов была отмечена у штамма L. buchneri 600 (табл. 2), который был отобран для дальнейшей работы как наиболее перспективный для таких областей производства, как защита растений и консервирование кормов, где его антагонистический потенциал может быть использован в наибольшей степени.

Таблица Размеры зон ингибирования роста грибов и бактерий штаммом L. buсhneri Тест-объект Радиус зоны подавления роста тест-культуры, мм Fusarium oxysporum 16,0±0, F. solani 18,0±0, F. graminearum 14,0±0, Bacillus subtilis 15,0±0, B. mesentericus 16,0±0, Escherichia coli 4,0±0, Многими исследователями (Niku-Paavola et al., 1999 ;

Lavermicocca et al., 2000, 2003) установлено, что антимикробная активность молочнокислых бактерий связана с продуцированием ими различных метаболитов. В связи с этим были проанализированы антимикробные метаболиты у штамма L.

buchneri 600, проявившего высокую антагонистическую активность.

Хроматографический анализ этилацетатного экстракта культуральной жидкости штамма выявил наличие в анализируемом экстракте трех фракций с антимикробной активностью, в том числе валериановую и масляную кислоты (рис. 1). Таким образом, установлено, что основным типом взаимоотношений исследуемой культуры-антагониста с патогенами является антибиоз, обусловленный действием внеклеточных метаболитов.

Известно, что штаммы, обладающие антагонистическими свойствами, нередко являются активными стимуляторами роста растений. Поэтому очередной нашей задачей было оценить, как влияет отобранный перспективный штамм L. buсhneri 600 в различных концентрациях на рост и развитие проростков кресс-салата.

Анализ показал, что штамм обладает фитостимулирующим действием.

Самые высокие показатели роста и развития проростков кресс-салата были отмечены при концентрации 105 КОЕ г/семян. При этом длина стеблевой и корневой частей проростков увеличивалась на 13,3 и 36,7% соответственно по сравнению с контрольными вариантами.

Известно, что эффект стимуляции роста растений многими бактериями связан с образованием ими какого-либо вида или целого набора биологически активных веществ. В связи с этим для выяснения механизма положительного влияния штамма L. buсhneri 600 на рост растений было изучено влияние продуктов его метаболизма: валериановой и масляной кислот - на рост и развитие кресс-салата.

Рис. 1. Идентификация метаболитов штамма L. buсhneri 600, обладающих антифунгальной активностью