Антимикробные пептиды сорного растения stellaria media и их гены: экспрессия и устойчивость к фитопатогенным грибам
На правах рукописи
Шукуров Рахим Рахманкулыевич Антимикробные пептиды сорного растения Stellaria media и их гены:
экспрессия и устойчивость к фитопатогенным грибам 03.01.06. – Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2011
Работа выполнена в лаборатории стрессоустойчивости растений Государственного научного учреждения Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии (г. Москва).
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Бабаков Алексей Владимирович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Смирнов Алексей Николаевич кандидат биологических наук Джавахия Виталий Георгиевич
Ведущая организация:
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.
Защита состоится «29» июня 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при Всероссийском научно исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу:
127550, Москва, Тимирязевская 42.
Тел.: (499) 976-65-44, факс: (499) 977-09-47, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии Автореферат разослан «_» 2011 г., размещен на Интернет-сайте www.vniisb.ru
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Меликова С.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. На сегодняшний день грибные заболевания культурных растений являются одной из основных проблем в сельском хозяй стве, вызывая сильное падение урожайности и нанося огромный экономиче ский ущерб (Agrios, 1988;
Ali and Reddy, 2000). Помимо снижения урожая фи топатогенные грибы, выделяя токсины, могут прямо влиять на здоровье людей и животных. Классические попытки ограничения таких потерь в сельском хо зяйстве основываются на использовании разнообразных фунгицидов, которые помимо своей стоимости имеют еще один значительный недостаток, связанный с их высоким потенциалом загрязнения окружающей среды. В настоящее время благодаря развитию биотехнологии появилась возможность создания устойчи вых растений сельскохозяйственных культур с помощью методов генетической инженерии, используя собственные защитные механизмы растений. К одному из таких механизмов относится синтез пептидов растениями с высокой анти грибной активностью. В связи с этим, большой интерес представляют анти грибные пептиды сорных растений, произрастающих вместе с культурными и подвергающихся действию идентичных фитопатогенов.
Ранее в лаборатории стрессоустойчивости растений ВНИИСБ совместно с ИБХ РАН было выделено два новых гевеин-подобных пептида SmAMP1.1a и SmAMP2.2a (GenBank: CBJ21248.1;
CBJ21249.1) из семян сорного растения мокрицы (Stellaria media L.). Интерес к этому растению был вызван двумя при чинами. Во-первых, в России это растение растет повсеместно на влажных почвах, благоприятных для роста и развития грибной инфекции;
во-вторых, это растение произрастает очень часто рядом с овощными культурами и, сле довательно, вступает в контакт с грибами, поражающими эти растения и при этом само не проявляет признаков заболевания. Как оказалось, оба пептида длиной 35 (SmAMP1.1a) и 31 (SmAMP2.2a) аминокислотных остатков с шестью остатками цистеина, формирующих три дисульфидные связи, имеют высокую гомологию с ранее охарактеризованными гевеин-подобными пептидами из Amaranthus caudatus и Amaranthus retroflexus (Broekaert et al., 1992;
Lipkin et al., 2005). Показано, что выделенные пептиды проявляют высокую и специфичную антигрибную активность по отношению к некоторым фитопатогенным грибам:
Alternaria solani, A. consortiale, Botrytis cinerea, Bipolaris sorokiniana, Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum, F. oxysporum и Thielaviopsis basicola. Нуклеотидные последовательности кДНК этих пептидов кодируют пропептиды pro-SmAMP и pro-SmAMP2, имеющие уникальную структуру. Уникальность заключается в том, что каждый из пропептидов содержит в своем составе вместо одного два неодинаковых по длине гевеин-подобных пептида, разделенных линкерным пептидом из 10 аминокислотных остатков. В структуру каждого пропептида входят также сигнальный пептид и С-концевой домен (68 и 66 аминокислотных остатков соответственно) с высоким содержанием отрицательно заряженных боковых групп. При таком типе биосинтеза одновременное появление в S.
media нескольких пептидов с разным спектром антигрибной активности, веро ятно, дает ей определенные преимущества в защите от фитопатогенных грибов.
Уникальность структуры пропетидов антимикробных пептидов в S. media оп ределила наш интерес к их использованию для повышения устойчивости куль турных растений к патогенам.
Цель данной работы заключалась в выяснении особенностей экспрессии ге нов pro-SmAMP1-3 в растениях S. media, а также в определении возможности использования этих генов для повышения устойчивости культурных растений к грибным заболеваниям.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• Исследовать экспрессию генов антимикробных пептидов pro-SmAMP1-3 в S. media в стерильных растениях и в растениях при их контакте с фитопато генными грибами;
• Получить трансгенные растения Arabidopsis thaliana и Nicotiana tabacum, экспрессирующие ген pro-SmAMP1 и его производные, моделирующие извест ные структуры предшественников антимикробных пептидов;
• Провести молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений;
• Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность про мотора гена pro-SmAMP2;
• Определить эффективность различных 5’- делеционных вариантов нук леотидной последовательности промотора pro-SmAMP2 для экспрессии генов в гетерологичных системах.
Научная новизна. В данной работе впервые обращается внимание на моле кулярные механизмы устойчивости сорных растений к биотическому стрессу посредством синтеза пептидов, обладающих высокой антигрибной активно стью. Показано, что экспрессия генов антимикробных пептидов в сорном рас тении S. media характеризуется органоспецифичностью и существенно возрас тает при взаимодействии растения с патогеном. Установлено, что передача сигнала от патогена к растению происходит с участием жасмоновой кислоты.
Обоснована возможность использования гена pro-SmAMP1 для повышения ус тойчивости растений к биотическому стрессу. В растении S. media идентифи цирован новый сильный конститутивный растительный промотор и показана перспективность его использования в гетерологичных системах при наработке рекомбинантных белков в больших количествах.
Апробация работы. Две векторные генетические конструкции для агро бактериальной трансформации растений, созданные на базе pro-SmAMP1 - од на с полной копией гена, вторая с участком гена pro-SmAMP1, кодирующим сигнальный пептид вместе с антимикробным пептидом SmAMP1.1a, - были переданы в лабораторию генной инженерии растений ВНИИСБ для проведения работы по генетической трансформации томата (Solanum lycopersicum L.). В результате было продемонстрировано повышение устойчивости к фитофторозу трансгенных растений томата (Халилуев М.Р., 2010), несущих ген pro SmAMP1или ген SmAMP1.1a.
Содержание работы и ее результатов отражены в пяти выступлениях на ме ждународных и всероссийских конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из вве дения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, резуль татов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 298 источник. Материалы диссертации изложены на 126 страни цах машинописного текста, включая 14 таблиц и 36 рисунков.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Биологический материал. Семена S. media были собраны в средней по лосе России. Наращивание спор фитопатогенных грибов B. sorokiniana, F. cul morum, B. cinerea и T. basicola проводили в жидкой культуре на картофельно декстрозной среде 7 cуток при 25С в темноте.
Для измерения экспрессии генов растения S.media были выращены в сте рильных условиях. В сосуд со стерильным четырехнедельным растением вно сили два блока агара с мицелием гриба. Через два дня после достижения ми целием гриба стебля растения надземную часть растения отбирали для вы деления тотальной РНК. Для заражения растений использовали грибы B.
sorokiniana, T. basicola, F. culmorum и B. cinerea.
При изучении действия салициловой кислоты или метилжасмоната сте рильные четырехнедельные растения S.media опрыскивали растворами этих соединений и через 24 часа из них выделяли тотальную РНК.
Выделение геномной ДНК из растений проводили в соответствие с ме тодом (Kang and Yang, 2004), а тотальной РНК - с использованием реагента Trizol («Invitrogen», США) в соответствие рекомендациям фирмы-изготови теля. Все измерения проводили в трехкратной повторности.
Синтез кДНК, постановку ПЦР, клонирование генно-инженерных кон струкций осуществляли согласно протоколам «Molecular cloning» (Sambrook and Russell, 2001).
Экспрессию генов pro-SmAMP1-3 в S. media измеряли ОТ-ПЦP в реальном времени, используя пару ген-специфичных праймеров, подобранных к одина ковым фрагментам участков кДНК pro-SmAMP1-3. В качестве внутреннего стандарта использовали предварительно отсеквенированный фрагмент гена ак тина S. media. Определение количества ПЦР-продукта в образцах в режиме ре ального времени осуществляли при помощи флуоресцентно меченых гибриди зационных зондов TaqMan («Синтол», Россия) на приборе АНК-32 (ИАП РАН, Россия).
Для определения тканеспецифичности экспрессии генов pro-SmAMP1- тотальную РНК выделяли из листьев, корней, стеблей и цветов отдельно, полу чали кДНК и затем проводили ОТ-ПЦР.
Для агробактериальной трансформации в работе использовали генетиче ские конструкции на основе вектора pBI121, полученные ранее в нашей ла боратории и обозначенные как pBI-pro-SmAMP1, включающей в себя полную нуклеотидную последовательность кДНК гена pro-SmAMP1, pBI-SmAMP1.1a с сигнальным пептидом и антимикробным пептидом SmAMP1.1a и pBI SmAMP1.1а(CTP) с добавленной по отношению к предыдущей нуклеотидной последовательности С-концевого домена (рис.1).
Плазмидную ДНК выделяли, используя набор Wizard Plus SV Minipreps («Promega», США). Нуклеотидную DNA Purification System последовательность определяли на автоматическом секвенаторе AhFexpress II («Amersham Рharmacia Biotech», Великобритания) в группе анализа геномов ВНИИСБ.
Рис. 1. Схемы векторов для трансформации растений: p35S, CaMV35S промотор;
5’UTR и 3’UTR, нетранслируемые участки кДНК гена pro-SmAMP1;
SP, сигнальный пептид;
AMP1.1a и AMP1.2a, индивидуальные пептиды, образующиеся в результате процессинга пропептида pro-SmAMP1;
LP, линкерный пептид;
CTP, С-концевой домен.
Векторы для агробактериальной трансформации растений были введены в аг робактерию штамма AGL0 путем электропорации (Wise et al., 2006).
Трансформация растений табака и арабидопсиса.
Arabidopsis thaliana экотипа Col-0 были выращены и протрансформиро ваны методом «floral dip» в соответствии с описанием (Zhang et al., 2006). Го мозиготные растения, содержащие одну вставку целевого гена были ис пользованы в анализе по определению устойчивости отдельных трансгенных растений к грибу B. sorokiniana. В этих растениях был определен уровень экс прессии гена pro-SmAMP1 методом ОТ-ПЦР в реальном времени в при сутствии интеркалирующего красителя SybrGreen.
Все трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum), используемые в данной работе, были получены в лаборатории индуцированного рекомбино генеза (ВНИИСБ).
Анализ устойчивости отдельных трансгенных растений A. thaliana к грибу B. sorokiniana. Растения A. thaliana выращивали в горшочках, запол ненных почвой в климакамере (Gallenkamp Fi-totron 600H, United Kingdom) при круглосуточном освещении и температуре 22°С в течении 4-х недель. После чего на листья розетки наносили 20 мкл суспензии конидий гриба B.
sorokiniana (106 спор/мл). Через 7 дней измеряли высоту растений и следили за поражением листьев розетки и побегообразованием.
Анализ устойчивости линий трансгенных растений N. tabacum к фи топатогенному грибу T. basicola проводили, используя отделенные не поврежденные листья из среднего и верхнего ярусов растений. На левую сто рону листа, от центральной жилки, наносили 50 мкл стерильной воды, а на правую - суспензию конидий гриба (106 спор/мл) в том же объеме. Чашки ин кубировали 5 суток в темноте при 26°С. При оценке устойчивости учитывали площадь поражения, а также визуальные признаки заболевания: усыхание, ос ветление, либо пожелтение листовой пластины, побурение пятна и некроз тка ни.
Оценку выживаемости проростков трансгенных растений A. thaliana поколения Т3 и N. tabacum поколения Т1 проводили на инфекционном фоне, создаваемом в почве: B. sorokiniana для арабидопсиса и T. basicola для табака.
Для этого предварительно была определена инфекционная нагрузка фитопато генными грибами, приводившая к гибели 50% контрольных растений. Семена трансгенных и контрольных растений высевали в почву, заполненную в чашки Петри, и инкубировали 9 суток в климакамере при круглосуточном освеще суспензию конидий гриба ( нии. К подсчитанным всходам добавляли спор/мл) в количестве 10 мл и инкубировали 2 суток в термостате при 24°С.
Далее растения переносили в климакамеру и через 5 суток подсчитывали про цент выживших проростков.
Нуклеотидная последовательность промотора pro-SmAMP2 была опре делена с помощью метода "прогулка по хромосоме" (Евроген, ИБХ РАН) и проанализирована с помощью программ PLACE Web Signal Scan (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html) (Higo et al., 1999), PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) (Lescot et al., 2002) и Vector NTI 8 Suite (InforMax inc.).
Амплификацию нуклеотидной последовательности промоторной об ласти гена pro-SmAMP2 и ее 5’-делеционных вариантов (-2160 п.н., -1544 п.н., -1189 п.н., - 862 п.н.) проводили с использованием Pfu-полимеразы (СибЭнзим, Россия), вектора pGEM-T и праймеров, содержащих рестриктные сайты фер ментов EcoRI и NcoI. Полученные ампликоны были клонированы в вектор pCAMBIA 1381Z с репортерным геном GUS и проверены секвенированием.
Трансформацию A. tumefaciens штамма AGL0 полученными генетическими конструкциями проводили, используя так называемый "трехродительский" ме тод (Wise et al., 2006).
Получение трансгенных растений N. tabacum поколения Т0, трансформи рованных генетическими конструкциями с 5’- делеционными вариантами промотора pro-SmAMP2 было проведено в лаборатории индуцированного ре комбиногенеза (ВНИИСБ) в соответствие с методом (Horsch et al., 1985).
Измерение активности GUS в трансгенных растениях табака было прове дено флуорометрическим методом (Jefferson et al., 1987) с использованием флуориметра LS55 (Perkin Elmer, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ Экспрессия генов pro-SmAMP1-3.
Антимикробные гевеин-подобные пептиды были идентифицированы в зрелых семенах S. media. Для оценки участия этих пептидов в защите целого растения S. media от фитопатогенов на начальном этапе работы представлялось целесообразным исследовать экспрессию кодирующих их генов в других ор ганах растения. Методом ОТ-ПЦР было установлено, что все три гена pro SmAMP1, pro-SmAMP2 и pro-SmAMP3 экспрессируются по-разному в S. me dia (рис. 2 А.) Наибольший уровень экспрессии всех 3-х генов наблюдался в корнях и стебле. Pro-SmAMP2 имел практически одинаковый уровень экспрес сии во всех проверенных органах растения, pro-SmAMP3 слабо экспрессировал ся в листьях и бутонах, а pro-SmAMP1 показал наименьший уровень экспрессии в листьях.
После выяснения органоспецифичности экспрессии генов pro-SmAMP1- нами была проверена их индуцибельность при грибном заражении растения мокрицы. Благодаря высокой гомологии генов pro-SmAMР1-3 нам удалось по добрать праймеры и TaqMan зонд, которые отжигаются на всех трех генах, и поэтому мы смогли получить информацию об усредненном уровне экспрес сии одновременно для всех трех генов (рис. 2 Б). Оказалось, что средний уро вень экспрессии pro-SmAMР1-3 при взаимодействии S. media с грибами увели чивался, при этом различные виды грибов по-разному влияли на экспрессию генов pro-SmAMР1-3.
Получив эти данные, мы попытались ответить на вопрос: имеется ли раз личие в изменении экспрессии отдельно у каждого из этих генов. Эксперимен ты показали (рис. 2 В), что разные грибы неодинаково влияли на экспрессию отдельных генов;
так наибольшее возрастание уровня экспрессии наблюда лось у pro-SmAMP1 при взаимодействии с грибом R. solanum (до 70 раз), сред нее – в 2-9 раз у pro-SmAMP2 и наименьшее – у pro-SmAMP3. В ряде случаев для гена pro-SmAMP3 наблюдалось падение уровня экспрессии. Интересно от метить, что ген pro-SmAMP2 экспрессировался на очень высоком уровне и у контрольных (стерильных) растений, пороговый цикл для него в ПЦР в реаль ном времени был сравним с пороговым циклом для гена актина мокрицы. Сле дует отметить, что во всех экспериментах по измерению влияния различных грибов на экспрессию генов pro-SmAMP1-3 не было отмечено заметных при знаков грибного поражения S.media, что указывает на высокую устойчивость этого растения к фитопатогенным грибам.
Известно (Reymond and Farmer, 1998), что в активации защитных механиз мов у растений принимают участие молекулы салициловой и жасмоновой ки слот. Проведенные эксперименты (рис.2 Б) показали, что индукция экспрес сии pro-SmAMP1-3 наблюдается при обработке S. media метилжасмонатом, но не салициловой кислотой.
Рис.2. Экспрессия генов pro-SmAMP1-3 в S. media. A. Экспрессия генов pro-SmAMP1-3 в разных органах растения S. media, изме ренная методом ОТ-ПЦР (выровненная по отношению к экспрессии гена актина S. media) ) К – корни, Л – листья, С – стебель, Б – бутоны.Б. Изменение экспрессии суммы генов pro-SmAMP1-3 (по отношению к уровню экспрессии гена актина) в стерильных рас тениях S. media, подвергнутых заражению грибами или действию метилжасмоната и салициловой кислоты.
В. Изменение экспрессии каждого из генов pro-SmAMP1-3 при грибном заражении стерильных растений S. media.
Повышение устойчивости трансгенных растений, экспрессирующих ген pro-SmAMP1.
A. thaliana. Для того чтобы выяснить приводит ли к увеличению устойчи вости к грибным заболеваниям сверхэкспрессия генов антигрибных пептидов pro-SmAMP1-3 в гетерологичной растительной системе, нами был выбран ген пропептида pro-SmAMP1, имеющего в своем составе пептид, показавший в ра нее проведенных экспериментах наибольший уровень антигрибной активно сти. Трансформацию растений проводили тремя генетическим конструкциями, показанными на рис. 1, моделирующие известные структуры пропептидов ан тимикробных пептидов растений.
Выбранные последовательности кДНК гена pro-SmAMP1 были клонированы в вектор pBI121 под контролем конститутивного промотора вируса мозаики цветной капусты CaMV35S. В качестве объектов для трансформации были вы браны два вида растений, относящиеся к разным семействам двудольных арабидопсис и табак, как наиболее хорошо изученные и часто применяемые в качестве модельных растений в различных исследованиях.
Молекулярно-биологический анализ был проведен на трансгенных расте ниях гомозиготных линий A. thaliana поколения Т3. Измерения экспрессии це левых генов, проведенные методом ПЦР в реальном времени, показали, что практически у всех растений, трансформированных конструкциями pBI SmAMP1.1a и pBI-SmAMP1.1a(CTP), уровень экспрессии был значительно ни же уровня экспрессии актина, в то время как у восьми из девяти растений A.
thaliana, трансформированных полной копией гена pro-SmAMP1 (вектор pBI proSmAMP1), он был сопоставим с уровнем экспрессии гена актина (рис. 3 А), а в некоторых растениях уровень мРНК pro-SmAMP превышал уровень мРНК актина в 4 раза (рис. 3 А).
Девять отобранных растений A. thaliana, трансформированных вектором pBI-pro-SmAMP, параллельно с растениями дикого типа, служившими в каче стве контрольных, проверяли на устойчивость к грибу B. sorokiniana. На ри сунке 3 Б. эти растения показаны через одну неделю после заражения суспен зией конидий гриба B. sorokiniana. Различия между трансгенными растениями и контрольными заключались в высоте, длине цветоноса, количестве цветов и бутонов. У контрольных растений наблюдалась существенная задержка в росте и уменьшение длины цветоноса по сравнению с трансгенными растениями (рис. 3 Б). Кроме того, трансгенные растения с высоким уровнем экспрессии pro-SmAMP1 мало отличались от незараженных контрольных образцов по габи тусу, количеству цветов и бутонов.
Оказалось также, что имеет место корреляция между высоким уровнем экс прессии pro-SmAMP1 и повышенной устойчивостью трансгенных растений к фитопатогенному грибу (табл. 1). Например, у растений № 5, 9 и 15 наблюда лось превышение экспрессии трансгена по сравнению с уровнем экспрессии ак тина в 3.1, 4.1 и 3.7 раза соответственно. Именно эти растения проявили и наи большую устойчивость к фитопатогенам. В то же время растения № 10 и 14, у которых относительный уровень экспрессии трансгена составлял 0.01 и 1. соответственно, практически ничем не отличались по устойчивости от кон трольных растений, подвергнутых заражению.
Табл. 1. Устойчивость растений A. thaliana поколения Т3, трансформиро ванных конструкцией pBI-pro-SmAMP1, к фитопатогенному грибу B. sorokinia na Т Относительный № растения Степень поражения растения уровень экспрессии* Дикий тип +++ 2 ++ 3, 4 ++ 2, 5 + 3, 9 + 4, 10 +++ 0, 12 ++ 2, 13 ++ 3, 14 ++ 1, 15 + 3, * уровень экспрессии гена pro-SmAMP1 в растениях A. thaliana по отношению к уровню экспрессии гена бета-актина +++ - некроз ткани, значительное осветление листа, отсутствие цветов ++ - значительное осветление листа + - локальное осветление листа. Растения в возрасте 4-х недель заражали грибом B.
sorokiniana, нанося 20 мкл суспензии конидий гриба (106 спор/мл) на листья розетки. Через 7 дней измеряли высоту растений и следили за поражением листьев розетки и побегообразованием.
Рис. 3. Arabidopsis thaliana A. Относительный уровень экспрессии трансгена в растениях A. thaliana, (по отношению к уровню экспрессии актина) по данным ПЦР в реальном времени. По горизонтальной оси номера растений A. thaliana поколения Т3 (qgene-96). Б. Пятинедельные растения A. thaliana, зараженные грибом B.sorokiniana. Растения в возрасте пяти недель заражали суспензией конидий грибов B.sorokiniana (106 клеток/мл) и через 7 дней анализировали распространение инфекции. Контрольные, незараженные растения опрыскивали стерильной водой. 1- дикий тип, контроль, 2 – дикий тип, зараженный грибом, 3 и 4 – трансгенные растения № 9 и №15 с геном pro-SmAMP1, подвергну тые заражению. В. Выживаемость проростков трансгенного A. thaliana, после инфицирования грибом B. sorokiniana. Col-0 – дикий тип;
pro SmAMP1, SmAMP1.1a, SmAMP1.1a(CTP) проростки Т3 поколения трансгенного A. thaliana.
Растения, трансформированные конструкциями pBI-SmAMP1.1a и pBI SmAMP1.1a(CTP) также проверяли на устойчивость к грибу B. sorokiniana, од нако значимых различий между зараженными растениями дикого типа и транс формантами не наблюдалось.
Нами была также проведена оценка выживаемости проростков трансгенных растений A. thaliana поколения Т3 на инфекционном фоне с грибом B.
sorokiniana, подобранным таким образом, чтобы выживаемость контрольных растений составляла 50%. По результатам эксперимента оказалось, что самая высокая степень выживаемости (82%) была у трансгенных растений, несущих полную копию гена pro-SmAMP. Трансгенные растения с конструкциями pBI SmAMP1.1a и pBI-SmAMP1.1a(CTP) показали меньшую степень выживаемости - 72% и 66% соответственно. Тем не менее, выживаемость всех трансгенных растений была выше, чем в контрольном варианте (рис. 3 В).
N. tabacum. Полученные нами первичные трансформанты N. tabacum с ге нами pro-SmAMP1, SmAMP1.1a, SmAMP1.1a(CTP) были высажены в почву и выращивались в теплице при естественном освещении. В качестве контроля служили растения, трансформированные геном nptII. В предварительных экспериментах при проведении чашечных тестов по устойчивости отделенных листьев табака Т0 к фитопатогену T. basicola нами были отобраны трансген ные растения, показавшие повышенную устойчивость к патогену: два растения с геном pro-SmAMP1 (№ 18, и 99) и одно с геном SmAMP1.1a (№189). От этих линий были получены семена поколения Т1, которые высаживали в почву на искусственно созданном инфекционном фоне с грибом T. basicola (рис. 4 А).
Установлено, что наибольшая выживаемость проростков оказалась у потомства pro-SmAmp1 № 99 и достигала 89% (рис. 4 Б). Надо отметить, что в этом экспе рименте мы наблюдали гораздо более низкую выживаемость растений SmAMP1.1a № 189 (15%) по сравнению с контролем nptII (48%).
А.
Б.
Рис. 4. А. Оценка выживаемости проростков трансгенных растений N. tabacum поколения Т1 от линий pro-SmAMP1 и SmAMP1.1a, выращенных на инфекционном фоне с грибом T.
basicola. 1 – SmAMP1.1a №189;
2 – pro-SmAMP1 №99;
3 – контроль nptII №9 без заражения;
– nptII №9. Б. Выживаемость проростков трансгенных растений N. tabacum pro-SmAMP1 и SmAMP1.1a, выращенных на инфекционном фоне с грибом T. basicola.По горизонтальной оси - номера линий трансформантов N. tabacum, от которых получены семена для проведения эксперимента.
Активность GUS в растениях, экспрессирующих репортерный ген под контролем 5’- делеционных вариантов промотора гена pro-SmAMP2.
Анализ экспрессии генов антимикробных пептидов в растении S. media показал, что ген pro-SmAMP2 экспрессировался на очень высоком уровне, сопоставимым с уровнем экспрессии гена – актина. Это послужило основанием начала работы по установлению нуклеотидной последовательности промотора гена pro-SmAMP2. Нуклеотидная последовательность промоторной области длиной 2160 п.н. была определена с помощью метода "прогулка по хромосоме. Для того чтобы охарактеризовать идентифицированную промоторную область нами были получены четыре 5’- делеционных варианта, показанные на рис. 5. Эти делеционные варианты были использованы в качестве промотора репортерного гена GUS в векторе pCAMBIA 1381Z. В качестве положительного контроля была использована плазмида pCAMBIA1301, где ген GUS находится под контролем CaMV35S промотора.
Полученными конструкциями при помощи агробактериального метода были протрансформированы растения N. tabacum.
Рис. 5. Схема конструкций с промотором pro-SmAMP2 для анализа экспрессии GUS (бе та-глюкоронидазы) в трансгенных растениях табака. Серии 5'-делеционных фрагментов нук леотидной последовательности промотора гена pro-SmAMP2 были слиты с репортерным ге ном GUS в векторе pCAMBIA1381Z. В качестве конструкции, где GUS находится под кон тролем CaMV35S промотора, была использована плазмида pCAMBIA1301. Int – каталазный интрон в последовательности гена GUS.
Всего было получено и проанализировано 19 линий трансгенных растений для конструкции, (-2160) 22 растения для (-1544) 17 для (-1189), 20 растений (-862) и 10 растений CaMV35S:GUS. Измерение активности GUS в экстрактах из трансгенных растений показало (рис.6) что, во-первых, уровень активно сти GUS был наименьшим у наиболее длинного фрагмента промотора pro SmAMP2 (-2160 п. н. от точки начала трансляции);
во-вторых, абсолютные зна чения активности GUS снижались по мере укорочения фрагмента, начиная с 1544 делеционного фрагмента;
в-третьих, уровень активности GUS в большин стве растений под контролем 5'- делеционных вариантов промотора pro SmAMP2 был существенно выше активности GUS в растениях, содержащих репортерный ген под контролем CaMV35S промотора.
Рис. 6. Активность GUS отдельных трансгенных растений N. tabacum, содержащих ген GUS, под контролем 5'-делеционных фрагментов нуклеотидной последовательности промо тора гена pro-SmAMP2 и промотора CaMV35S. Активность GUS измерена флуориметриче ским способом, используя 4MUG в качестве субстрата.
ОБСУЖДЕНИЕ Взаимодействие S. media с разными видами фитопатогенных грибов приводит к активации экспрессии всех генов pro-SmAMP1-3, однако, как видно из рис. 2 В. их экспрессия возрастает неодинаково. Наибольший эффект вызывали F. culmorum и B. cinerea, наименьший – B. sorokiniana. Одна из причин наблюдаемого различия может быть связана с самим экспериментом, а именно, с фиксированным временем измерения экспрессии генов для всех грибов. При разной скорости развития ответа растения при контакте с конкретным фитопатогеном максимальный ответ может достигаться через разное время, что должно приводить при одномоментном измерении экспрессии генов pro-SmAMP1-3 к различным величинам. Другая причина может заключаться в реальных различиях амплитуд ответа S. media при контакте с разными грибами, обусловленных специфичностью взаимодействия S. media с разными видами фитопатогенных грибов.
Измерения экспрессии генов показали, что все три пропептида pro SmAMP1-3 экспрессируются в корнях и стеблях S. media, pro-SmAMP1 экспрес сируется также в бутонах, а pro-SmAMP2 и в бутонах и в листьях (рис. 2 А). Из этих данных следует, что корни и стебли S. media наиболее защищены от гриб ной инфекции, поскольку в них, видимо, синтезируются все 5 антимикробных пептидов. Такой результат выглядит вполне логичным с точки зрения защиты от грибной инфекции, поскольку она, возникая в почве, проникает через корень и распространяется по растению через стебель.
Эксперименты с обработкой стерильных растений салициловой кислотой и метилжасмонатом, показали, что экспрессия генов pro-SmAMP1-3 не меняется под действием салициловой кислоты, но активируется жасмонатом (рис. 2 Б).
Полученные нами результаты подтверждают, что гены гевеин-подобных пеп тидов или экспрессируются конститутивно (Koo et al., 2002) или активируются путем передачи сигнала, не зависимым от салициловой кислоты.
Анализ трансгенных растений A. thaliana и N. tabacum показал, что ус тойчивость к фитопатогенным грибам увеличивается только у растений, экс прессирующих полную копию кДНК пропептида pro-SmAMP1, что дает допол нительные сведения об определенной биологической роли гевеин-подобных пептидов S. media в защите растения-хозяина.
Уровень экспрессии трансгена, измеренный с помощью ПЦР в реальном времени, показал, что у всех растений A. thaliana pBI-SmAMP1.1a и pBI SmAMP1.1a(CTP) он был значительно ниже уровня экспрессии актина, в то время как у растений, трансформированных полной копией гена pro-SmAMP1, такой низкий уровень наблюдался только у одного растения (рис. 3 А). Сущест венное различие в экспрессии при прочих равных условиях, вероятно, связано с большей стабильностью мРНК полной копии гена pro-SmAMP1.
Повышенная устойчивость трансгенных растений A. thaliana и N. tabacum к фитопатогенным грибам, экспрессирующих именно ген pro-SmAMP1, также может быть обусловлена вероятным процессингом пропептида pro-SmAMP1, при котором происходит двукратное увеличение общей кон-центрации анти микробных пептидов и благодаря различию в специфичности антигрибной ак тивности пептидов повышается устойчивость, по-видимому, к более широко му кругу фитопатогенных грибов. Частично это подтверждено нашими данны ми об устойчивости трансгенных растений A. thaliana и N. tabacum к несколь ким видам фитопатогенным грибам.
Анализ идентифицированной последовательности промотора гена pro SmAMP2 показал наличие специфических мотивов, которые обнаруживаются только у сильных растительных промоторов (Sawant et al., 1999). 5’- делецион ные варианты -2160, 1544, 1189, 862 п. н. промотора гена pro-SmAMP2 были достаточны, чтобы обеспечивать высокий и конститутивный уровень экспрес сии репортерного гена GUS под их контролем в трансгенных растениях N. taba cum. В полученных нами 3-х делеционных вариантах промотора гена pro SmAMP2 (-1544, -1189, -862) активность GUS в трансгенных растениях была на порядок выше аналогичной величины в растениях с геном GUS под контро лем промотора CaMV35S. Активность GUS в трансгенных растениях с деле ционном вариантом -2160 п.н. была гораздо ниже по сравнению с активностью GUS, измеренной в растениях с более короткими 5’-делеционными вариан тами (-1544, -1189, -862). Этот результат, вероятно, связан с присутствием в участке -2160 -1544 неизвестных супрессорных регуляторных элементов, присутствие которых значительно снижает силу промотора. Также интересно отметить, что с укорочением нуклеотидной последовательности 5'- промотор ной области pro-SmAMP2 возрастает стабильность экспрессии GUS, что про явилось в увеличении относительного количества трансгенных растений с вы соким уровнем активности GUS (Рис.6). Возможно, это связано каким-то обра зом с эффектом положения целевого гена при встраивании в геном N. tabacum (Finnegan and McElroy, 1994).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Уникальность структуры предшественников антимикробных пептидов в S.
media вместе с их высокой антигрибной активностью определяет интерес к их использованию в биотехнологии культурных растений. Возможность примене ния их для таких целей показана на примере двух видов растений, относящиеся к разным семействам – A. thaliana и N. tabacum. На основании полученных дан ных можно сделать вывод о перспективности использования гена пропептида pro-SmAMP1 из S. media для повышения устойчивости культурных растений к фитопатогенным грибам. Кроме этого оказалось, что несомненный интерес для биотехнологии представляет также идентифицированный нами сильный расти тельный промотор гена pro-SmAMP2, который может быть использован в гене тической инженерии растений вместо широко распространенного вирусного промотора CaMV35S.
Проведенное исследование показало, что сорное растение S. media обладает эффективной защитой против фитопатогенов. Причем эффективность опреде ляется как уникальной структурой предшественников антимикробных пептидов и индуцибельностью их промоторов, так и, по-видимому, высокой стабильно стью кодирующей их мРНК. Полученные знания об устройстве защитной сис темы сорного растения указывают на разнообразие в мире растений защитных механизмов против фитопатогенов и могут оказаться чрезвычайно полезными для понимания путей улучшения устойчивости культурных растений к гриб ным болезням.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что сорное растение S. media обладает эффективной защитой против фитопатогенов, обусловленной как уникальной структурой белков-предшественников антимикробных гевеин-подобных пептидов, так и высоким уровнем накопления кодирующей их мРНК.
2. Показано, что гетерологичная экспрессия гена пропептида pro-SmAMP из в растениях A. thaliana и N. tabacum приводит к повыше S. media нию устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным грибам, что указывает на перспективность использования гена pro-SmAMP1 в биотехнологии культурных растений.
3. В нуклеотидной последовательности промоторной области гена pro SmAMP2 идентифицированы три 5’- делеционных фрагмента, каждый из которых проявил себя в трансгенных растениях N. tabacum в качестве сильного промотора.
4. Идентифицированные фрагменты существенно превосходят по эффек тивности широко используемый в генетической инженерии растений ви русный промотор CaMV35S и могут найти применение в современной биотехнологии растений.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Шукуров Р.Р., Вобликова В.Д., Никонорова А.К., Егоров Ц.А., Гришин Е.В., Бабаков А.В. Повышение устойчивости растений Arabidopsis thaliana к фитопатогенным грибам, экспрессирующих гевеиноподобные пептиды из сор ного растения Stellaria media. Доклады РАСХН. - Москва, 2010. - С.24- 2. Егоров Ц.А., Мусолямов А.Х., Никонорова А.К., Вобликова В.Д., Шуку ров Р.Р., Бабаков А.В., Гришин Е.В. Антимикробные пептиды семян звездчат ки (Stellaria media L.) – VI Съезд общества физиологов растений России. Меж дународная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» Сыктывкар, 2007. Материалы докладов в трех частях, часть 2: 124 3. Вобликова В.Д., Никонорова А.К., Комахин Р.А., Шукуров Р.Р. Созда ние модельных трансгенных растений, экспрессирующих гены антимикробных пептидов из Stellaria media, для изучения механизмов устойчивости к фитопа тогенным грибам, с оценкой перспективы их практического использования. – «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России» Сергиев Посад, 2009. Материалы конференции РАСХН-РФФИ, 60- 4. Шукуров Р.Р., Вобликова В.Д., Никонорова А.К., Егоров Ц.А., Бабаков А.В. Молекулярные основы преимущества сорных растений в устойчивости к биотическому стрессу на примере растения Stellaria media. Всероссийский сим позиум «РАСТЕНИЕ И СТРЕСС (Plants under Environmental Stress)», Тезисы докладов. – Москва, 2010. – С.401- 5. Shukurov R.R., Voblikova V.D., Nikonorova A.K., Komakhin R.A., Komakhina V.V., Egorov T.A., Grishin E.V., Babakov A.V. 2011. Transfor mation of tobacco and arabidopsis plants with Stellaria media genes encoding novel hevein – like peptides increases their resistance to fungal pathogens, Transgenic Re search, in press.