Создание новых форм биопрепаратов на основе клубеньковых и ассоциативных ризобактерий и оценка их эффективности

На правах рукописи

ЛАКТИОНОВ Юрий Владимирович СОЗДАНИЕ НОВЫХ ФОРМ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ И АССОЦИАТИВНЫХ РИЗОБАКТЕРИЙ И ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ 03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург — 2010

Работа выполнена в лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных ризобактерий ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сель скохозяйственной микробиологии (ГНУ ВНИИСХМ г. Санкт-Петербург)

Научный консультант: кандидат биологических наук Кожемяков Андрей Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Круглов Юрий Владимирович доктор биологических наук, профессор Вишнякова Маргарита Афанасьевна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений РАСХН

Защита состоится «» 2010 г. в _ ч на заседании объединенного совета ДМ 212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адре су: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Биолого-почвенный факультет СПбГУ, аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «» марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е. И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Реальной альтернативой использованию агрохимикатов являются микробные препараты, которые во взаимодействии с растением выполняют целый комплекс полезных функций (улучшение мине рального питания растений, защиту их от фитопатогенов, повышение устойчи вости к стрессовым условиям, стимуляция роста растений и др.), практически не влияя на экологическую обстановку в агроценозе (Кожемяков, 1997;

Зава лин, 2005;

Тихонович и др., 2005). Прогресс в области производства и приме нения биопрепаратов во многом связан с разработкой эффективных, высоко технологичных, сохраняющих долгое время исходные свойства препаративных форм.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является созда ние технологичных, экономически выгодных форм биопрепаратов высокого качества, а также проверка их эффективности на основных сельскохозяйствен ных культурах.

В соответствии с целью исследований были определены следующие зада чи:

1. Разработать прогрессивную технологию производства биопрепаратов на основе вермикулита и жидких форм препаратов.

2. Подобрать композиции питательных веществ в препарате, обеспечиваю щих его высокое качество.

3. Определить оптимальные температурные режимы хранения биопрепара тов.

4. Изучить эффективность разных форм биопрепаратов (на торфе, на вер микулите, жидких) на различных видах бобовых и небобовых растений.

5. Оценить эффективность совместного применения биопрепаратов с ком плексом микроэлементов, а также на различных фонах минерального питания.

Научная новизна. Впервые выполнены комплексные исследования по изучению возможностей использования перспективного носителя (вермику лит) для симбиотических и ассоциативных ризобактерий с целью создания тех нологичной и эффективной формы микробных биопрепаратов. Разработаны способы культивирования микроорганизмов на различных носителях с исполь зованием оптимизированных питательных сред. Подобраны оптимальные соче тания стабилизирующих, питательных и защитных субстратов, обеспечиваю щих длительное хранение и высокую эффективность биопрепаратов. Усовер шенствован состав жидкой формы биопрепарата, позволяющей увеличить срок хранения с 20 до 60 суток. Впервые изучено влияние комплекса новых компо зиций микроэлементов на эффективность биопрепаратов.

Практическая значимость. Созданы новые формы биопрепаратов, об ладающие высокой технологичностью, эффективностью и экономичностью.

Разработанная биотехнология является универсальной для различных видов клубеньковых и ассоциативных ризобактерий. Новые формы биопрепаратов апробированы на нескольких сельскохозяйственных культурах (соя, козлятник, кукуруза, пшеница) в различных агроэкологических условиях.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана новая форма биопрепарата на тврдом носителе (вермику лит), обеспечивающая высокую эффективность микроорганизмов, удобная в производстве и применении.

2. Оптимизированы жидкие формы биопрепаратов, которые способны со хранять свои потребительские качества в течении 2-х месяцев.

3. Биопрепараты на основе вермикулита по эффективности не уступают препаратам на основе торфа, а также жидким формам (и даже превосходят их).

4. Инокуляция семян новыми бактериальными препаратами улучшает ми неральное питание растений и повышает качество растительной продукции.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ме ждународной школе молодых учных "Прикладные и фундаментальные аспек ты сигнальных процессов, развития и эффективности симбиозов микроорга низмов с корнями" (Санкт-Петербург, 2007);

на международной научной кон ференции "Костычев и современная сельскохозяйственная микробиология" (Ялта, 2007);

на международной научной конференции, посвящнной 40-летию южной опытной станции "Почвенная микробиология и стабильное развитие аг роэкосистем" (Алушта, 2008);

на V Всероссийском съезде почвоведов им. В.В.

Докучаева (Ростов-на-Дону, 2008);

на конференции профессорско преподавательского состава Санкт-Петербургского Государственного аграрно го университета (Санкт-Петербург, 2009);

на международной молодежной рос сийско-польской конференция "Молекулярная биология растений" (Польша, Гданьск, 2009).

Публикации результатов исследований. По материалам исследований опубликовано 9 работ.

Структура и объм работы. Диссертация состоит из введения, литера турного обзора, описания объектов и методов исследования, эксперименталь ной части, заключения, выводов, приложения и списка литературы.

Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит таблиц, 29 рисунков. Список литературы включает 228 наименований, в числе которых 86 на иностранных языках.

Объекты и методы исследования Использованные микроорганизмы: для исследований из коллекции ГНУ ВНИИСХМ были взяты: клубеньковые бактерии сои (Bradyrhizobium japonicum: штаммы 634б, 640б, 645б, 626а), клубеньковые бактерии козлятника (Rhizobium galegae: штаммы 912, 913), ассоциативные ризобактерии (Arthrobacter mysorens, шт.7;

Azospirillum brasilense, шт.8;

Agrobacterium radiobacter, шт.204).

Растительный материал: в полевых и вегетационных опытах использо вались следующие сорта растений:

Соя – сорта: «Дон 21», «Дива», «Донская» Кукуруза – сорта: «Зерноградский 282МВ», «Зерноградский 330МВ» Пшеница – сорт «Харьковская-23» В качестве носителя бактерий использовались:

Вспученный вермикулит - продукт обжига минерала вермикулита. Ис пользовалась средняя фракция (0,6-1,5 мм) согласно ГОСТу 12865-67. Верми кулит является экологически чистым и стерильным материалом, не токсичен, не содержит тяжелых металлов, pH - нейтральный.

Торф – органическая порода, образующаяся в результате биохимического процесса разложения болотных растений при повышенной влажности и недос татке кислорода.

Питательные и стабилизирующие добавки:

«ДАРИНА» - высококонцентрированный комплекс гуминовых органо минеральных удобрений на основе сапропеля. В составе «ДАРИНЫ» природ ные стимуляторы роста - гуминовые и фульво- кислоты и также другие биоло гически активные вещества.

Гуматы (калиевые) – группа естественных высокомолекулярных веществ, которые характеризуются высокой физиологической активностью.

Глицерин – химическое соединение, широко используемое в криобиоло гии в качестве криопротектора (Yoon et al, 2003).

Сорбат калия (калий сорбиновокислый) - калиевая соль сорбиновой ки слоты. Является природным консервантом и широко применяется при консер вировании пищевых продуктов.

Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) – продукт взаимодействия целлюлозы с монохлоруксусной кислотой. КМЦ используется как стабилизатор консистен ции, загуститель, средство для капсулирования.

Число жизнеспособных клеток определяли методом серийных разведе ний.

Состав комплексов микроэлементов:

«АКВАМИКС-Т»: комплексное водорастворимое комбинированное мик роудобрение, предназначено для предпосевной обработки семян бобовых трав.

«Аквамикс-т» содержит следующие микроэлементы: Mo – 16,9%;

B -3,4%;

Co 2,1%;

Cu-2,8 %;

Zn – 2,8% в соотношениях, соответствующих физиолого биохимическим потребностям бобовых.

«МИКРОМАК»: минеральное удобрение предназначено для предпосев ной обработки семян, состоит из двух частей «Микромак-А» и «Микромак-Б».

Массовая доля питательных веществ для «Микромак-А»:

Сu-38±1;

Zn-34±1;

Mg-14,5±1;

Ni-0,17±0,01;

Li-0,6±0,01;

Co-22±0,5;

Fe 5,2±0,2;

Mn-3,2±0,2.

Массовая доля питательных веществ для «Микромак-Б»:

K2O-37±1;

Cr-1,2±0,1;

Mo-6,6±0,2;

B-4,3±0,2;

V-0,9±0,05;

Se-0,08±0,01;

P2O5-3±0,1.

Суммарное содержание азота в «Микромак-А» и «Микромак-Б» - 47± Назначение – предпосевная обработка семян зерновых, зернобобовых и технических культур.

«МИКРОЭЛ»: комплексное минеральное удобрение для некорневой об работки посевов сельскохозяйственных культур. Обработка препаратом акти визирует процессы фотосинтеза и азотфиксации.

Содержание микроэлементов в препарате (%):

Азотфиксирующий и фотосинтезирующий комплекс: Сu-0,64;

Zn-1,36;

B 0,15;

Mn-0,29;

Fe-0,40;

Mo-0,44;

Co-0,084;

Mg-0,89.

Схемы опытов и методика проведения исследований.

В условиях лабораторного опыта изучено влияние различных добавок и протекторов (в питательную среду для инокулюма, в субстрат) на динамику численности микроорганизмов в препарате и на его эффективность. Также оп ределены оптимальные составы сред жидких форм препаратов. В качестве ис точников питания использовали: глюкозу, сахарозу, препарат «Дарина», гуматы и мелассу в различных комбинациях и соотношениях. Как стабилизатор ис пользовали глицерин, КМЦ, сорбат калия.

При изучении влияния температуры на изменение численности бактерий в препарате их хранили при температурах +18…+210С и +4…+60С.

Титр культур определяли в динамике через определнные интервалы времени. Для определения жизнеспособности и количественной оценки бакте рий использовали метод серийных предельных разведений.

Вегетационный опыт Изучалась эффективность разработанных форм биопрепаратов различной влажности, с добавками, на фоне стимуляторов роста растений «Аквамикс», «Микромак» и «Микроэл».

Вегетационные опыты проводились на опытном участке ВНИИСХМ на дерново-подзолистой почве (рН = 6,2-6,8;

Nобщ = 0,26%;

Р = 150 мг/кг;

содержа ние гумуса – 1,8%).

Учитывались: масса растений (сырая и сухая), количество и площадь ли стьев, содержание белка в растениях. Для сои учитывалось количество клу беньков на растении, их масса и нитрогеназная активность.

Для определения нитрогеназной активности использовали ацетиленовый метод в модификации ВНИИСХМ.

Количество образовавшегося этилена измеряли на газовом хроматографе.

Содержание общего азота в растениях определяли с использованием ме тода Къельдаля на полуавтоматическом анализаторе азота «Kjeltec auto».

Постановка опытов, учт и оценка полученных результатов проводилась согласно стандартным методикам (Фробишер, 1965;

Ашмарин, 1971;

Доспехов, 1985;

Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Полевой опыт Полевые исследования проводились на опытном поле ВНИИЗК им. И.Г.

Калиненко Зерноградского района Ростовской области. Почвы опытного участ ка - чернозм обыкновенный тяжелосуглинистый. Агрохимические показатели в слое почвы 0-20см: рН – 7,1;

гумус – 3,3-3,5%;

Р2О5 – 20-25 мг/кг;

К2О – 300 350 мг/кг почвы. Площадь делянки – 100 м2, повторность 3-х кратная.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация параметров препаратов симбиотических и ассоциативных ризобактерий на основе вермикулита.

Установлено, что различные источники углеводного питания существен но улучшают размножение и выживаемость клубеньковых бактерий сои в пре паратах на основе вермикулита.

Во всех вариантах опыта в питательную среду был добавлен глицерин в количестве 1% от объма питательной среды. Показано, что через 17 суток титры во всех вариантах опыта были высокими и варьировали от 3,8•109 до 33,5•109 КОЕ /г. Исключением был вариант с добавлением в вермикулит 1% глюкозы и 2% мелассы. Титр бактерий в этом варианте был 1,5•109 КОЕ /г.

Спустя месяц титр данного варианта опыта возрос до 15,6•109 КОЕ /г. В 2 раза увеличился титр бактерий в препарате с добавлением в вермикулит 1% глюко зы и 1% гуматов. По-видимому, в этих вариантах клетки использовали мелассу и гуматы как углеводсодержащий источник в субстрате для своего роста после истощения запасов легкодоступной глюкозы.

Согласно технологическому регламенту биопрепарат является качествен ным при титре препарата не менее 1 миллиарда (через 6 месяцев после изготов ления). Наибольший титр спустя 6 месяцев хранения был в варианте с добавле нием в вермикулит 0,5% мелассы, 1% глицерина и 0,5% гуматов и составил 6,1•109 КОЕ/г. Это определяется разной степенью доступности углеводов из этих компонентов, что обеспечивает питанием клетки на протяжении всего срока их хранения (табл. 1).

Таблица 1.

Титр клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum (шт. 634б) при внесении различных добавок в вермикулит.

Титр бактерий, КОЕ•109/г Добавки в Добавки в питательную вермикулит Срок хранения среду 17 дней 1 месяц 2 месяца 6 месяцев глицерин 1% глюкоза 1% 16,5±0,2 14,0±0,2 8,2±0,2 1,1±0, глюкоза 1% + глицерин 1% 27,6±0,3 40,0±0,2 30,6±0,3 3,2±0, Дарина 1% глюкоза 1% + глицерин 1% 27,1±0,2 12,7±0,2 8,5±0,2 4,0±0, глицерин 1% глюкоза 1% + глицерин 1% 8,2±0, 33,5±0,2 24,5±0,3 4,1±0, гуматы 0,5% Меласса 0,5% + глицерин 1% глицерин 1% + 34,1±0,2 7,4±0, 26,0±0,3 6,1±0, гуматы 0,5 % Также изучено влияние различных добавок на сохранность в препарате клубеньковых бактерий сои (штаммы 626а, 640б, 645б) и быстрорастущих клу беньковых бактерий козлятника (штаммы 912, 913).

Препараты, в состав которых входили сахароза, гуматы и глицерин, име ли более высокий титр по сравнению с вариантами, в которых в вермикулит вносилась только сахароза. Внесение в вермикулит 1% сахарозы и 0,5% гума тов увеличивают титр препарата в 5 раз, и он составлял более 30 млрд. клеток/г.

Хорошо показали себя варианты, где помимо сахарозы в качестве дополни тельных компонентов вносилось 1% глицерина, а также вариант с дополни тельным внесением 5% мелассы.

Таким образом, подобраны оптимальные сочетания компонентов, кото рые позволяют поддерживать высокий титр бактерий в препарате на протяже нии продолжительного времени.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что используя вермику лит в качестве носителя бактерий, возможно подобрать оптимальные сочетания компонентов для производства качественных биопрепаратов. Таким образом, изготовление препаратов на основе вермикулита становится технологичнее, дешевле и проще, чем изготовление их на основе торфа.

Влияние различных температурных режимов хранения на качество биопрепаратов Поскольку в процессе транспортировки биопрепараты подвергаются воз действию различных температур (иногда отрицательных), изучено влияние температурных режимов (-3…-6оС;

+5…+8оС;

+20…+22оС) на их качество.

Определялась сохранность бактерий в препарате при двух основных ре жимах хранения (5-8 и 20-22оС), которым они подвергаются в реальных услови ях (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние температуры хранения на титр клубеньковых бактерий сои и козлятника (2 месяца хранения) Титр бактерий, КОЕ•109/г Штаммы t хранения бактерий 20-22С 5-8С B. japonicum 634б 3,0±0,2 5,1±0, B. japonicum 640 б 3,0±0,4 14,2±0, B. japonicum 645 б 3,2±0,2 21,4±0, R. galega 913 7,5±0,3 63,0±0, Из полученных данных следует, что хранение препаратов при температу ре 5-8оС позволяет сохранить титр клубеньковых бактерий на порядок выше, чем хранение при температуре 20-22оС.

При замораживании происходят существенные физико-химические и биохимические изменения. Для уменьшения повреждающего действия отрица тельных температур используют криопротекторы. Помещение живых объектов в растворы криопротекторов и замораживание в этих растворах снижает или полностью исключает формирование внутриклеточного льда и обезвоживание.

Использование глицерина (криопротектор проникающего действия) сни жало негативное действие замораживания на клубеньковые бактерии козлятни ка в 5- 10 раз (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние замораживания на титр клубеньковых бактерий в препарате Титр бактерий, КОЕ/г срок замораживания препаратов Штаммы без замо ражива 2 дня 2 недели бактерий ния без глицери- с глицери- без глице- с глицери на ном рина ном R. galega шт.912 3±0,2·109 8 9 8±0,2· 2,2±0,2·10 1,5±0,2·10 2±0,3· 4,6±0,3· R. galega шт.913 7±0,2·109 7±0,2·108 1±0,2·109 1±0,2·106 B. japonicum 4,3±0,2·109 0 0 0 634б Зависимость титра ризобактерий от влажности препарата.

Одним из факторов, определяющих качество и сохранность биопрепара тов является значение его влажности.

Оптимальная влажность торфяного препарата, по данным разных иссле дователей, составляет 30-60% (Burton, 1967;

Rughley, 1967) Были изготовлены вермикулитные препараты с влажностью от 50 до 80%.

Препараты влажностью 50 и 80% имели самый низкий титр. Показано, что наи больший титр имели препараты влажностью 60 и 70% (табл. 4).

Таблица 4.

Влияние влажности препарата на титр ризобактерий (после 1 месяца хранения) Титр бактерий, КОЕ•109/г Штаммы влажность влажность бактерий препарата 60 % препарата 70 % Arthrobacter mysorens, шт. 7 5,6±0,2 41,0±0, Azospirillum brasilense, шт. 8 1,6±0,2 20,1±0, Bradyrhizobium japonicum, шт.634б 1,7±0,3 10,0±0, Bradyrhizobium japonicum, шт.640 б 2,3±0,2 15,0±0, Установлено, что оптимальная влажность препаратов на основе вермику лита составляет 70%, так как именно при такой влажности в нм наилучшим образом сохраняются ризобактерии, а препарат более эффективен. Это под тверждается полевыми и вегетационными опытами.

Оптимизация жидкой формы биопрепаратов Наиболее дешевой и технологичной является жидкая форма препарата.

Основной недостаток данной формы – короткий срок хранения. В условиях жидкой культуры титр бактерий начинает резко снижаться уже через 5-15 суток хранения. Второй недостаток – опасность контаминации при производстве, фа совке и хранении препарата.

Влияние температурных режимов хранения, питательных и стабили зирующих добавок на численность R. galegae в жидких препаратах.

Численность R. galegae при выращивании на бобовой среде без добавок являлась контролем во всех экспериментах. Изменение титра клеток показало, что через 14 суток после приготовления препарата титр ризобий менялся незна чительно. Через 56 суток хранения происходило существенное уменьшение титра. Такая динамика титра наблюдалась при обоих температурных режимах хранения. Через 14 суток хранения численность клеток в среде была в 7 раз выше, когда препарат хранился при 4-6°С. Низкая температура снижала ско рость падения титра. Об этом свидетельствует численность клеток через 28 су ток хранения. Если при 18-21°С титр контрольного варианта составлял 0,6• клеток, то при 4-6°С он был равен 7,4•108 клеток R. galegae. Таким образом, наиболее благоприятной температурой хранения является 4-6°С.

При температуре 18-21°С добавка глицерина в количестве 1% увеличива ла титр ризобий на 14-е сутки в 5 раз. При увеличении количества глицерина в среде до 2% наблюдалось ингибирование роста бактерий, численность которых была значительно ниже, чем в контроле.

При температуре 18-21°С через 14 суток хранения гуматы калия оказыва ли стимулирующее действие на рост бактерий (табл. 5). Однако при добавлении в среду гуматов калия и глицерина численность R. galegae резко снижалась и была ниже, чем в контроле. Через 28 суток хранения в варианте с гуматами на блюдалось снижение скорости падения титра бактерий. При температуре 4-6°С гуматы калия также оказали стимулирующее действие на рост R. galegae через 14 суток хранения.

Установлено, что действие КМЦ на титр R. galegae зависело от темпера турного режима хранения. При температуре хранения 18-21°С самый высокий титр через 14 суток хранения получен при использовании добавки КМЦ (1%) + сорбат К (1%). Выявлено значительное снижение скорости падения титра через 28 и 56 суток хранения. При низкой температуре хранения эта добавка снижала титр R. galegae через 14 суток. Однако в течение последующего времени хра нения титр ризобий снижался мало вплоть до 56 суток.

Добавка КМЦ (1%) + сорбат К (1%) + глицерин (1%) оказывала одинако вое действие на титр R. galegae и динамику численности при разных темпера турных режимах хранения. В наибольшей степени процесс торможения был выражен при температуре 4-6°С, где количество клеток ризобий было практи чески одинаковым через 14, 28 и 56 суток хранения.

Таблица 5.

Титр жидких препаратов R. galegae (КОЕ) при добавлении в среду различных компонентов Вариант 2 недели хране- 4 недели хране- 8 недель хране ния ния ния 18-21°С 4-6°С 18-21°С 4-6°С 18-21°С 4-6°С 6.1·10 8 3.4·10 9 6.1·10 7 7.4·10 8 3.4·10 6 8·10 Контроль 8.3·10 8 7.1·10 9 3.6·10 8 6.2·10 7 4,1·10 7 4.7·10 гуматы 1% 2.3·10 9 1.2·10 9 4.1·10 8 8.2·10 8 5.7·10 7 4.5·10 глицерин 1% глицерин + гуматы 4.3·10 8 2.1·10 8 3.1·10 7 1.4·10 8 4.3·10 6 1·10 (по 1%) 4.1·10 9 3.2·10 9 1.5·10 8 1.8·10 9 1.1·10 8 1.2·10 сорбат калия 1% 8.1·10 8 2.8·10 9 2.1·10 8 2.8·10 8 6.7·10 7 7.8·10 КМЦ 1% сoрбат калия + 1.2·10 9 1.4·10 9 3.4·10 8 4.4·10 8 6·10 7 8.4·10 КМЦ (по 1%) сорбат калия + КМЦ 3.2·10 8 1.3·10 9 2.1·10 8 1.4·10 9 1.2·10 8 1.1·10 + глицерин (по 1%) Эффективность биопрепаратов разной влажности В полевых и вегетационных опытах показано, что вермикулитные препа раты влажностью 70% дают на 5-7% большую прибавку надземной зелной массы, чем препараты влажностью 60%.

Совместное применение биопрепаратов и комплекса микроэлементов по разному влияет на продуктивность растений сои. Так, совместное применение микроэлементов и препарата на основе штамма B. japonicum 634б, способствует увеличению урожайности сои на 10-25%. Однако при использовании с препара том на основе штамма B. japonicum 640б урожайность сои снижается на 25-60% по сравнению с вариантом обработки только биопрепаратом (рис. 1).

сорт Дон 140 сорт Дива Прибавка, % ) ) ) оль ) кв) (70% кв) 0% + акв 0% нт р 34б (6 +а +а б (7 б Ко 634 0% 0% 0% б (6 б (7 б (7 вариант 634 634 НСР = 5, Рис. 1. Влияние влажности препарата и стимулятора роста «Аквамикс» на про дуктивность сои (вегетационный опыт) Данные по эффективности препаратов разной влажности на основе ассо циативных ризобактерий и совместном использовании их с комплексным удоб рением «Аквамикс» показали, что нет чткой закономерности по их влиянию на урожайность кукурузы. Так, на кукурузе сорта «Зерноградский 330 МВ» наи лучшее действие отмечено при использовании «Азоризина» (A. brasilense шт.8) влажностью 70%. Прибавка урожайности в этом варианте составляла 48%, при совместной обработке с «Аквамиксом» - 4%. Совместная обработка биопрепа ратом «Ризоагрин» с «Аквамиксом» увеличила эффективность последнего на 12% и составила 51% по сравнению с контрольным вариантом. Остальные ва рианты давали средние прибавки, которые составляли от 15 до 22%.

Обработка семян кукурузы сорта «Зерноградский 282 МВ» биопрепара том «Азоризин» (A. brasilense шт.8) влажностью 70% обеспечила прибавку урожая, составляющую 24%, при совместной же обработке с «Аквамиксом» эффективность препарата возрастала до 49% относительно контроля.

Применение «Ризоагрина» (A. radiobacter) на кукурузе сорта «Зерноград ский 330МВ» дат прибавки 39-51% по сравнению с контролем. Прибавка же на сорте «Зерноградский 282 МВ» составляют 12-14%. Это доказывает, что эф фективность инокуляции семян бактериями во многом определяется генотипом растения-хозяина (Кожемяков, 2003;

Nutman, 1965;

Patterson, LaRue,1983;

Bar net et al., 1984). Значителен вклад в конечную эффективность и генотипа бакте рий (Проворов, Симаров, 1987;

Симаров и др., 1990).

В полевом опыте также подтвердились данные по высокой эффективно сти биопрепаратов влажностью 70% (табл. 6).

Таблица 6.

Влияние биопрепаратов разной влажности на элементы структуры и урожайность кукурузы сорт «Зерноградский 401 МВ» (полевой опыт) Вариант Количество Масса зер- Масса Урожайность, зрен в на с ц/га початке, шт початка, г зрен, г контроль 255 62,7 246 23, Мизорин вл.2 260 65,3 251 24, Мизорин вл.1 256 63,2 248 23, Азоризин вл.2 268 67,8 253 25, Азоризин вл.1 261 65,1 251 25, Фон + Мизорин вл.2 279 77 276 29, Фон + Мизорин вл.1 271 73,1 272 28, Фон + Азоризин вл.2 288 85,2 296 32, Фон + Азоризин вл.1 281 80,9 289 31, НСР05 0, Фон – N60P60K вл.1 – влажность препарата 60 % вл.2 – влажность препарата 70 % Использование препарата «Азоризин» влажностью 70% увеличивало урожайность на 12%, в то время как препарат влажностью 60% дал прибавку в 8% по отношению к контролю. Внесение в почву фона (N60P60K60) увеличивало урожайность кукурузы. При обработке семян «Азоризином» урожайность воз растала до 45-50%, и составляла 31-32 ц/га. При обработке семян «Мизорином» наблюдалась та же закономерность. Наибольшая прибавка была в варианте, где производилась обработка препаратом влажностью 70% на фоне (N60P60K60) и составила 29% по отношению к контрольному варианту.

Эффективность новых форм биопрепаратов на фоне комплекса микроэлементов.

Для обеспечения растений недостающими микроэлементами применяют микроудобрения. Наиболее выгодными и удобными являются предпосевная обработка семян и некорневая подкормка растений (Анспок, 1990;

Панасин, 2006).

Изучение влияния биопрепарата «Ризоторфин» на растения сои показало, что наибольшая прибавка была получена в варианте с применением биопрепа рата на вермикулите с гуматами и глицерином. Прибавка составила 38% по от ношению к необработанному варианту. Биопрепараты на носителе (вермикули те) и в жидкой форме дали одинаковые прибавки урожая сухой массы в преде лах 21- 23% по отношению к контролю.

Содержание белка при использовании биопрепаратов увеличивается с до 14,5%. Максимальное содержание белка было в вариантах, где обработка производилась биопрепаратом на основе вермикулита с обработкой «Микро элом» и жидкой формой биопрепарата с добавлением гуматов (рис. 2). Добавка гуматов к жидкой форме существенно повышала содержание белка.

содержание белка, %.) мак оль ) кв) -к) ) эл ) иц) ) рм ж.к 2-х ты нтр на ве рм+ а + мик мик- м а икро +г л 34б ( эл гу Ко ик- гум б( м к.+ ве + м вер верм м + м рм + 634 б (на (ж. вариант а б н ве ер а 634 634б ( 4б (н а в б (на б (н Рис. 2. Содержание белка в надземной части растений сои (сорт «Дива») Изучение нитрогеназной активности корней сои показало, что все вари анты опыта превосходят контрольный вариант в 2-4 раза. Наилучшими были варианты с обработкой биопрепаратами без микроэлементов. В этих вариантах азотфиксирующая активность увеличивалась в 4 раза по сравнению с кон трольным вариантом. Использование микроэлементов несколько снижало нит рогеназную активность симбиоза.

В вегетационных опытах по изучению влияния действия биопрепарата «Мизорин» на урожайность сухой массы растений кукурузы было выявлено достоверное увеличение урожайности (от 10 до 40%) надземной массы (рис. 3).

45, 30, % 15, 0, ) ф.) ) к ин к-к ль кв эл 2-х ма ум ик +а зор (ж.

тро ми л(.+г ро +м н ми н к э + н ф ик ри Ко (ж. ми ри ин ин изо изо зор +м ин ор м зор м ми з н вариант ми ри ми изо м Рис 3. Влияние сочетаний биопрепаратов и микроэлементов на продуктивность кукурузы (прибавка, %;

вегетационный опыт).

Сорт «Зерноградский 330 МВ» Биопрепарат «Азоризин» обеспечивал прибавку урожая надземной массы от 14 до 31 % во всех вариантах опыта по отношению к контрольному вариан ту. «Микромак» же в чистом виде дал прибавку к контролю 17%. Наибольшая прибавка урожая наблюдалась в варианте, где применялась совместная обра ботка «Азоризином» с «Микроэлом». Прибавка в этих вариантах достигала 31% к контролю.

При изучении содержания белка в растениях кукурузы установлено, что все варианты по этому показателю превосходили контрольное значение.

В опыте с обработкой семян «Азоризином» все варианты достоверно от личаются от контрольного. При обработке семян кукурузы «Азоризином» со вместно с 2-х кратной обработкой «Микроэлом» наблюдается увеличение со держания белка в растении на 2% по сравнению с контролем.

В полевых опытах изучалась эффективность биопрепарата «Ризоторфин» на основе вермикулита, а также его совместное использование с микроэлемен тами молибден (Mo) и бор (В) (табл. 7).

Аналогичные данные получены и для сортов «Дон 21» и «Дива». Показа но, что повысить эффективность биопрепаратов возможно путм дополнитель ной обработки семян молибденом и бором.

Таблица 7.

Влияние «Ризоторфина» и микроудобрений на продуктивность и элементы структуры урожая сои Показатели число бобов вес семян масса Варианты Урожайность, на растении, с 1 расте- ц/га шт ния, г семян, г Донская Контроль 12,4 3,6 145,3 11, Ризоторфин 15,9 4,7 155,2 13, Ризоторфин + Мо 19,4 4,8 154,3 13, Ризоторфин + В 20,7 5,3 158,3 14, Ризоторфин + Мо + В 23,3 5,7 160,6 14, НСР05 0, Обработка семян биопрепаратом совместно с микроэлементами оказыва ла положительное влияние на все элементы структуры и урожай сои. Так со вместное применение «Ризоторфина», молибдена и бора позволяет получить прибавку до 30% по отношению к контрольному варианту, в то время как обра ботка только биопрепаратом увеличивает урожайность на 7-15%.

Также в полевых опытах изучалось влияние биопрепаратов на основе вермикулита, приготовленные с учтом оптимальных компонентов среды на урожайность пшеницы в условиях сильной засоленности почвы (табл. 8).

Таблица 8.

Урожайность яровой пшеницы сорта Харьковская- (полевой опыт 2008, Крым).

Вариант Урожайность, ц/га Прибавка, % к контролю Контроль 13,55 Ризоагрин шт.204 14,67 8, Азоризин шт. 8 14,67 8, Азоризин шт. 6 14,40 6, Флавобактерин шт. 30 16,45 21, Мизорин шт. 7 16,35 20, Pseudomonas sp. 25-5 16,47 21, НСР 0,5 0, Выявлено, что в условиях сильной засолнности почвы не все штаммы проявляют высокую эффективность. Наибольшие прибавки были получены при использовании биопрепаратов «Флавобактерин», «Мизорин» и Pseudomonas sp.

штамм 25-5.

Сравнительная эффективность жидкой, торфяной и вермикулитной формы биопрепаратов.

В условиях полевого и вегетационного опытов была изучена эффектив ность различных форм биопрепаратов (торфяных, жидких и на основе вермику лита) на растениях сои и кукурузы.

Показано, что биопрепараты на основе вермикулита (шт. 634б, шт. 640б) по эффективности не уступает торфяной и жидкой форме биопрепаратов. Мак симальные прибавки зелной массы сои были отмечены в вариантах, где био препарат был изготовлен на вермикулите со стабилизирующими и питательны ми добавками, а также жидкая форма биопрепарата с добавлением гуматов.

Установлено, что биопрепараты на основе вермикулита обладают боль шей эффективностью, чем препараты на основе торфа (табл. 9). Это подтвер ждается массой клубеньков и азотфиксирующей активностью. Внесение стар товой дозы азота (N30) положительно влияет на действие биопрепарата и его эффективность возрастает.

Таблица 9.

Влияние бактериальных и минеральных удобрений на элементы структуры урожая сои (полевой опыт) Вариант Биомасса Число Масса клу- Азотфиксация Урожай, надзем- бобов, беньков мкг ц/га ная, г/м2 шт./раст. (сырая), N2/раст.·ч г/раст.

Контроль 450 13,1 1,6 140 19, Ризоторфин 469 16,3 2,2 182 20, (на торфе) Ризоторфин 497 19,0 2,2 210 23, (на вермикулите) N30 534 19,6 1,2 186 22, N30+ Ризоторфин 529 19,7 1,8 287 22, (на торфе) N30+ Ризоторфин 564 19,0 2,0 298 25, (на вермикулите) НСР05 Выявлено, что использование биопрепарата на основе вермикулита уве личивает число бобов на растении на 45% по сравнению с контрольным вари антом, и на 16,5% по сравнению с биопрепаратом на основе торфа. На фоне (N30) количество бобов на растении практически одинаково во всех вариантах опыта. В варианте с торфяной формой биопрепарата масса зерна с растения на 26% больше чем в контрольном варианте. Таким образом, использование био препарата на основе вермикулита увеличивает урожайность на 21% по сравне нию с контрольным вариантом. В варианте с фоновой дозой азота урожайность была на 32% больше контроля. Использование торфяной формы увеличивает урожайность на 8%, а с фоновой дозой азота на 20%, в сравнении с контроль ным вариантом без обработки.

В вегетационном опыте сравнивались разные формы биопрепаратов на основе ассоциативных ризобактерий («Мизорин» и «Азоризин»). При испыта нии биопрепарата «Мизорин» прибавка в 40% была на вермикулитной форме с добавками. Жидкая форма и жидкая форма с добавками дали прибавки 22 и 30% соответственно.

Эффективность «Азоризина» на вермикулите с добавками, а также его жидкие формы показали приблизительно одинаковую эффективность. Прибав ки в этих вариантах составляли 15-18% к контрольным значениям.

Выводы:

1. Применение вермикулита в качестве носителя обеспечивает высокую эф фективность биопрепаратов симбиотических и ассоциативных ризобактерий. В ряде случаев она оказывается эффективнее жидких и торфяных форм.

2. Введение в питательную среду препарата «Дарина» и гуматов приводит к значительному повышению титра клубеньковых бактерий в препарате. Глице рин, введнный в препарат в концентрации 1-2%, действует как стабилизатор титра при хранении препаратов.

3. Для препаратов на основе вермикулита оптимальной является влажность 70%. При этой влажности титр микроорганизмов поддерживается на высоком уровне длительное время.

4. Показано, что хранение препаратов на основе вермикулита при темпера туре 5-8оС позволяет сохранить титр клубеньковых бактерий на порядок выше, чем при температуре 20-22оС. Замораживание препаратов полностью убивает клубеньковые бактерии сои и в 10 раз снижает титр клубеньковых бактерий козлятника. При введении глицерина титр бактерий козлятника снижается только в 4 раза.

5. Введение стабилизирующих добавок в жидкую форму препарата позво ляет увеличить срок его хранения до 2-х месяцев. Наиболее высокие значения титра R. galegae были получены при добавлении в среду КМЦ (1%) + сорбат К (1%) + глицерин (1%).

6. Установлено, что оптимальной температурой хранения жидкой формы препарата R. galegae является 4-6°С.

7. Применение микроэлементов совместно с биопрепаратами позволяет по высить эффективность последних, однако степень влияния определяется гено типом растений и микроорганизмов. В отдельных случаях микроэлементы ин гибировали развитие и нитрогеназную активность симбиоза. Внесение мине ральных удобрений в дозе N60P60K60 повышает эффективность биопрепаратов в 2-3 раза.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лактионов Ю.В., Кожемяков А.П., Попова Т.А. Влияние влажности бактери альных препаратов на их эффективность // Известия Санкт-Петербургского Государственного Аграрного Университета, 2008. - №11 С. 40- 2. Лактионов Ю.В. Землеудобрительные биопрепараты для широкого спектра сельскохозяйственных растений // Известия Санкт-Петербургского Государ ственного Аграрного Университета, 2009. - № 16 С. 52- 3. Лактионов Ю.В. Приготовление биопрепарата ускоряющего деструкцию растительного материала и оценка его эффективности//Сборник трудов био лого-почвенного факультета РГУ. Ростов-на-Дону. Ростиздат, 2005 г., 262 с.

4. Laktionov Y.V. Search of new carriers for symbiotic and associative rhizobacteria with an improved efficiency//Volume of Abstracts of Postgraduate Course "Ap plied and Fundamental Aspects of Responses, Signaling and Developmental Process in the Root-Microbe Systems". 2007, Saint-Petersburg, ARRIAM, 96 pp.

5. Laktionov Y.V., Kojemyakov A.P. Search of new carriers for symbiotic and asso ciative rhizobacteria with an improved efficiency// International Scientific Confe rence S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology (Yalta, Octo ber 8-12, 2007): Abstr. – Chernihiv: CSTEI, 2007. – 130 p.

6. Лактионов Ю.В., Кожемяков А.П., Попова Т.А. Создание новых форм пре паратов симбиотических и ассоциативных ризобактерий с повышенной эф фективностью//Материалы V Всероссийского съезда почвоведов им. В.В.

Докучаева. Ростиздат, Ростов-на-Дону, 18-23 августа 2008 г., 557с.

7. Лактионов Ю.В., Кожемяков А.П., Попова Т.А. Создание новых форм пре паратов симбиотических и ассоциативных ризобактерий с повышенной эф фективностью // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвідомчий тема тичний науковий збірник. - Чернігів: Чернігівський ЦНТЕІ, 2008. - Вип.7. С. 77-87.

8. Лактионов Ю.В., Попова Т.А., Кожемяков А.П. Эффективность новых форм биопрепаратов на фоне комплекса микроэлементов // Материалы конферен ции профессорско-преподавательского состава и аспирантов Санкт Петербургского Государственного аграрного университета 29-30 января.

2009 г. С.12- 9. Laktionov Y.V. Optimization of the form fertilizer biopreparation at use vermicu lit as the carrier symbiotic and associative rhizobacteria // 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology – XV Biotechnology Summer School (5-12 July 2009, Gdansk, Poland), 2009. - 82 p.