Состав жирных масел плодов бересклетов
На правах рукописи
Сидоров Роман Александрович СОСТАВ ЖИРНЫХ МАСЕЛ ПЛОДОВ БЕРЕСКЛЕТОВ 03.01.05 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в лаборатории липидного обмена Федерального государственного бюд жетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Россий ской академии наук, г. Москва.
Научный консультант: кандидат биологических наук Цыдендамбаев Владимир Дылыкович
Официальные оппоненты: Соловченко Алексей Евгеньевич доктор биологических наук, кафедра биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова, г. Москва, ведущий научный сотрудник Загоскина Наталья Викторовна доктор биологических наук, ИФР РАН, г. Москва, ведущий научный сотрудник
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учре ждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Россий ской академии наук, г. Казань
Защита состоится 20 июня 2013 г. в 15.00 на заседании совета по защите докторских и кан дидатских диссертаций Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учре ждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, д. 35. Факс: +7 (499) 977-80-18, e-mail:
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственно го бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук.
Автореферат разослан «19» мая 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Азаркович Марина Ивановна ~2~
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Род Бересклет (Euonymus L.) составляют кустарниковые или древесные растения, распространённые в основном в Северном полушарии, в том чис ле в нашей стране [Леонова, 1974]. Он включает 129 [Ma, 2001] или даже 220 видов [Zhu, 2012], которые, подразделяются на два подрода Euonymus и Kalonymus [Blakelock, 1951;
Ma, 2001], а также ряд секций [Леонова, 1974].
Фитохимические исследования растений рода Euonymus проводились до сих пор глав ным образом для обнаружения биологически активных веществ. Многие его виды исполь зуются в китайской народной медицине, поскольку они содержат вещества, обладающие противоопухолевой, противомикробной, антидиабетической и инсектицидной активно стью [Zhu, 2012]. К настоящему времени из этих видов было выделено и идентифицирова но свыше 200 различных соединений [Zhu, 2012].
Кроме того, в плодах отдельных видов этих растений уже давно было найдено жир ное масло [Blakelock, 1951], которое накапливается не только в семенах, но и в ариллусах плодов [Corner, 1976;
Меликян, Савинов, 2000]. Таким образом, можно заключить, что ви ды рода Euonymus принадлежат к группе растений с сочными масличными плодами [Тру сов, Созонова, 2012], накапливающих масло не только в высыхающих при созревании се менах, но и в водонасыщенных внесеменных частях плода (гипантиях, мезокарпах и др.).
При этом масла, запасаемые в разных частях их плодов, резко различаются по ЖК-составу.
В семенах исследованных ранее видов бересклетов резервные нейтральные ацилгли церины (НАГ) масла на 80–98% состояли из ацДАГ (sn-1,2-диацил-3-ацетилглицеринов аналогов триацилглицеринов (ТАГ), у которых sn-3-положение этерифицировано остатком уксусной кислоты) и лишь на 2–15% – из ТАГ обычного состава. В то же время, в НАГ ариллусов E. alatus [Durrett et al., 2010] содержались преимущественно ТАГ, наряду с ко торыми в небольшом количестве присутствовали и ацДАГ [Milcamps et al., 2005]. И ТАГ, и sn-1,2-положения ацДАГ включали главным образом остатки высших С16–С18-насы щенных и -ненасыщенных ЖК [Kleiman et al., 1967;
Milcamps et al., 2005], однако то, что остаток уксусной кислоты ацилирует именно sn-3-положение молекулы ацДАГ, достовер но доказано не было. Кроме того, динамика накопления сухой массы, а также содержания и состава обоих классов НАГ в ходе развития плодов бересклетов также никем не изуча лись. Наконец, качественный и количественный состав резервных НАГ семян и ариллусов был до сих пор в той или иной степени изучен лишь у нескольких видов рода Euonymus, причём ни в одном случае не исследовались НАГ обеих частей одних и тех же плодов.
~3~ Учитывая это, а также то, что разные представители этого рода очень сильно отличаются друг от друга по морфологии и окраске плодов и семян, представляло интерес исследовать особенности состава и содержания НАГ в плодах ряда бересклетов, принадлежащих к раз личным систематическим подразделениям рода Euonymus.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — изучить особенности коли чественного и качественного состава НАГ ариллусов и семян зрелых плодов 14 видов бе ресклетов, относящихся к обоим подродам рода Euonymus.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
• Изучить качественный и количественный состав НАГ в маслах ариллусов и семян зрелых плодов 14 видов бересклетов, а также ЖК-состав обоих классов НАГ;
• Доказать, что остаток уксусной кислоты в молекуле ацДАГ этерифицирует исклю чительно sn-3-положение глицеринового остатка;
• Исследовать особенности формирования морфологической и анатомической струк туры созревающих плодов трёх модельных видов бересклетов, относящихся к разным под родам и секциям рода Euonymus;
• Установить особенности накопления НАГ в ариллусах и семенах отдельных видов бересклетов в ходе созревания плодов, а также изменения их ЖК-состава.
Научная новизна работы. С помощью двумерной ЯМР-спектроскопии впервые бы ло доказано, что остаток уксусной кислоты этерифицирует исключительно sn-3-положе ние в молекуле ацДАГ, выделенных из семян бересклетовых растений. Тем самым получе но первое строгое экспериментальное доказательство того, что в семенах бересклетов на ряду с обычной диацилглицерин-3-ацилтрансферазой (ДАГАТ), специфичной к обычным ацил-КоА и катализирующей синтез ТАГ, содержится ДАГАТ, строго специфичная как к ацетил-КоА в качестве субстрата, так и к sn-3-положению глицеринового остатка, резуль татом действия которой является образование ацДАГ. Установлено, что при ЯМР-спектро скопии остаток уксусной кислоты при sn-3-положении влияет на химические сдвиги про тонов при sn-1- и sn-3-углеродных атомах глицеринового остатка ацДАГ, что позволило исправить имевшееся ранее в литературе некорректное представление о соотнесении сиг налов от этих протонов с их положением в молекуле ацДАГ.
Охарактеризован качественный и количественный состав НАГ ариллусов и семян как зрелых, так и созревающих плодов бересклетов, а также изучен их ЖК-состав;
для 11 ви дов состав НАГ определён впервые. Кроме того, в ТАГ ариллусов некоторых видов бе ресклетов были обнаружены в значительных количествах (до 7.8%) необычные для выс ~4~ ших растений 8-16:1 и 10-18:1 ЖК, структура которых была доказана с помощью масс спектрометрии их DMOX-производных;
эти жирные кислоты в растениях обнаружены впервые. Показано, что ЖК-состав ТАГ ариллусов является хемотаксономическим призна ком, характеризующим тот или иной вид бересклета на уровне подрода. Установлено, что ариллусы по абсолютному и относительному содержанию НАГ превосходят семена.
Впервые в составе жирных масел ариллусов 12 видов и семян 4 видов бересклетов были обнаружены и детально изучены низшие алкиловые эфиры ЖК (НАЭЖК), состоящие из метиловых, этиловых, изо-пропиловых и н-бутиловых эфиров. Показано, что разные фракции НАЭЖК могли образовываться за счёт различных пулов ЖК.
Практическая значимость. Экспериментальные результаты и теоретические обоб щения диссертационной работы могут быть использованы для разработки программ науч ных исследований по изучению диетической и энергетической ценности ацДАГ природно го происхождения, а также особенностей их метаболизма в организме животных;
при пла нировании исследований, направленных на получение генетически модифицированных линий различных масличных культур, продуцирующих ацДАГ, которые могут быть ис пользованы для синтеза биодизеля или как пищевая добавка в диетическом питании. Сово купность экспериментальных данных может быть использована при чтении курсов лекций для студентов биологических специальностей вузов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII съезде Об щества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011);
на конференциях (Москва, 2011 и 2012) и семинаре молодых учёных ИФР РАН (Москва, 2010);
на IX Международ ном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2011);
на Международной научно-практической конференции «Клеточная био логия и биотехнология растений» (Минск, 2013);
на XIX и XX Международной конферен ции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2012 и 2013).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных ра бот, из которых 2 являются статьями в рецензируемых изданиях.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литерату ры, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 124 страницах ма шинописного текста, содержат 15 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает источников, в том числе 315 на иностранном языке.
~5~ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Растительный материал. Зрелые плоды бересклетов (стадия III) собирали на стадии вскрывшейся коробочки в течение 2010 и 2011 годов в дендрарии Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН. Было исследовано 14 видов, относящихся к двум подродам и секциям рода Euonymus L. Помимо зрелых плодов, также были выбраны три модельных вида, относящихся к секциям Euonymus (E. europaeus) и Pseudovyenomus (E. verrucosus) подрода Euonymus, и к одноимённой секции подрода Kalonymus (E. maximoviczianus). Их плоды собирали в процессе развития: на стадии глобулярного зародыша (стадия I), на ста дии зрелого плода – раскрывшейся коробочки (стадия III) и между этими сроками, когда зародыш был вполне сформирован (стадия II).
Экстракция липидов. Семена в ариллусах фиксировали в течение 1 мин в кипящей воде, после чего разделяли на ариллусы и семена. Полученный материал гомогенизирова ли и липиды экстрагировали как описано ранее [Пчёлкин и др, 2006].
Тонкослойная хроматография экстрактов. Аналитическую ТСХ экстрактов арил лусов и семян проводили на пластинках Silufol (40100 мм), используя смесь н-гексан : ди этиловый эфир : СН3СООН (70:30:1) в качестве подвижной фазы. Фракционирование экс трактов выполняли на пластинках Merck Kieselgel 60F (200200 мм), предварительно про мытых смесью ацетон : хлороформ (1:1), пропитанных 0.001%-ным раствором 2’,7’-ди хлорфлюоресцеина в метаноле.
ЯМР-спектрокопия ацДАГ растительного происхождения. Выделенные ацДАГ (~50 мг) растворяли в 500 мкл CDCl3 и переносили в 5-мм ампулу для ЯМР спектрометра.
Одномерные 1Н и С, двумерные гомоядерные 1Н/1Н спектры COSY, TOCSY, ROESY и двумерные гетероядерные 1H/13C спектры HMBC, HSQC и HSQC-TOCSY регистрировали на приборе AV-600 Bruker по стандартным методикам. Химические сдвиги в 13С спектрах (ppm) регистрировали относительно сигнала 13C растворителя CDCl3 (С 77.0 ppm) и оста точного сигнала 1Н CНCl3 (H 7.27 ppm).
ГЖХ-анализ ЖК-состава НАГ и идентификация необычных ЖК. Метиловые эфиры ЖК (МЭЖК) ацДАГ или ТАГ получали прямой переэтерификацией в метаноле, со державшем 10% ацетилхлорида по методу [Zhukov, Vereshchagin, 1970]. Синтез DMOX производных ЖК для установления точного положения двойной связи проводили по мето ду Куклева-Смита [Kuklev, Smith, 2003]. Состав МЭЖК и DMOX определяли с помощью ГЖХ-МС на приборе Agilent 7890A с капиллярной колонкой DB-23 (60 м 0.25 мм 0. мкм). Анализ и интерпретацию масс-спектров DMOX производных ЖК проводили на ос ~6~ нове эмпирических правил и таблиц диагностических фрагментарных ионов [Zhang et al., 1998;
Spitzer, 1997]. Количественное содержание ТАГ и ацДАГ определяли с помощью ГЖХ с внутренним стандартом (17:0) как описано ранее [Zhukov, Vereshchagin, 1970].
Статистическая обработка экспериментальных данных. Все вычисления произво дили в программе STATISTICA. Все данные были проверены на нормальность распреде ления с помощью теста Шапиро-Уилка (0.72 W 1.00, 0.31 p 0.84) [Shapiro, Wilk, 1965]. Достоверность различий между анализируемыми выборками определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия Фишера. Степень возможного родст ва исследованных видов бересклетов, основанная на сходстве ЖК-состава запасных ТАГ ариллусов зрелых плодов, была изучена с помощью метода кластерного UPGMA-анализа (метод невзвешенного арифметического среднего) [Sneath, Sokal, 1973], а также с помо щью кластеризации методом k-средних [MacQueen, 1967]. В таблицах представлены сред ние арифметические трёх аналитических определений трёх биологических повторностей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Установление стереоспецифичности строения молекул ацДАГ растительного проис хождения с помощью ЯМР-спектроскопии В настоящее время известно лишь три статьи, в которых ацДАГ растительного или животного происхождения были изучены с помощью ЯМР-спектроскопии, однако досто верного доказательства того, что остаток уксусной кислоты этерифицирует исключи тельно sn-3-положение авторам получить не удалось по причине недостаточного разреше ния применяемых приборов [Kleiman et al, 1967], либо из-за ошибочного соотнесения сиг налов от атомов [Limb et al, 1999], или по причине того, что исследователи не применяли методы 2D-ЯМР [Durrett et al, 2010].
Рис. 1. Область 4.1-4.4 ppm H-ЯМР спектра (600 МГц) ацДАГ из семян бересклета Максимовича ~7~ На рис. 1 приведена часть 1H-ЯМР спектра ацДАГ из семян бересклета Максимовича.
Можно видеть, что в области 4.3 ppm имеет место выраженная асимметричность двойного дублета. Опираясь на известные данные [Lie Ken Jie, Lam, 1995], мы предположили, что химические сдвиги протонов HA и HA H 4.31 и 4.29 соответственно, обусловлены влияни ем ацильных остатков разной длины при sn-1- и sn-3-положениях глицеринового остатка.
Для проверки этой гипотезы, мы записали спектры 1H/13C HMBC (рис. 2 и 3) и HSQC TOCSY этих ацДАГ.
На рис. 2 видно, что протон HA коррелирует с углеродным атомом глицеринового ос татка (C 170.37), в то время как протоны HA, HB и HB с углеродным атомом C 173.20 и 173.16. Это расщепление сигнала от углеродного атома карбоксильной группы ROC=O обусловлено различными остатками насыщенных и ненасыщенных ЖК при sn-1-поло жении глицеринового остатка. Также видно, что ни один из этих четырёх протонов не кор релирует с углеродным атомом (C 172.78) при sn-2-положении.
Рис. 2. Фрагмент 1H13C HMBC спектра ацДАГ из семян E. maximovic zianus Также нами впервые было установлено, что синглет от протонов остатка уксусной кислоты (H 2.07 ppm) даёт единственную корреляцию с углеродным атомом карбоксиль ной группы (C 170.37 ppm). Два перекрывающихся триплета от протонов углеродного атома, связанного с углеродным атомом карбоксильной группы (H 2.331 и 2.318 ppm), на против, дают чёткие корреляции с углеродными атомами карбоксильных групп C 172. и 173.16 ppm соответственно (рис. 3).
~8~ Рис. 3. Фрагмент 1H13C HMBC спектра ацДАГ из семян E. maximovic zianus Таким образом, было показано, что протон HA (H 4.29) при углеродном атоме C 62.32 остатка глицерина коррелирует с углеродным атомом C 170.37 карбоксильной груп пы, которая также коррелирует с протонами ацетатного остатка (H 2.07). Это означает, что остаток уксусной кислоты связан с углеродным атомом C 62.32, который, согласно дан ным Дарретта с соавт. [Durrett et al, 2010], представляет собой углеродный атом в sn-3 положении глицеринового остатка молекулы ацДАГ. То есть, нами получено строгое ин струментальное подтверждение стереоспецифичности строения ацДАГ, а значит, и при сутствия в семенах бересклетов наряду с обычной диацилглицерин-3-ацилтрансферазой (ДАГАТ), специфичной к обычным ацил-КоА и катализирующей синтез ТАГ, другой ДА ГАТ, строго специфичной как к ацетил-КоА в качестве субстрата, так и к sn-3-положению глицеринового остатка.
Содержание сухого вещества и НАГ в зрелых плодах бересклетов В ходе проведённых исследований было установлено, что семена достоверно превос ходили ариллусы по абсолютному и относительному (рис. 4 А) содержанию сухой массы в среднем в 2.6 и 1.6 раза, соответственно.
У всех изученных видов ТАГ в том или ином количестве присутствовали в обеих час тях плода. В то же время, ацДАГ всегда обнаруживались только в семенах, а в ариллусах четырёх видов они содержались лишь в следовых количествах. Абсолютное содержание НАГ в ариллусах в мг/г сухой массы было в среднем вдвое выше, чем в семенах (23.6 и 11.3 %) (рис. 4 Б);
в расчёте на сухую массу 1 органа, ариллусы также обнаруживают по вышенную масличность (рис. 4 В). Доля ТАГ в семенах изученных нами бересклетов со ставляла 4–5%, а в ариллусах – ~98% от суммы НАГ, что было несколько выше, чем обна ~9~ руженное ранее в семенах (3.3 и 91.7% от суммы липидов) и ариллусах (91.2 и 0.5%, соот ветственно) E. alatus [Durrett et al, 2009].
Рис. 4. Дисперсионный анализ достоверности различий некоторых признаков в наблюдае мых выборках (N=14) А: Fdf=1=38.2, p=0.001%;
Б: Fdf=1=15.8, p=0.006%;
В: Fdf=1=7.2, p=1.3% Таким образом, у бересклетов, как и у других растений с сочными масличными пло дами, разные части плода резко различались по составу резервных НАГ – в ариллусах, об ладающих только материнским генотипом, содержались преимущественно ТАГ, а в семе нах, обладающих генами обоих родителей, присутствовали почти исключительно ацДАГ.
Ранее было показано, что семена и гипантии плода облепихи, НАГ которых состояли толь ко из ТАГ, также резко различались между собой по составу ЖК. Так, в гипантиях содер жалось высоконасыщенное масло с преобладанием С16-ЖК – 16:0 и 9-16:1 и/или октаде ценовых кислот, в то время как в семенах тех же плодов накапливаются ТАГ, богатые С18 полиненасыщенными ЖК. [Пчёлкин и др., 2006].
ЖК-состав НАГ из плодов бересклетов В НАГ плодов было обнаружено (наряду с минорными ЖК) 14 видов ЖК, среди ко торых всегда преобладали пальмитиновая, олеиновая, линолевая и -линоленовая кислоты (табл. 1 и 2). В более или менее заметных количествах (3–12%) могли содержаться 12:0, 14:0, 18:0, 9-16:1, 9,12-16:2 и 11-18:1, а также необычные 8-16:1- и 10-18:1-ЖК, струк тура которых была установлена нами с помощью масс- спектрометрии их DMOX производных (рис. 5, Табл. 3). 8-16:1- и 10-18:1-ЖК в липидах растений обнаружены впервые.
~ 10 ~ Таблица 1. Жирнокислотный состав ТАГ и ацДАГ из ариллусов зрелых плодов 14 видов бересклетов Жирные кислоты, мас. % Вид НАГ ИН Прочие 16:0 9-16:1 18:0 9-18:1 11-18:1 9,12-18:2 9,12,15-18: ТАГ2 29.3 3.9 1.4 11.2 3.0 39.7 1.2 10.3 1. E. bungeanus 20.5 1.5 1.5 10.9 2.2 53.6 2.7 7.1 1. ацДАГ ТАГ 23.0 3.8 1.7 17.8 4.6 41.4 2.3 5.4 1. E. europaeus 21.3 2.6 1.6 10.0 4.0 52.7 2.7 5.1 1. ацДАГ ТАГ 30.8 1.8 2.2 15.3 1.7 45.0 1.6 1.6 1. E. hamiltonianus 19.9 0.7 1.8 7.4 1.5 64.9 2.4 1.4 1. ацДАГ ТАГ 32.9 1.2 4.7 16.6 1.0 39.5 1.7 2.4 1. E. phellomanus ТАГ 29.4 3.8 1.4 11.4 4.0 46.5 1.1 2.4 1. E. semiexsertus 20.7 1.3 1.6 5.7 3.5 63.2 1.8 2.2 1. ацДАГ ТАГ 21.7 12.6 1.7 13.2 10.7 34.5 1.0 4.6 1. E. sieboldianus 15.9 7.1 1.2 4.5 8.8 53.5 2.3 6.7 1. ацДАГ ТАГ 26.3 0.4 1.8 21.4 1.5 45.2 2.7 0.7 1. E. alatus 23.0 0.3 2.4 19.8 1.6 47.0 3.3 2.6 1. ацДАГ ТАГ 23.5 0.9 1.8 25.3 2.1 43.1 2.8 0.5 1. E. sacrosanctus 17.6 0.6 2.3 15.2 1.7 43.8 14.3 4.5 1. ацДАГ ТАГ 27.9 0.9 4.9 36.8 1.4 25.6 1.0 1.5 0. E. pauciflorus 18.4 0.4 3.4 30.4 0.9 40.0 2.5 4.0 1. ацДАГ ТАГ 11.0 2.6 2.6 38.5 3.5 26.0 3.8 12.0 1. E. verrucosus ТАГ 21.6 1.4 1.9 52.3 1.0 18.1 2.7 1.0 0. E. latifolius 17.2 0.7 2.9 42.2 0.9 25.6 8.0 2.5 1. ацДАГ ТАГ 41.8 0.4 2.8 18.9 1.7 31.1 2.7 0.6 0. E. macropterus 22.5 0.7 3.1 19.2 1.4 32.3 17.3 3.5 1. ацДАГ ТАГ 39.0 0.8 3.2 27.5 0.7 26.9 1.0 0.9 0. E. maximoviczianus ТАГ 35.6 0.4 5.5 44.5 1.5 11.4 0.7 0.4 0. E. sachalinensis сумма остальных ЖК, каждой из которых содержалось менее 1.0% (10:0, 12:0, 14:0, 15:0, 7-16:1, 11-16:1, 7,10-16:2, 9,12-16:2, 17:0, 20:0, 11-20:1, 22:0, 24:0);
2 содержали также 8-16:1 (6.7%) и 10-18:1 (2.2%) ЖК;
3 содержали 2,3% 8-16:1 ЖК;
4 содержали 12:0 (4.8%), 14.0 (3.1%) ЖК.
Таблица 2. Жирнокислотный состав ТАГ и ацДАГ из семян зрелых плодов 14 видов бересклетов Жирные кислоты, мас. % Вид бересклета НАГ ИН Прочие 16:0 9-16:1 18:0 9-18:1 11-18:1 9,12-18:2 9,12,15-18: ТАГ 23.0 1.4 4.1 31.5 1.4 32.6 2.8 3.2 1. E. bungeanus 15.6 0.2 1.8 38.4 1.2 34.6 7.6 0.6 1. ацДАГ ТАГ 22.4 2.3 4.0 31.9 2.8 25.9 4.4 6.3 0. E. europaeus 18.1 0.2 2.0 43.8 1.1 24.6 9.3 0.9 0. ацДАГ ТАГ 22.5 0.7 3.2 33.0 1.1 33.4 4.3 1.8 1. E. hamiltonianus 16.3 0.1 2.7 52.5 1.1 19.6 7.0 0.7 1. ацДАГ ТАГ 23.6 0.4 4.9 31.9 0.9 32.0 4.9 1.4 1. E. phellomanus 19.1 0.1 2.3 47.4 1.2 21.2 8.1 0.6 1. ацДАГ ТАГ 22.4 1.5 2.8 29.9 1.9 34.9 4.6 2.0 1. E. semiexsertus 16.4 0.1 2.2 50.6 1.0 20.5 8.7 0.5 1. ацДАГ ТАГ 20.8 8.0 2.4 23.7 7.2 32.3 2.4 3.2 1. E. sieboldianus 15.4 0.1 2.0 54.8 1.2 19.2 6.8 0.5 1. ацДАГ ТАГ 24.8 0.2 6.3 31.0 1.0 32.9 1.8 2.0 1. E. alatus 20.2 0.1 2.9 25.7 0.9 47.9 1.7 0.6 1. ацДАГ ТАГ 18.6 0.3 4.9 36.8 1.1 35.5 1.8 1.0 1. E. sacrosanctus 18.7 0.2 2.3 27.0 1.0 48.8 1.7 0.3 1. ацДАГ ТАГ 15.6 0.3 5.3 36.5 0.8 36.9 2.3 2.3 1. E. pauciflorus 15.5 0.1 3.5 29.4 0.7 48.7 1.4 0.7 1. ацДАГ ТАГ 16.7 0.2 4.8 48.6 0.8 25.1 1.8 2.0 1. E. verrucosus 17.3 0.1 3.6 44.0 0.7 31.0 2.0 1.3 1. ацДАГ ТАГ 16.6 0.2 5.8 52.0 1.1 16.3 6.0 2.0 1. E. latifolius 17.7 0.1 2.6 46.1 1.2 25.4 6.0 0.9 1. ацДАГ ТАГ 22.2 0.5 3.9 42.2 1.4 25.3 2.9 1.6 1. E. macropterus 18.6 0.2 2.5 43.8 1.1 26.1 7.2 0.6 1. ацДАГ ТАГ 21.9 0.3 5.3 43.9 1.2 22.9 3.1 1.4 1. E. maximoviczianus 19.4 0.2 4.3 36.8 1.0 31.2 6.9 0.2 1. ацДАГ ТАГ 28.0 0.3 4.4 44.1 1.1 14.8 5.3 2.0 0. E. sachalinensis 20.9 0.0 3.2 54.1 1.1 14.1 6.0 0.5 1. ацДАГ Сумма ЖК, каждой из которых содержалось 1.0% (10:0, 12:0, 14:0, 15:0, 7-16:1, 11-16:1, 7,10- и 9,12-16:2, 17:0, 20:0, 11-20:1, 22:0).
~ 12 ~ Рис. 5. Масс спектр DMOX производного не обычной 8-гекса деценовой кисло ты из ТАГ зрелых ариллусов E. sieboldianus Таблица 3. Массовые числа молекулярных и диагностических фрагментарных ионов необычных ЖК Отношение массы к заряду, а.е.м ЖК Ионы с Ионы с =12 Молекуляр- Положение =54 а.е.м а.е.м ный ион двойной связи 168/222 182/194 307 X-16: 182/236 196/208 307 9-16: 182/236 196/208 335 9-18: 196/250 210/222 335 X2-18: 210/264 224/236 335 11-18: По-видимому, 10-18:1 ЖК образуется посредством C2-удлинения её предшествен ника – 8-16:1, за синтез которой может отвечать специфическая десатураза, как это было показано ранее для растений, способных накапливать ЖК с необычным положением двой ной связи [Suh, Schiltz, Ohlrogge, 1999]. Эти две кислоты обнаруживались только в ТАГ ариллусов бересклетов, относящихся к подроду Euonymus (см. ниже). Каких-либо упоми наний в литературе об этих необычных ЖК в составе липидов растений и животных нам обнаружить не удалось.
Ранее было показано, что в sn-1,2-положениях ацДАГ семян E. verrucosus содержание 16:0, 18:0, 9-18:1, 9,12-18:2 и 9,12,15-18:3 составляло 14, 4, 40, 40 и 2% [Kleiman et al, 1967], а для трёх видов растений Maytenus sp., также принадлежащих к сем. Celastraceae, соответствующие величины составляли 13.0–15.2, 3.0–6.0, 36.8–58.7, 21.0–44.5 и 0.2–0.6% [Spitzer, Aichholz, 1996]. Приведённые данные указывают на определённое сходство между отдельными видами бересклетовых растений по составу главных ЖК в НАГ плодов.
~ 13 ~ Во всех пробах НАГ (табл. 1 и 2), за исключением НАГ семян E. hamiltonianus, по ве личине ИН ТАГ в той или иной степени уступали ацДАГ (табл. 2). По-видимому, это раз личие вызывалось, прежде всего, тем, что молекула ТАГ содержит два положения остатка глицерина (sn-1 и sn-3), включающие преимущественно более насыщенные высшие ЖК [Пчёлкин и др., 2006], тогда как в ацДАГ имеется только одно такое положение – sn-1 (см.
выше). Обнаруженное различие было гораздо сильнее выражено в ариллусах, где средние величины ИН в ТАГ и ацДАГ составляли 1.051 и 1.357, чем в семенах (1.074 и 1.180, со отв.), что связано с намного более высоким уровнем линолеата в ацДАГ ариллусов, чем в ацДАГ семян.
Хемотаксономический анализ возможного родства изученных видов бересклетов Чтобы проверить наше предположение о связи ЖК-состава НАГ зрелых плодов различных видов бересклетов с их систематическим положением внутри рода, мы приме нили иерархический кластерный анализ. E. verrucosus был исключён из анализа, как вид, практически не накапливающий жирное масло в ариллусах (0.02-0.1% от сухой массы).
Рис. 6. Дендрограмма объе динения видов бересклетов в кластеры по сходству ЖК составов запасных ТАГ ариллусов зрелых плодов (невзвешенное арифметиче ское среднее, метрика Че бышева) На рис. 6 представлен результат иерархической кластеризации изученных видов рода Euonymus на основе данных ЖК-состава ТАГ ариллусов их плодов (см. табл. 1). Можно видеть, что изученные виды группируются в три кластера: кластеры 1 и 2 включают в себя виды, относящиеся, за исключением E. pauciflorus, к секции Kalonymus одноимённого подрода, а кластер 3 объединил виды, принадлежащие к подроду Euonymus, который в этом исследовании был представлен тремя секциями: Euonymus, Melanocarya и Pseudo vyenomus [Леонова, 1974]. Группировка отдельных видов в менее крупные кластеры внут ри кластера 3 не отражает их принадлежности к различным секциям подрода Euonymus.
~ 14 ~ Таким образом, ЖК-состав ТАГ ариллусов исследованных видов бересклетов достоверно характеризует только относительно крупные таксономические единицы – подроды.
В то же время сама по себе иерархическая кластеризация не позволяет определить факторы, которые оказывают влияние на формирование того или иного кластера. Поэтому для того чтобы определить, какими различиями в ЖК-составе ТАГ характеризуются под роды Euonymus и Kalonymus, которые обусловливают состав кластеров, был применён до полнительный анализ ЖК-состава ТАГ ариллусов изученных видов бересклетов с помо щью метода k-средних.
Рис. 7. Величины k-средних зна чений содержания i-тых ЖК для двух кластеров 1-19 – обозначения ЖК: 1 – 10:0, 2 – 12:0, 3 – 14:0, 4 – 16:0, 5 – 7 16:1, 6 – 8-16:1, 7 – 9-16:1, 8 – 7,10-16:2, 9 – 9,12-16:2, 10 – 18:0, 11 – 9-18:1, 12 – 10-18:1, – 11-18:1, 14 – 9,12-18:2, 15 – 9,12,15-18:3, 16 – 20:0, 17 – 11 20:1, 18 – 11,14-20:2, 19 – 22:0) При кластеризации методом k-средних и количестве кластеров k=2 (по числу подро дов) исследуемые виды группируются практически в полном соответствии с их системати ческим положением внутри рода. Из данных, представленных на рис. 7, видно, что значи мыми факторами при формировании кластеров являются средние концентрации олеиновой (p=0.01%, F=32.9) и линолевой кислот (p=0.01%, F=33.8) в ТАГ ариллусов. Виды из подро да Euonymus, формирующие кластер 3 (рис. 6), достоверно отличаются более высоким со держанием линолевой кислоты по сравнению с олеиновой, а для видов из кластеров 1 и 2, к которым относятся представители подрода Kalonymus, наблюдается обратное соотноше ние между концентрациями этих ЖК в ТАГ.
Виды, относящиеся к кластеру 3, также отличаются несколько повышенным содержа нием 9-16:1- и 11-18:1-ЖК, хотя это различие статистически недостоверно;
также в них ~ 15 ~ присутствуют необычные 8-16:1 и 10-18:1 ЖК. Что же касается насыщенных кислот, 16:0 и 18:0, то значимые различия между видами из разных подродов отсутствуют.
Вместе с тем, на рис. 6 можно видеть, что E. pauciflorus, по классификации [Леонова, 1974] относящийся к секции Pseudovyenomus подрода Euonymus, по ЖК-составу запасных ТАГ ариллусов оказывается в одном кластере с представителями подрода Kalonymus, что возможно свидетельствует в пользу необходимости уточнения его систематической при надлежности. К тому же недавно было показано, что анатомическое строение ариллусов E.
pauciflorus сходно с таковым у представителей подрода Kalonymus и отличается от других представителей подрода Euonymus наличием у зрелых ариллусов между эпидермами не скольких слоёв паренхимных клеток, которые не разрушаются в процессе развития плода [Трусов, 2010].
Что же касается ацДАГ семян зрелых плодов бересклетов, то кластерный анализ их ЖК-состава не выявил никакой связи с их систематическим положением не только на уровне секции, но и подрода.
Накопление сухой массы и НАГ в развивающихся плодах бересклетов После изучения особенностей качественного и количественного состава НАГ ариллу сов и семян зрелых плодов бересклетов, было выбрано три модельных вида, относящихся к разным подродам и секциям рода Euonymus L. – E. europaeus, E. verrucosus и E. maximowiczianus.
У изученных видов на всех стадиях созревания семена по сухой массе органа в не сколько раз превосходили ариллусы, и лишь у E. europaeus на стадии I наблюдалась об ратная картина. У E. maximowiczianus и E. verrucosus накопление сухой массы семян и осо бенно ариллусов происходило значительно медленнее, чем у E. europaeus. Если у первых двух видов на стадии I (глобулярного зародыша) сухая масса семени составляла лишь 5.5 и 9% массы зрелого семени и 13 и 7.7% массы зрелого ариллуса, соответственно, а на стадии II (зрелого зародыша) накапливалось только 23 и 31.6% массы зрелого семени и 32.7 и 20.5% конечной сухой массы зрелого ариллуса, то у E. europaeus эта доля, составлявшая 4.2 и 57.3% на стадии I, на стадии II достигала уже 47.6 и 66% сухой массы соответствую щей части плода, соотв. В ходе созревания от стадии I до стадии III сухая масса одного се мени у E. maximowiczianus и E. verrucosus возрастала в 18 и 11 раз, а у E. europaeus – в 23. раза. Между тем, для ариллусов прирост сухой массы у этих видов не был столь значи тельным. Относительный уровень массы ариллусов в ходе роста изменялся мало, а у E.
verrucosus он был намного ниже, чем у двух других видов.
~ 16 ~ Также нами было исследовано накопление НАГ в ходе созревания плодов, которое у бересклетов ранее не изучалось. В семенах всех изученных видов главным классом НАГ на каждой стадии созревания были ацДАГ (92–100% от суммы НАГ), которые по абсолютно му содержанию на полтора порядка величин превышали ТАГ. На стадии I в семенах обна руживалось лишь малое количество НАГ (не более 100–200 мкг/плод), которое на даль нейших стадиях созревания непрерывно возрастало. В ходе этого процесса E. verrucosus всегда значительно превосходил E. europaeus и E. maximowiczianus по интенсивности об разования каждого из классов НАГ. На стадии III (полной зрелости) эти два вида обычно также были ближе друг к другу по абсолютному содержанию НАГ и заметно уступали E.
verrucosus по величине данного параметра. Так, в зрелых семенах E. europaeus и E. maxi mowiczianus абсолютное содержание НАГ в расчёте на одно семя было лишь в 5.8 и 6. раза выше, чем на стадии I, тогда как у E. verrucosus уровень НАГ к концу созревания воз растал, главным образом за счёт ацДАГ, почти в 42 раза. Наблюдавшееся накопление НАГ в ходе созревания плодов обусловливало рост числа олеосом в клетках семян и ариллусов.
В созревающих и зрелых ариллусах E. verrucosus НАГ – как ТАГ, так и ацДАГ – практически полностью отсутствовали, а динамика накопления ТАГ у двух других видов была сходна с наблюдавшейся в семенах. По содержанию ТАГ в зрелых ариллусах E. maxi mowiczianus в 1.6 раза превосходил другой вид – E. europaeus. В последнем случае оно бы ло во много раз выше, чем содержание ацДАГ. Наконец, совершенно необычной была ди намика абсолютного содержания ацДАГ в созревающих ариллусах E. maximowiczianus: эта величина была максимальной на стадии I, затем резко снижалась, а при наступлении пол ной зрелости плода и вовсе падала до нуля.
Таким образом, обмен веществ в плодах бересклетов при созревании характеризовал ся более интенсивным накоплением сухой массы у семян, чем у ариллусов. У семян E.
europaeus он был более интенсивным, чем у семян E. maximowiczianus и E. verrucosus;
на против, по скорости образования сухого вещества в ариллусах E. europaeus значительно уступал двум другим исследованным видам.
В семенах ацДАГ синтезировались во много раз активнее, чем ТАГ, а E. europaeus и E. maximowiczianus по интенсивности биосинтеза каждого из классов НАГ заметно уступа ли E. verrucosus. В ариллусах, в отличие от семян, образовывались преимущественно ТАГ, а по характеру обмена НАГ в ариллусах имели место резкие межвидовые различия. Так, в ариллусах E. verrucosus НАГ практически не обнаруживались, а в ариллусах плодов ~ 17 ~ E. maximowiczianus уровень ацДАГ достигал максимума в начале созревания, а в зрелом плоде снижался до нуля.
Динамика ЖК-состава НАГ созревающих плодов бересклетов В составе НАГ созревающих плодов бересклетов было обнаружено 29 индивидуаль ных ЖК, главными из которых (до 29–51% от суммы ЖК) были пальмитиновая, олеиновая, линолевая и -линоленовая кислоты. В значительно меньших количествах содержались 12:0 (до 4.8%), 14:0 (до 1.1–3.1%), 7-16:1 (до 1.0–3.9%), 8-16:1 (до 1.3–7.6%), 9-16:1 (до 1.2–3.7%), 17:0 (до 1.6–2.1%), 18:0 (до 1.0–5.3%), 10-18:1 (2.8–3.2%), 11-18:1 (до 1.0–4.6%), 20:0 (до 1.8%) и 22:0 (до 1.4%) ЖК. Качественный состав главных ЖК НАГ в ходе созре вания плодов почти не изменялся. Динамика их количественного содержания в ТАГ и ац ДАГ семян и ариллусов приведена в таблицах 4 и 5.
Можно видеть, что в этих классах НАГ на разных стадиях созревания плода домини ровали 9,12-18:2 и 9-18:1 ЖК — на долю каждой из них могло приходиться до половины от суммы ЖК, и их содержание отличалось наибольшей изменчивостью в зависимости от вида растения, части плода, стадии созревания и класса НАГ. Так, в семенах в ходе созре вания плодов доля 9-18:1 как в ТАГ, так и в ацДАГ, возрастала в 1.5–2.5 раза, а в ариллу сах E. europaeus и E. verrucosus – в 2.5 и 4 раза, соответственно, в то время как в ТАГ E.
maximowiczianus и ацДАГ E. europaeus она снижалась в 1.3 раза. Эти изменения концен трации олеата в НАГ сопровождались соответствующим ростом или снижением относи тельного содержания линолеата.
Пальмитиновая кислота в наиболее высокой концентрации (40–47% от суммы ЖК) содержалась в ТАГ ариллусов E. maximowiczianus, а в остальных пробах её уровень обыч но не превышал 15–25% и относительно мало возрастал в ходе созревания. Наконец, линоленовая кислота была главной ЖК только в ацДАГ наименее зрелых семян E.
europaeus. Её концентрация в НАГ по мере их накопления в плоде обычно падала. Наибо лее резкое снижение (с 26–28 до 3–8%) наблюдалось в отдельных пробах ТАГ и ацДАГ из семян и ариллусов E. europaeus и E. maximowiczianus (с 20 до 4–7%). В других пробах НАГ из ариллусов этих видов, а также из семян и ариллусов E. verrucosus это снижение было менее значительным (с 3–10 до 2–4%).
~ 18 ~ Таблица 4. ЖК-состав ТАГ и ацДАГ ариллусов созревающих плодов трёх видов бересклетов АРИЛЛУСЫ Жирные кислоты, мас.% Вид Стадия НАГ ИН 16:0 7-16:1 8-16:1 9-16:1 18:0 9-18:1 10-18:1 11-18:1 9,12-18:2 9,12,15-18: ТАГ 23.9 7.6 2.4 2.3 7.2 3.2 3.2 42.0 4.7 1. I 20.5 1.3 1.1 2.1 13.4 1.8 30.2 28.3 1. E. europaeus ацДАГ ТАГ 23.3 6.9 2.7 2.1 8.1 2.8 3.7 43.7 4.1 1. II 26.7 3.2 1.4 2.7 12.6 2.6 39.6 7.5 1. ацДАГ ТАГ 23.0 3.9 Следы 3.8 1.7 17.8 Следы 4.6 41.4 2.3 1. III 21.3 2.9 2.6 1.6 10.0 4.0 52.7 2.7 1. ацДАГ ТАГ На данной стадии отсутствуют E. maximoviczianus I 29.2 0.2 0.6 1.0 36.70 1.3 25.8 3.1 1. ацДАГ ТАГ 47.1 0.6 0.7 1.2 35.6 1.1 13.2 Следы 0. II 23.3 0.8 1.2 1.2 41.6 1.8 27.2 2.2 1. ацДАГ ТАГ 39.0 0.3 0.8 3.2 27.5 0.7 26.9 1.0 0. III На данной стадии отсутствуют ацДАГ ТАГ 18.8 0.6 1.1 1.1 9.9 3.3 50.6 10.4 1. I E. verrusosus Отсутствуют у этого вида ацДАГ ТАГ 21.0 1.0 0.3 3.4 24.0 4.1 29.6 7.2 1. II Отсутствуют у этого вида ацДАГ ТАГ 11.0 1.4 2.6 2.6 38.5 3.5 26.0 3.8 1. III Отсутствуют у этого вида ацДАГ ~ 19 ~ Таблица 5. ЖК-состав ТАГ и ацДАГ созревающих семян трёх видов бересклетов СЕМЕНА Жирные кислоты, мас.% Вид Стадия НАГ ИН 16:0 7-16:1 8-16:1 9-16:1 18:0 9-18:1 10-18:1 11-18:1 9,12-18:2 9,12,15-18: ТАГ 18.9 0.2 1.5 2.2 1.9 13.1 2.5 30.8 26.5 1. I 22.6 0.1 0.2 2.9 23.7 1.3 22.4 25.5 1. ацДАГ E. europaeus ТАГ 19.9 0.1 1.7 1.4 2.2 23.3 2.1 32.3 15.4 1. II 19.9 0.1 0.2 2.8 33.4 1.2 23.5 17.6 1. ацДАГ ТАГ 22.4 0.3 0.7 2.3 4.0 31.9 2.8 25.9 4.4 0. III 18.1 0.1 0.2 2.0 43.8 1.1 24.6 9.3 0. ацДАГ ТАГ 19.6 0.2 0.3 3.3 19.3 Следы 35.2 19.9 1. E. maximoviczianus I 14.4 0.1 0.2 2.9 16.0 Следы 45.2 20.7 1. ацДАГ ТАГ 14.6 0.3 0.2 3.1 40.6 1.1 29.9 9.3 1. II 14.6 0.1 0.1 2.6 25.5 0.1 40.1 16.4 1. ацДАГ ТАГ 21.9 0.2 0.3 5.3 43.9 1.2 22.9 3.1 1. III 19.4 0.1 0.2 4.3 36.8 1.0 30.5 6.9 1. ацДАГ ТАГ На данной стадии отсутствуют I 17.0 0.1 0.3 2.3 28.8 Следы 43.9 6.8 1. ацДАГ E. verrusosus ТАГ 18.1 0.7 2.8 32.1 2.6 38.2 3.3 1. II 18.6 2.8 36.7 1.0 36.8 3.1 1. ацДАГ ТАГ 16.7 0.1 0.2 4.8 48.5 0.8 25.1 1.8 1. III 17.3 0.1 0.1 3.6 44.0 0.7 31.0 2.0 1. ацДАГ ~ 20 ~ Присутствие низших алкиловых эфиров ЖК в плодах растений рода Euonymus Исследуя состав нейтральных липидов в зрелых масличных плодах бересклетов, мы нашли в них неидентифицированный компонент (“компонент Х”). В условиях ТСХ на си ликагеле в системе н-гексан : диэтиловый эфир зона этого компонента совпадала по вели чине подвижности с зоной стандартных метиловых эфиров ЖК (МЭЖК). Методом капил лярной ГЖХ-МС мы установили, что эта фракция наряду с МЭЖК содержала также эфиры этилового и других низших спиртов и, следовательно, компонент Х представлял собой смесь низших алкиловых эфиров ЖК (НАЭЖК). Из 14 исследованных нами видов береск летов НАЭЖК в плодах содержали только 10 видов, причём у 4 видов бересклетов, входя щих в секции Euonymus и Melanocarya подрода Euonymus, НАЭЖК присутствовали не только в ариллусах, но и в семенах.
В плодах изученных бересклетов были идентифицированы 32 индивидуальных вида НАЭЖК: 16 видов МЭЖК, девять видов этиловых (ЭЭЖК), пять видов изо-пропиловых (ИПЭЖК), а также два вида н-бутиловых эфиров ЖК. В ЖК-составе НАЭЖК нашли (с учетом минорных ЖК) 16 индивидуальных видов С14–С24-ЖК, включавших насыщенные (8 видов), -моно- (6 видов), -ди- (1 вид) и -триненасыщенные ЖК (1 вид). В НАЭЖК арил лусов всегда присутствовали МЭЖК, которые обычно превосходили по концентрации дру гие фракции. У E. maximowiczianus и у E. latifolius этиловые эфиры ЖК (ЭЭЖК) были в значительной степени сходны с МЭЖК по ЖК-составу. Существование такого сходства позволяет предположить, что в ариллусах этих видов биосинтез МЭЖК и ЭЭЖК осущест влялся за счёт одного и того же, свойственного данному виду растений, пула ЖК.
ИПЭЖК содержались в ариллусах девяти видов бересклетов и обычно несколько ус тупали МЭЖК по концентрации в сумме НАЭЖК. Исключением здесь был только вид E.
alatus, в НАЭЖК которого ИПЭЖК составляли 86.4% и состояли почти полностью из изо пропилмиристата. Очень близкая по составу смесь ИПЭЖК присутствовала и в семенах этого вида, где соответствующая величина достигала 94.6%. В ИПЭЖК ариллусов у всех видов, кроме E. maximowiczianus и E. europaeus, содержалась только 14:0 ЖК, которая, в свою очередь, почти никогда не обнаруживалась в других фракциях НАЭЖК. Наконец, ИПЭЖК семян E. phellomanus и E. alatus представляли собой чистый изопропилмиристат.
Весьма ограниченным набором ЖК отличались также н-бутиловые эфиры, содержавшие или только линолевую кислоту (в семенах E. sacrosanctus) или её смесь (7:3) с олеиновой (в ариллусах E. europaeus).
~ 21 ~ Найденные особенности ЖК-состава ИПЭЖК и н-бутиловых эфиров ЖК позволяют предположить, что эти эфиры по механизму биосинтеза значительно отличаются от МЭЖК и ЭЭЖК. Действительно, у МЭЖК и ЭЭЖК набор ЖК был много шире, а жёсткая избирательность по отношению к тому или иному виду низшего спирта или виду ЖК при этерификации отмечалась лишь у E. bungeanus.
Результаты настоящей работы показывают, что у растений рода Euonymus НАЭЖК образовывались преимущественно в ариллусах, которые к тому же значительно превосхо дили семена по числу видов ЖК в НАЭЖК. Следовательно, ариллусы намного более ак тивны в биосинтезе НАЭЖК, чем семена.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, нами установлено, что изученные представители рода Euonymus (за исключением E. verruscosus), как и другие растения с сочными масличными плодами, на капливают жирные масла, как в семенах, так и во внесеменной части плода – ариллусах.
Запасаемые в семенах и ариллусах масла, состоят из нейтральных ацилглицеринов ТАГ и ацДАГ, однако у разных видов бересклетов эти масла различаются не только ЖК составом, но и соотношением между классами составляющих их запасных НАГ. В ариллу сах всегда доминируют ТАГ, а в семенах – ацДАГ, причём несмотря на пониженное по сравнению с семенами содержание сухой массы, ариллусы характеризовались бльшей, чем семена масличностью как в абсолютном (мг/г сухой массы), так и в относительном выражении (% от сухой массы). Доля ТАГ в семенах составила 4–5%, а в ариллусах – ~98% от суммы НАГ.
Поскольку до начала нашей работы было известно, что остаток ацетата в ацДАГ мо жет быть связан с углеродным атомом либо в sn-1-, либо в sn-3-положении глицеринового остатка [Durrett et al, 2010], было необходимо выяснить какие из этих положений он может ацилировать. Методом двумерной ЯМР-спектроскопии нами впервые было доказано, что в семенах бересклетов остаток уксусной кислоты в молекуле ацДАГ этерифицирует исклю чительно sn-3-положение. Отсюда следует, что в семенах бересклетов наряду с обычной ДАГАТ, катализирующей синтез ТАГ из обычных ацил-КоА, содержится и ДАГАТ, стро го специфичная как к ацетил-КоА в качестве субстрата, так и к sn-3-положению глицери нового остатка, результатом действия которой и является образование ацДАГ. В ходе нашего исследования было также показано, что при ЯМР-спектроскопии остаток уксусной кислоты при sn-3-положении влияет на химические сдвиги протонов при sn-1- и sn-3 углеродных атомах глицеринового остатка ацДАГ, что позволило исправить имевшееся ~ 22 ~ ранее в литературе некорректное представление о соотнесении сигналов от этих протонов с их положением в молекуле ацДАГ.
У 14 видов, относящихся к двум подродам и четырём секциям рода Euonymus, был охарактеризован качественный и количественный состав НАГ ариллусов и семян как зре лых, так и созревающих плодов бересклетов, а также изучен их ЖК-состав;
для 11 видов состав НАГ определён впервые. В НАГ плодов было обнаружено (наряду с минорными ЖК) 14 видов ЖК, главными из которых всегда были линолевая, олеиновая и пальмитино вая кислоты. У всех изученных видов бересклетов ТАГ ариллусов, по сравнению с ацДАГ семян, всегда отличались бльшим разнообразием состава ЖК. Для ТАГ и ацДАГ ариллу сов была характерна достоверно более высокая концентрация пальмитиновой и олеиновой кислот, в то время как в ЖК-составе НАГ семян преобладала линолевая кислота. Помимо обычных ЖК в ТАГ ариллусов некоторых видов бересклетов были обнаружены в значи тельных количествах (до 7.8%) необычные ЖК, идентифицированные как 8-гексаде ценовая и 10-октадеценовая кислоты;
эти ЖК в растениях обнаружены впервые. Кроме того, с помощью метода кластерного UPGMA-анализа, а также с помощью кластеризации методом k-средних нами было показано, что ЖК-состав ТАГ ариллусов является хемотак сономическим признаком, характеризующим тот или вид бересклета на уровне подрода.
У трёх модельных видов, относящихся к секциям Euonymus (E. europaeus) и Pseudovyenomus (E. verrucosus) подрода Euonymus, и к одноимённой секции подрода Kalonymus (E. maximoviczianus) было изучено формирование морфолого-анатомической структуры семян и ариллусов плода в ходе созревания. Изученные виды бересклетов зна чительно различаются по характеру роста и накопления НАГ в семенах и ариллусах. В хо де созревания плодов как в клетках эндосперма и семядолей, так и в клетках ариллусов у всех изученных бересклетов формируются мелкие олеосомы одинакового размера, а у E. europaeus и E. maximowiczianus, наряду с ними – также крупные олеосомы разной вели чины. Количество жировых включений в клетках ариллусов у всех изученных видов в ходе созревания увеличивается. В ходе созревания в семенах ацДАГ синтезируются во много раз активнее, чем ТАГ, а в ариллусах, наоборот, образуются преимущественно ТАГ. При этом если при созревании плодов качественный состав главных ЖК в обоих классах НАГ почти не изменялся, то значения индекса ненасыщенности ЖК и в ТАГ, и в ацДАГ, всегда снижались вследствие резкого падения уровня -линолената, уменьшения концентрации линолеата и соответствующего роста содержания олеата.
~ 23 ~ Помимо НАГ, в составе жирных масел ариллусов большинства исследованных бе ресклетов в небольшом количестве (0.03-0.05% от сырой массы) содержатся необычные компоненты – низшие алкиловые эфиры ЖК, представляющие собой смеси метиловых, этиловых, изо-пропиловых и н-бутиловых эфиров С14-С24-ЖК. Семена некоторых видов бересклетов также содержат НАЭЖК. Как и в ТАГ, в МЭЖК и ЭЭЖК обеих частей плода преобладают линолевая, олеиновая и пальмитиновая кислоты. Метиловые и этиловые эфи ры ЖК могут образовываться за счёт того же пула ЖК, что и НАГ, в то время как изо пропиловые и н-бутиловые эфиры ЖК по-видимому синтезируются за счёт иного, чем НАГ пула ЖК.
ВЫВОДЫ 1. Исследованные представители рода Euonymus (за исключением E. verruscosus) накап ливают жирные масла, как в семенах, так и во внесеменной части плода – ариллусах.
Запасаемые в семенах и ариллусах масла, различаются не только ЖК-составом, но и соотношением между классами запасных НАГ: ТАГ и ацДАГ. В ариллусах всегда до минируют ТАГ, а в семенах – ацДАГ, причём ариллусы по абсолютному и относитель ному содержанию НАГ превосходят семена.
2. Методом двумерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения впервые достоверно установлено, что в ацДАГ остаток уксусной кислоты ацилирует только sn-3-положение остатка глицерина. Это указывает на присутствие в семенах бересклетов наряду с обычной диацилглицерин-3-ацилтрансферазой (ДАГАТ), специфичной к обычным ацил-КоА и катализирующей синтез ТАГ, другой ДАГАТ, строго специфичной как к ацетил-КоА в качестве субстрата, так и к sn-3-положению глицеринового остатка.
3. Изученные виды бересклетов значительно различаются по характеру роста и накопле ния НАГ в семенах и ариллусах. В ходе созревания плодов как в клетках эндосперма и семядолей, так и в клетках ариллусов формируются мелкие олеосомы одинакового размера, а у E. europaeus и E. maximowiczianus, наряду с ними – также крупные олео сомы разной величины;
в процессе созревания их количество клетках возрастает.
4. В ходе созревания в семенах ацДАГ синтезируются во много раз активнее, чем ТАГ, а в ариллусах, наоборот, образуются преимущественно ТАГ. При этом если при созрева нии плодов качественный состав главных ЖК в обоих классах НАГ почти не изменял ся, то значения индекса ненасыщенности ЖК и в ТАГ, и в ацДАГ, всегда снижались вследствие резкого падения уровня -линолената, уменьшения концентрации линолеа та и соответствующего роста содержания олеата.
~ 24 ~ 5. У всех изученных видов бересклетов ТАГ ариллусов, по сравнению с ацДАГ семян, всегда отличались большим разнообразием состава ЖК. Для ТАГ, и ацДАГ ариллусов было характерно достоверно более высокое относительное содержание пальмитиновой и олеиновой кислот, в то время как в ЖК-составе НАГ семян преобладала линолевая кислота. Помимо обычных ЖК в ТАГ ариллусов некоторых видов бересклетов были обнаружены необычные ЖК, идентифицированные как 8-гексадеценовая и 10 октадеценовая кислоты;
эти ЖК в растениях обнаружены впервые.
6. Установлено, что особенности ЖК-состава ТАГ ариллусов являются хемотаксономи ческим признаком, характеризующим тот или иной вид бересклетов на уровне подро да. В частности, для видов, относящихся к подроду Euonymus, в ТАГ ариллусов харак терен более высокий уровень линолевой кислоты по сравнению с олеиновой;
для видов из подрода Kalonymus в ТАГ наблюдается обратное соотношение между этими ЖК.
Обнаруженная особенность ЖК-состава ТАГ ариллусов видов, относящихся к разным подродам, наблюдается даже на самых ранних этапах развития плодов.
7. Помимо НАГ, в составе жирных масел ариллусов большинства исследованных береск летов в небольшом количестве (0.03-0.05% от сырой массы) содержатся необычные компоненты – низшие алкиловые эфиры ЖК, представляющие собой смеси метиловых, этиловых, изо-пропиловых и н-бутиловых эфиров С14-С24-ЖК. Семена некоторых ви дов бересклетов также содержат НАЭЖК. Как и в ТАГ, в МЭЖК и ЭЭЖК обеих час тей плода преобладают линолевая, олеиновая и пальмитиновая кислоты. Метиловые и этиловые эфиры ЖК могут образовываться за счёт того же пула ЖК, что и НАГ, в то время как изо-пропиловые и н-бутиловые эфиры ЖК по-видимому синтезируются за счёт иного, чем НАГ пула ЖК.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Сидоров Р.А., Трусов Н.А., Цыдендамбаев В.Д (2011). Анатомическое строение семян и присемянников бересклета Максимовича (Euonymus maximowiczianus) и состав их жирных масел // В сб. Древесные растения: фундаментальные и прикладные исследо вания, М.: ООО «Астра-Полиграфия», 2011, Вып. 1, с. 108–114.
2. Сидоров Р.А., Трусов Н.А., Цыдендамбаев В.Д (2011). Бересклеты как перспективный источник сырья для биодизеля. // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их ~ 25 ~ использования: Материалы IX международного симпозиума. T. III. – М.: РУДН, с. 206–209.
3. Сидоров Р.А., Жуков А.В., Пчёлкин В.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г. (2011) Позиционный состав триацилглицеринов из масла присемянников плодов двух видов бересклетов. // Тез. докладов VII съезда Общества физиологов растений России. Ниж ний Новгород, ч.2, с. 634.
4. Сидоров Р.А., Трусов Н.А., Цыдендамбаев В.Д. (2011) Липидный состав масел присе мянников и семян бересклета Максимовича (Euonymus maximowiczianus) // Тез. докла дов VII съезда Общества физиологов растений России. Нижний Новгород, ч.2, с. 635.
5. Сидоров Р.А., Жуков А.В., Верещагин А.Г., Цыдендамбаев В.Д (2012). Низшие алки ловые эфиры жирных кислот из плодов бересклетов. Физиология растений, 59:
362–368.
6. Сидоров Р.А., Трусов Н.А. (2012). Строение присемянников и семян Euonymus europaeus L. (Celastraceae) и состав их жирных масел в ходе созревания плодов. XIX международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов — 2012», тезисы докладов. М: МАКС-пресс, с. 239–240.
7. Sidorov R.A., Zhukov A.V., Pchelkin V.P., Vereshchagin A.G., Tsydendambaev V.D.
(2013). Occurrence of fatty acid short-chain-alkyl esters in fruits of Celastraceae plants.
Chemistry and Biodiversity, doi: 10.1002/cbdv. 8. Сидоров Р.А., Фоменков А.А. (2013). Особенности биосинтеза запасных триацилгли церинов и низших алкиловых эфиров жирных кислот клетками суспензионной культу ры бересклета Максимовича. XX международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов — 2013», тезисы докладов. М: МАКС-пресс, с. 308–309.
9. Фоменков А.А., Сидоров Р.А., Носов А.В. (2013) Суспензионная культура клеток E. maximowiczianus — новый объект в исследованиях биосинтеза низших алкиловых эфиров жирных кислот. Международная научно-практическая конференция «Клеточ ная биология и биотехнология растений», тезисы докладов. Минск: Издательский центр БГУ, с. 61.
~ 26 ~