Внеклеточные пептидазы грибов, образующих биотические связи с насекомыми

На правах рукописи

СЕМЕНОВА Татьяна Александровна ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПЕПТИДАЗЫ ГРИБОВ, ОБРАЗУЮЩИХ БИОТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ С НАСЕКОМЫМИ 03.02.12-микология 03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии биополимеров Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Дунаевский Яков Ефимович кандидат биологических наук, доцент Белякова Галина Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Руденская Галина Николаевна кандидат биологических наук, с.н.с.

Озерская Светлана Михайловна

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ВИЗР)

Защита состоится 11 ноября 2011 года в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория М-1, тел./ факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Отзывы (в двух экземплярах) просим направлять по адресу: 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, Биологический факультет, Кафедра физиологии растений, ученому секретарю Диссертационного совета Д 501.001.46. Факс (495) 939-39 70.

Автореферат разослан _ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гетеротрофный тип питания, характерный для грибов, определяет их способность к образованию биотических связей с представителями самых разных царств живых организмов (Encyclopedia of entomology, 2008). Экологические взаимоотношения грибов и насекомых включают как взаимовыигрышные системы, например, «грибные сады», в которых различные виды муравьев трибы Attini выращивают гриб Leucoagaricus gongylophorus, так и эксплуатационные, как например, паразитизм энтомопатогенных грибов на насекомых–хозяевах. Многие виды грибов не образуют облигатных связей с насекомыми, однако используются насекомыми-микофагами в качестве пищевого субстрата и экологической ниши.

Гидролитические ферменты, секретируемые грибами, играют важную роль в поддержании указанных биотических связей. В мутуалистических системах гидролитические ферменты гриба расщепляют субстраты, недоступные для собственного ферментативного аппарата насекомых;

в паразитических системах внеклеточные гидролазы грибов–энтомопатогенов контролируют процессы патогенеза. Особая роль как в расщеплении пищевых субстратов, так и в процессах патогенеза отмечается для внеклеточных пептидаз грибов (St. Leger, 1995).

Синтез и секреция пептидаз клетками гриба является энергоемким процессом, что обуславливает образование ферментов, максимально адаптированных к условиям обитания мицелия. Поэтому различия в спектре пептидаз, секретируемых мицелием, развивающимся в составе разнообразных систем с насекомыми, косвенно отражают экологические и метаболические особенности грибов. Несмотря на то, что из грибов выделено и охарактеризовано несколько тысяч пептидаз, исследований, посвященных поиску связей между различными экологическими и таксономическими группами грибов и спектром секретируемых ими пептидаз, ранее не проводилось.

Цель работы: провести сравнительное изучение физико-химических, биохимических и функциональных свойств внеклеточных пептидаз грибов, принадлежащих к различным таксономическим и трофическим группам. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение корреляций между спектром секретируемых пептидаз и таксономическим положением и типом питания у грибов 2. Изучение внеклеточных пептидаз грибного симбионта Leucoagaricus gongylophorus в системе «грибного сада» по сравнению с близкородственным свободноживущим видом Agaricus bisporus. Определение адаптивных изменений в спектре внеклеточных пептидаз, вызванных переходом грибов к обитанию с насекомыми.

3. Проведение сравнительного анализа свойств наиболее представленных пептидаз грибов Cordyceps militaris, Agaricus bisporus и Leucoagaricus gongylophorus.

Научная новизна и практическая значимость. Определена способность мицелиальных грибов к росту на агаризованных средах, содержащих различные источники азота и углерода. Показано, что штаммы грибов-патогенов, в целом, обладают более широкими адаптивными возможностями, т.е. способны к росту на средах, содержащих белок как единственный источник азота и углерода.

Впервые показано распределение внеклеточной протеолитической активности мицелиальных грибов по каталитическим классам: выявлено, что наибольшее число видов аскомицетов секретирует сериновые пептидазы со щелочным рН-оптимумом, в то время как виды базидиомицетов преимущественно секретируют металлопротеиназы с оптимумом активности более близким к нейтральному. Выявлены определенные корреляции между экологическими особенностями (паразитическим или сапротрофным образом жизни) и субстрат-специфичной протеолитической активностью некоторых мицелиальных грибов. Показано, что трипсиноподобная активность может служить маркером патогенности, а относительная аминопептидазная – сапротрофности.

Впервые изучена класс-специфичная протеолитическая активность в мутуалистической системе грибов и насекомых – «грибном саду». Показано, что спектр внеклеточных пептидаз грибного симбионта зависит от степени эволюционной прогрессивности видов муравьев, поддерживающих «грибной сад». Впервые показано, что обитание совместно с муравьями приводит к изменению рН-оптимума активности пептидаз грибного симбионта от 6.0 до 5.2 (рН, поддерживаемый в «грибном саду»). В смывах мицелия из «грибного сада» обнаружены выраженные буферные свойства, которые могут являться одним из факторов, поддерживающих стабильность функционирования этой мутуалистической системы.

Выявлены и идентифицированы пептидазы, секретируемые энтомопатогенным грибом Cordyceps militaris (сериновая, субтилизиноподобная) и грибом-сапротрофом (металлопротеиназа). Получены высокоочищенные препараты Agaricus bisporus исследуемых ферментов, определены их важнейшие физико-химические и биохимические свойства.

Полученные данные могут найти практическое применение в разработке новых методов биологической борьбы с насекомыми-вредителями сельского хозяйства, для диагностики патогенных микроорганизмов, изучения механизмов патогенеза энтомопатогенных грибов и регуляции продукции внеклеточных пептидаз грибами на уровне синтеза и секреции.

Апробация работы. Основные положения изложены на I (XI) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006 г.), VI Международном симпозиуме “Химия протеолитических ферментов” (Москва, 2007 г.), Международной конференции «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2007), II Съезде Микологов России (Москва, 2008), Nordic Network for Social Evolution (Финляндия, Oulu, 2008), I (IX) Международной конференции молодых ученых «Ломоносов» (2010), а также заседаниях кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов работы, выводов. Диссертация изложена на 130 страницах, содержит 42 иллюстрации (рисунки, таблицы). Список литературы включает 172 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы В обзоре литературы приведены сведения по систематике, экологии и биологии грибов, образующих биотические связи с насекомыми, представлены данные о роли внеклеточных пептидаз в поддержании систем насекомых и грибов, приведена классификация протеолитических ферментов, а также данные о практическом применении внеклеточных пептидаз микроорганизмов.

Глава 2. Материалы и методы исследований Объекты исследования. Основными объектами исследования служили виды грибов, образующих биотические связи с насекомыми: энтомопатогенный гриб Cordyceps militaris (L.) Link, Leucoagaricus gongylophorus (Mller) R. Heim – гриб, выращиваемый муравьями трибы Attini в системе «грибного сада», а также Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach - не образующий облигатных биотических связей, но являющийся потенциальным пищевым субстратом для насекомых.

Для интерпретации полученных результатов были также использованы виды аско и базидиомицетных грибов – патогенов насекомых и растений, а также сапротрофов, служащих пищевым субстратом для насекомых - Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill, Fusarium graminearum Schwabe, Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin, Humicola grisea Traaen, Paecilomyces carneus (Duch & Heim) A.H.S.Br. & G.Sm., Penicillium nalgiovense Laxa, Penicillium vulpinum (Cooke & Massee) Seifert & Samson, Trichurus spiralis Hasselbr, Trichoderma saturnisporum Hammill, Coprinus comatus (O.F.Mll.) Pers., Marasmius oreades (Bolton) Fr., Pholiota aurivella (Batsch) P. Kumm. и Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.

Культивирование проводили на агаризованных и жидких средах, содержащих различные источники азота и углерода с целью определения способности грибов к росту на указанных средах, а также повышения выхода исследуемых внеклеточных пептидаз.

Протеолитические ферменты L. gongylophorus изучали в водных вытяжках мицелия, взятого непосредственно из 28 используемых в работе «грибных садов», выращиваемых муравьями, относящимися к различным родам и видам трибы Attini.

Определение протеолитической активности проводили как по белковым (азоказеин, желатина), так и синтетическим п-нитроанилидным субстратам (Erlanger at al., 1961). Класс-специфичную активность определяли с использованием ингибиторов, специфичных для различных классов пептидаз: EDTA для металлопротеиназ, PMSF, TLCK, TPCK для сериновых пептидаз, E-64 для цистеиновых пептидаз и пепстатин для аспартильных пептидаз. Для определения субстрат-специфичной активности использовали синтетические п-нитроанилидные субстраты, специфичные для определенных групп внеклеточных пептидаз – Glp-AAL-pNa, Suc-AAPF-pNa, Bz-R-pNa, Glp-AAQ-pNa, L-pNa, Y-pNa, R-pNa. Оптимум активности в зависимости от рН определяли в 0.5M универсальном буфере для диапазона рН 3.0 – 9.0.

Определение буферных свойств водных вытяжек из «грибных садов» проводили по стандартной методике. Буферную емкость определяли на рН-метре как объем раствора (мкл) 1M NaOH, который необходимо было добавить к 1 мл экстракта для изменения значения его рН на единицу.

Построение филогенетического древа проводили на основе анализа последовательностей генов LSU рРНК и фактора элонгации 1. Выделение ДНК проводилось стандартным методом с использованием хелатирующего агента Chelex (Walsh et al., 1991). Для амплификации участка LSU рРНК длиной около 920 пар нуклеотидов были использованы праймеры LR0R 5’-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3’ и LR5 5’-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3’. Для амплификации участка гена, кодирующего фактор элонгации 1 протяженностью около 850 пар нуклеотидов, использовали праймеры EF1a-F 5’-GTT GCT GTC AAC AAG ATG GAC ACT AC-3’ (Mikheyev et al., 2006) и EF1a-R5 5’-CAG GCA ATG TGG GCT GTG TGA CAA TC-3’. Полученные нуклеотидные последовательности представлены в базе данных GenBank под номерами HQ191224–HQ191277. Полученные последовательности выравнивали при помощи программы Clustal W (Thompson et al., 1994). Для полученных выровненных последовательностей строили филогенетическое древо методом максимального правдоподобия PhyML-aLRT (Guindon & Gascuel, 2003) с использованием GTR модели (Tavar, 1986). Итоговые филогенетические деревья анализировали методом объединения соседних нуклеотидных пар (BIONJ) с использованием непараметрической Shimodaira– Hasegawa aLRT статистической модели.

Выделение и очистка ферментов C. militaris и A. bisporus проводилась на препаратах культуральной жидкости грибов, выращенных на среде Чапека, модифицированной соответственно добавлением желатины и казеина. Для очистки сериновой субтилизиноподобной пептидазы из C. militaris использовали методы аффинной хроматографии на бацитрацин-силохроме и гель-хроматографии на Superdex G75. Металлопротеиназу из A. bisporus очищали методом ионообменной хроматографии на DEAE Sephadex A-50 (batch-процедура) и на колонке Mono Q в режиме FPLC.

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значение стандартного отклонения. Все эксперименты проводили не менее чем в трех повторностях. Достоверность полученных данных проверяли двухвыборочным t-тестом для выборок с различающимися дисперсиями.

Результаты и обсуждение Глава 3. Определение корреляций между спектром секретируемых пептидаз и таксономическим положением или принадлежностью к определенным трофическим группам у грибов Методом ингибиторного анализа было установлено, что в препаратах культуральной жидкости исследованных мицелиальных грибов преимущественно содержатся пептидазы, относящиеся к двум классам – сериновых и металлопротеиназ.

Анализ распределения активности между этими двумя классами (рис. 1) показал, что пептидазы, секретируемые грибами, преимущественно принадлежат к одному из классов, Активность сериновых пептидаз, % P.nalgiovense 80 C.militaris.

T. saturnisporum T.spiralis B.bassiana 70 H.grisea M.anisopliae 60 P.carneus F.graminearum P. ostreatus 20 P. vulpinum M.oreades L.gongylophorus 10 A.bisporus P.aurivella C.comatus 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Активность металлопротеиназ, % Рис.1. Класс-специфичная активность внеклеточных пептидаз мицелиальных грибов Виды аскомицетов выделены желтым цветом, виды базидиомицетов – зеленым.

металлопротеиназ, ед.

M. oreades 200 P. vulpinum Активность A. bisporus 150 C. militaris P. aurivella 100 P. ostreatus C. comatus 5 6 7 8 9 рН оптимум металлопротеиназ B.bassiana Активность сериновых M.anisopliae T.spiralis 800 T.saturnisporum пептидаз, ед.

F.graminearum 600 P.nalgiovense C.militaris 200 P.ostreatus P.carneus 5 6 7 8 9 pH оптимум сериновых пептидаз Рис. 2. рН оптимумы наиболее представленных пептидаз исследованных мицелиальных грибов.

Виды аскомицетов выделены желтым цветом, виды базидиомицетов – зеленым. Красными линиями выделены интервалы значений рН-оптимумов пептидаз исследованных грибов.

при этом группу грибов с наиболее представленной активностью сериновых пептидаз составляли виды аскомицетов;

виды базидиомицетов преимущественно секретировали металлопротеиназы. На основании полученных данных было сделано предположение о существовании корреляции между класс-специфичной активностью пептидаз и таксономическим положением грибов.

Сравнение оптимумов рН активности наиболее представленных пептидаз показало, что внеклеточные сериновые пептидазы грибов наиболее активны в диапазоне рН 7.6 – 9.0, а металлопротеиназы – при рН 5.5 – 7.1 (рис. 2).

Изучение субстратной специфичности внеклеточных пептидаз выявило корреляции между секрецией некоторых групп ферментов и принадлежностью грибов к трофическим группам (табл. 1).

Таблица 1. Субстратная специфичность пептидаз исследуемых мицелиальных грибов Протеолитическая активность, рассчитанная на г. мицелия, ед.*102/ г Субстраты, cпецифичные для Субстраты, специфичные Экологическая группа эндопептидаз для экзопептидаз Glp-AAL- Glp-AAQ Bz-R-pNa L-pNa Y-pNa R-pNa pNa pNa Патогены растений и 13 533 1426 61 99 насекомых Сапротрофы как ассоциированные, так и 0 143 333 41 146 не связанные с насекомыми Степень достоверности t3=9.0 t12=4.6 t3=0.9 t4=0.78 t13=0.66 t4=1. наблюдаемых различий p = 2.6*10-3 p 0.001 p = 0.42 p = 0.48 p = 0.52 p = 0. в значениях активности Примечание: для определения степени достоверности полученных результатов использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями. tdf-рассчитанное значение t-статистики для определенного числа степеней свободы (df). Значение p определяет вероятность принадлежности всех полученных данных к одной выборке.

Розовым и сиреневым цветами, соответствующими использованным на рис. 3, выделены значения активности трипсиноподобных ферментов и аминопептидаз. Синим цветом выделены значения активности, определенные по субстрату Glp-AAL-pNa, специфичному для субтилизиноподобных ферментов.

Активность по синтетическому субстрату Bz-R-pNa была отмечена у видов патогенных грибов и отсутствовала у сапротрофов, за исключением вида T. saturnisporum.

Субстрат Bz-R-pNa является специфичным для трипсиноподобных пептидаз, и, по видимому, секреция пептидаз этого семейства может служить маркером патогенности.

Анализ доступных геномов грибов показал, что 95% видов, в геномах которых были обнаружены последовательности, сходные с трипсином, оказались патогенами (Hu, Leger, 2004;

Dubovenko et al., 2010).

Сравнение активности препаратов культуральной жидкости мицелиальных грибов по субстрату GLP-AAL-pNa, специфичному для эндопептидаз субтилизинового типа, показало, что эта активность присутствует у большинства исследованных грибов, хотя виды грибов-патогенов значительно интенсивнее секретировали пептидазы, активные по этому субстрату, чем виды сапротрофных грибов.

Вместе с тем, активность пептидаз по другим использованным субстратам, достоверно не различалась (табл.1), и, таким образом, относительная активность по субстратам L-pNa, Y-pNa и R-pNa, специфичным для аминопептидаз, у сапротрофов заметно превышала значение относительной активности этих ферментов, определенной у видов грибов-патогенов.

Величины относительной аминопептидазной и трипсиноподобной активности, определенные в препаратах культуральной жидкости исследованных мицелиальных грибов, представлены на рис. 3.

Как следует из приведенных данных, активность трипсиноподобных ферментов отрицательно коррелировала с величиной относительной активности аминопептидаз, при этом наличие этих активностей строго соответствовало типу питания грибов патогенности и сапротрофности. Возможно, сравнительно высокая секреция экзопептидаз связана с сапротрофным образом жизни, так как, по-видимому, основную роль в расщеплении белков в почве играют бактерии (Watanabe, Hayano, 1994), эндопептидазы которых образуют короткие пептиды. Обитание в микробном сообществе позволяет грибам секретировать только экзопептидазы, расщепляющие свободные короткие пептиды, образованные эндопептидазами бактерий.

Активности пептидаз обеих групп регистрировались лишь в случае гриба T. saturnisporum, что, по-видимому, объясняется мощными ферментными системами, известными для грибов этого рода.

Активность трипсиноподобных пептидаз, ед* 35 Относительная активность аминопептидаз, % 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Вид гриба* относительная активность аминопептидаз относительная актив ность аминопептидаз активность трипсиноподобных пептидаз актив ность по субстрату Bz-R-pNa Рис. 3. Относительная аминопептидазная и трипсиноподобная активность пептидаз некоторых мицелиальных грибов *1-A. bisporus, 2-B. bassiana, 3-C. comatus, 4-C. militaris, 5-F. graminearum, 6-H. grisea, 7 M. oreades, 8-M. anisopliae, 9-P. carneus, 10-P. nalgiovense, 11-P. vulpinum, 12-P. aurivella, 13-P. ostreatus, 14-T. spiralis, 15-T. saturnisporum.

Таким образом, были выявлены определенные корреляции между спектром внеклеточных пептидаз, с одной стороны, и таксономическим положением или принадлежностью к определенной трофической группе у грибов, с другой.

Глава 4. Изучение внутривидовой изменчивости протеолитической активности у грибов на примере системы «грибной сад» «Грибные сады» представляют собой мутуалистическую систему муравьев, принадлежащих к разным родам и видам трибы Attini, и гриба L. gongylophorus. «Грибные сады», образованные разными видами муравьев, различаются как морфологически, так и по привносимому муравьями в «сад» субстрату, что должно оказывать влияние на спектр секретируемых грибом соединений.

Таким образом, на примере «грибных садов», выращиваемых различными видами муравьев, возможно оценить изменчивость в спектре внеклеточных пептидаз под влиянием различных условий обитания гриба.

Анализ класс-специфичной активности показал, что в исследуемых колониях муравьев, прежде всего, секретируются пептидазы двух классов – сериновые и металлопротеиназы (рис. 4). Грибы-симбионты «низших муравьев» обладали низкой общей активностью пептидаз, с преобладанием металлопротеиназной активности.

Симбионты «высших муравьев» секретировали преимущественно сериновые пептидазы, и только для трех колоний была отмечена более высокая относительная активность металлопротеиназ.

Активность сериновых пептидаз, ед* Колонии низших муравьев Колонии высших муравьев Колонии муравьев листорезов Agaricus bisporus 200 26 50 2 8 4 18 5 76 10 0 50 100 150 200 250 300 Активность металлопротеиназ, ед* Рис. 4. Класс-специфичная активность пептидаз грибного симбионта в «грибных садах» * номера соответствуют номерам колоний муравьев, приведенным на рис.6: точкам синего цвета соответствуют профили активности, определенные в колониях низших муравьев, точкам зеленого цвета – активности, определенные в колониях высших муравьев, точкам красного цвета – активности сериновых и металлопротеиназ, определенные для L. gongylophorus из колоний муравьев-листорезов. Точке голубого цвета соответствует профиль активности, полученный для свободноживущего, филогенетически родственного L. gongylophorus гриба A. bisporus в погруженной культуре.

Грибы-симбионты муравьев-листорезов обладали наиболее высокой секреторной протеолитической активностью, с преобладанием металлопротеиназной активности.

Таким образом, величина общей активности пептидаз грибных симбионтов коррелировала с уровнем эволюционной прогрессивности видов муравьев, выращивающих данный грибной симбионт. При этом класс-специфичная активность (преобладание активности сериновых или металлопротеиназ) пептидаз грибного симбионта коррелировала с основными таксономическими группами муравьев, выращивающих L. gongylophorus.

В водных вытяжках мицелия грибного симбионта были обнаружены выраженные буферные свойства. Результаты экспериментов по определению буферной емкости образцов из «грибных садов» в сравнении с чистыми культурами L. gongylophorus и свободноживущих грибов приведены в табл 2.

Из приведенных данных следует, что значения буферной емкости, определенные в образцах из «грибных садов», значительно превышают значения, полученные для свободноживущих грибов или наблюдаемые в природных системах – почве (2.2 мэкв/Л) (Yong, 2001), и морской воде (2.4 мэкв/Л) (Mitchell & Rakestraw, 1993).

Таблица 2. Буферные свойства в системе «грибного сада» Вид гриба (Семейство) Чистая культура/ колония Буферная «грибного сада» емкость, мэкв/Л Свободноживущие грибы Чистая культура 9.6±1. Agaricus bisporus (Agaricaceae) Чистая культура 5.0±0. Pleurotus ostreatus (Pleurotaceae) Чистая культура 3.1±0. Pleurotus pulmonarius (Pleurotaceae) Чистая культура 2.0±0. Lentinula edodes (Marasmiaceae) Грибной симбионт Чистая культура 16.2±2. Leucoagaricus gongylophorus (из колонии Acech 322) (Agaricaceae) 21.9±3. L. gongylophorus Myrmicocrypta ednaella (Myred2) 21.9±2. Mycocephurus smithii (Mycsmi32) 20.6±0. Trachymyrmex cornetzi (Trcor1) 16.7±1. Sericomyrmex amabilis (Serama7) 17.9±1. Acromyrmex echinator (Acech322) 16.8±3. Acromyrmex octospinosus (Acoct1) 17.6±3. Atta colombica (Atcol1) 22.2±2. Atta cephalotes (Atcep1) При этом величина буферной емкости, определенная в «грибных садах», сходна со значением, известным для крови человека - 37 мэкв/Л (Ellison et al., 1958), что позволяет сделать вывод о важной роли поддержания рН в системе «грибного сада».

По-видимому, сохранение рН на уровне 5.2 в исследуемой системе приводит, с одной стороны, к снижению скорости размножения паразитических бактерий, а с другой – обеспечивает условия для роста собственного грибного симбионта.

Значение рН является одним из важнейших факторов, влияющих на функционирование системы «грибного сада», поэтому были проведены эксперименты по измерению зависимости активности внеклеточных пептидаз L. gongylophorus от рН (рис. 5).

250 Acech322, Активность металлопротеиназ, ед.

Acoct1, Atcol Trcor 150 A.bisporus Cylon Mycsmi Trcor Trsp3- Trzet 50 Myred Serama Cycos 4,5 5,5 6,5 7, pH оптимум активности металлопротеиназ Активность сериновых пептидаз. ед.

250 Trzet Trsp3- Serama 150 Acech322, Acoct1, Atcol Trcor 50 Myred 4,5 5,5 6,5 7, pH оптимум активности сериновых пептидаз Рис.5. pH оптимумы наиболее представленных пептидаз L. gongylophorus в «грибных садах» * Точкам синего цвета соответствуют значения рН оптимумов активности, определенные для пептидаз грибного симбионта L. gongylophorus в колониях низших муравьев: Cyphomyrmex longisсapus (колония Cylon12), Mycocepurus smithii (Mycsmi9), Myrmicocrypta ednaella (Myred 1), точкам зеленого цвета – оптимумы активности, определенные в колониях высших муравьев: Trachymyrmex cornetzi (Trcor4, Trcor10), Trachymyrmex sp. 3 (Trsp3-3), Trachymyrmex zeteki (Trzet3), Sericomyrmex amabilis (Serama1) точкам красного цвета – значения рН оптимумов активности сериновых и металлопротеиназ, определенные для L. gongylophorus из колоний муравьев-листорезов:

Acromyrmex echinator (Acech322), Acromyrmex octospinosus (Acoct1), Atta colombica (Atcol1). Точке голубого цвета соответствует значение рН-оптимума активности, полученное для свободноживущего, филогенетически родственного L. gongylophorus гриба A. bisporus в погруженной культуре. Пунктирными линиями показаны значения рН оптимумов пептидаз в колониях Trsp3-3 и Trcor4, для которых было отмечено два пика активности протеолитических ферментов грибного симбионта. Красными линиями выделены интервалы значений рН-оптимумов пептидаз L. gongylophorus в исследованных колониях муравьев.

_ Как следует из приведенных данных, оптимум активности как сериновых, так и металлопротеиназ несколько сдвинут в нейтральную область по сравнению со значениями рН-оптимума, определенного для свободноживущих грибов (рис. 2), и составляет 5.2 -7. для сериновых и 5.0-6.0 для металлопротеиназ, что, по-видимому, отражает адаптацию ферментативного аппарата L. gongylophorus к обитанию в более кислых условиях.

При этом, для некоторых колоний муравьев рода Trachymyrmex были отмечены дополнительные пики активности сериновых пептидаз при рН 5.2, что, в целом, нетипично для этого класса ферментов, однако согласуется с представлением об адаптивных изменениях в спектре внеклеточных ферментов L. gongylophorus, произошедших при переходе к обитанию в условиях «грибного сада».

Для грибных симбионтов, взятых из различных колоний муравьев, было построено филогенетическое древо (рис. 6), на которое были нанесены профили рН-зависимости общей и класс-специфичной активности внеклеточных пептидаз L. gongylophorus.

Согласно приведенным данным, филогения грибного симбионта строго совпадала с филогенетическим положением видов муравьев, выращивающих данный симбионт.

Симбионты, выращиваемые муравьями формировали на T. cornetzi, филогенетическом древе сестринскую ветвь к группе грибных симбионтов из колоний Sericomyrmex amabilis, Trachymyrmex sp3 и T.sp.f zeteki, но секретировали спектр протеолитических ферментов, сходный с пептидазами симбионтов из колоний муравьев листорезов – Acromyrmex и Atta. Симбионты T. cornetzi (колония Trcor4) занимали промежуточное положение на филогенетическом древе между группами симбионтов с преимущественной активностью сериновых и металлопротеиназ и секретировали приблизительно равные количества пептидаз, принадлежащих к двум классам.

Профили активности, полученные для симбионтов «низших муравьев», практически полностью совпадали с данными, полученными для близкородственных свободноживущих грибов – A. bisporus и C. comatus.

Рис. 6. Филогенетическое положение и рН оптимумы общей и класс-специфичной активности грибного симбионта из «грибных садов»* *Приведенные профили протеолитической активности включают общую активность (сплошные линии), активность металлопротеиназ (штриховые линии) и сериновых пептидаз (пунктирные линии). Вертикальные линии на графиках отражают значение рН в «грибном саду» (5.2) и нижнюю границу области оптимального функционирования щелочных пептидаз (7.0). Красным цветом выделены колонии муравьев-листорезов, в смывах из которых преимущественно регистрировалась активность металлопротеиназ. Зеленым цветом выделены колонии высших муравьев, с наиболее представленной активностью сериновых пептидаз грибного симбионта. Синим цветом выделены колонии низших муравьев, грибной симбионт которых преимущественно секретировал металлопротеиназы. Профиль активности, полученный для родственного свободноживущего гриба Agaricus bisporus, выделен голубым цветом.

Грибной симбионт муравьев Trachymyrmex cornetzi, секретирующий приблизительно равные количества сериновых и металлопротеиназ и занимающий промежуточное положение на филогенетическом древе, выделен коричневым цветом. Профиль активности симбионта колонии Apterostigma collare, относящегося к другому семейству – Pterulaceae, выделен серым цветом. Филогенетическое древо построено на основе анализа последовательностей генов LSU рРНК и фактора элонгации гена 1, за исключением образцов 20 и 23, для которых были использованы только последовательности генов LSU рРНК. Статистическая проверка достоверности полученных данных проводилась по критерию отношения правдоподобия, показаны значения, превышающие 0.5.

Согласно проведенным молекулярно-филогенетическим исследованиям (Mueller et al., 1998;

Vo et al., 2009;

Mikheyev et al., 2010), низшие муравьи трибы Attini выращивают в своих «садах» парафилетическую группу симбионтов, включающую также близкородственные виды свободноживущих грибов. Сходство полученных профилей активности A. bisporus и C. comatus (рис. 1, рис. 6) с результатами, полученными для симбионтов низших муравьев, может быть, таким образом, обусловлено филогенетическим родством этих грибов.

Сходство спектров соединений, секретируемых симбионтами низших муравьев трибы Attini и родственными свободноживущими грибами, было также показано De Fine Licht et al. (2010).

Активность, ед* Активность, ед*103 Активность, ед* Активность, ед* Активность, ед*103 Активность, ед*103 Активность, ед*103 Активность, ед* Рис. 6. Филогенетическое положение и рН оптимумы общей и класс-специфичной активности грибного симбионта из «грибных садов» Сопоставление профилей рН-зависимости активности грибных симбионтов низших, высших муравьев и муравьев-листорезов выявило смещение оптимума общей и класс-специфичной активности от рН 6.0 до 5.2, соответствующего рН «грибного сада».

Согласно полученным результатам, преимущественная секреция металлопротеиназ, по-видимому, является признаком, характерным для симбионтов предковых и наиболее примитивных групп муравьев. рН-оптимум как общей, так и металлопротеиназной активности симбионтов «низших муравьев» составлял 6.0, и был близок к предполагаемому рН почвы, в которой обитали свободноживущие предки грибных симбионтов «грибных садов». Возможно, в процессе эволюции произошло смещение рН-оптимума секретируемых ферментов от 6.0, соответствовавшего рН почвы, до 5.2 – значению рН, которое поддерживается муравьями в «грибном саду» (Orthius Lechner et al., 2000;

Bot et al., 2002).

Данные по изучению субстратной специфичности пептидаз L. gongylophorus в колониях «грибных садов» приведены в табл. 3.

Согласно представленным данным, грибные симбионты колоний Sericomyrmex amabilis, Trachymyrmex zeteki и Trachymyrmex sp3, с преимущественной активностью сериновых пептидаз, проявляли активность по п-нитроанилидным субстратам Glp-AAL pNa и Suc-AAPF-pNa, специфичным для субтилаз, но не расщепляли специфичные субстраты соответственно для трипсинов и химотрипсинов, Bz-R-pNa и Glp-F-pNa.

Ингибиторным анализом было показано, что активность этих пептидаз снижалась в присутствии общего ингибитора сериновых протеиназ PMSF, но не TLCK и TPCK (ингибиторов трипсина и химотрипсина) (Proteolytic enzymes, 2001), что указывает на возможную принадлежность сериновых пептидаз грибного симбионта к семейству субтилизина.

Полученные данные о субстратной специфичности, в целом, согласуются с представлением о сапротрофной природе предков грибного симбионта (Schultz et al., 2005). Вместе с тем, грибные симбионты демонстрировали сравнительно высокие значения активности внеклеточных эндопептидаз и обладали низкой относительной активностью экзопептидаз, что отличалось от данных, полученных для свободноживущих сапротрофных грибов (табл. 2). Возможно, это связано с тем, что микробное сообщество «грибного сада» значительно отличается от почвенного, так как муравьи удаляют бактерии и несимбиотические грибы из колонии, и поэтому белки не расщепляются предварительно бактериальными эндопептидазами, тем самым определяя высокую активность эндопептидаз самого грибного симбионта.

Таким образом, изучение внутривидовой изменчивости протеолитической активности у грибов на примере системы «грибной сад» подтвердило наличие корреляции между класс-специфичной активностью пептидаз и филогенией.

Таблица 3. Субстрат-специфичная активность пептидаз L. gongylophorus в системе «грибного сада» Колония муравьев, Класс-специфичная Протеолитическая активность, ед.

выбранная для активность по Субстраты Субстраты изучения пептидаз азоказеину, % эндопептидаз экзопептидаз грибного симбионта Металло- Сериновые Glp- Bz- Suc- F- L- Y протеиназы пептидазы AAL- R- AAPF- pNa pNa pNa pNa pNa pNa Apterostigma collare 94.1 0.27 9 0.02 11 0.04 0.08 (Apcol1) Mycocepurus smithii 88.6 4.6 3 0 5 0.01 0 (Mycsmi9) Cyphomyrmex 77.3 5.4 5 0.01 7 0 0.01 0. costatus (Cycos9) Myrmicocrypta 89.9 5.6 15 0 26 0 0 ednaella (Myred1) Sericomyrmex 13.8 73.7 187 0 427 0.01 0 amabilis (Serama12) Trachymyrmex 85.1 5.0 5 0 8.1 0 0 cornetzi (Trcor10) Trachymyrmex zeteki 8.3 92.6 121 0 214 0.06 0.02 0. (Trzet3) Trachymyrmex sp 17.4 76.1 209 0.05 356 0 0 0. (Trsp3-3) Acromyrmex 70.4 20.6 15 0 24 0 0.07 echinator (Acech322) Сопоставление профилей активности L. gongylophorus в колониях низших, высших муравьев и муравьев-листорезов выявило адаптивные изменения в спектре секретируемых пептидаз гриба, вызванные переходом к обитанию в системе с насекомыми.

Глава 5. Сравнительный анализ свойств наиболее представленных пептидаз грибов Cordyceps militaris, Agaricus bisporus и Leucoagaricus gongylophorus Наиболее активные ферменты из трех основных объектов исследования – сериновая пептидаза из энтомопатогенного гриба С. militaris, металлопротеиназа из гриба сапротрофа - A. bisporus и металлопротеиназа из L. gongylophorus (симбионта колонии муравьев Acromyrmex echinator) представляли интерес с точки зрения сравнения био- и физико-химических свойств. Для очистки пептидаз С. militaris и A. bisporus использовали культуральную жидкость качалочной культуры грибов. Результаты экспериментов по подбору среды культивирования, обеспечивающей максимальный выход исследуемых пептидаз, показали, что оптимальной средой для культивирования С. militaris является среда Чапека, модифицированная добавлением желатины, а для A. bisporus – эта же среда, с казеином. Сериновая пептидаза из С. militaris расщепляла как белковые, так и трех- и четырехчленные синтетические субстраты;

препарат металлопротеиназы из A. bisporus проявлял активность по одночленным субстратам, а также азоказеину и желатине.

Методами аффинной хроматографии на бацитрацин-силохроме и гель хроматографии на Superdex G75 был получен электрофоретически гомогенный препарат сериновой пептидазы из С. militaris с выходом 15% и степенью очистки 99 раз.

Металлопротеиназа из A. bisporus была получена в виде высокоочищенного препарата методами ионообменной хроматографии на DEAE Sephadex A-50 и ионообменной хроматографии на колонке Mono Q с выходом 0.71% и степенью очистки 60 раз.

Результаты экспериментов по проведению сравнительного анализа свойств наиболее представленных пептидаз грибов C. militaris, A. bisporus и L. gongylophorus приведены в табл. 4.

Таблица 4. Физико-химические свойства наиболее представленных пептидаз исследуемых мицелиальных грибов Вид гриба tC оптимум tC рН оптимум рН стабильность стабильность до 50C C.militaris 35-55 7-9 4.8-9. до 50C A.bisporus 35-40 6.0 4.5-9. до 50C L.gongylophorus 35-40 5.2 4.5-9. Как следует из приведенных данных, исследуемые пептидазы значительно различались зависимостью активности от рН. При этом щелочной оптимум активности, наблюдаемый в случае C. militaris, соотвествовал рН внутренней среды насекомого, оптимум активности металлопротеиназы из совпадал с рН, L. gongylophorus поддерживаемым в «грибном саду», а оптимум активности пептидазы A. bisporus, возможно, отражает адаптацию к функционированию ферментов в почвенных местообитаниях.

Внеклеточные пептидазы энтомопатогенных грибов, преимущественно относящиеся к классу сериновых, оказались более эффективными для расщепления покровов насекомых, чем ферменты сапротрофных грибов, принадлежащие, в основном, к классу металлопротеиназ. Результаты экспериментов по расщеплению белков кутикулы насекомых сериновой пептидазой C. militaris и металлопротеиназой A. bisporus представлены в табл. 5.

Согласно приведенным данным, Таблица 5. Действие сериновой пептидазы C.militaris и металлопротеиназы A.bisporus пептидаза гриба-энтомопатогена в два раза на белки кутикулы Nauphoeta cinerea более эффективно расщепляла белки покровов Вид гриба Деградация белков насекомого, чем металлопротеиназа гриба кутикулы, % сапротрофа A. bisporus, что, по-видимому, 18± Cordyceps militaris отражает большую приспособленность 9± Agaricus bisporus ферментативного аппарата энтомопатогенов к деградации специфичных для этих грибов субстратов.

Сравнительный анализ спектров внеклеточных пептидаз, секретируемых грибами, образующими биотические связи с насекомыми, выявил следующие корреляции (рис. 7 а,б): виды базидиомицетов, к которым относились грибы, являющиеся пищевым субстратом для насекомых, в основном секретировали металлопротеиназы и обладали сравнительно низкой активностью субтилизиноподобных пептидаз.

Виды аскомицетных грибов, к которым относятся многие грибы-энтомопатогены, преимущественно секретировали сериновые пептидазы и обладали высокой активностью субтилизиноподобных ферментов.

Класс-специфичная активность, таким образом, коррелировала с таксономическим положением грибов как на уровне больших таксономических единиц, так и на уровне штаммов одного вида (что было показано при изучении системы «грибного сада»).

Рис. 7. а. Корреляция между внеклеточной протеолитической активностью и таксономическим положением исследованных мицелиальных грибов.

Желтым цветом выделены виды аскомицетов, зеленым – базидиомицетов. Синим цветом отражена величина активности субтилизиноподобных пептидаз, при этом величина активности пропорциональна интенсивности цвета. Розовым цветом отмечены виды грибов с преобладающей активностью сериновых пептидаз, красным – металлопротеиназ. Вид P. ostreatus с приблизительно равными величинами этих активностей выделен обоими цветами.

б. Корреляция между внеклеточной протеолитической активностью и экологическими особенностями исследованных мицелиальных грибов.

Красным цветом выделены виды грибов-патогенов, серым – сапротрофов. Желтым цветом показано наличие трипсиноподобной активности, площадь выделения пропорциональна величине активности. Оттенками синего отражена величина аминопептидазной активности, при этом интенсивность цвета пропорциональна величине этой активности.

Активность по некоторым субстратам совпадала с принадлежностью грибов к определенным трофическим группам: виды грибов-патогенов расщепляли субстрат Bz-R pNa, специфичный для трипсиноподобных пептидаз. Сапротрофные грибы обладали более высокой относительной активностью аминопептидаз, однако вклад этих ферментов в деградацию белковых субстратов зависел от состава микробного сообщества: он был большим у почвенных грибов, и практически незначительным у штаммов L. gongylophorus в системе «грибного сада».

а Субтилизино Базидиомицеты подобная активность Trichurus Pleurotus spiralis ostreatus Coprinus Penicillium comatus nalgiovense Humicola Agaricus gisea bisporus Marasmius Trichoderma oreades saturnisporum Pholiota Metarhizium aurivella anisopliae Fusarium Penicillium graminearum vulpinum Paecilomyces Cordyceps militaris Beauveria carneus bassiana Активность Аскомицеты металлопротеиназ Активность сериновых пептидаз б Аминопептидазная Сапротрофы активность Trichurus Pleurotus spiralis ostreatus Coprinus Penicillium comatus nalgiovense Humicola Agaricus gisea bisporus Marasmius Trichoderma oreades saturnisporum Pholiota Metarhizium aurivella anisopliae Fusarium Penicillium graminearum vulpinum Paecilomyces Cordyceps carneus militaris Beauveria Трипсиноподобная bassiana активность Патогены Рис. 7. а, б Корреляция между внеклеточной протеолитической активностью и/ или таксономическим положением исследованных мицелиальных грибов.

Выводы 1. Выявлена корреляция между спектром секретируемых протеолитических ферментов и таксономическим положением мицелиальных грибов: изученные виды аскомицетов секретируют преимущественно сериновые пептидазы со щелочным рН-оптимумом 7.6 – 9.0, а виды базидиомицетов – металлопротеиназы с рН оптимумом 5.5 – 7.1.

2. Показана связь между субстратной специфичностью секретируемых пептидаз и принадлежностью грибов к определенным трофическим группам. Высокая трипсиноподобная активность показана для грибов – энтомо- и фитопатогенов, в то время как аминопептидазная активность может служить маркером сапротрофности.

3. В водных вытяжках мицелия грибного симбионта, полученного из «грибных садов», обнаружены выраженные буферные свойства. Оптимум активности пептидаз, секретируемых грибным симбионтом, совпадает с рН, поддерживаемым в «грибном саду», что обеспечивает максимальную эффективность деградации белков в этой системе. Переход к обитанию в системе с насекомыми приводит к изменению рН оптимума активности пептидаз L. gongylophorus с рН 6.0 до 5.2 (рН «грибного сада»).

4. Анализ высокоочищенных препаратов пептидаз из C. militaris, A. bisporus и L. gongylophorus показал, что исследуемые ферменты отличаются рН оптимумом активности. Пептидаза из энтомопатогенного гриба C. militaris эффективнее расщепляла кутикулу насекомых по сравнению с пептидазой сапротрофного гриба A. bisporus.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных положений по теме диссертации.

1. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Сектретируемая протеиназа энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris: подбор состава среды и разработка метода очистки. Микология и фитопатология, 2011. 44(6). 535-541.

2. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Сектретируемая протеиназа энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris: энзиматические свойства и адсорбция на кутикуле насекомых. Микология и фитопатология, 2011. 45 (1). 64-69.

3. Semenova TA, Hughes DP, Schiott M, Boomsma JJ. Evolutionary patterns of proteinase activity in attine ant fungus gardens. (in English). BMC Microbiology, 2011. 11:15.

Тезисы, материалы конференций.

1. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Протеиназа из энтомопатогенного гриба Cordyceps sp. I(XI) Международная конференция молодых ботаников, Санкт-Петербург, Май, 21-25, 2006.

2. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Секретируемая протеиназа из энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris (Fr.) Link. VI Международный Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», Москва, апрель 22-26, 2007.

3. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Секретируемая протеиназа энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris (L.) Link”, Перспективы и проблемы современной ботаники, Новосибирск, Октябрь, 17-21, 4. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Секретируемые протеиназы и ингибиторы пептидаз энтомопатогенных грибов. II Съезд Микологов в России, Москва, Апрель, 16-18, 2008.

5. Semenova TA, Schiott M, Boomsma JJ, Hughes DP. Fungal-ant interactions as models for solving evolutionary questions Nordforsk Meeting on Social Insect Biology (Nordic Network in Social Evolution), Oulanka, Finland, December 8-11, 2008.

6. Семенова ТА. Протеолитическая активность грибного симбионта в системе «грибной сад». I(IX) Конференция молодых ученых «Ломоносов», Апрель 11-14, 2010.

Для заметок