Исследование влияния бактерий pseudomonas sp. b-
На правах рукописи
Акимова Елена Евгеньевна ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP. B-6798 НА ФИТОПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ И ВЫСШИЕ РАСТЕНИЯ 03.00.16 – Экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Томск – 2007 2
Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии ГОУ ВПО «Томский государственный университет»
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Евгений Васильевич Евдокимов
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Большаков Михаил Алексеевич, кафедра физиологии человека и животных, ГОУ ВПО «Томский государственный универси тет» доктор биологических наук, профессор Штерншис Маргарита Владимировна, кафедра биологической защиты растений, ФГОУ ВПО «Новосибирский государст венный аграрный университет»
Ведущая организация: Институт биофизики СО РАН
Защита диссертации состоится «2» ноября 2007 г. в 12 час. на заседании диссерта ционного совета Д 212.267.10 при ГОУ ВПО «Томский государственный университет» по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина,
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Томский го сударственный университет» Автореферат разослан «» октября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Ю. Просекина Актуальность работы. В последнее время большое внимание уделяется развитию экологических методов борьбы с заболеваниями культурных растений, которые рассмат риваются как альтернатива химическим (Сорокина и др., 1999;
Штерншис и др., 2000).
По сравнению с химическими средствами защиты биопрепараты отличаются экологиче ской безопасностью, избирательностью действия;
их применение не нарушает взаимо связи между элементами агроэкосистемы и не вызывает резистентности у фитопатоген ных микроорганизмов. В связи с этим проблема поиска высокоактивных, конкуренто способных, технологичных штаммов микроорганизмов-антагонистов и разработки на их основе биопрепаратов с широким спектром полезного действия является весьма акту альной (Соколов, 1990;
Боронин, 1998;
Романовская и др., 2002).
Бактерии Pseudomonas sp. B-6798 обладают выраженным ризосферным эффектом, несмотря на то, что были получены с помощью автоселекции и скрининга к повышен ным концентрациям формальдегида, который является одним из наиболее токсичных от ходов ряда химических производств. Благодаря возможности использования формальде гида в качестве единственного источника углерода и энергии, являющегося одновремен но стерилизатором питательной среды, производство биопрепарата на основе бактерий Pseudomonas sp. B-6798 по сравнению с известными аналогами будет отличаться высо кой технологичностью, уменьшением энергоемкости, соответственно уменьшением за грязнения окружающей среды (например, выбросами углекислого газа в атмосферу) и рядом других положительных аспектов. Однако неясными остаются механизмы взаимо отношения данных бактерий с высшими растениями и их патогенами и поведение ин тродуцированной популяции, исходно чужеродной почвенной микрофлоре, в ризосфере сельскохозяйственных растений.
Целью данной работы являлось изучение взаимодействия формальдегидутилизи рующих бактерий Pseudomonas sp. B-6798 с фитопатогенными грибами и высшими рас тениями.
В задачи исследования входило:
1. Изучение влияния качественного состава среды на фунгистатические и ростстиму лирующие свойства бактерий Pseudomonas sp. В-6798, их культивирования и утилизации формальдегида.
2. Исследование кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов рода Fusar ium бактериями Pseudomonas sp. B-6798 в зависимости от концентрации в среде ионов железа (Fe3+).
3. Изучение влияния формальдегидутилизирующих бактерий на рост и развитие кар тофеля в лабораторных и полевых экспериментах и их выживаемость в ризосфере.
4. Изучение взаимоотношений бактерий Pseudomonas sp. B-6798 с фитопатогенами картофеля в полевых экспериментах.
5. Сравнительная оценка эффективности применения бактерий Pseudomonas sp. B 6798, с официально рекомендованным к применению биопрепаратом «Планриз» на ос нове бактерий Pseudomonas fluorescens AP-33.
Научная новизна работы. Показано, что среда М9 с формальдегидом положительно влияет на фунгистатическую и ростстимулирующую активность исследуемых бактерий, по сравнению с богатыми средами, рекомендуемыми для культивирования бактерий данного семейства. Построена и экспериментально подтверждена математическая мо дель кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798 in vitro посредством сидерофорного механизма. Полученные результаты мо делирования могут служить основой селекции бактерий-антагонистов, способных более эффективно конкурировать с фитопатогенами за железо при его высоких концентрациях в почве, за счет увеличения активности сидерофорной системы.
В лабораторных и полевых экспериментах выявлена стимуляция роста и развития картофеля под действием бактерий Pseudomonas sp. B-6798. Полезная продуктивность картофеля при бактеризации увеличивается на 10-40 %. Бактеризация клубней бактерия ми Pseudomonas sp. B-6798 позволяет уменьшить развитие ризоктониоза и парши обык новенной на 40-70 % и фитофтороза в вегетационный период на 45-50 %.
Практическая значимость. Проведенные лабораторные и полевые эксперименты позволяют рекомендовать бактерии Pseudomonas sp. В-6798 к применению в качестве биопрепарата, повышающего продуктивность картофеля, а также в защите растений против комплекса возбудителей его заболеваний. При выращивании бактерий на среде, содержащей формальдегид, стоимость препарата снижается за счет уменьшения затрат, направленных на достижение стерильности процесса культивирования. При этом биоло гическая эффективность применения препарата на основе формальдегидутилизирующих бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на 20-30 % выше аналогового биопрепарата «План риз».
Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на город ской конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 2003), VII и VIII Междуна родной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003, 2004), XLI и XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно технический прогресс» (Новосибирск, 2003, 2004), Актуальные проблемы биологии, ме дицины и экологии (Томск, 2004), III российско-монгольской конференции молодых ученых и студентов (Бийск, 2004), XI молодежной научной конференции Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктыв кар, 2004).
Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертации было сделано 9 пуб ликаций, из них 2 в изданиях, рецензируемых ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 134 страницах, содержит 29 ри сунков, 5 таблиц. Список литературы включает 223 источника, из них 104 – иностран ных источников.
Работа не состоялась бы без идейного вдохновителя – научного руководителя, д.б.н., профессора Евгения Васильевича Евдокимова за что ему особая благодарность. Автор выражает глубоую признательность и благодарность А.В. Евдокимову за методическую помощь при культивировании;
ст. преп. кафедры с/х биотехнологии Ю.Е. Якимову за методическую помощь в постановке полевых экспериментов и оформлении работы;
ст.
преп. кафедры с/х биотехнологии О.М. Минаевой за ценные советы, без помощи и под держки которой работа не была бы закончена;
к.б.н., доценту А.В. Куровскому и к. с-х.
н., доценту Н.Н.Терещенко за методическую помощь;
и.о. зав. кафедры с/х биотехноло гии, к.б.н., доценту С.Ю.Семенову за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 2. Объекты и методы исследований Объектом исследования являлись формальдегидрезистентные бактерии Pseudomonas sp. ВКПМ В-6798. Штамм получен методами направленной автоселекции и скрининга на устойчивость к формальдегиду из активного ила очистных сооружений Томского нефте химического комбината (ТНХК) в лаборатории биокинетики и биотехнологии НИИ ББ.
В качестве эталонного контроля для оценки эффективности применения формальде гидрезистентных псевдомонад использовались бактерии Pseudomonas fluorescens ВКПМ AP 33, являющиеся активным началом биопрепарата «Планриз». Для оценки антагони стической активности исследуемых бактерий в качестве тест-объекта взят гриб Fusarium oxysporum f.sp. gladioli;
ростстимулирующей – семена пшеницы сорта Новосибирская 15, клубни картофеля сортов Фреско, Невский, Луговской, Жуковский ранний, колони зирующей способности – семена кукурузы сорта Молдавская-215 АМВ, овса – сорта На рымский.
Питательные среды и культивирование. Культивирование бактерий Pseudomonas sp.
B-6798 осуществлялось на минимальной среде М9 (Миллер, 1976) с формальдегидом (4 г/л) путем каскадного пересева культуры. В процессе роста культуры происходило за кисление среды до рН=4.5-5.0, поэтому в среду добавлялся аммиак. Контроль численно сти клеток осуществляли согласно общепринятой методике (Руководство к практиче ским занятиям по микробиологии, 1995). Бактерии P. fluorescens AP-33 (биопрепарат «Планриз») в 2002 г. культивировали на ферментационной установке;
в 2004 г. были предоставлены ФГУ «Томская станция защиты растений». Для выращивания фитопато генных грибов использовался 20 % сусло-агар, крепостью 4-6 по Баллингу.
Изучение влияния сред различного состава. В ходе экспериментов семена пшеницы замачивались на 30 мин в суспензии бактерий Pseudomonas sp. В-6798 выращенных на различных средах в концентрации 106-107 клеток/мл: минеральной среде М9 с глюкозой, среде М9 с формальдегидом (4 г/л), богатой питательной среде, содержащей пептон, глицерин, свекловичную мелассу и кукурузный экстракт. В качестве контроля использо валась дистиллированная вода. Эксперимент проводился в пяти повторностях, по семян на каждый вариант. Влияние сред на активность бактериальной культуры оцени вали с помощью фитопатологического анализа одновременно с замером длины молодого растения.
Изучение кинетики ингибирования бактериями роста фитопатогенных грибов в зави симости от концентрации ионов железа (Fe3+) в среде. В питательную среду добавлялось необходимое количество железа (Fe3+), на чашки Петри со средой газоном высевались бактериальные суспензии (0.1 мл). После появления видимого бактериального роста для предотвращения физического контакта бактериальных и грибных колоний посевы зали вали тонким слоем агаризованной среды. На поверхность помещались агаровые блоки с мицелием гриба диаметром 1 мм равномерно по шаблону. Блоки вырезались из сплош ного шестисуточного газона мицелия гриба цилиндрическим пробкорезом. Чашки инку бировались в термостате (24±1.0 С). В качестве измеряемого параметра, отражающего рост гриба, использован диаметр колоний. Единым параметром оценки степени анти фунгального влияния предложено использование константы ингибирования. Описанным способом без нанесения бактериальной суспензии поставлена серия экспериментов для изучения влияния ионов железа (Fe3+) на рост фитопатогенных грибов.
Исследование влияния формальдегидутилизирующих псевдомонад на рост и разви тие картофеля в лабораторных условиях. В экспериментах была создана экосистема, со стоящая из трех звеньев: почвогрунт – растение-хозяин – опытный бактериальный штамм в концентрации 1*106–107 клеток/мл. В качестве растения-хозяина – проростки картофеля сорта Луговской длиной 1 см, которые отделялись от клубня, замачивались на 30 мин в суспензии бактерий, в контроле – в воде с минеральными солями. Растения вы ращивали в фитокамерах при 12-ти часовом освещении и температуре 22±1.0 С. Спустя 30 дней после посадки, растения повторно проливались бактериальной культурой в ука занной концентрации. Эксперимент был проведен в трех повторностях, по 35-40 расте ний на каждый вариант. С момента появления ростков замерялась высота побега, по окончанию эксперимента у каждого растения измерялась сырая вегетационная масса, количество листьев, учитывались количество и масса клубней.
Изучение влияния бактерий Pseudomonas sp. штамм В-6798 на рост, развитие и уро жайность картофеля в полевых условиях. Полевые эксперименты были заложены в веге тационные периоды 2002, 2004–2005 гг. на клубнях картофеля сортов Невский, Лугов ской, Жуковский ранний, Фреско. В ходе экспериментов клубни, а затем и растения кар тофеля обрабатывали бактериальной суспензией изучаемого штамма из расчета 1-3* клеток на клубень или растение. В контроле клубни картофеля обрабатывались водой с минеральными солями. В качестве эталонного контроля использован биопрепарат «Планриз». Растения высаживались из расчета 42 000 клубней/га.
Учет численности бактерий в ризосфере оценивался с помощью метода разведения и высева на плотные питательные среды (Руководство к практическим занятиям по микро биологии, 1995).
Антагонистическую активность бактерий оценивали путем проведения фитопатоло гических анализов клубней картофеля, полученных от бактеризованных и контрольных растений, в период хранения в соответствии с ГОСТ 11856-89 и ГОСТ 7194-81. В вегета ционный период 2005 года был проведен ряд фитопатологических учетов фитофтороза.
Определение процента поражения и степени развития заболеваний проводилось по стан дартной методике (Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков, 1989).
Статистическая обработка материала. Данные, полученные в ходе экспериментов, обрабатывались с помощью пакета STATISTICA for Windows, версия 6.0. Данные в ра боте представлены в виде средней арифметической с доверительным интервалом с уче том критерия Стьюдента для 95 % уровня значимости. Оценка достоверности получен ных результатов фитоанализа семян проводилась сравнением выборочных долей с уче том критерия Стьюдента для вероятностей 25–75 % включительно, с учетом критерия Фишера для других значений вероятностей. Сравнение данных параметров роста и раз вития растений в полевых экспериментах проводили по непараметрическому критерию Mann-Whitney (р0.05). Определение скоростей роста грибных колоний на твердой пита тельной среде проводилось с использованием линейного регрессионного анализа. Пара метры уравнений для исследования кинетики ингибирования бактериями роста грибов и параметров роста растений вычислялись с использованием нелинейного регрессионного анализа.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Технология культивирования бактерий Pseudomonas sp. штамм В-6798 на ферментационной установке Существует проблема утилизации формальдегида из его водных растворов, напри мер, как побочного продукта ряда технологических процессов. Известен способ аэроб ной биологической очистки промышленных сточных вод на очистных сооружениях типа аэротенков путем окисления формальдегида микроорганизмами активного ила. Недос татком способа являются низкие (до 1 г/л) предельно допустимые концентрации фор мальдегида в сточных водах, которые могут быть поданы на очистные сооружения, что ограничивает применимость способа. Учитывая аномально высокую устойчивость бак терий Pseudomonas sp. В-6798 к значительным дозам формальдегида (8000 мг/л) целью экспериментов данного раздела являлось получение большого количества биомассы формальдегидутилизирующих бактерий одновременно с утилизацией формальдегида на ферментационной установке «Bioengineering».
В соответствии с поставленной задачей предлагаемый способ культивирования мик роорганизмов осуществляется с помощью реактора объемом 15 л с микробной популя цией в водно-минеральной среде, без соблюдения условий строгой стерильности, аэроб ным глубинным способом в периодическом режиме в течение трех суток до концентра ции 3-61011-12 и полной утилизации формальдегида. Засев реактора осуществлялся куль турой бактерий рода Pseudomonas sp. В-6798 объемом 8-10 % от объема ферментера.
Биологическую производительность микробной популяции в среде реактора развива ли путем введения плавно увеличивающихся порций водного раствора формальдегида.
Для увеличения количества вводимых доз формальдегида на стадии падения рН (до 6.2) под действием ввода новой порции, в среду подавали порцию 25 % водного раствора аммиака в количестве, обеспечивающем увеличение кислотности до 90 % от диапазона его уменьшения. По соотношению периода восстановления содержания кислорода и пе риода восстановления нейтрального значения рН в среде под воздействием формальде гида и аммиака судят о сохранении дееспособности микробной популяции, что позволя ет оптимизировать величину порций формальдегида на наибольшем уровне.
Порционное введение формальдегида в режиме рН-стата позволяет увеличить вво димую порцию формальдегида до 64000 мг/л, при этом максимальная удельная скорость роста бактерий В-6798 µ=0.3 час-1, а концентрация биомассы 3.0-3.5 г АСБ/л соответст вует скорости усвоения формальдегида 85 мг в минуту на 1 г АСБ.
Проведенные в лаборатории длительные эксперименты с использованием селектив ного штамма формальдегидутилизирующих псевдомонад В-6798 показали высокую ста бильность штамма. В сравнении с известными способами биологического производства биомассы предлагаемый способ характеризуется простотой и дешевизной технологии и аппаратурного обеспечения. Использование этого штамма позволит значительно удеше вить процесс производства бакпрепаратов, по сравнению с традиционным, за счет уменьшения энерго- и ресурсозатрат и увеличить эффективность применения в различ ных областях биотехнологии, в частности для полной утилизации формальдегида из очистных вод промышленных предприятий.
3.2 Влияние качественного состава среды на фунгистатические и ростстимулирующие свойства Pseudomonas sp. В- Образование псевдомонадами антибиотиков и сидерофор в значительной степени за висят от углеродного и минерального питания бактерий (Кравченко и др., 2003;
Штарк, 2003;
Bellis, Ercolani, 2001;
Nielsen et al., 1998).
Для всех вариантов с бактеризацией семян, наблюдается значимое снижение общей зараженности в среднем в 2.4 раза, о чем свидетельствует рисунок 1. Общая заражен ность семян включала возбудителей корневых гнилей, альтельнариоза, бактериоза и плесневых грибов. Варианты с использованием бактерий выращенных на разных средах отличались друг от друга статистически незначимо.
Зараженность семян, % * * * Контроль МС М9+глюкоза БПС МС М9+ФДГ Рисунок 1 – Общая зараженность семян пшеницы сорта Новосибирская-15 возбудителями се менных инфекций в различных вариантах эксперимента Примечание. – Контроль – семена замоченные в воде;
БПС – богатая питательная среда для куль тивирования бактерий;
МС М9+глюкоза – минеральная среда с глюкозой;
МС М9+ФДГ– минеральная среда с формальдегидом (4 г/л);
* – статистически значимое отличие от контрольного варианта (р0.05).
*# *# Длина растений, мм * Контроль МС М9 + глюкоза БПС МС М9 + ФДГ Рисунок 2 – Длина растений пшеницы сорта Новосибирская-15 в зависимости от варианта экс перимента Примечание. –*– статистически значимое отличие от контрольного варианта;
# – статистически зна чимое отличие от варианта с бактериями, выращенными на БПС (р0.05).
Во всех вариантах с обработкой семян бактериальной культурой конечная длина мо лодого растения увеличилась по сравнению с контролем (рисунок 2). Однако наиболь шее влияние оказали бактерии, выращенные на минеральной среде М9 с глюкозой и с формальдегидом. Длина растений в этих вариантах статистически значимо отличалась как от контрольного варианта, так и от варианта с бактериями, выращенными на БПС.
3.3 Построение математической модели кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798 in vitro 3.3.1 Кинетика ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp. В- Подавление роста растений фитопатогенными микроорганизмами есть результат их выигрыша в конкуренции с другими видами микроорганизмов микрофлоры почвы. Из вестно, что железо, является одним из элементов питания, за который конкурируют мик роорганизмы (Neilands, 1957;
Шавловский, Логвиненко, 1988). В этой ситуации выигры вают те виды, которые более эффективно усваивают железо и делают его недоступным для конкурентов. Предварительные эксперименты (Минаева, 2007) показали, что бакте рии Pseudomonas sp. В-6798 обладают преимуществом перед фитопатогенами. Из лите ратуры известно, что в основе этого лежит способность флуоресцирующих псевдомонад к повышенной продукции сидерофорных соединений (Боронин, 1998;
Штерншис и др., 2000). Исследование антагонизма бактерий может также оказаться полезным для реше ния проблем их экологии и систематики, а также для использования в качестве средства биологической борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений (Соколов, 1990).
В работе О.М. Минаевой (2007) показано, что зависимость скорости роста колоний грибов на питательных средах с различными концентрациями бактерий подчиняется мо дифицированному уравнению Н.Д. Иерусалимского (Евдокимов, 2001):
K i V (C ) = V + Vmax K i + C [1] ;
где V(C) – скорость увеличения диаметра колоний фитопатогенных грибов (мм/ч);
V – остаточная ско рость роста гриба при “бесконечной” концентрации бактерий (мм/ч);
Vmax – кинетический параметр, от ражающий скорость роста гифов в отсутствии бактерий и в сумме с V, численно равный максимальной скорости роста данного гриба (мм/ч);
Ki – константа ингибирования, численно равная концентрации бак терий, при которой достигается половина от максимального эффекта ингибирования (клеток/мл);
– ко эффициент нелинейности ингибирования;
С – концентрация клеток бактерий в инокулюме (клеток/мл).
Количественным показателем описанной модели при унифицированной методике постановки эксперимента предложено использование константы ингибирования (Ki), ко торая отражает степень влияния бактерий на скорость роста гриба: чем она выше, тем ниже антифунгальный эффект, и наоборот. Например, Ki для Fusarium oxysporum f.sp. lini и Fusarium oxysporum f.sp. gladioli составила порядка 103 клеток/мл, для Fusarium oxysporum f.sp. – 102 клеток/мл.
Нами была предложена и апробирована методика, позволяющая численно оценить эффект подавления роста грибных колоний на плотных питательных средах в чашках Петри. В ходе экспериментов каждые 24 часа проводили измерение диаметра грибных колоний, образующихся на агаризованных питательных средах с различными концен трациями железа и бактерий в концентрации 106-107 клеток/мл в инокулюме. На рисунке 3 представлена зависимость ингибирования скоростей роста диаметра гриба Fusarium oxysporum f.sp. gladioli бактериями Pseudomonas sp. В-6798 от различных концентраций ионов железа Fe3+ в питательной среде.
0, Скорость роста гриба, мм/ч 0, 0, 0, 0, Контроль 0,028 0,56 10, 0 0,056 5, Концентрация железа (Fe3+) в среде, мг/л Рисунок 3 – Кинетика ингибирования скорости роста Fusarium oxysporum f.sp. gladioli бакте риями Pseudomonas sp. В-6798 при различных концентрациях ионов железа (Fe3+) в среде Примечание. – Контроль – рост гриба на стандартной среде (10 мг/л Fe3+) без бактерий;
0 – рост гри ба c бактериями Pseudomonas sp. B-6798 на среде без внесения ионов железа;
0.028, 0.056, 0.56, 5.6, 10.0 – рост гриба c бактериями Pseudomonas sp. B-6798 при заданных концентрациях железа (мг/л Fe3+) в среде.
С ростом концентрации ионов железа (Fe3+) в среде, степень ингибирования скорости роста Fusarium oxysporum f.sp. gladioli бактериями Pseudomonas sp. В-6798 снижается, как продемонстрировано на рисунке 3: добавление в среду ионов железа даже в концен трации 0.028 мг/л частично снимает ингибирование роста грибных колоний, что связано со снижением конкуренции за этот элемент сидерофор бактерий с сидерофорами фито патогенного гриба. Следует отметить, что добавление ионов железа Fe3+ не полностью снимает фунгистатический эффект оказываемый бактериями В-6798 на развитие фито патогена даже в концентрации 10 мг/л, что может быть связано со способностью иссле дуемого штамма продуцировать отличные от сидерофор антибиотические вещества.
3.3.2 Влияние ионов железа (Fe3+) в среде на рост фитопатогенных грибов Зависимость скорости роста грибных колоний можно описать с помощью классиче ского уравнения Моно. Скорость роста грибных колоний при отсутствии добавленного железа в среде очень низка, но не равна нулю. Поэтому, введем в уравнение дополни тельный член µ0:
S µ = µ0 + µ m Ks + S, [2] где µ0 – удельная скорость роста гифов при отсутствии ионов железа в среде;
µm – максимальная удель ная скорость роста гифов;
S – концентрация субстрата;
Ks – константа насыщения.
Рисунок 4 – Зависимость скорости роста диаметра гриба Fusarium oxysporum f.sp. gladioli от концентрации железа (Fe3+) в питательной среде Примечание. – В виде точек отображены практически полученные данные, в виде линии – теорети чески рассчитанная кривая.
С помощью метода нелинейного регрессионного анализа нами были рассчитаны ко эффициенты для зависимости скоростей роста диаметра колоний гриба Fusarium oxy sporum f.sp. gladioli от концентрации железа (Fe3+) в питательной среде (рисунок 4). В описанной модели µm составляла 0.45 мм/ч, Ks находилась на уровне 1.95, а µ0 не пре вышала 0.005 мм/ч.
Таким образом, описанная нами модель является классической и универсальной для описания зависимости удельной скорости размножения от концентрации лимитирующе го субстрата.
3.3.3 Математическая модель кинетики ингибирования бактерий рода Pseudomonas sp. B-6798 при сидерофорном механизме Для максимально эффективного использования популяции микробов-антагонистов в борьбе с фитопатогенами необходимо математическое описание кинетики конкурентно го взаимодействия популяций (Печуркин, 1978). Биологический аспект применения мик роорганизмов в защите растений основан на популяционных взаимодействиях конкури рующих видов с фитопатогенами. При этом популяции антагонистических видов либо интродуцируются, либо активизируется деятельность уже существующих антагонистов.
Методы эти популяционные, и для успешного их развития необходимо знать кинетиче ские характеристики используемых природных популяций.
Известно, что бактерии при росте в условиях недоступности ионов железа способны образовывать сидерофоры (Соколов, 1990;
Боронин,1998). Для удобства обозначим ко личество выделяемых молекул сидерофор через S. Концентрация молекул сидерофор, выделяемых в питательную среду, пропорциональна титру бактерий. Следовательно, ис ходную концентрацию молекул сидерофор в культуре бактериальных клеток можно принять за [S] (Варфоломеев, Гуревич, 1999):
[S] = С*k, [3] где С – титр клеток псевдомонад, клеток/л;
k – удельная продуктивность синтеза сидерофор клетками, моль/клеток.
Как известно из литературных данных, связывание ионов 3-х валентного железа из питательной среды молекулами сидерофор как продуктов метаболизма при нейтральных рН происходит в реакциях комплексообразования (Neilands, 1957;
Gill, Warren, 1988;
Al exander, Zuberer, 1993):
S + n Fe3+ SFe, к которым применимо классическое уравнение равновесия (Варфоломеев, Гуревич, 1999):
[ SFe] K= [ Fe 3+ ] n [ S ], [4] где K – константа равновесия, [ ] – концентрация вещества.
Из уравнения 4. выразим концентрацию свободных ионов железа Fe3+ в среде с сиде рофор-образующими бактериальными клетками:
[ SFe] n [ Fe 3+ ] = 1 [ K ] [S ], n n [5] где n – целое число, стехиометрический коэффициент.
Используя уравнение [2] и заменив [Fe3+] из выражения [5] преобразуем его к сле дующему виду:.
µ ([ Fe3+ ]) = µ 0 + µ m 1 K Fe [ K ] n [ S ] n + [ SFe ] n ;
[6] где KFe – константа насыщения.
K Fe [ K ] n 1 k K i, а так Обозначим n как (коэффициент нелинейности), и [ SFe ] n как же поделим числитель и знаменатель в дроби в выражении [6] на k K i. В результате получаем:
k Ki µ ([S ]) = µ0 + µm k Ki + [ S ] [7] Заменив [S] в соответствии с [3] на С*k и разделив числитель и знаменатель дроби в выражении [7] на k получаем искомую формулу, описывающую зависимость удельной скорости роста гифов µ от концентрации клеток ризобактерий [C]:
Ki µ ([S ]) = µ0 + µm Ki + [C ] [8] Из этого следует, что выражение [8] полностью совпадает с модифицированным уравнением Иерусалимского [1], при этом [ SFe] Ki = k K Fe K n Получив методом регрессионного анализа среднее значение, можно узнать n, а именно, сколько ионов железа участвует в сидерофорном транспорте одной бактериаль ной клетки. В работе О.М. Минаевой (2007) показано, что (коэффициент нелинейности ингибирования) грибов рода Fusarium и Bipolaris бактериями Pseudomonas sp. B-6798 в среднем равен 0.19±0.02, следовательно n 5, то есть столько ионов железа связываются сидерофорной системой одной бактериальной клетки Pseudomonas sp. В-6798.
Антагонизм псевдомонад в отношении фитопатогенов, обусловленный конкуренцией за железо, эффективен только при низком содержании железа в почве (Боронин, 1998;
Соколов, 1990). При высоких концентрациях железа в почве возможно два пути повы шения эффективности применяемых бактерий. Первый основан на увеличении плотно сти популяции агента, что практически реализовать достаточно сложно, второй – на применении агентов, имеющих более высокую активность сидерофорной системы транспорта. Предложенная математическая модель кинетики сидерофорного механизма ингибирования позволяет численно оценить этот параметр по экспериментально полу ченному коэффициенту нелинейности ингибирования. На основании этого возможна це ленаправленная селекция бактерий-антагонистов по активности сидерофорной системы.
3.4 Влияние формальдегидутилизирующих бактерий штамм В-6798 на рост и развитие картофеля 3.4.1 Влияние бактерий В-6798 на рост и развитие картофеля в лабораторных условиях Из литературы известно о положительном влиянии на рост, развитие и урожайность сельскохозяйственных растений при внесении ризосферных бактерий рода Pseudomonas.
Установлено, что бактерии Pseudomonas sp. B-6798 эффективно влияют на рост и разви тие овса, пшеницы, кукурузы, как в лабораторных, так и полевых условиях (Минаева, 2007), но неизвестно влияние данного штамма бактерий на параметры развития и уро жайность картофеля.
В ходе обработки данных установлено, что рост картофеля, соответствовал S образной кривой. Для описания данной кривой было использовано логистическое урав нение следующего вида (Ризниченко, Рубин, 1993):
Ae rt y (t ) = B + x0 e rt [9] ;
где y соответствует длине проростка с течением времени (мм);
t – время (сут.);
r – скорость удлинения проростка (мм/сут.);
x0 – «минимальная» длина проростка, соответствующая длине проростка после ак тивации семени в течение 24 часов (мм);
А – константа уравнения, численно соответствующая произве дению минимальной длины проростка на максимально возможную в условиях эксперимента (мм) A=x0xmax;
В – константа уравнения, численно соответствующая вычитанию минимальной длины пророст ка из максимальной (мм), B= xmax – x0.
В ходе эксперимента установлено, что обработка растений бактериальной культурой положительно повлияла как на кинетические параметры роста растений: удельная ско рость роста растений (r) статистически значимо увеличилась по сравнению с необрабо танными растениями, конечная длина растения (хmax) в варианте с обработкой бактерия ми увеличилась в 1.3 раза;
так и на все параметры развития растения: увеличилась ко нечная длина растений, масса растений, количество листьев, количество и масса клуб ней. Количество растений, обработанных бактериями, находящихся в фазе клубнеобра зования, было выше в 2 раза, по сравнению с контрольным вариантом. Масса клубней, собранных в вариантах с обработкой растений бактериями В-6798 по сравнению с необ работанными, увеличилась в 3.6 раза.
3.4.2 Влияние формальдегидутилизирующих бактерий штамм В-6798 на рост и раз витие картофеля в полевых условиях 3.4.2.1. Влияние бактерий на рост картофеля в полевых условиях Рост растений картофеля в полевых условиях в зависимости от сезона описывался в 2002 и 2004 гг. логистической, в 2005 экспоненциальной кривыми, что может быть свя зано с разными почвенно-климатическими условиями в период роста растений в течение вегетационных экспериментах. Культура бактерий для эксперимента Pseudomonas sp. В 6798 и P. fluorescens AP-33 были выращены на ферментационной установке «Bioengi neering». В ходе эксперимента в течение месяца от всходов растений измерялась длина максимального побега в каждом кусте во всех вариантах. Также в эксперименте учиты валось количество стеблей в кусте, интенсивность цветения растений.
Для описания начального участка кривой логистического роста растений было ис пользовано экспоненциальное уравнение следующего вида (Ризниченко, Рубин, 1993):
x = x0 e rt [10] ;
где L – длина вегетативной части растения через время (t) (мм);
x0 – первоначальная (исходная) длина проростка, при t=0 (мм);
r – скорость удлинения растения (мм/час);
t – время (час).
В ходе экспериментов установлено, что обработка клубней и растений бактериаль ными препаратами в целом положительно повлияла на все параметры развития растений:
отмечена тенденция, а в 2002 г. статистически значимое увеличение конечной длины растений xmax в вариантах с применением бактериальных препаратов, увеличилось коли чество стеблей в кусте;
цветение в вариантах с обработкой начиналось раньше и было более обильное, чем в контроле.
Известно (Мишустин, 1972;
Боронин, 1998), что стимулирующее влияние на рост и развитие вегетативной массы основано на том, что бактерии рода Pseudomonas способны к синтезу различных регуляторов роста (ИУК, гиббереллины), витаминов. По данным Ю.А. Гущиной и И.Ф. Головацкой (2001) бактерии штамма В-6798 способны секретиро вать в среду вещества ауксиновой природы, и, в частности, ИУК в количестве 0.8 мкг/мл.
Бактерии опытного штамма на протяжении полевых экспериментов 2002 и 2004 гг.
оказывали на рост и развитие растений больший положительный эффект, чем зарегист рированный и применяемый в России биопрепарат «Планриз».
3.4.2.4 Влияние бактеризации на урожайность картофеля Для изучения влияния бактерий штамма В-6798 на полезную продуктивность карто феля в вегетационных экспериментах послы выкопки учитывалась масса (г/куст) и коли чество клубней в лунке, фракционный состав.
2004 г.
2002 г. Жуковский Полезная продуктивность картофеля, ц/га Жуковский Невский Луговской Фреско ранний *# # ранний ** * К Пз К Пз К Пз К Пз К Пз B-6798 B-6798 B-6798 B-6798 B- Рисунок 5 –Полезная продуктивность картофеля в полевых экспериментах 2002 и 2004 гг.
Примечание. – К – контроль;
В-6798 – вариант с применением бактерий штамма В-6798;
Пз – вари ант с применением биопрепарата Планриз;
* – статистически достоверное отличие от контроля, # – ста тистически достоверное отличие от Планриза (р0.05).
В 2002 г. полезная продуктивность от применения штамма В-6798 увеличилась в среднем на 26-31 % в зависимости от сорта (рисунок 5);
от применения биопрепарата «Планриз» на 22-32 %;
наблюдается тенденция к увеличению количества клубней в лун ке от бактеризации. В 2004 г. полезная продуктивность растений в варианте с использо ванием бактерий В-6798 сорта Луговской увеличилась на 30-32 %, сорта Невский на 13 15 %, сорта Жуковский ранний на 8-10 % по сравнению с контрольным вариантом, в то время как в варианте с применением биопрепарата Планриз она снизилась на всех сортах даже по сравнению с контролем. На растениях сорта Жуковский и Луговской отмечена тенденция к увеличению количества клубней в лунке в вариантах с обработкой растений бактериями штамма В-6798.
Известно, что стимулирование роста картофеля флуоресцирующими псевдомонада ми эффективно только при коротком севообороте (1:1) и только для семенного картофе ля (Bakker и др., 1986;
Geels и др., 1986). Поэтому, в полевом эксперименте 2005 г. дваж ды за вегетацию проводился учет формирования урожая. Отмечено, что именно на ран них этапах развития растений эффективность применения бактерий В-6798 выше: на картофеле сорта Невский значимо увеличилась масса клубней (в 2.2 раза), сорта Лугов ской в 2.5 раза, а количество клубней с лунки увеличилось в 2.8 раза по сравнению с контролем, в дальнейшем отмеченное отличие сглаживается.
Таким образом, показано, что биологические препараты оказывают положительное влияние на урожайность клубней, но, в итоге, эффективность применения зависит от сорта, почвы, севооборота и погодных условий.
3.4.3 Выживаемость бактерий Pseudomonas sp. B-6798 в ризосфере сельскохозяйственных растений Успешная колонизация корней растений и дальнейшая способность бактерий под держивать численность в зоне ризосферы на достаточно высоком уровне являются обя зательными свойствами, предъявляемыми к штаммам-интродуцентам (Боронин, 1998;
Benizri et al., 2001). Только при наличии данных условий бактерии способны проявлять весь комплекс положительных эффектов на рост и развитие растений.
В наших экспериментах установлено, что бактерии Pseudomonas sp. B-6798 в ризо сфере кукурузы, овса, пшеницы и картофеля способны не только выживать, но и успеш но размножаться, значительно увеличивая свою численность, как в лабораторных, так и полевых экспериментах. Следует отметить, что период наибольшего увеличения числен ности бактерий в прикорневой зоне совпадает с периодом активного роста проростков.
Динамика численности интродуцированного штамма в целом соответствует общему изменению количества бактериальной флоры в ризосфере кукурузы (рисунок 6). Макси мальное количество бактерий в зоне ризосферы кукурузы наблюдалось приблизительно на 70 сутки с момента постановки экспериментов, соответствующие периоду цветения– образования початков, после чего наблюдается некоторое снижение общей бактериальной численности.
Рисунок 6 – Рост кукурузы и динамика численности бактериальной флоры в зоне ризосферы в полевых экспериментах Примечание. – 1 – длина кукурузы;
2 – общая численность бактерий;
3 – численность бактерий Pseudomonas sp. B-6798.
Для эффективной работы биопрепарата необходимо поддерживать в ризоплане ми нимальную концентрацию бактериальных клеток ( 104 бактерий/см корня);
этот порог зависит также от вида растения, его возраста (Соколов, 1990). В наших экспериментах численность бактерий-интродуцентов устанавливалась на уровне свыше 1*104 КОЕ/г почвы, примыкающей к растительному корню уже на 20 сутки эксперимента для всех исследованных видов растений (кукуруза, пшеница, овес), после чего численность бак терий в зоне ризосферы до окончания цветения нарастала. После окончания вегетации бактерии полностью вытеснялись из бактериальной флоры почвы, сохраняя экологиче ское равновесие и не вызывая бактериального загрязнения почв. Однако периода их на личия в ризосфере растений достаточно для оказания значительного ростостимулирую щего эффекта (длина бактеризованных растений кукурузы в 1.6 раз превышала длину контрольных, пшеницы и овса – в 1.4 и 1.5 раза соответственно).
Таким образом, бактерии Pseudomonas sp. B-6798 способны поддерживать числен ность на достаточно высоком уровне в ризосфере сельскохозяйственных культур в веге тационный период в лабораторных и полевых условиях, используя в качестве источни ков углерода и энергии корневые выделения растений.
3.4.3 Влияние формальдегидутилизирующих псевдомонад на зараженность картофеля возбудителями листовых инфекций в вегетационный период Как известно из литературных источников, растение, находящееся в благоприятных условиях, при сбалансированном поступлении питательных веществ формирует имму нитет, способный противостоять внедрению патогенов и развитию заболевания. Поэтому проведение учета пораженности растений фитофторозом в вегетационный период кос венным образом отражает их способность противостоять поражению фитопатогенными грибами и свидетельствует об уровне их иммунитета (Павлюшин и др., 2002).
Распространенность болезни отражает количество больных растений или отдельных органов, выраженное в процентах от общего числа обследованных растений на участке, в поле:
n P= N;
[11] где P – распространенность болезней, %;
n – число больных растений (клубней) в пробе, шт.;
N – общее число растений (клубней) в пробе, шт.
Степень развития болезни или интенсивность поражения служит качественным пока зателем болезни и рассчитывается по формуле:
(a b) R= N ;
[12] где R – степень развития болезни, %;
(a х b) – сумма произведений числа больных растений (клубней) (a) на соответствующий процент поражения (b);
N – общее число растений (клубней) в пробе.
Контроль Pseudomonas sp. B- Развитие болезни, % * * * I II III IV I II III IV Рисунок 7 – Развитие фитофтороза на посадках картофеля сорта Невский в полевом экспери менте 2005 г.
Примечание. – I, II, III, IV – фазы замеров.* – достоверное отличие от контрольного варианта (р0,05).
Представленный рисунок демонстрирует, что с момента проявления на посадках кар тофеля фитофтороза на опытном участке болезнь получила значительно меньшее рас пространение. К окончанию вегетации развитие фитофтороза на опытных участках на 45-50 % ниже, чем на участках контроля. Процент пораженных растений при этом в кон троле и опыте достигал 100. В связи с чем, уменьшение развития фитофтороза можно связать только со снижением интенсивности поражения.
Как известно, урожай, а также интенсивность развития заболеваний клубней при хранении находятся в прямой зависимости от степени проявления болезней картофеля в период вегетации. Приемы, снижающие развитие фитофтороза в вегетационный период позволяют получить большее число здоровых клубней с минимальным предрасположе нием к заражению гнилями и развитию их в период хранения.
3.4.4 Влияние бактерий Pseudomonas sp. штамм В-6798 на устойчивость клубней картофеля к заболеваниям при хранении Микробные сообщества, формирующиеся на поверхности корня растения и в при корневой зоне почвы, оказывают существенное влияние на рост и развитие растений.
Так, значительная численность фитопатогенных микроорганизмов в прикорневой зоне создает повышенный риск заболевания, а усиленная конкуренция непатогенных популя ций, напротив, снижает этот риск. При биоконтроле происходит не полное уничтожение нежелательного микроорганизма, а ограничение его доминирования, безудержного раз множения, приводящего к уничтожению растения-хозяина.
Таким образом, цель экспериментов данного раздела – оценить фунгистатический эффект формальдегидутилизирующих псевдомонад на клубнях картофеля нового урожая в период хранения. Для этого картофель во всех экспериментах после выкопки заклады вался на зимнее хранение.
Для определения степени пораженности клубней картофеля использовалась бальная шкала (Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков, 1989). Распространен ность болезни в партии клубней рассчитывается по формуле [11], степень развития бо лезней на клубнях по формуле [12]. Данные о развитии болезней на клубнях картофеля представлены на рисунке 8.
1, Ризоктониоз Парша 1, Развитие болезни, балл 1, 1, 1, *# 0, 0, 0, *# 0, 0, Контроль Планриз Контроль Планриз Ps. sp. B-6798 Ps.sp. B- Рисунок 8 – Развитие заболеваний на клубнях картофеля на примере сорта Жуковский ранний 2002 г.
Примечание. – * – статистически достоверное отличие от контрольного варианта, # – статистически достоверное отличие от варианта с бактеризацией планризом (р0.05).
Следует отметить, что обработка клубней и растений в вегетационный период бакте риями штамма В-6798 позволило значимо снизить развитие заболеваний образовавшихся клубней. На приведенном рисунке в опытном варианте показано статистически значимое снижение развитие парши обыкновенной (в 2 раза) и ризоктониоза (в 4 раза) по сравне нию с контролем. В среднем снижение развития парши и ризоктониоза при бактеризации опытным штаммом псевдомонад составило 40-50 % и 50-75 % соответственно. На сни жении развития заболеваний главным образом оказало влияние снижение интенсивности поражения, в меньшей степени – уменьшение количества больных клубней.
Меньшее влияние на снижение развития заболеваний оказала бактеризация клубней планризом: в среднем снижение достигало 30-40 %. В некоторых случаях уменьшение развития заболеваний не отмечено и даже превысило контрольные показатели. Таким образом в наших экспериментах наблюдался нестабильный эффект от применения био препарата «Планриз»: препарат или не снижал развитие заболеваний, или снижал, но менее эффективно по сравнению со штаммом В-6798.
Известно, что предпосадочная обработка посевных клубней и последующее опры скивание растений в ходе вегетации препаратами способствует снижению популяцион ной плотности на клубнях нового урожая возбудителей заболеваний как за счет сниже ния плотности популяции фитопатогенов в почве, так и за счет увеличения резистентно сти растений к данным возбудителям. Отмечено, что применение биопрепаратов, как правило, способствует улучшению фитосанитарного состояния клубней нового урожая (Куликов и др., 2006).
Выводы 1. Установлено влияние качественного состава питательной среды на фунгистатические и ростстимулирующие свойства бактерий Pseudomonas sp. В-6798: наибольший положи тельный эффект отмечен при культивировании бактерий на минеральной среде М 9 с глюкозой и минеральной среде М 9 с формальдегидом в качестве единственного источ ника углерода и энергии.
2. Построена математическая модель кинетики ингибирования грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798 посредством сидерофорного механизма, на основании которой возможна количественная оценка активности сидерофорной системы бактериальной клетки, что дает основание для целенаправленной селекции штаммов бактерий антагонистов по увеличению способности связывания ионов железа (Fe3+).
3. Отмечено положительное влияние формальдегидутилизирующих псевдомонад на рост и продуктивность растений картофеля, при этом полезная продуктивность увеличи вается как в лабораторных (в 2.5-3 раза), так и полевых условиях (на 10-40 % в зависи мости от сорта).
4. Бактеризация клубней и растений Pseudomonas sp. В-6798 положительно сказывается на снижении развития заболеваний картофеля: фитофтороза в вегетационный период на 45-50 %, ризоктониоза и парши обыкновенной в период хранения на 40-70 %.
5. Показано, что бактерии Pseudomonas sp. В-6798 при интродукции в ризосферу пше ницы, овса, кукурузы, картофеля способны выживать и сохранять свою численность на уровне, достаточном для оказания значительного положительного эффекта (не менее 104 клеток/г почвы).
6. В полевых экспериментах показано, что биологическая эффективность бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на 20-30 % выше эффективности бактерий официально рекомен дованного к применению биопрепарата «Планриз».
Работы, опубликованные по теме диссертации 1. Акимова Е.Е. Использование искусственных экосистем в качестве моделей для изучения и реализации устойчивого развития в агрофитоценнозах / Минаева О.М., Акимова Е.Е. // Вестник ТГУ. Приложение. Материалы международных, всерос сийских и региональных научных конференций, симпозиумов, школ, проводимых в ТГУ. – 2005. – № 13. – С. 107–109.
2. Акимова Е.Е. Использование малых моделей искусственных экосистем для изу чения взаимодействия ризобактерий с растением-хозяином и микроскопическими почвенными грибами / Минаева О.М., Акимова Е.Е. // Исследовано в России. – Электрон. журнал. – 2006. – № 062. – С. 617–623.
3. Акимова Е.Е. Бактерии Pseudomonas sp. В-6798 как антагонисты роста фитопатоген ных грибов и стимуляторы роста растений / Минаева О.М., Акимова Е.Е., Гущина Ю.А., Евдокимов Е.В. // Проблемы экологической безопасности и природопользования в За падной Сибири. Труды ТГУ, серия биологическая. – Т. 266 – Томск: 2004. – С. 55–59.
4. Акимова Е.Е. Влияние ризосферных псевдомонад на урожайность сельскохозяйствен ных культур // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. Сборник науч ных работ. – Т. 3. – № 3. – Томск: 2004. – С. 400-401. СГМУ.
5. Акимова Е.Е. Формальдегидутилизирующие псевдомонады, способствующие росту и развитию растений // Материалы XLII Международной научной студенческой конфе ренции «Студент и научно-технический прогресс»: Молекулярный дизайн и экологиче ски безопасные технологии. – Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т., 2004. – 52 с. – С. 13–14.
6. Акимова Е.Е. Действие формальдегидутилизирующих псевдомонад // Биология – нау ка XXI века: VIII Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. – Пущино: Авторская редакция, 2004. – С. 348–348.
7. Акимова Е.Е. Действие формальдегидутилизирующих псевдомонад на урожайность картофеля // Алтай: экология и природопользование: Материалы III российско монгольской конференции молодых ученых и студентов. – Бийск: НИЦ БПГУ им.
В.М.Шукшина, 2004. – 431 – с. 282-285.
8. Акимова Е.Е. Использование формальдегидутилизирующих псевдомонад для защиты картофеля от фитопатогенных микроорганизмов // Материалы докладов XV Коми рес публиканской молодежной научной конференции (в 2-х томах), Т. 2: XI молодежная на учная конференция Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии». – Сыктывкар: 2004. – 357 с. – С. 8-9.
9. Акимова Е.Е. Действие формальдегидутилизирующих псевдомонад // Биология – нау ка XXI века: VII Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых.
Сборник тезисов. – Пущино: Авторская редакция, 2003. – 452 с. – С. 83.