Искусственные ассоциации бактерий rhizobium leguminosarum с корнями томата и табака, трансгенными по гену psl лектина гороха
На правах рукописи
БЛАГОВА ДАРЬЯ КОНСТАНТИНОВНА Искусственные ассоциации бактерий Rhizobium leguminosarum с корнями томата и табака, трансгенными по гену psl лектина гороха 03.01.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук Баймиев Алексей Ханифович
Научный консультант:
Доктор биологических наук, доцент
Официальные оппоненты: Маркушева Татьяна Вячеславовна Доктор биологических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра РАН руководитель тематической группы Белимов Андрей Алексеевич Доктор биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН заведующий лабораторией Федеральное государственное бюджетное
Ведущая организация:
учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Защита диссертации состоится «_» 2013 г. в «» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133. при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии Наук по адресу: Уфа, пр. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), e-mail: [email protected]
Автореферат разослан «» 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность: В настоящее время важной задачей является увеличение эффективности использования аграрных ресурсов без ущерба для окружающей среды. Одним из возможных подходов для развития экологически ориентированного земледелия может стать использование ростостимулирующих ризобактерий (Plant growth promoting rhizobacteria – PGPR). Исследования этой перспективной группы почвенных микроорганизмов вызывают большой интерес, как с фундаментальной, так и с практической точки зрения. Обнаружены штаммы PGPR, способные улучшать рост и урожайность растений, защищать их от фитопатогенов и негативного воздействия окружающей среды (Dimkpa, 2009;
Pliego et al., 2011;
Glick, 2012).
К хозяйственно полезным видам PGPR в числе прочих относятся ризобии – почвенные грамм-отрицательные бактерии, способные вступать в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями. Хотя ризобии способны вступать в эндосимбиоз, за редким исключением, только с бобовыми растениями, существуют работы, выявляющие их потенциал в качестве ассоциативных микросимбионтов для небобовых культур (Mishra et al.,2006;
Mehboob et al., 2012;
Ashraf, 2013). Однако в естественных условиях искусственно интродуцированные ризобии с полезными признаками часто не выдерживают конкуренции и вытесняются более агрессивными микроорганизмами.
Для улучшения колонизации ризобиями корней небобовых растений и создания более стабильных ассоциативных симбиозов применяются различные методы, в том числе, получение трансгенных растений, синтезирующих вещества, участвующие в сигналинге на ранних этапах бобово-ризобиального симбиоза.
(Sreevidya et al., 2006;
Li et al., 2011;
Tirichine, 2012) Одними из таких веществ являются лектины - секретируемые белки, способные узнавать и избирательно связывать разнообразные углеводы. Они связываются с полисахаридами на клеточных стенках ризобий, тем самым фиксируя микроорганизмы на поверхности корневых волосков и вызывая у них перестройки, значимые для формирования симбиоза. (Карпунина и др., 2002;
Садовникова и др., 2003;
De Hoff et al., 2009) Ранее в нашей лаборатории была исследована возможность использования лектинов для модификации процессов узнавания бобовыми растениями симбиотических партнеров и создания ассоциаций между ризобиями и такими небобовыми растениями как облепиха, рапс и табак (Вершинина, 2010).
Дальнейшим направлением исследований, представленных в данной работе, стало изучение характеристик искусственных симбиотических ассоциаций между небобовыми растениями, трансгенными по гену лектина гороха (psl) и ризобиями, обладающими различными полезными свойствами, с точки зрения их возможного практического применения.
Целью данной работы являлось создание искусственных ассоциаций клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями, трансгенными по гену psl лектина гороха, и исследование их свойств. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Получить маркированные флуоресцентными белками штаммы клубеньковых бактерий для их детекции in vivo и in vitro;
2. Исследовать возможность и характер колонизации ризосферы растений табака и томата, трансгенных по гену psl, флуоресцентно меченым штаммом клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum;
3. Изучить влияние колонизации ризобиями трансгенных по гену psl корней растений на их устойчивость к фитопатогенам (на примере возбудителей корневой гнили);
4. Исследовать возможность использования ассоциаций трансгенных по psl растений с ризобиями, вырабатывающими псевдофитохелатин, для биоремедиации земель, загрязненных кадмием;
5. Создать векторные конструкции с геном psl под контролем корнеспецифичного промотора RB7 и испытать специфичность экспрессии данного гена в растениях табака.
Научная новизна работы: Исследована возможность колонизации ризосферы томатов флуоресцентно меченым штаммом ризобактерий. Обнаружены штаммы бактерий с антагонистической активностью против фитопатогенных грибов рода Fusarium среди микросимбионтов дикорастущих бобовых растений Республики Башкортостан (РБ). Впервые получены ризобии, трансгенные по псевдофитохелатиновому гену, более устойчивые к большим концентрациям кадмия в почве, проанализировано их влияние на накопление кадмия трансгенными по psl растениями табака. На основе вектора pCambia 1301 созданы генетические конструкции, содержащие ген лектина гороха psl под управлением корнеспецифичного промотора RB7.
Научно-практическая значимость работы: Полученные результаты расширяют представление о возможных положительных эффектах при использовании лектина гороха как инструмента для создания ассоциативных симбиотических систем небобовых растений. Найденные штаммы бактерий с антагонистической активностью в отношении фитопатогенов могут стать основой для получения биопрепаратов, защищающих растения от болезней.
Симбиотические системы с трансгенными по psl растениями и ризобиями, продуцирующими псевдофитохелатин, могут использоваться в фиторемедиации.
Полученная генетическая конструкция, содержащая корнеспецифичный промотор, может использоваться для создания трансгенных растений с тканеспецифичной экспрессией целевого гена.
Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов-2010), международной конференции «Актуальные проблемы науки» (Тамбов, 2011), 2 и 3-й школе-конференции молодых ученых Волго Уральского региона «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), Всероссийской конференции «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 116 страницах, содержит 23 рисунка, 5 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 256 работ.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Объектом исследования в данной работе служили растения томата сорта «Дубок» и табака сорта Petit Havana линии SR1. В экспериментах был использован ген лектина семян гороха (psl) (Губайдуллин и др., 2006).
При проведении экспериментов по клонированию генов применяли штамм E. coli XL1-Blue и плазмиды pJN105, pTurboGFP-B, pAL-TA. Для трансформации растений были использованы бинарные векторные конструкции pCambia 1305.1, pCambia 1281Z и pCambia 1301. Для получения композитных растений с «бородатыми корнями» и полностью трансгенных растений применяли штаммы A. rhizogenes 15834 и A. tumefaciens AGL0, соответственно. Для анализа колонизации корней растений использовали штамм Rhizobium leguminosarum из коллекции ВНИИСХМ. В работе также применяли штаммы из коллекции ИБГ УНЦ РАН бактерий, ассоциированных с корнями дикорастущих бобовых растений РБ. Для изучения антагонистических свойств бактерий использовали фитопатогенные грибы рода Fusarium: F. solani, F. oxysporum, Fusarium sp. D13 из коллекции Уфимского государственного нефтяного технического университета и F. oxysporum f.sp. lycopersici F-140 из Всероссийской коллекции микроорганизмов.
Методы исследования Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК и растительной РНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, подготовку компетентных клеток, их трансформацию плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. Для экспериментов по оценке экспрессии гена psl кДНК, получали при помощи фермента AMW ревертазы. Гистохимический gus-анализ проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с небольшими модификациями (Kosugi et al., 1990). Получение «бородатых» корней проводили по методу, описанному Collier (2005). Проверку антагонистической активности бактерий по отношению к фитопатогенам проводили методом двойной культуры (Whipps, 1987). Способность бактерий синтезировать сидерофоры определяли на «синем агаре» (Schwynan, 1986). Синтез цианида определяли по методике Bakker (1987).
Трансгенные растения табака получали методом агробактериальной трансформации листовых пластинок (Horsh and Fry, 1985). Содержание кадмия в растениях табака определяли методом полярографии на вольтамперометрическом анализаторе «Экотест-ВА».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение флуоресцентно меченых штаммов ризобактерий При изучении взаимодействия микроорганизмов с корнями растений возникает необходимость отслеживать клетки исследуемого штамма, не влияя на их жизнеспособность. Нами были созданы генетические конструкции на основе вектора pJN105, содержащие гены флуоресцентных белков серии TurboColors:
TurboGFP и TurboRFP (рис. 1) (Баймиев и др., 2011). В качестве основы для конструкций была взята плазмида широкого круга хозяев pJN105.
Рис. 1. Схема получения экспрессирующей векторной конструкции, содержащей ген TurboGFP.
Полученными конструкциями были трансформированы штаммы бактерий.
Rhizobium leguminosarum, R. tropici, R. galegae и Sinorhizobium meliloti (Баймиев и др., 2011). Для дальнейших экспериментов по изучению колонизаций корней растений был использован штамм R. leguminosarum 1078 RFP (рис. 2).
Рис. 2. Бактерии R. leguminosarum 1078 RFP: а) общий вид культуры на чашке Петри;
б) бактерии под микроскопом, увеличение 2000.
2. Получение трансгенных бородатых корней на растениях томата и анализ их колонизации клубеньковыми бактериями R. leguminosarum.
Оценку колонизации ризобиями трансгенных по psl корней проводили на композитных растениях томата, состоящих из нетрансгенной надземной части и трансгенных «бородатых корней». В экспериментах по получению «бородатых корней» был использован штамм Agrobacterium. rhizogenes 15834, содержащий бинарный вектор pCambia 1305.1 с геном psl лектина гороха под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Этот вектор в качестве маркерного содержит в области Т-ДНК ген -D-глюкоуронидазы (gus) (Вершинина, 2010).
Для создания композитных растений было использовано два способа: in vitro, в стерильной среде MS на чашках Петри, и ex vitro, с использованием минеральной ваты, пропитанной суспензией агробактерий.
При получении композитных растений in vitro «бородатые корни» появлялись приблизительно на 70% растений (рис. 3). Частота трансформации составила 31%.
При получении композитных растений данным способом некоторую сложность представляла необходимость последующего удаления питательной среды с корней и акклиматизация растений.
Рис. 3. Получение композитных растений томата in vitro:
а) общий вид растений;
б) «бородатые корни» после 10 дней выращивания растений;
в) «бородатые корни» после 3 недель выращивания.
При использовании минеральной ваты, пропитанной суспензией агробактерий, бородатые корни начинали образовываться также через 10-12 дней на 90% растений (рис. 4). Gus-окрашивающиеся корни были обнаружены у 53% растений. ПЦР-анализ бородатых корней показал наличие продукта гена лектина на уровне мРНК. Преимуществом последнего метода является отсутствие необходимости соблюдать стерильность и высокая степень выживаемости растений после пересаживания в почву, поскольку им не нужно адаптироваться к изменившимся условиям. Все дальнейшие эксперименты проводились на композитных растениях, полученных этим способом.
Рис. 4. Получение композитных растений томата ex vitro: а) растения в минеральной вате;
б) «бородатые корни» после 10 дней выращивания растений;
в) «бородатые корни» после 3 недель выращивания Для проведения визуальных исследований взаимодействия клубеньковых бактерий с растениями был использован ранее полученный штамм R. leguminosarum 1078 RFP. Корни растений инокулировали в суспензии бактерий в течение ночи, после чего их отмывали и проводили визуальный анализ при помощи микроскопа. На трансгенных корнях томатов было обнаружено гораздо большее количество бактерий, чем на корнях контрольных растений, для получения которых применялся штамм A. rhizogenes, содержащий вектор pCambia 1305.1 без гена psl (рис. 5).
1 мм 1 мм а б Рис. 5. Взаимодействие ризобий, меченых красным флуоресцентным белком с нетрансгенными (а) и трансгенными (б) корнями томата.
Также проводилось определение количества бактерий, адгезированных на корнях композитных растений, полученных с использованием плазмиды pCambia 1305.1-psl и контрольных. Для этого фрагменты корней, через 1 сутки инокуляции и после 1 месяц выращивания растений в почве, измельчали, ресуспендировали в питательной среде, рассевали на агаризованную среду с антибиотиком гентамицином и проводили подсчет выросших колоний. Обнаружено, что хотя со временем количество бактерий на корнях и снижается, все же оно остается на порядок выше, чем на корнях контрольных растений (рис. 6).
345, 17, Количество ризобий, КОЕ/г* 6 Количество ризобий, КОЕ/г*10 39, 50 1, б а psl- psl+ psl- psl+ Рис. 6. Количество ризобий, адгезированных на корнях томата:
а) через сутки после инокуляции;
б) после 1 месяца выращивания растений.
Ранее в нашей лаборатории были получены трансгенные растения табака, а также композитные растения рапса, экспрессирующие ген лектина гороха. На данных растениях было обнаружено увеличение количества бактерий R. leguminosarum в 37 и 14 раз соответственно, по сравнению с контрольными растениями. Таким образом, для трансгенных по гену psl корней томата также было показано усиление интенсивности колонизации клубеньковыми бактериями.
3. Изучение защитных свойств ризобий при заражении растений патогенными грибами Поиск штаммов бактерий, обладающих фунгистатической активностью Известно, что отдельные штаммы ризобий могут проявлять антагонистические свойства по отношению к фитопатогенам (Mehboob et al., 2012). Нами была исследована возможность использования данных свойств клубеньковых бактерий и повышенной степени колонизации ими трансгенных по гену psl корней для защиты растений.
Методом двойной культуры было исследовано 568 изолятов, ассоциированных с корнями четырнадцати видов дикорастущих бобовых растений трибы Vicea. В качестве культур фитопатогенов использовались грибы рода Fusarium. Антагонистическая активность в отношении исследуемых грибов обнаружена у 7 штаммов (табл. 1). Определение видовой принадлежности штаммов бактерий проводилось анализом последовательности гена 16S рРНК.
Таблица Ингибирование роста грибов различными штаммами бактерий (%) Растение- Микросимбионт Грибы макросимбионт Fusarium F. oxysporum F. solani F. oxyspo sp. f.sp. lycopersici rum Горошек Rhizobium гороховидный leguminosarum 116 17 41 65 Vicia pisiformis L.
Горошек Pseudomonas sp. заборный 0 0 25 Vicia sepium L.
Чина болотная Pseudomonas sp.102 40 29 53 Lathyrus palustris Pseudomonas sp.103 0 21 22 L.
Чина луговая Pseudomonas 0 13 17 Lathyrus pratensis sp.15. L. Pseudomonas 0 25 19 sp.14M Stenotrophomonas 40 0 33 rhizophila Исследование синтеза бактериями фунгистатических метаболитов Одним из механизмов фунгистатической активности бактерий является выделение сидерофоров – белков, способных образовывать комплекс с ионами железа, таким образом, делая их недоступными для грибов. Скрининг для обнаружения продуцирования сидерофоров был проведен на «синем агаре» агаризованной минимальной среде, содержащей комплекс Fe3+ и HDTMA с красителем хром-азуролом S (CAS), исходная окраска которой меняется на розовую, желтую или оранжевую при выделении бактериями сидерофоров и связывании ионов железа в составе питательной среды. Наиболее интенсивно изменялась окраска двух штаммов Pseudomonas, S. rhizophila 18 и R. leguminosarum 116 (табл. 2).
Некоторые штаммы PGPR способны выделять цианид водорода (HCN), что также оказывает отрицательное воздействие на рост грибов. Данный признак был обнаружен у двух штаммов Pseudomonas (14M и 103), а так же S. rhizophila (табл. 3). Штаммы, обладающие наилучшей фунгистатической активностью (R. leguminosarum 116 и Pseudomonas sp. 102), синтезировали сидерофоры, но не цианид. Однако, степень ингибирования роста фитопатогенов штаммом S. rhizophila 18, синтезирующим оба этих вещества, была только 18-40%.
Возможно, что фунгистатическая активность данных штаммов связана еще с какими-то механизмами, например, с синтезом антибиотиков.
Таблица Синтез фунгистатических метаболитов различными штаммами бактерий Микросимбионт Синтез сидерофоров Синтез цианида Rhizobium leguminosarum 116 + Pseudomonas sp. 2 + Pseudomonas sp.102 + Pseudomonas sp.103 - + Pseudomonas sp.14M - + Stenotrophomonas rhizophila 18 + + Совместная обработка растений F. oxysporum f.sp. lycopersici и R. leguminosarum Композитные растения томатов c трансгенными по гену psl корнями и контрольными инокулировали в суспензии штамма R. leguminosarum 116, пересаживали в почву, содержащую споры гриба F. oxysporum f.sp. lycopersici и выращивали течение трех суток. После окрашивания корней растений толуидиновым синим, их анализировали при помощи микроскопа. Клетки растений окрашивались в голубой цвет, а грибы – в фиолетовый (Пермяков, 1988) (рис. 7).
Рис. 7. Совместная обработка растений F. oxysporum f.sp.lycopersici и R. leguminosarum:
а) контрольные растения томата + F. oxysporum f.sp.lycopersici;
б) растения томата с трансгенными по psl корнями + F. oxysporum f.sp.lycopersici;
в) контрольные растения томата+ F. oxysporum f.sp.lycopersici + R. leguminosarum 116;
г) растения томата с трансгенными по psl корнями + F. oxysporum f.sp.lycopersici + R. leguminosarum 116;
д) не зараженные контрольные растения В результате проведенных экспериментов было выяснено, что обработка трансгенных по гену psl корней томата штаммом R. leguminosarum 116 с фунгистатическими свойствами уменьшает количество гиф патогена F. oxysporum f.sp.lycopersici в ризосфере данных растений. Такой же эффект, но в гораздо меньшей степени, наблюдается на корнях контрольных растений, на которых прикрепление ризобий происходит менее эффективно.
Ранее в ряде работ была показана способность ризобий ингибировать рост различных штаммов грибов in vivo и возможность использования данных бактерий для защиты небобовых растений от фитопатогенов (Ehteshamul-Haque and Ghaffar, 1993;
Perveen et al., 1994;
Siddqui et al., 1998;
Chandra et al., 2007). Таким образом, использование лектинов в качестве трансгенов позволяет получать искусственные корневые ассоциации с ризобиями у несимбиотрофных растений, таких как томат, что в сочетании с использованием микроорганизмов с фунгистатической активностью может более эффективно защищать корневую систему растений от патогенов.
4. Изучение влияния ризобий на растения табака при загрязнении почвы кадмием Получение штамма ризобий с псевдофитохелатиновым геном Белки, участвующие в детоксикации тяжелых металлов (ТМ) обнаружены как у про-, так и у эукариот. У растений такими соединениями являются короткие, богатые цистеином пептиды – фитохелатины с общей структурой [-Glu(Cys)]n Gly, где n = 2-11 (Clemens et al., 1999;
Vatamaniuk, 2004). Звенья -Glu-Cys связывают ТМ, образуя с ними комплексные соединения. Псевдофитохелатины со структурой Мet[(Glu(Cys)]nGly (где n количество повторяющихся мотивов Glu Cys), которые кодируются специально синтезированными синтетическими “псевдофитохелатиновыми” генами, также способны к комплексообразованию с ТМ (Постригань и др., 2012). В эксперименте по клонированию псевдофитохелатинового гена был использован вектор pTurboGFP-B, содержащий ген флуоресцентного белка TurboGFP. Этот ген был вырезан по сайтам рестрикции BamHI и HindIII, и по этим же сайтам был клонирован синтетический псевдофитохелатиновый ген pph (рис. 8).
Рис. 8. Клонирование псевдофитохелатинового гена (pph) в плазмиде pTurboGFP-B.
Данной конструкцией методом электропорации трансформировали бактерии R. leguminosarum 1078. ПЦР-анализ показал наличие псевдофитохелатинового гена в трансформированных бактериях (рис. 9).
66 п.н.
Рис. 9. Электрофореграмма продуктов ПЦР вставки псевдофитохелатинового гена в векторе pTurboGFP-B. 1 Маркер, амплификат псевдофитохелатинового гена, 66 п.н.;
2, 3 амплификаты исследуемых клонов, содержащих вставку гена;
4 отрицательный контроль без генетического материала Выращивание трансформированных и контрольных бактерий на среде, содержащей различные концентрации кадмия (0, 100, 200, 400 мкМ), показало, что ризобии, несущие псевдофитохелатиновый ген более устойчивы к высоким концентрациям данного тяжелого металла (рис. 10).
Рис. 10. Рост ризобий на среде с кадмием: а) штамм, трансформированный геном pph;
б) контрольный штамм.
Влияние ризобий на содержание кадмия в растениях табака В эксперименте были использованы трансгенные по psl растения табака второго поколения (F2) (psl+), у которых экспрессию гена лектина определяли по маркерному белку GUS, и контрольные, полученные от трансформированных плазмидой pCambia 1305.1 (psl-). Оба варианта растений были инокулированы штаммом ризобий с pph и штаммом дикого типа (контроль). В качестве контроля также использовались неинокулированные растения. Для каждого варианта было взято по 5 растений. Их высаживали в почву с добавлением кадмия в виде 0,1М раствора ацетата кадмия до концентрации 300 мкМ. После выращивания в почве и измерения содержания кадмия в растениях методом полярографии были получены следующие результаты:
1. При выращивании растений в почве без добавления ацетата кадмия, содержание кадмия в растениях, инокулированных бактериями с pph незначительно повышалось (рис. 11), что, возможно, связано с изначальным наличием небольшого количества ТМ в почве.
растениях, мг/кг сухой массы 9, 7, Содержание кадмия в 2,12 1, 1,75 1, psl- конт psl+ конт psl- psl+ psl- pph psl+ pph Рис. 11. Содержание кадмия в растениях, выращенных без добавления ТМ в почву.
2. На почве, содержащей 300 мкМ ацетата кадмия, было отмечено понижение накопительных свойств трансгенных растений при инокуляции их штаммом бактерий дикого типа на 60% по сравнению с неинокулированными растениями. В нетрансгенных растениях содержание кадмия оставалось без изменений, как и в растениях, выращиваемых без ризобий (рис. 12).
Проведенные ранее эксперименты на бобовых растениях показали, что инокуляция ризобиями может снижать накопление в растениях тяжелых металлов.
(Wani et al., 2007, 2008). Вероятным механизмом такого влияния называется адсорбция ТМ бактериями (Mamaril et al., 1997). Различные микроорганизмы могут связывать ионы металлов поляризованными группами клеточной стенки или капсулы (фосфатными, карбоксильными, гидроксильными и аминогруппами).
Таким образом, возможно, ризобии, прикрепляясь к корням растений, трансгенных по psl, могли препятствовать попаданию ТМ в растения.
1030, растениях, мг/кг сухой массы 714, Содержание кадмия в 262,09 305,81 280, 105, psl- конт psl+ конт psl- psl+ psl- pph psl+ pph Рис. 12. Содержание кадмия в растениях, выращенных на почве с добавлением 300 мМ ацетата кадмия.
3. При инокуляции растений штаммом, несущим псевдофитохелатиновый ген, количество кадмия в растениях значительно возрастало (рис. 12). В нетрансгенных растениях кадмия было в 2,7 раз больше по сравнению с растениями, выращиваемыми без инокуляции, а в растениях, трансгенных по гену лектина - в 3,4 раза. По сравнению с нетрансгенными растениями, в табаках с геном psl содержание кадмия было больше на 31%.
Эти данные могут свидетельствовать о том, что комплексы, которые кадмий образует с псевдофитохелатинами, экскретируются в окружающую среду, что способствует накоплению кадмия в растениях.
4. Измерения сырой массы растений показали, что при выращивании растений в почве без добавления кадмия, инокуляция ризобиями оказывает положительное влияние на этот параметр (рис. 13). Масса контрольных растений при инокуляции контрольными и трансгенными по pph ризобиями увеличивалась на 51%. Масса же трансгенных по psl растений увеличивалась на 55% при инокуляции контрольными ризобиями и на 71% при обработке ризобиями, трансгенными по pph. Ранее в нашей лаборатории проводились эксперименты по изучению загрязнения субстрата кадмием на симбиоз козлятника восточного с Rhizobium galegae (Губайдуллин и др., 2005). Было выяснено, что добавление в почву следового количества кадмия стимулирует рост растений. Возможно, инокуляция растений бактериями, вырабатывающими псевдофитохелатин, оказывает на растения табака, трансгенные по psl, такое же влияние.
При выращивании растений на почве с добавлением кадмия, значимых отличий между различными комбинациями растений и бактерий обнаружено не было. Эти результаты так же согласуются с данными Ike (2007), где обработка растений астрагала накапливающими ТМ ризобиями не влияла на рост растений при выращивании их в среде с кадмием.
0 мкМ Cd 300 мкМ Cd Масса растений, мг 428, 328,33 330,0 388, 250, 300 217, 137,33 170,67 159, 137, 200 139, 101, psl- конт psl+ конт psl- psl- pph psl+ psl+ pph Рис. 13. Влияние инокуляции ризобиями на массу растений табака при выращивании на почве с добавлением и без добавления ацетата кадмия.
Таким образом, улучшенная колонизация ризобиями корней, трансгенных по psl растений табака, способствует снижению количества в них кадмия, что может найти применение в защите растений от негативного воздействия ТМ. А использование ризобий, трансформированных генетическими конструкциями с псевдофитохелатиновым геном, наоборот, ведет к накоплению тяжелых металлов в растениях, что дает возможность использования данных симбиотических систем в фиторемедиации.
5. Создание векторных конструкций с геном лектина под контролем корнеспецифичного промотора RB7.
При создании трансгенных по psl растений, лектин должен вырабатываться в корнях, но его присутствие в других частях растений не обязательно.
Представляет большой интерес создание небобовых растений экспрессирующих ген лектина под контролем тканеспецифичного промотора.
К числу часто используемых корнеспецифичных промоторов относится RB7.
Он был выделен из растений табака и является промотором гена аквапорина белка мембранного канала (Yamamoto et al., 1991). Методом промотор делеционного анализа (Concling et al., 1995) было показано, что наибольшей экспрессионной активностью обладает вариант данного промотора размером п.н. (RB7/1), а у варианта размером 1385 п.н. (RB7/2) была зафиксирована наибольшая разница между экспрессией в корнях и листьях. Для клонирования в векторе pCambia 1281Z и проверки тканеспецифичности было решено взять оба этих участка промотора RB7.
Клонирование двух вариантов промотора RB7 в векторе pCambia 1281Z Были подобраны специфичные праймеры к двум делеционным вариантам промотора RB7 (рис. 14). Данные участки амплифицировали с геномной ДНК табака и провели их секвенирование. Полученные последовательности нуклеотидов оказались идентичными последовательности для данного промотора в базе данных NCBI (GenBank: S45406.1).
Рис. 14. Расположение праймеров, подобранных к двум вариантам промотора RB7.
Оба варианта промотора клонировали в векторе pAL-TA, а затем вырезали по сайту EcoR1 и субклонировали в векторе pCambia 1281Z, содержащем полилинкер перед маркерным геном gus, для оценки тканеспецифичности (рис. 15).
Плазмидными конструкциями с промоторами обоих типов методом электропорации трансформировали бактерии A. tumifaciens AGL0, которые затем использовали для получения трансгенных растений табака.
Рис. 15. Клонирование промотора RB7 в плазмиде pCambia 1281Z.
Проверка специфичности функционирования вариантов промотора RB7 в трансгенных растениях табака Растения получали методом агробактериальной трансформации листовых пластинок табака (Horsh and Fry, 1985). После выращивания растений регенерантов в течение месяца был проведен их гистохимический анализ (табл. 3).
Было обнаружено, что промотор RB7/2, обладает более высокой тканеспецифичностью по сравнению с более коротким вариантом данного регуляторного элемента, поскольку в части растений, полученных с использованием промотора RB7/2, gus-окрашивание наблюдалось только в корнях.
В связи с этим именно вариант RB7/2 был использован для дальнейших экспериментов.
Таблица Количество полученных трансгенных растений табака и специфичность двух вариантов промотора RB Вариант Всего Gus+ промотора получено Всего Только Корни и Корни, стебли, растений RB7 корни стебли листья RB7/1 13 9 0 0 RB7/2 19 16 5 4 Клонирование гена psl под контролем промотора RB7/2 в векторе pCambia Промотор RB7/2 был вырезан по сайту рестрикции EcoR1 из плазмиды pAL TA, после чего встроен по тому же сайту в плазмиду pCambia 1301. Был подобран праймер polyA к сайту полиаденилирования гена psl, ранее клонированного в плазмиде pBluescript. С помощью праймеров polyA и lecfor кодирующая область гена psl была амплифицирована вместе с сайтом полиаденилирования и встроена в плазмиду pCambia 1301 по сайту рестрикции SmaI (рис. 16).
Рис. 16. Клонирование гена psl под контролем промотора RB7/2 в плазмиде pCambia 1301.
ПЦР-анализ подтвердил наличие, а также правильность порядка и ориентации кодирующей и регуляторных частей гена в собранной конструкции (рис. 17).
Рис. 17 Электрофореграмма продуктов ПЦР фрагментов конструкции pCambia 1301-RB7/2-psl-polyA: 1) ген psl;
2) psl + polyA;
3) RB7/2 +psl + polyA;
4) отрицательный контроль без генетического материала;
М) 100 bp+1.5 Kb+ Kb ДНК маркер (Sibenzym, Россия).
Полученной плазмидой трансформировали бактерии A. tumifaciens AGL0, которые затем использовали для получения трансгенных растений табака.
Получение растений табака, экспрессирующих ген лектина под управлением промотора RB7/ Для того чтобы выявить экспрессию гена лектина была проведена ОТ-ПЦР.
РНК отдельно выделяли из листьев и из корней четырех трансгенных растений и одного контрольного (F2 растений трансформированных плазмидой pCambia 1305.1). Было показано, что у всех опытных растений мРНК гена psl присутствует только в корнях (рис. 18). Таким образом, данный промотор является хорошим инструментом для обеспечения направленной экспрессии различных генов в корневой системе растений. Получение растений, у которых продукт целевого гена будет накапливаться только в строго определенных органах, является перспективным подходом для создания симбиотических систем, которые в дальнейшем могут найти применение в сельском хозяйстве.
Рис. 18. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР гена psl под контролем промотора RB7/2: 1-4)трансгенные растения;
5) контрольное растение;
л-листья, к корни;
6) положительный контроль ПЦР;
7) отрицательный контроль без генетического материала;
М) 100 bp+1.5 Kb+3 Kb ДНК маркер (Sibenzym, Россия).
Таким образом, нами были проведены эксперименты по созданию искусственных симбиотических ассоциаций небобовых растений с клубеньковыми бактериями R. leguminosarum, а также исследованы возможности их практического применения. Обнаружено значительное увеличение количества адгезировавшихся ризобий на трансгенных по psl корнях томатов, что при использовании штаммов с фунгистатической активностью, может способствовать защите растений от фитопатогенов. Было исследовано накопление кадмия в симбиотической системе, включающей растения табака, трансгенные по psl и ризобии с псевдофитохелатиновым геном (pph). Получены растения табака, экспрессирующие ген psl под управлением корнеспецифичного промотора RB7.
Разработанный нами подход к созданию искусственных симбиозов с использованием генов лектинов в качестве трансгенов может быть использован в различных отраслях сельского хозяйства, а также как инструмент для фиторемедиации.
ВЫВОДЫ 1. Получены флуоресцентно меченые штаммы ризобий Rhizobium leguminosarum, R. tropici, R. galegae и Sinorhizobium meliloti, вступающих в симбиоз с дикорастущими и культурными видами бобовых растений.
2. Исследование колонизации трансгенных по гену psl корней томата флуоресцентно меченым штаммом R. leguminosarum 1078 показало, что количество бактерий, адгезированных на трансгенных корнях после 1 суток инкубации, было на порядок больше по сравнению с контролем, и подобное соотношение сохранялось через месяц выращивания растений в почве.
3. В коллекции микросимбионтов дикорастущих бобовых растений трибы Viceae, обнаружены штаммы sp. и R. leguminosarum, Pseudomonas Stenotrophomonas rhizophila, обладающие фунгистатической активностью в отношении фитопатогенов Fusarium solani, F. oxysporum, Fusarium sp. и F.
oxysporum f. sp. lycopersici. Максимальная антагонистическая активность выявлена у штамма R. leguminosarum по отношению к F. oxysporum f. sp. lycopersici.
4. Обнаружено, что колонизация корней томата, трансгенных по гену psl бактериями R. leguminosarum с фунгистатической активностью может способствовать защите растений от фитопатогенных грибов.
5. Показано, что штамм бактерий R. leguminosarum 1078, содержащий псевдофитохелатиновый ген, более устойчив к высоким концентрациям кадмия в среде. Колонизация данными ризобиями корней растений табака, трансгенных по гену psl приводила к накоплению кадмия в таких растениях в несколько раз больше по сравнению с неинокулированными трансгенными и на 30% больше по сравнению с инокулированными контрольными растениями. Обработка трансгенных по psl растений штаммом ризобий дикого типа, напротив, приводила к уменьшению количества в них кадмия по сравнению с неинокулированными растениями.
6. С использованием вектора pCambia 1281Z получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген gus под двумя вариантами корнеспецифичного промотора RB7. Выявлено, что более высокой тканеспецифичностью характеризуется вариант промотора длиной 1358 п.н. На трансгенных растениях табака показана тканеспецифичность экспрессии гена psl под управлением данного варианта промотора.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Баймиев, Ан.Х. Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro./ Ан.Х.Баймиев, Р.С.Ямиданов, Р.Т.Матниязов, Д.К.Благова, Ал.Х.Баймиев, А.В.Чемерис // Молекулярная биология. – 2011. - Т. 45. - № 6. - С.984-991.
2. Баймиев, Ан.Х. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с чиной весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh / Ан.Х.Баймиев, К.Г.Птицын, Д.К.Благова, А.А.Мулдашев, Ал.Х.Баймиев // Микробиология. 2011. - Т. 80. - №1. - С. 100-104.
3. Вершинина, З.Р. Биоинженерия симбиотических систем: создание новых ассоциативных симбиозов с помощью лектинов на примере табака и рапса / З.Р.
Вершинина, Ан.Х.Баймиев, Д.К.Благова, А.В.Князев, Ал.Х.Баймиев, А.В.Чемерис // Прикладная биохимия и микробиология. - 2011. - Т. 47. - №3. - С. 336-342.
4. Vershinina, Z.R. Lectins as a factor that allows the nonlegume plant to form associative symbiosis with rhizobia / Z.R.Vershinina, A.K.Baymiev, D.K.Blagova, O.V.Chubukova, A.K.Baymiev, A.V.Chemeris. // Proceedings of World Academy of Science, Engineering and Technology. - 2011- V. 60. - P. 1622-1623.
5. Vershinina, Z.R.Artificial Colonization of Non-symbiotic Plants Roots with the Use of Lectins / Z.R.Vershinina, An.K.Baymiev, D.K.Blagova, O.V.Chubukova, Al.K.Baymiev, A.V.Chemeris // Symbiosis. - 2012. - V. 56. - N.1. - P. 25-33.
6. Вершинина, З.Р. Лектины как инструмент для биоинженерии симбиотических систем / З.Р.Вершинина, Д.К.Благова // Материалы XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». Москва. -2010. – Том I, подсекция 1. Стендовый доклад.
7. Благова, Д.К. Плазмидный состав штаммов клубеньковых бактерий, нодулирующих чину весеннюю Lathyrus vernus (l.) bernh / Д.К.Благова, А.Х.Баймиев // Материалы V всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой».
Саратов. -2010. -C. 21.
8. Благова, Д.К. Конструирование обладающей полезными свойствами «искусственной ризосферы» у несимбиотрофных видов культурных растений / Д.К.Благова // Материалы XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Москва. -2011. – Том I, подсекция 1.
9. Благова, Д.К. Трансгенные бородатые корни как модель для анализа ассоциативных симбиотических реакция томата с ризобиями / Д.К.Благова, З.Р.Вершинина, Ан.Х.Баймиев // Материалы международной конференции «Актуальные проблемы науки». Тамбов. -2011. -С.26-27.
10. Благова, Д.К. «Химерные» растения томата с корнями, экспрессирующими ген лектина гороха и их колонизация клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum / Д.К.Благова, З.Р.Вершинина // Материалы II школы-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона «Биомика – наука XXI века». Уфа. 2011. -С.20-21.
11. Благова, Д.К. Трансгенные растения табака с геном psl под контролем корнеспецифичного промотора / Д.К.Благова // Материалы XIX международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2012".
Москва. 2012. -Том 1, подсекция 1.
12. Благова, Д.К. Поиск штаммов, обладающих фунгицидной активностью среди бактерий, ассоциированных с корнями дикорастущих бобовых растений / Д.К.Благова, Л.Р.Нигматуллина // Материалы всероссийской конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия растений и микроорганизмов с окружающей средой". Саратов. -2012. -С. 102.
13. Благова, Д.К. Колонизация корней трансгенных растений ризобиями с фунгицидной активностью / Д.К.Благова, Л.Р.Нигматуллина, А.М.Оркодашвили // Материалы III школы-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона «Биомика-наука XXI века». Уфа. -2012. -C. 19-20.
14. Благова, Д.К. Устойчивость ассоциативных ризобиальных симбиотических систем к воздействию тяжелых металлов и перспективы их применения в фиторемедиации / Д.К.Благова, Б.Н.Постригань, В.В.Федяев // Материалы всероссийской конференции «Инновационные направления современной физиологии растений». Москва. -2013.