Получение и анализ tn5-мутантов sinorhizobium meliloti с измененными поверхностными полисахаридами

На правах рукописи

ЗАТОВСКАЯ Татьяна Викторовна ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ Tn5-МУТАНТОВ Sinorhizobium meliloti С ИЗМЕНЕННЫМИ ПОВЕРХНОСТНЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ Специальность: 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2012 2 Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Симаров Борис Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Квитко Константин Васильевич, Санкт-Петербургский государственный университет кандидат биологических наук Коновалова Галина Сергеевна, Всероссийский научно исследовательский институт растениеводства им. Н.И.Вавилова Россельхозакадемии

Ведущая организация: Институт физиологии и генетики растений и микроорганизмов РАН г. Саратов

Защита диссертации состоится 24 мая 2012 г. в часов на заседании Объединенного совета ДМ 212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.

7/9, СПбГУ, Биолого-почвенный факультет, аудитория 133.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Почвенные бактерии сем. Rhizobiaceae вступают в симбиоз с бобовыми растениями. При этом на корнях растений образуются клубеньки, в которых бактерии, преобразованные в бактероиды, фиксируют атмосферный азот. Формирование симбиоза происходит при участии различных сигнальных молекул обоих партнеров. Важную роль в этом процессе играют поверхностные полисахариды бактерий. Клубеньковые бактерии синтезируют четыре типа поверхностных полисахаридов – экзополисахариды (ЭПС), капсулярные полисахариды (КПС), липополисаха риды (ЛПС) и -1,2-глюканы (Fraysse et al., 2003).

Объектом наших исследований были клубеньковые бактерии Sinorhizo bium meliloti, вступающие в симбиоз с люцерной, донником и пажитником. В настоящее время у этого вида ризобий детально изучены только экзополи сахариды – ЭПС1 и ЭПС2. У эталонного штамма 1021 S. meliloti была устано влена структура ЭПС1 и ЭПС2, изучена генетика их синтеза и его регуляции.

Показана роль ЭПС в формировании симбиоза. Липополисахариды – наименее изученные полисахариды S. meliloti. Структура полисахаридной части ЛПС не установлена ни для одного штамма S. meliloti, не выяснены функции большинства генов, контролирующих синтез коровой области ЛПС. Практи чески ничего не известно о генах синтеза О-цепи S. meliloti. Исследование роли ЛПС в симбиозе проводилось только у штамма 1021 S. meliloti.

Основным подходом в изучении структуры, функций и генетики синтеза полисахаридов в настоящее время остается получение Tn5-транспозоновых мутантов с нарушениями синтеза полисахаридов. Новые возможности в изучении функций полисахаридов и генетики их синтеза открылись после полного секвенирования генома эталонного штамма 1021 S. meliloti (Galibert et al., 2001). Кроме двух уже исследованных кластеров генов, детерминирующих синтез ЭПС1 и ЭПС2, на мегаплазмиде pSymb S. meliloti было выявлено несколько генетических кластеров, которые также могут быть связаны с синтезом полисахаридов (Finan et al., 2001). Их функции у S. meliloti пока не известны. Таким образом, изложенные сведения определяют актуальность данной работы.

Целью нашей работы было – выявление новых генов Sinorhizobium meliloti, вовлеченных в контроль синтеза липополисахаридов и других поверхностных полисахаридов и выяснение их роли в формировании бобово-ризобиальном симбиоза бактерий c Мedicago sativa.

Задачами данной работы являлись:

1. Получение Tn5-мутантов S. meliloti с нарушениями синтеза ЛПС и других поверхностных полисахаридов, первичная характеристика их ЛПС и капсулярных полисахаридов при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза.

2. Изучение симбиотических свойств – эффективности и нодуляционной конкурентоспособности – Tn5-мутантов с измененными S. meliloti поверхностными полисахаридами.

3. Идентификация генов, инактивированных Tn5-инсерциями у полученных мутантов S. meliloti.

4. Изучение компонентного состава липополисахаридов штамма СХМ1- S. meliloti и ЛПС-мутантов с помощью газо-жидкостной хроматографии и гель-фильтрации.

Научная новизна полученных результатов. Впервые получено два Tn5 мутанта S. meliloti, не имеющих высокомолекулярной формы ЛПС (ЛПС1).

Показано, что отсутствие ЛПС1 в одном случае связано с Tn5-инсерцией в гене fabF2, кодирующем ацил-АПБ-синтазу, фермент синтеза 27-ОН-С28 жирной кислоты (жк) в липидной части ЛПС, а в другом случае - с Tn5-мутацией в гене кодирующем метионинсинтазу. Показано, что отсутствие metH, высокомолекулярного ЛПС1 у S. meliloti не влияет на способность формировать симбиоз с люцерной и симбиотическую эффективность, но приводит к снижению нодуляционной конкурентоспособности бактерий. Впервые получен Tn5-мутант S. meliloti по гену tolC и показано, что мутация в этом гене приводит к нарушению секреции экзополисахаридов S. meliloti. Установлено, что мутант по гену tolC S. meliloti не способен вступать в симбиоз с Medicago sativa. Показано, что белок-канал TolC у S. meliloti вовлечен в cекрецию белков ExsH и ExpE1. Получены Tn5-мутанты S. meliloti по генам SMc00951 и SMc02705 и изучены их симбиотические свойства. Исследован Tn5-мутант S.

meliloti по гену phbA и показано, что мутация влияет на синтез ЭПС1 и ПОМ при выращивании бактерий на минимальной среде. Установлено, что ген phbA у S. meliloti транскрибируется во время симбиоза.

Практическая значимость работы. Результаты исследований были использованы в научно-практическом пособии “Биологическое разнообразие клубеньковых бактерий в экосистемах и агроценозах” (Румянцева и др., 2011).

Мутант характеризующийся повышенной симбиотической Ts152, эффективностью и конкурентоспособностью, проходит испытания в географи ческой сети опытов (ГСО). Мутант Ts152 применяется в качестве штамма тестера для оценки нодуляционной конкурентоспособности штаммов S. meli loti в микровегетационных опытах. Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курса лекций «Симбиогенетика», читаемого на кафедре генетики и селекции СПбГУ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Tn5-мутанты S. meliloti, лишенные высокомолекулярной формы ЛПС, формируют эффективный симбиоз с M. sativa и M. truncatula, но характеризуются резко сниженной конкурентоспособностью.

2. Отсутствие высокомолекулярного ЛПС у S. meliloti связано с отсутствием длинноцепочечной 27OH-C28 жирной кислоты в липиде А ЛПС.

3. Белок TolC у S. meliloti необходим для секреции экзополисахаридов ЭПС1 и ЭПС2, секреции белков ExsH и ExpE1 и формирования симбиоза с M. sativa.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на X Междуна родном конгрессе по азотфиксации (С.-Петербург, 1995), 8-м Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Иерусалим, 1996), II-м съезде ВОГиС (С-Петербург, 2000), XVI Международном симпозиуме по гликоконъюгатам (Гаага, 2001), XI Международном конгрессе по молекуляр ным растительно-микробным взаимодействиям (Санкт-Петербург, 2003), III съезде ВОГиС, (Москва), 2004 г., 12 съезде Общества Микробиологов Украины им. С. Н. Виноградского (Ужгород, Украина, 2009 г.).

Данная работа выполнена с использованием оборудования Центра коллек тивного пользования "Геномные технологии и клеточная биология" ГНУ ВНИИСХМ ОЗ Россельхозакадемии (ГК Министерства образования и науки №16.552.11.7047).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов докладов на научных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 2-х глав экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 44 рисунка. Список литературы включает 347 наименований, из них 17 - на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Штаммы бактерий, плазмиды. Объектами исследований были штамм СХМ1-188 S. meliloti (Федоров, Симаров, 1983) и полученные у него мутанты с нарушениями синтеза поверхностных полисахаридов (Затовская и др., 1998).

Для отбора мутантов с изменениями синтеза поверхностных полисахаридов использовали три селективные среды: 1) LB c 0,1% дезоксихолатом натрия (ДОХ);

2) минимальную среду с 0,02% Конго красным и 3) LB с 0,02% калько флуором. Конкурентоспособность оценивали с использованием тестерного штаммма CХМ1-48 S. meliloti (SmR, Fix -) (Шарыпова, Симаров, 1985). При изучении экспрессии гена phbA использовали штамм М4 S. meliloti, содержа щий конститутивно экспресссирующийся ген gusA (Selbischka et al., 1995). Для клонирования фрагментов ДНК был использован штамм DH5 E. сoli (F -, recA1, endA1, gyrA96, hsdR17, deoR, (lacZYA-argF)U169) (Grant et al., 1990).

Конъюгационный перенос плазмид проводили при помощи штамма S17-1, в хромосому которого интегрирована плазмида pRP4 (Tc::Mu, Km::Tn7) (Simon et al., 1983). Для Tn5-мутагенеза использовали плазмиду pSUP5011 (pBR325 Tn5::mob, ApR, TcR, CmR) (Simon, 1983). Для клонирования фрагментов ДНК были использованы плазмиды pUC18 (lacZ::M13mp, ApR) (Simon et al., 1983) и pTZ19R (lacZ::M13mp, ApR) (Meade et al., 1986). Для конструирования транскрипционного слияния была использована плазмида pCambia1381Xa (lacZ::M9mp, gusA без промотора, KmR) (Cambia, Австралия, 1998).

Методы. Методы работы с ДНК. Выделение геномной ДНК проводили по стандартной методике (Meade et al., 1982), выделение плазмидной ДНК - по методу щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979).

Реакции рестрикции, лигирования ДНК, электрофорез ДНК в агарозном геле, блот-гибридизацию по Саузерну, трансформацию плазмид проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Секвенирование выполняли с использованием терминирующих нуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями, на секвенаторе ДНК MegaBASE1000 (Amersham Biosciences). Для определения последовательностей ДНК, смежных с Tn5, использовали праймер на IS-элемент Tn5-транспозона 5’GAGAACACAGATTTAGCCCAG-3’.

Секвенированные последовательности сравнивали с последовательностями из генетического банка данных (GeneBank) с помощью программы NCBI BLAST.

Получение фаголизатов и трансдукцию проводили по лабораторной методике (Новикова и др., 1984) с использованием фага М12 (Finan et al., 1984). Экспрессию транскрипционного слияния phbA:gusA в свободноживущих бактериях и в симбиозе с M.sativa выявляли по наличию активности -глюкуро нидазной активности в присутствии X-GlcA.

Электронно-микроскопический анализ клубеньков проводили согласно стандартным протоколам. Полутонкие и ультратонкие срезы клубеньков были выполнены при помощи ультрамикротома (Reichert-Jung Ultracut).

Методы исследования ЛПС и белков. ЛПС, полученные из сырых бактериаль ных экстрактов, обработанных протеиназой К, анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ электрофорез). Использовали 12% концентрирующий и 12% разделяющий гели, которые окрашивали нитратом серебра согласно стандартным протоколам (Tsai, Frasch, 1982). Для выявления КПС гели обрабатывали 2 % альциановым голубым, затем нитратом серебра согласно методике (Corzo et al., 1991).

Для изучения компонентного состава ЛПС экстрагировали из высушенных бактериальных клеток 45%-ной горячей водно-фенольной смесью (Westphal, Jann, 1965). ЛПС отделяли от периплазматических глюканов путем трехкратного ультра-центрифугирования при 105-120 тыс. об/мин в течение 5- часов. Глюканы оставались в супернатанте, ЛПС – в осадке. Очищенные ЛПС лиофилизировали. Состав моносахаридов и жирных кислот в препаратах ЛПС анализировали методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) на хромато графе Хром-5 (Чехословакия) с пламенно-ионизационным детектором.

Содержание нейтральных углеводов, уроновых кислот, 2-кето-3-дезокси-окту лозоновой кислоты (КДО) и белков в препаратах ЛПС определяли общеприня тыми аналитическими методами (Захарова, Косенко, 1982). Мягкий кислотный гидролиз ЛПС проводили 1% уксусной кислотой (4 ч, 100С) или 2% уксусной кислотой (5 ч, 100С). Полисахаридную часть отделяли от липида А центрифугированием. Фракционирование олигосахаридов проводили на колонке (55,4 х 2,1 см), заполненной Sephadex G-25 (Pharmacia) и прокалиброванной с использованием углеводных стандартов.

Cекретируемые белки S. meliloti экстрагировали буферно-фенольной смесью из очищенного лиофилизированного супернатанта культуральной жидкости бактерий, выращенных на жидкой минимальной среде Винсента в течение 3,5 сут. Электрофорез белков в ПААГ с ДСН проводили по стандартной методике (Laemmli, 1071). Перенос на нитроцеллюлозные мембраны и иммунодетекцию белков выполняли согласно стандартным протоколам (Towbin et al., 1979, Harlow, Lane, 1988). Антисыворотки против белков ExpE1, ExsH и ExoK штамма Rm2011 S. meliloti были любезно предоставлены A. Беккер (Университет г. Билефельд, Германия).

Анализ симбиотических свойств мутантов. Симбиотические свойства штаммов изучали в условиях стерильного микровегетационного опыта (Федоров и др., 1983) на люцерне M. sativa (сорт Вега) и на M. truncatula (сорт Jamalong).

Симбиотическую эффективность мутантов определяли по массе высушенной надземной части растений. Нодуляционную конкурентоспособность (НКС) мутантов изучали прямым (резистентным) и косвенным методами. Для оценки НКС косвенным методом использовали тестерный штамм СХМ1-48 S. meliloti.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖЕНИЕ Получение Tn5-мутантов S. meliloti с измененными поверхностными полисахаридами Мутантов с измененными поверхностными полисахаридами получали у штамма СХМ1-188 S. meliloti путем неспецифического Tn5-мутагенеза и последующего отбора на селективных средах. При отборе мутантов учиты вались: 1) окраска и слизистость колоний на минимальной среде с Конго красным (выявление мутантов с различными изменениями синтеза полисаха ридов - ЭПС, ЛПС, КПС);

2) отсутствие роста на среде LB с ДОХ (выявление ЛПС - мутантов);

3) изменения в свечении бактериальных колоний в УФ свете на среде LB с Калькофлуором белым (выявление мутантов, дефектных в синтезе ЭПС1). Всего было отобрано 8 мутантов: 5 мутантов - Tb29, Ts22, Ts32, Tb9 и Ts152 – из транспозантов, полученных ранее в лаборатории С. Н.

Юргель, и 3 мутанта - Tr53, Tr63 и Tr465 - из Tn5-транспозантов, полученных автором. Все мутанты отличались от родительского штамма СХМ1-188 по окраске колоний и характеру роста на селективных средах (табл. 1).

ЛПС исследуемых штаммов анализировали электрофорезом в полиакрил амидном геле с ДСН (рис. 1). ЛПС родительского штамма СХМ1-188 S. meliloti разделялись на две зоны: высокомолекулярную (S-ЛПС), обозначаемую у ризобий ЛПС1, и низкомолекулярную (R-ЛПС), обозначаемую ЛПС2. У мутантов Tb29 и Ts22 отсутствовала зона ЛПС1. У мутантов Tb9 и Tr53 обе зоны ЛПС были модифицированы. Анализ капсулярных полисахаридов у исследуемых штаммов показал, что у мутанта Tr53 отсутствовала зона КПС, а мутант Ts22 синтезировал КПС с большей электрофоретической подвижностью, чем родительский штамм СХМ1-188 S. meliloti.

Саузерн блот-гибридизацией ДНК мутантов с Tn5-зондом было подтверждено, что все мутанты содержат единственную копию Tn5 транспозона в геноме. Трансдукция маркера устойчивости к канамицину из мутантов в родительский штамм и анализ трансдуктантов подтвердили, что фенотипические особенности всех мутантов обусловлены Tn5-инсерциями в их геном, а не другими генетическими изменениями.

Таким образом, впервые были получены два Tn5-мутанта S. meliloti, не имеющих высокомолекулярной формы ЛПС (Tb29 и Ts22). Мутанты Tb9 и Tr53 содержали обе формы ЛПС, но отличались рисунком микрогетерогенности ЛПС. Повышенная чувствительность мутантов Ts32, Tr63 и Tr465 к ДОХ могла быть вызвана изменениями клеточной поверхности, не связанными с синтезом ЛПС. Изменения слизеобразования и флуоресценции колоний в УФ свете у мутантов Tr53, Tr63 и Ts152 указывали на нарушения у них синтеза экзополисахаридов.

Таблица 1. Характеристика роста штамма СХМ1-188 S. meliloti и его Tn5- мутантов на селективных средах Окраска колоний на Рост Свечение в УФ Штамм минимальной среде на среде LB свете на среде LB с с Конго красным c ДОХ Калькофлуором СХМ1-188 розовая + + красная Tb 29 - + красная Ts 22 - + коричневая Ts 32 + + оранжевая Tb 9 + + оранжевая / красная Tr 53 + красная / черная Tr 63 - красная Tr465 - ++ черная Ts 152 + + ЛПС ЛПС 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН липополисахаридов штамма СХМ1-188 S. meliloti и его Tn5-мутантов.

Обозначения: 1 – СХМ1-188;

2 – Tb9;

3 – Tb29;

4 – Ts22;

5 – Ts32;

6 – Tr53;

7 – Tr63;

8 – Tb9;

9 – Tr465.

Анализ симбиотических свойств Tn5-мутантов с измененными полисахаридами Симбиотическая эффективность и нодуляционная конкурентоспособность мутантов были изучены в нескольких микровегетационных опытах на люцерне Medicagо sativa и M. truncatula. Мутанты Tb29, Ts22, Ts32, Tb9, Tr465 и Ts формировали эффективный симбиоз с обоими растениями-хозяевами. Масса растений M. sativa, инокулированных мутантами Tb29, Ts22, Ts32, Tb9 и Tr465, достоверно не отличалась от массы растений, инокулированных родительским штаммом. Мутант Ts152 имел повышенную симбиотическую эффективность по сравнению с родительским штаммом, что подтвердилось в микровегетационных опытах (прибавка массы растений M. sativa составляла, в среднем, 20%).

НКС мутантов определяли косвенным и прямым методами. При оценке НКС применяли разбивку на классы. Мутанты Tb29 и Ts22, не имеющие высокомолекулярного ЛПС1, и мутант Tr465 с повышенной чувствительно стью к ДОХ характеризовались достоверно сниженной НКС (класс К(_)).

Конкурентоспособность мутантов Ts32 и Tb9 была ниже, чем у исходного штамма, но выше, чем у тестерного штамма. Они были отнесены к классу К( + ).

НКС мутанта Ts152 была высокой (класс К( + )).

Мутанты Tr53 и Tr63 с нарушениями синтеза экзополисахаридов были дефектны в формировании симбиоза и образовывали на корнях M. sativa и M. truncatula мелкие белые, не фиксирующие азот клубеньки. Электронно микроскопический анализ клубеньков, индуцированных этими мутантами на M. sativa, показал, что гистологическая зональность в клубеньках была слабо выражена. Зона инфекции в клубеньках была представлена растительными клетками, содержащими небольшое количество недифференцированных бактероидов. Большую часть клубеньков занимала зона старения.

Трансдуктанты, полученные от каждого мутанта, характеризовались такими же симбиотическими свойствами, что и соответствующие им мутанты.

Это подтверждает связь Tn5-инсерций c симбиотическим фенотипом мутантов.

Характеристика генов, инактивированных Tn5-инсерциями у мутантов с измененными полисахаридами Для того, чтобы выяснить, какие гены были затронуты Tn5-инсерциями у мутантов, проводили клонирование и секвенирование фрагментов ДНК мутантов, смежных с Tn5. В результате клонирования по сайтам рестрикции EcoRI и BamHI были получены плазмиды, содержащие фрагмент Tn5 с прилегающей областью ризобиальной ДНК (0,8 – 7,0 т.п.н.). Анализ секвенированных последовательностей ДНК представлен в таблице 2.

У всех мутантов Tn5-транспозон встроился в открытые рамки считывания.

Смежные с Tn5 последовательности ДНК мутантов были гомологичны последо вательностям генов штамма 1021 S. meliloti, геном которого был полностью сек венирован. Идентичность по нуклеотидным основаниям составляла 97-100%.

Для характеристики генов использовали данные аннотации генома штамма S. meliloti на сайте http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi.

Таблица 2. Анализ секвенированных последовательностей ДНК мутантов Просек- % гомо вениро- логии с Ген Tn5 мутант вано мишень Tn5 Продукт гена S.meliloti нуклео- Rm1021* тидов ацил-AПБ-синтаза fabF 798 Tb (хромосома) (400 амк) Метионинсинтаза metH 618 Ts (хромосома) (1527 амк) УДФ-глюкуронат lpsL эпимераза 611 Tb (хромосома) (328 амк) УДФ-глюкозо-4-эпимераза exoB Tr 53 389 100 (мега 2) (328 амк) Белок-канал tolC внешней мембраны 638 Tr (хромосома) (456 амк) Трансмембранный белок SMc 852 Ts (хромосома) (604 амк) Белок внешней мембраны SMc Tr 465 633 98 (хромосома) (937 амк) Ацетил-КоА phbA ацетилтрансфераза 638 Ts152 (хромосома) (393 амк) * % идентичности по нуклеотидным основаниям между секвенированными фрагментами генов мутантов (без последовательностей Tn5) и фрагментами соответствующих генов штамма 1021 S. meliloti.

У мутанта Tb29 с изменениями ЛПС Tn5-транспозон встроился в ген fabF2, кодирующий ацил-AПБ-синтазу II. Данный фермент участвует в синтезе 27-OH-28:0 жк, характерного компонента липида А ЛПС у всех представителей Rhizobiaceae. У мутанта Ts22 Tn5-инсерция произошла в ген metH, кодирую щий метионинсинтазу. Фермент переносит метильные группы и участвует в синтезе метионина. Ген не входит в состав какого-либо кластера.

У мутанта Tb9 транспозон встроился в ген lpsL, кодирующий фермент для образования УДФ-галактуроновой кислоты. Галактуроновая кислота входит в состав кора ЛПС у S. meliloti. Мутация по гену lpsL была ранее описана также у штамма 1021 S. meliloti (Keating et al., 2002).

Мутант Tr53 содержит Tn5-инсерцию в гене exoB, кодирующем эпимеразу для образования УДФ-галактозы. Ранее было показано, что у S. meliloti галактоза входит в состав ЛПС, а также в состав ЭПС1 и ЭПС2 (Leigh, Lee, 1988;

Her et al., 1990;

Reinhold et al., 1994). Нами было установлено, что мутация по гену exoB у штамма СХМ1-188 S. meliloti также блокирует синтез КПС.

У мутанта Tr63 Tn5-инсерция была локализована в гене tolC на хромосоме.

Ген tolC кодирует белок-канал внешней мембраны и является компонентом секреторных систем I типа, участвующих в экскреции некоторых белков у грам-отрицательных бактерий. У мутанта Tn5-транспозон был Ts локализован в гене SMc00951, а у мутанта Tr465 – в гене SMc02705. Оба гена расположены в различных локусах хромосомы, не связанных с кластерами генов синтеза ЛПС, и кодируют консервативные белки внешней мембраны.

У мутанта Ts152 Tn5-инсерция была локализована в гене phbA, кодирующем ацетил-КоА-ацетилтрансферазу (-кетотиолазу), ключевой фермент синтеза полиоксимасляной кислоты (ПОМ) (Tombolini et al., 1995).

Сравнительный анализ липополисахаридов родительского штамма СХМ1-188 S. meliloti и мутантов Tb29 и Ts На основе сравнительного анализа ЛПС родительского штамма и мутан тов предполагалось выявить различия в составе ЛПС1 и ЛПС2 и выяснить состав О-цепи у S. meliloti. Был исследован моносахаридный и жирнокислотный состав ЛПС родительского штамма и мутантов Tb29 и Ts22.

Состав жирных кислот в ЛПС исследуемых штаммов представлен в таблице 3. Главным отличием ЛПС мутанта Tb29 от ЛПС родительского штамма было отсутствие у мутанта 27-ОН С28:0 жк. В ЛПС обоих мутантов по сравнению с ЛПС родительского штамма было меньшее относительное содержание 3-ОН-С14:0 жк и более высокое содержание C18:0 жк и окси Х жк.

Таблица 3. Жирнокислотный состав ЛПС штамма CXM1-188 S. meliloti и его мутантов Tb29 и Ts22.

Штамм Компонент СХМ1-188 Tb29 Ts % от суммы площадей на ГЖХ-хроматограммах 3-OH C14:0 48,5 41,0 38, 3-OH C15:0 8,2 7,9 8, 3-OH C16:0 5,6 4,6 6, 3-OH C18:0 20,2 19,6 21, C18:1 11,4 10,1 11, C18:0 3,7 11,6 8, Окси Х (Т 3-OH C:14=1,33 ) 2,4 5,2 4, 27-ОН С28:0 * Не + определяли В полисахаридной части ЛПС всех трех исследуемых штаммов были выявлены глюкоза, галактоза, галактуроновая и глюкуроновая кислоты, КДО, манноза, неидетифицированный сахар Х (предположительно, 6-дезоксигексоза), рамноза, следы ксилозы и фукозы. В ЛПС родительского штамма СХМ1-188 в небольшом количестве был выявлен также галактозамин (табл. 4).

Таблица 4. Моносахаридный состав ЛПС штамма CXM1-188 S. meliloti и его Tn5-мутантов Ts22 и Tb29.

Штамм Компонент СХМ1-188 Ts22 Tb % от суммы площадей на ГЖХ-хроматограммах Глюкоза 56,3 60,3 66, Галактоза 13,2 11,8 16, Манноза 7,0 5,6 3, Дезоксигексоза Х 8,6 10,7 8, (Тglc = 0,47) Рамноза 14,9 11,6 5, % от сухой массы препарата* Общие углеводы 26,0 26,4 39, Уроновые 11,6 9,3 9, кислоты КДО 5,2 10,8 10, Глюкозамин 2,44 2,45 1, Этаноламин 0,24 0,22 0, Галактозамин 0,15 - * В таблице не учтены жирные кислоты, фосфатные и сульфатные группы, присутствующие в ЛПС S. meliloti.

Для исследования полисахаридной части ЛПС (кора и О-цепи) проводили мягкую деградацию ЛПС 1% уксусной кислотой. Полисахаридную порцию ЛПС, отделенную от липида А, фракционировали на колонке с Sephadex G-25.

Элюционные профили выхода фракций с колонки строили по содержанию в них углеводов, уроновых кислот и КДО (рис. 2). Моносахаридный состав каждой фракции у всех штаммов определяли методом ГЖХ. В таблице 5 представлен моносахаридный состав фракций ЛПС родительского штамма.

При гельфильтрации на Sephadex G-25 частично деградированные полисахариды ЛПС исследуемых штаммов разделились на 4 (у Tb29) или (у СХМ1-188 и Ts22) фракций. Фракции I (около 4000-4600 Да) были небольшие. Они могут представлять собой недеградированный ЛПС или сопут ствующий полисахарид. Фракции II (около 2700 Да) у всех штаммов элюировались в одном объеме и содержали весь набор сахаров, выявленных в недеградированном ЛПС. Предполагается, что эти фракции представляют собой полный коровый олигосахарид. Фракции III (690-770 Да) у всех трех штаммов также выходят в одном элюционном объеме. Они содержат только глюкозу, уроновые кислоты, галактозу и маннозу и представляют собой небольшие олигосахариды (тетрамеры сахаров), образовавшиеся при расщеплении кора.

А490 – углеводы, А490 – углеводы, А530 –уроновые А530 –уроновые кислоты СХМ1-188 Tb кислоты А549 - КДО А549 - КДО А490 – углеводы, А530 –уроновые кислоты Ts А549 - КДО Рис. 2. Элюционные профили, полученные после гель-фильтрации на Sephadex G-25 полисахаридной части ЛПС штаммов СХМ1-188, Tb и Ts22 S. meliloti, деградированных 1% уксусной кислотой. Обозначения:

Фракции IV (360-540 Да) у штаммов СХМ1-188 и Ts22 представляют собой смесь отщепившихся в результате деградации димеров и тримеров сахаров. В этих фракциях содержится много КДО. Фракция V (180-210 Да) – фракция мономеров сахаров. Она наиболее выражена у родительского штамма. В этой фракции у СХМ1-188 содержатся различные нейтральные сахара и уроновые кислоты.

Мы не выявили отдельной фракции, соответствующей О-полисахариду ЛПС1. Это может свидетельствовать о нетипичном строении ЛПС S. melilloti.

О-цепь могла отделяться от кора и элюироваться в том же объеме, что и коровый олигосахарид, если между ними содержится КДО. Другим объяснением полученных данных может быть то, что высокомолекулярный Таблица 5. Моносахаридный состав полисахаридных фракций ЛПС штамма CXM1-188 S. meliloti, частично деградированного 1%-ной уксусной кислотой.

Фракции (ММ, Да) Моносахарид I II III IV V (4000) (2700) (690-770) (360-540) (180-210) % от суммы площадей на ГЖХ-хроматограммах Глюкоза 53,6 90,1 68,0 50,0 74, Галактоза 17,0 4,5 18,7 34,2 16, Манноза 12,5 2,2 1,3 0,9 2, X (T Glc 0,47) 4,8 2,2 - 6,2 6, Рамноза 12,1 1,0 - 8,7 мкг/мл максимального выхода фракции Общее содержание 20,2 134,0 94,0 53,0 98, углеводов Уроновые кислоты 18,5 121,0 113,0 36,0 98, КДО - 0,2 2,8 1,7 1, Соотношение углеводов к уроновым кислотам 1,1 0,83 1,5 ЛПС1, обнаруживаемый при электрофорезе ЛПС S. meliloti, представляет собой агрегированную форму ЛПС2. Отсутствие длинноцепочечной 27-ОН-С28 жк влияет на агрегационные свойства ЛПС, что может приводить к исчезновению высокомолекулярной формы ЛПС.

Изучение tolC мутанта Tr63, дефектного в продукции экзополисахаридов Мутант Tr63 имел Tn5-инсерцию в гене tolC, кодирующем белок-канал, но имел фенотип, характерный для мутантов, дефектных в синтезе экзополисахаридов. Мы исследовали связь белка TolC с продукцией экзополи сахаридов у S. meliloti. При выращивании на среде с Калькофлуором белым мутант Tr63 не образовывал вокруг колоний светящихся в УФ-свете ореолов.

Эта особенность характерна для мутантов S. meliloti, дефектных в секреции эндогликаназ ExsH и ExoK, расщепляющих высокомолекулярный ЭПС1.

Способность tolC мутанта Tr63 продуцировать второй экзополисахарид S. meli loti – ЭПС2 – тестировали на среде MOPS с низким содержанием фосфора (0,1 mM K 2 HPO 4 ). На этой среде мутант Tr63 формировал бесслизистые колонии, что свидетельствовало о нарушении у него продукции ЭПС2.

Поскольку Tr63 имел мутацию в гене tolC, он мог быть дефектен в секреции белков, экспортирующихся через секреторные системы I типа. Отсутствие светящихся ореолов у мутанта Tr63 могло быть связано с отсутствием белка ExsH, а бесслизизистые колонии – с отсутствием белка ExpE1, необходимого для экспорта ЭПС2. Из литературных данных известно, что белки ExsH и ExpE выделяются через секреторные системы I типа.

Мы проанализировали наличие белков ExsH, ExpE1 и ExoK в культуральной жидкости у tolC мутанта при помощи поликлональных антисывороток, полученных против этих белков. Для анализа секретируемых белков использовали штаммы СХМ1-188exoY, Tr63exoY и Rm2011exoY, не синтезирующие ЭПС1, что облегчало процедуру выделения секретируемых белков из культуральной жидкости. Штамм Rm2011exoY был взят как контрольный, т.к. антисыворотки были получены к его белкам. Результаты анализа представлены на рис. 3.

ExsH ExpE1 ExoK 1 2 3 1 2 3 1 2 Рис. 3. Иммуноблотинг секретируемых белков штаммов Rm2011exoY, CХМ1-188exoY и Tr63exoY S. meliloti с поликлональными антисыворотками против белков ExsH, ExpE1 и ExoK.

Обозначения: 1– Rm2011exoY, 2 – CХМ1-188exoY, 3 – Tr63exoY.

Стрелками обозначены ответы с белками ExsH, ExpE1 и ExoK.

Показано, что иммунные ответы на связывание с антисыворотками против белков ExsH и ExpE1 отсутствуют у мутанта Tr63exoY. Белок ExoK, который выделяется через секреторную систему II типа, содержится в смеси секретируемых белков штаммма Tr63exoY. Полученные результаты свидетельствуют о том, что белки ExsH и ExpE1 у S. meliloti экспортируются во внешнюю среду через белок-канал TolC.

Предполагается, что Fix(-) – фенотип мутанта Tr63 обусловлен нарушении ями у него секреции экзополисахаридов, в частности ЭПС1.

Изучение мутанта phbA мутанта Ts152 S. meliloti Мутант Ts152 имел Tn5-инсерцию в гене phbA, участвующим в синтезе ПОМ. При выращивании на минимальной среде Ts152 образовывал мало слизистые колонии, что указывало на изменение у него продукции экзополи сахаридов. На среде LB с Калькофлуором белым колонии мутанта Ts флуоресци-ровали в УФ свете, что свидетельствовало о синтезе ЭПС1. Однако, если мутант Ts152 предварительно выращивали на минимальной среде, а затем переносили на среду с Калькофлуором, колонии Ts152 не флуоресцировали (рис. 4). Тестирование мутанта на среде MOPS с 0,1 mM K 2 HPO 4 показало, что продукция ЭПС2 у него не изменена. Эти данные свидетельствуют о том, что мутация по гену phbA блокирует синтез ЭПС1 у S. meliloti только при выращивании бактерий на минимальной среде и не влияет на синтез ЭПС2.

Была исследована способность мутанта Ts152 синтезировать ПОМ. Из данных литературы известно, что у S. meliloti отложения ПОМ образуются только в свободноживущем состоянии. Они хорошо видны в бактериях S. meliloti, находящихся в инфекционных нитях, но никогда не обнаруживаются в бактероидах. Электронно-микроскопический анализ клубеньков выявил отложе-ния ПОМ в бактериях мутанта Ts152, находящихся в инфекционных нитях, но в меньшем количестве, чем у родительского штамма S. meliloti. В бактероидах обоих штаммов гранулы ПОМ отсутствовали. Мы также исследовали отложения ПОМ в свободноживущих клетках родительского штамма и мутанта, выращенных на минимальной среде. Отложения ПОМ содержались в большом количестве в клетках родительского штамма и также выявлялись в некоторых клетках Ts152. Однако в большинстве клеток мутанта, выращенных на минимальной среде, гранулы ПОМ отсутствовали (рис. 5).

СХМ1-188 Ts Рис. 4. Свечение колоний Рис. 5. Исследование накопле штаммов СХМ1-188 и Ts152 S.

ния ПОМ у свободноживущих meliloti в УФ свете на среде LB бактерий. Отложения ПОМ с Калькофлуором белым после показаны стрелками.

выращивания на минимальной среде.

У штамма Ts152 мутация в гене phbA приводила к повышению эффектив ности симбиоза. Для того чтобы выяснить, экспрессируется ли ген phbA у S. meliloti в условиях симбиоза (в бактероидах), было сконструировано слияние гена phbA S. meliloti с репортерным геном gusA. Проростки люцерны M. sativa были инокулированы штаммом СХМ1-188 (phbA::gusA) и контрольным штаммом. После обработки буферным раствором, содержащим X-GlcA, клубеньки, образованные штаммом СХМ1-188 (phbA:: gusA), полностью окрашивались в синий цвет (рис. 6). Это свидетель ствует об экспрессии гена phbA во всех зонах клубенька.

Таким образом, хотя ПОМ не обнаруживается в бактероидах S. meliloti, ген phbA экспрессиру ется в процессе симбиоза. Возможно, выключение этого гена у мутанта Ts152 приводит к повышению его симбиотической эффективности.

Рис. 6. Анализ экспрессии гена phbA у штамма СХМ1-188 S. meliloti в условиях симбиоза с M. sativa.

ВЫВОДЫ 1. Впервые получено два Tn5-мутанта (Tb29 и Ts22) S. meliloti, не имеющие высокомолекулярного ЛПС1, и показано, что отсутствие ЛПС1 у S. meliloti не влияет на симбиотическую эффективность бактерий, но значительно снижает их нодуляционную конкурентоспособность.

2. Показано, что отсутствие ЛПС1 у мутанта Tb29 связано с Tn5-инсерцией в ген fabF2, кодирующий ацил-АПБ-синтазу, необходимую для синтеза 27-OH-C28 жирной кислоты в липиде А ЛПС, а у мутанта Ts22 c Tn5-инсерцией в ген metH, кодирующий метионинсинтазу.

3. Исследован компонентный состав ЛПС штамма СХМ1-188 S. meliloti и ЛПС-мутантов Tb29 и Ts22 и показано, что в липиде А мутанта Tb отсутствует 27-OH-C28 жирная кислота, а по моносахаридному составу ЛПС родительского штамма и обоих мутантов существенно не различаются.

4. Показано, что мутация в гене lpsL (мутант Tb9) не влияет на эффективность и конкурентоспособность штамма СХМ1-188 S. meliloti, а мутация в гене exoB (мутант Tr53) приводит к отсутствию КПС и Fix(-) – фенотипу на растениях-хозяевах Medicago sativa и Medicago truncatula.

5. Впервые получены Tn5-мутанты S. meliloti по генам SMc00951 (мутант Ts32) и SMc02705 (мутант Tr465), кодирующим консервативные белки внешней мембраны, и показано, что мутации в данных генах приводят к снижению конкурентоспособности S. meliloti, но не влияют на симбиотическую эффективность бактерий.

6. Впервые получен Tn5-мутант Tr63 S. meliloti по гену tolC и показано, что белок TolC у S. meliloti вовлечен в секрецию белков ExsH и ExpE1 и является необходимым для продукции экзополисахаридов и формирования симбиоза с люцерной.

7. Показано, что мутация по гену phbA, кодирующему ацетил-КоА-ацетил трансферазу, не блокирует синтез ПОМ у штамма СХМ1-188 S. meliloti, но отменяет синтез ЭПС1 при выращивании бактерий на минимальной среде, а также приводит к повышению эффективности симбиоза с люцерной M. sativa.

Ген phbA S. meliloti экспрессируется во время симбиоза с M. sativa.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

В рецензируемых изданиях:

1. Затовская Т.В., Ушаков К.В., Юргель С.Н., Косенко Л.В., Захарова И.Я., Симаров Б.В. Получение Tn5-мутантов Rhizobium meliloti с измененным составом липополисахаридов и анализ их симбиотических свойств // Генетика.

1998. T.34, N6. C.742-748.

2. Косенко Л.В., Затовская Т.В. Изучение липополисахаридов Sinorhizobium meliloti СХМ1-188 и двух его мутантов, характеризующихся сниженной нодуля ционной конкурентоспособностью // Микробиология. 2004. Т.73, N3. C. 350-357.

3. Затовская Т.В., Шарыпова Л.А., Селиверстова Е.В., Симаров Б.В. Мутант Tr63 по гену tolC штамма СХМ1-188 Sinorhizobium meliloti не спосoбен к формированию эффективного симбиоза с люцерной // Генетика. 2007. Т.43, N3.

С.323-332.

В других изданиях:

4. Затовская Т.В., Косенко Л.В., Юргель С.Н., Симаров Б.В. ЛПС-мутанты Sinorhizobium meliloti и их нодуляционная конкурентоспособность // Микробиол. журнал (Украина). 2000. Т.62. N2. С.27-37.

5. Zatovska T.V., Kosenko L.V., Ushakov K.V., Yurgel S.N., Simarov B.V.

Rhizobium meliloti mutants with altered surface and their symbiotic properties // Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture. 1995. V.27. P.425.

6. Zatovska T., Kosenko L., Zakharova I., Simarov B., Yurgel S. The role of bacterial lipopolysaccharides in determination of nodulation competitiveness of Rhizobium meliloti // Proc. 8th Intern. Congr. of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Jerusalem, Izrael, 1996, August 18-23.

4. Zatovskaya T. V., Kosenko L.V., Simarov B.V. Partial characterization of Rhizobium meliloti Ts22 impaired in lipopolysaccharide synthesis // Proc. 9th Intern.

Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. 1999. Amsterdam. Holland. P.58.

6. Затовская Т.В., Косенко Л.В., Ушаков К.В., Шарыпова Л.А. Биохимическая и симбиотическая характеристика Rhizobium meliloti Tn5-мутанта, дефектного в синтезе липополисахаридов // Тезисы II-й съезда ВОГиС, Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000 г. Т.1. С. 282-283.

7. Моржина Е.В., Затовская Т.В., Стефанов С.Ю. Морфологический анализ клубеньков, формируемых мутантами Sinorhizobium meliloti Tr53 и Tr63, дефектными по синтезу полисахаридов // Тезисы II-й съезда ВОГиС, Санкт Петербург, 1-5 февраля 2000 г. Т.1. С. 292.

8. Zatovska T.V., Kosenko L.V., Varbanetz L.D., Simarov B.V.

Lipopolysaccharides from Sinorhizobium meliloti CXM1-188 and its LPS-mutant Ts22 // Abstracts of XVI International Symposium on Glycoconjugates. 2001.

August 19-24. C5.11. The Hague, Netherlands.

9. Zatovska T.V., Kosenko L.V., Sharypova L.A. Lipopolysaccharides from Sinorhizobium meliloti CXM1-188 and its Tn5-mutant affected in biosynthesis of 27-OH-C28:0 fatty acid // Proc. of 11-th Intern. Congr. on Molecular Plant-Microbe Interactions. St.-Petersburg: Russia, 18-26 July 2003. P. 282.

12. Затовская Т.В., Симаров Б.В., Шарыпова Л.А. Гены, контролирующие синтез ЛПС у Sinorhizobium meliloti СХМ1-188 // Тезисы III съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004 г. С.425.

13. Затовская Т.В., Симаров Б.В. Влияние мутации в гене phbA на синтез экзо полисахаридов у Sinorhizobium meliloti // Тезисы докладов 12 съезда Общества Микробиологов Украины им. С. Н. Виноградского, 25-30 мая 2009 г., С. 52.

Ужгород, Украина.