Роль гена wox5 в контроле пролиферации и дифференцировки клеток на модели органогенеза клубеньков бобовых растений

На правах рукописи

ОСИПОВА Мария Александровна РОЛЬ ГЕНА WOX5 В КОНТРОЛЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК НА МОДЕЛИ ОРГАНОГЕНЕЗА КЛУБЕНЬКОВ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ 03.02.07 Генетика 03.01.05 Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010 2

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном университете на кафедре генетики и селекции в лаборатории генной и клеточной инженерии растений и во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии РАСХН в лаборатории молекулярной и клеточной биологии растений Научные руководители: кандидат биологических наук, Долгих Елена Анатольевна доктор биологических наук, профессор Лутова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Ежова Татьяна Анатольевна кафедра генетики Московского Государственного университета доктор биологических наук Шишова Мария Федоровна кафедра физиологии и биохимии растений Санкт-Петербургского Государственного университета Ведущее учреждение: Всесоюзный институт растениеводства (ВИР) имени Н.И.Вавилова

Защита состоится ”16” декабря 2010 г. в 16 часов 30 минут на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт Петербургского государственного университета

Автореферат разослан ””2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук Л.А.Мамон Изучение регуляции пролиферации и Актуальность проблемы.

дифференцировки клеток является важной фундаментальной задачей биологии развития. В силу консервативности механизмов, регулирующих пролиферацию клеток у эукариот, многие данные о регуляции клеточных делений, полученные для животных, впоследствии проверяются и подтверждаются для растений. У животных лишь ограниченное число клеток взрослого организма способно делиться и обеспечивать формирование тканей и органов, эти клетки называют стволовыми. В отличие от животных, практически все живые клетки растений являются тотипотентными, и при определенных условиях способны дать начало целому организму. При этом активная пролиферация клеток свойственна особому типу клеток растений – клеткам меристем. У растений выделяют «регулярные» меристемы (такие как апикальные меристемы побега и корня) и «нерегулярные» (или дополнительные) меристемы, формирующиеся de novo при определенных условиях. К «нерегулярным» меристемам, можно отнести, например, меристемы специализированных органов, таких как клубеньки, образующиеся на корнях бобовых растений при симбиозе с бактериями ризобиями.

Для обеспечения правильного развития растений необходима тонкая регуляция баланса пролиферирующих клеток в меристемах. Пролиферация клеток растений регулируется различными системами. В первую очередь, непосредственными регуляторами пролиферации клеток являются комплексы циклинов и циклин зависимых киназ, кроме того, важную роль в регуляции пролиферации клеток играют гормоны, такие как ауксин и цитокинин. В последние годы было также показано, что ключевыми генами, определяющими баланс пролиферирующих клеток в меристеме побега, являются гены, кодирующие транскрипционные факторы. Среди них особое место занимают гены семейства WOX (от WUSCHEL-related homeobox), кодирующие транскрипционные факторы с гомеодоменом. Предполагается, что транскрипционные факторы WOX являются ключевыми регуляторами пролиферации и дифференцировки клеток в так называемых «организующих центрах» апикальных меристем, функция которых заключается в стимулировании пролиферации прилежащих клеток и предотвращении их дифференцировки. Так, в организующем центре меристемы побега экспрессируется ген WUS (WUSCHEL), а в организующем центре меристемы корня (его называют «покоящимся» центром) - его паралог, ген WOX5. Было показано, что активность именно генов WOX (WUS и WOX5) необходима для предотвращения дифференцировки и стимулирования пролиферации клеток меристемы (меристемы побега и корня, соответственно). Также известно, что гены семейства WOX экспрессируются в меристемах специализированных органов (например, при морфогенезе клубеньков бобовых растений при симбиозе с бактериями ризобиями), однако их роль в формировании подобных меристем практически не изучена. Большинство данных о механизмах, за счет которых гены WOX регулируют пролиферацию клеток, получено для апикальной меристемы побега.

В меристеме побега WUS вовлечен как в локальную, так и в системную регуляцию пролиферации клеток. Известно, что в меристеме побега такая регуляция осуществляется через взаимодействие транскрипционного фактора WUS с системой CLAVATA и компонентами каскада сигнальной трансдукции, регулируемой цитокинином. Транскрипционный фактор WUS стимулирует деления клеток, непосредственно регулируя экспрессию генов, кодирующих регуляторы цитокининового сигнального каскада ARR (Arabidopsis Response Regulators) А-типа, обеспечивая локальное усиление действия цитокинина в тканях – гормона, стимулирующего пролиферацию (Leibfried et. al. 2005). В то же время ген WUS взаимодействует с системой CLAVATA, включающей гетеродимерный рецептор CLV1/CLV2, с которым связывается пептидный лиганд CLV3 – член семейства CLE пептидов, недавно охарактеризованных регуляторных пептидов, которые рассматривают как новый класс пептидных гормонов растений. Связывание лиганда CLE запускает сигнальный каскад, приводящий к подавлению экспрессии WUS, и, как следствие, к ограничению пролиферации клеток в меристеме. Взаимодействие WUS CLAVATA обеспечивает регуляцию тонкого баланса пролиферации и дифференцировки клеток в меристеме.

Для апикальной меристемы достаточно хорошо изучена роль WUS в регуляции пролиферации клеток. Однако роль паралога гена WUS, гена WOX5, экспрессирующегося в других типах меристем, и механизм его действия практически не исследован. Как показали исследования на модельном объекте, арабидопсисе, продукты генов WUS и WOX5 функционально эквивалентны (Sarkar et al., 2007): оба эти гена экспрессируются в «организующих центрах» меристем и обеспечивают поддержание пула стволовых клеток, стимулируя их пролиферацию и блокируя дифференцировку. На основании сходства выполняемых функций можно предположить схожий механизм действия регуляторов WUS и WOX5. Последние данные свидетельствуют о том, что WOX5 может взаимодействовать с CLAVATA подобной системой в меристеме корня: CLE-пептид (компонент системы CLAVATA) CLE40 ограничивает область экспрессии WOX5 в меристеме корня таким же образом, как CLV3 ограничивает область экспрессии гена WUS в меристеме побега (Stahl and Simon, 2009). Участие других компонентов системы CLAVATA (гомологов рецепторного комплекса CLV1/CLV2) в ограничении экспрессии WOX5 в меристеме корня к настоящему времени не показано.

Таким образом, к настоящему времени накоплены данные о роли генов WOX в «организующих центрах» апикальных меристем, тогда как их роль при развитии других типов меристем – формирующихся у растений de novo, остается неизученной.

Одним из примеров формирования такого типа меристемы является органогенез клубенька, образующегося на корнях бобовых растений при симбиозе с почвенными бактериями ризобиями. Формирование клубеньков у бобовых растений происходит в результате дедифференцировки и реактивации делений клеток корня. Этот процесс представляет собой уникальную модель для изучения механизмов регуляции деления и дифференцировки клеток у растений. Известны данные о том, что в процесс развития клубенька у бобовых растений может быть вовлечен ген WOX5 (Wan et al., 2005), однако функция и механизм действия гена WOX5 в развитии клубенька остаются неизученными. Кроме того, совсем недавно была показано, что компоненты системы CLAVATA вовлечены в авторегуляцию клубенькообразования, с помощью которой растение контролирует численность клубеньков. В частности, одним из компонентов системы авторегуляции клубенькообразования является CLAVATA1-подобный ген, функционирующий в побеге у бобовых растений, имеющий большой процент сходства с геном CLAVATA1 у арабидопсиса (Searle et al., 2003). Мутация по этому гену приводит к нарушению системного контроля клубенькообразования, и как следствие – к формированию избыточного количества клубеньков (суперклубенькообразующему фенотипу). Кроме того, совсем недавно у бобовых были выявлены CLE- пептиды, специфичные для клубеньков, которые могут быть вовлечены в авторегуляцию с участием системы CLAVATA (Mortier et al. 2008;

Okamoto et al. 2009). На основании данных, известных для меристемы побега, можно предположить, что мишенями таких пептидных регуляторов могут являться как раз гены семейства WOX. В пользу такого предположения свидетельствуют данные о том, что в меристеме корня CLE-пептид CLE40 ограничивает область экспрессии WOX5.

Использование модели развития клубенька у бобовых растений позволяет изучить роль гена WOX5 при формировании меристем de novo, и позволяет исследовать взаимосвязь гена WOX5 с компонентами системы CLAVATA (CLV1 подобный рецептор, CLE-пептиды) при развитии клубенька. Изучение особенностей регуляции экспрессии WOX5 при развитии клубенька позволит разрешить вопрос о существовании общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток в апикальных меристемах и при развитии специализированных органов – клубеньков.

Цель и задачи работы. Цель работы - изучение роли меристемспецифичного гена WOX5 при развитии клубенька. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубенька 1.1. Идентификация гена WOX5 у гороха 1.2. Анализ экспрессии гена WOX5 при клубенькообразовании у растений дикого типа 1.3. Локальный анализ экспрессии гена WOX5 с использованием генетических конструкций 1.4. Изучение клубенькообразования у растений с искусственно подавленной экспрессией гена WOX5 путем РНК-интерференции (WOX5-RNAi) 2. Изучение взаимодействия WOX5 и комплекса CLAVATA при развитии клубенька 2.1. Изучение экспрессии WOX5 при развитии клубеньков у суперклубенькообразующих мутантов 2.1.1. Количественный анализ экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующих мутантов гороха.

2.1.2. Сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 у люцерны дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 с нарушением системы CLAVATA 2.2. Анализ влияния CLE-пептидов на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у растений дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов 2.2.1. Определение последовательности гена, кодирующего специфичный для клубеньков CLE-пептид, у гороха.

2.2.2. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептидов на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов по генам PsSYM29, PsSYM28 и PsNOD3.

2.2.3. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn-3.

Научная новизна диссертационной работы. В ходе выполнения данной работы были идентифицирован ген WOX5 у гороха и впервые показано участие гена WOX5 в клубенькообразовании и изучена локализация гена WOX5 на различных этапах развития клубенька у бобовых растений. Изучена взаимосвязь между геном WOX5 и компонентами системы CLAVATA (CLV1-подобный рецептор, CLE-пептид) и показана общность механизмов регуляции генов WOX при формировании меристем de novo (клубенькообразование) и в апикальных меристемах растений.

Практическая ценность. Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курсов лекций «Симбиогенетика», «Генетика развития растений», читаемых на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Полученные в работе генетические конструкции для трансформации растений могут быть использованы на практике широким кругом исследователей при работе с трансгенными растениями.

Апробация работы. По результатам работы были сделаны сообщения на конференциях: 9-ый европейский конгресс по азотфиксации Женева, Швейцария, 6 10 сентября 2010, V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21- июня 2009, Москва, школа-конференция для аспирантов AB-RMS («Агробиотехнология в корневых-микробных системах») в рамках программы NOVA University Network в 2007 (Санкт-Петербург, Россия) и 2008 (Тюне, Дания), 8-ой европейский конгресс по азотфиксации Гент, Бельгия, 30 августа- 3 сентября, конференция «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XX века». Петрозаводск, XV Конгресс Федерации Европейского сообщества по биологии растений (FESPB), 17-21 июля 2006, Лион, Франция, 10-ая Пущинская школа конференция молодых ученых "Биология - Наука XXI века". 17-21 апреля 2006, Москва.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (145 источников). Работа изложена на 139 страницах и содержит 43 рисунка и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Растительный материал. В работе использовали горох (Pisum sativum L.) сортов Rondo, Frisson и SGE, а также полученные на основе сорта SGE мутантные линии SGENod--8 (sym38), SGEFix--2 (sym33), SGENod--3 (sym35), мутантные линии P64 (sym28), P88 (sym29), полученные на основе сорта Frisson, мутантную линию P (nod3), полученную на основе сорта Rondo из коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (http://www.arriam.spb.ru/eng/lab9/collections.html). Кроме того, в работе использовали линию люцерны диплоидной Medicago truncatula Gaertn A17 и мутантную линию люцерны диплоидной sunn-3, любезно предоставленную коллегами из Университета г. Гента (VIB, UGent, Бельгия).

Условия выращивания растений. Семена стерилизовали с использованием концентрированной серной кислоты в течение 10 минут с последующей 5-кратной промывкой в стерильной воде. Семена высевали на 1% водный агар и проращивали в темноте в течение 4-5 дней. В экспериментах по изучению экспрессии генов проростки гороха переносили в горшки с вермикулитом, поливали жидкой средой Jensen (Jensen, 1942). Растения выращивали в фитотроне с режимом день/ночь 16/ часов, 21oC, относительной влажности 75%, освещенности 30 тыс. люкс. Образцы корней для выделения РНК собирали на 5, 7, 9, 11, 15, 22 дни после инокуляции, корни 3-4 растений на вариант.

Штаммы микроорганизмов. Для инокуляции растений гороха Pisum sativum L использовали штамм Rhizobium leguminosarum bv. vicea CIAM 1026 (Safronova and Novikova, 1996), полученный из коллекции ГНУ Всероссийского научно исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (http://www.arriam.spb.ru/eng/lab10/). Для инокуляции растений люцерны M. truncatula использовали штамм Sinorhizobium meliloti 2011.

Клонирование фрагментов генов гороха и редиса осуществляли в клетках E. coli DH5. Для трансформации растений использовали штаммы Agrobacterium rhizogenes MSU440 и Arqua.

Векторы и генетические конструкции. Для клонирования фрагментов генов гороха использовали вектор pAL-TA (Евроген, Россия). Клонирование промотора гена осуществляли в векторе pENTR-D/TOPO (Invitrogen, США), с последующим переклонированием в вектор pBGFWS7.0 (VIB, UGent, Бельгия). Фрагмент для РНК интерференции гена MtWOX5 клонировали в векторе pDONR221 (Invitrogen, США) с последующим переклонированием в вектор pK7GWiWG2D (VIB, UGent, Бельгия).

Молекулярно-биологические процедуры. Выделение ДНК из растительного материала проводили с использованием ЦТАБ-буфера по модифицированному протоколу Rogers, Bendich, 1985. РНК выделяли с использованием реагента TRI® (Sigma, США) согласно протоколу производителя или с помощью метода с использованием горячего фенола и LiCl (Pawlowski et al. 1994). Плазмидную ДНК выделяли из ночной культуры клеток E.coli с помощью метода лизиса щелочью (Lee, Rasheed, 1990). Анализ последовательностей ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора CEQTM 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США) по протоколу производителя. Количественный анализ экспрессии генов проводили путем ОТ-ПЦР в реальном времени с помощью системы Bio-Rad iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием коммерческого набора iQ SYBR Green Supermix. При анализе экспрессии в качестве референсного гена использовали убиквитин (Ubi).

Трансформация растений с помощью Agrobacterium rhizogenes.

Трансформацию растений люцерны диплоидной и гороха осуществляли с помощью Agrobacterium rhizogenes по протоколу, описанному Лимпенсом и соавторами (Limpens et al., 2004), путем нанесения суспензии бактерий на срез в области гипокотиля асептических проростков in vitro и культивирования проростков с агробактериями в течение 4-5 дней на твердой питательной среде Farhaeus.

Световая микроскопия. Детекцию активности репортерного гена GUS осуществляли c помощью субстрата X-Gluc (Sigma-Aldrich, США), инкубируя растительные ткани в буфере для GUS-окрашивания (Na-фосфатный буфер, pH 7,0;

0,5 мМ K3Fe(CN)6;

0,5 мМ K4Fe(CN)6;

0,05% Triton X-100;

0,5 мМ X-Gluc в диметилформамиде) при 37°C в течение 1,5-2 часов. Срезы тканей растений, заключенных в 4% агарозу, получали с использованием микротома с вибрирующим лезвием НМ 650V (Microm International GmbH). Микроскопический анализ проводили с использованием микроскопа LSM 510 META NLO (Carl Zeiss).

Статистические методы и компьютерные программы, используемые в работе.

Для статистической обработки данных при анализе количества образующихся клубеньков использовали программу STATISTICA 6. Для выравнивания последовательностей нуклеиновых кислот применяли программу AlignX, использующую алгоритм Clustal W (Thompson et al., 1994), из пакета Vector NTI Advance 10 (InforMax, Inc http://www.informaxinc.com). Количественную оценку экспрессии анализируемых генов проводили с помощью программы BioRad IQ5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубенька Идентификация гена WOX5 у гороха На основании взятых из базы данных GenBank нуклеотидных последовательностей гена WOX5 Arabidopsis thaliana (GenBank AY251396) и Medicago truncatula (GenBank BF649819) были подобраны вырожденные праймеры к консервативным участкам, которые использовали для получения продукта на матрице кДНК гороха. Проведенный анализ выявил 88,3% сходства фрагмента кДНК с соответствующей последовательностью люцерны диплоидной Medicago truncatula.

Анализ экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков у гороха Анализ экспрессии выявленного нами гена PsWOX5 в различных органах гороха показал, что этот ген экспрессируется в кончике корня гороха, слабая экспрессия гена PsWOX5 наблюдалась в тканях зрелого клубенька, однако его экспрессия отсутствовала в побеговой части растений (листья, стебли).

Экспрессия этого гена в тканях корня у гороха дикого типа усиливалась в ответ на инокуляцию ризобиями. Был проведен анализ экспрессии PsWOX5 у мутантов гороха с нарушением развития примордиев/меристемы клубеньков SGENod--3 (sym35) и SGENod–-8 (sym38). У мутанта по гену PsSYM35 наблюдается ранний блок в развитии клубеньков: не происходит активации делений клеток коры, тогда как у мутанта sym38 образуются очень редкие примордии клубеньков, но меристема не формируется. У мутантов sym35 и sym38 экспрессия гена PsWOX5 в ответ на инокуляцию нами не была выявлена. При этом у дикого типа и у мутанта sym33, у которого меристема клубенька формируется, но происходят нарушения на последующих этапах клубенькообразования, наблюдали экспрессию PsWOX5 в ответ на инокуляцию (см. рис. 1).

Анализ экспрессии PsWOX5 был проведен также на различных сроках после инокуляции ризобиями. В целом, после инокуляции уровень экспрессии PsWOX возрастал, достигал максимума к 9-11 дню после инокуляции (дпи), затем на 15 дпи происходило снижение экспрессии гена PsWOX5 (см. рис. 2). В неинокулированных контрольных образцах экспрессию гена PsWOX5 не наблюдали.

Относит. ед.

wt sym38 sym35 sym PsWOX UBI дни после инокуляции Рисунок 2. Количественный анализ Рисунок 1. Анализ экспрессии PsWOX5 в динамики экспрессии PsWOX5 при корнях гороха дикого типа (wt) и развитии клубенька гороха линии мутантов sym35, sym38, sym33 на 7 день Frisson методом ОТ-ПЦР в реальном после инокуляции ризобиями (7 дпи) времени развития клубенька люцерны WOX Полученные результаты указывают на участие гена в развитии cимбиотического клубенька.

Локальный анализ активности гена WOX5 при органогенезе клубеньков Подтверждением участия гена WOX5 в развитии клубенька стал локальный анализ его экспрессии у растений, трансформированных генетической конструкцией, содержащей промотор гена люцерны WOX5, соединенный с репортерным геном бета глюкоронидазы (pMtWOX5::GUS). Полученная нами конструкция pMtWOX5::GUS оказалась эффективной для локального анализа экспрессии WOX5 как у люцерны, так и у гороха.

Е Рисунок 3. Локализация экспрессии гена WOX5 на различных этапах развития клубенька люцерны Установлено, что ген WOX5 начинает экспрессироваться на ранних этапах развития клубенька – при первых кортикальных делениях, и его экспрессия связана с зоной пролиферирующих клеток.

На последующих этапах клубенькообразования экспрессия гена наблюдается в делящихся клетках развивающегося примордия клубенька (рисунок 3, A, B). По мере развития клубенька, зона экспрессии WOX5 смещается к периферической области клубенька (рис. 3, C). На более поздних этапах развития клубенька экспрессия WOX сохраняется лишь в области окончаний проводящих пучков: в инициальных клетках проводящих пучков (рис. 3, D). На рис. 3E представлена схема, иллюстрирующая локализацию экспрессии гена WOX5 на различных этапах развития клубенька.

Данные по локализации экспрессии гена WOX5 на различных этапах развития клубенька согласуются с данными по динамике экспрессии WOX5, полученными с помощью метода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Локализация экспрессии WOX5 в клетках примордия клубенька согласуется с высоким уровнем экспрессии этого гена, определенном с помощью метода ОТ-ПЦР, на 5-11 дпи – сроках, когда происходит закладка примордиев клубеньков. Корреляция этих данных подтверждает наше предположение о важной роли транскрипционного фактора WOX5 именно на ранних этапах развития клубенька – в процессе формирования примордия/меристемы клубенька. Наблюдаемое нами снижение экспрессии гена WOX5 на поздних этапах развития клубенька, выявленной с помощью количественной ОТ-ПЦР, соответствует ограничению зоны экспрессии гена WOX5 в развивающемся клубеньке областями окончаний проводящих пучков.

Изучение клубенькообразования у растений с искусственным подавлением экспрессии WOX5 (WOX5-RNAi ) Для окончательного подтверждения роли WOX5 в клубенькообразовании, было проанализировано влияние подавления экспрессии гена WOX5 на процесс формирования клубеньков. Для этого нами была получена конструкция для подавления активности WOX5 с помощью метода РНК-интереференции.

Как показал количественный анализ экспрессии гена WOX5, в трансгенных корнях, содержащих конструкцию WOX5-RNAi, экспрессия гена WOX5 была снижена в 1,7 раз, по сравнению с контролем (GUS-OE) (рис. 4).

Кол-во клубеньков Относит. ед.

GUS-OE WOX5-RNAi GUS-OE WOX5-RNAi Рисунок 4. Экспрессия гена WOX5 в Рисунок 5. Количество клубеньков на корнях растений люцерны, корнях растений люцерны, трансформированных конструкцией GUS- трансформированных конструкцией GUS-OE (контроль) и WOX5-RNAi OE (контроль) и WOX5-RNAi Представлены средние значения ± 95% ДИ.

Вместе с этим, на трансгенных корнях, содержащих конструкцию WOX5-RNAi, наблюдали статистически значимое (P0,05) снижение клубенькообразования, по сравнению с контролем (снижение в 2,4 раза) (рис. 5). Это является прямым доказательством роли гена WOX5 в контроле развития клубеньков.

2. Изучение взаимодействия гена WOX5 и компонентов системы CLAVATA при развитии клубенька Количественный анализ экспрессии PsWOX5 у суперклубенькообразующих мутантов гороха Следующим этапом работы было исследование механизмов действия транскрипционного фактора WOX5 при развитии клубенька и его взаимодействия с компонентами системы CLAVATA (CLV). Может ли WOX5 являться мишенью системы CLV, вовлеченной в авторегуляцию? Подходящей моделью для изучения взаимосвязи гена WOX5 и системы CLV при развитии клубенька являются суперклубенькообразующие мутанты с нарушением авторегуляции клубенькообразования. В авторегуляцию вовлечена CLV-1 подобная киназа, компонент побеговой системы авторегуляции, которая дистанционно (long-distance) подавляет формирование новых клубеньков, таким образом регулируя их численность. У гороха известно несколько суперклубенькообразующих мутантов, в том числе по генам PsSYM29, PsSYM28, PsNOD3. Суперклубенькообразующий мутант гороха P88 (sym29) имеет мутацию именно в гене CLV-1-подобной киназы. Другой мутант гороха – P64 (sym28), также имеет нарушение в побеговой системе авторегуляции, ген PsSym28 еще не клонирован, но фенотипические особенности мутанта позволяют предположить, что он также может быть компонентом системы CLV (например, CLV2): у мутанта наблюдаются характерные для мутантов по генам CLV у арабидопсиса фасциации стебля (Sagan and Duc, 1996). Уникальным мутантом является мутант P79 (nod3), имеющий нарушения в корневой системе авторегуляции (что было показано методом прививок). Такие мутанты редки у бобовых растений и на сегодняшний день еще не клонирован ни один ген, вовлеченный в корневую систему авторегуляции.

Был проведен анализ экспрессии гена PsWOX5 у суперклубенькообразующих мутантов sym28, sym29 и nod3 на различных сроках после инокуляции с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени (см. рис. 6). У мутантов максимум экспрессии наблюдается раньше (7-9 дпи), чем у дикого типа (11 дпи), кроме того у мутантов не наблюдается такого значительного снижения экспрессии PsWOX5 к дпи, как у растений дикого типа (линия Frisson: дикий тип – в 6,2 раза, sym29 ~ в 2, раза;

sym28 ~ в 1,3/1,7 раза;

линия Rondo: дикий тип - в 2 раза, nod3 в 1,2/1,3 раза). У Rondo наблюдается другой характер динамики экспрессии PsWOX5 в ходе развития клубенька, по сравнению с линией Frisson.

Oтносит. ед. Относит. ед.

Рисунок 6. Количественный анализ экспрессии гена PsWOX5 у суперклубенькообразующих мутантов sym28, sym29 и nod3 методом ОТ-ПЦР в реальном времени Кроме того, у мутанта nod3 не наблюдалось такого значительного снижения уровня экспрессии PsWOX5, по сравнению с максимумом (снижение в ~1,3 раза), как у других суперклубенькообразующих мутантов (sym29 ~ в 2,5 раза;

sym28 ~ в 1,7 раз) (см. рисунок 6).

Таким образом, с помощью количественной ОТ-ПЦР были выявлены различия в динамике экспрессии гена PsWOX5 у суперклубенькообразующих мутантов sym28, sym29 и nod3 и растений дикого типа. Полученные результаты свидетельствуют о существовании взаимосвязи между изменениями в системе CLAVATA и экспрессией ее предположительной мишени – гена WOX5.

Количественный анализ выявил более высокий уровень экспрессии гена WOX при клубенькообразовании у суперклубенькообразующих мутантов гороха, по сравнению с растениями дикого типа. Одной из причин таких различий может быть большая численность примордиев/клубеньков на корнях у суперклубенькообразующих мутантов. Но, кроме того, причиной более высокого уровня экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующих мутантов может также быть локальное изменение экспрессии этого гена в пределах одного примордия/клубенька. Для ответа на этот вопрос мы изучили локализацию экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn-3, несущего мутацию в CLV1-подобном гене - ортологе SYM29 гороха.

Сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 у люцерны дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 с нарушением системы CLAVATA Для локального анализа экспрессии гена WOX5 при развитии клубенька у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn-3 и растений люцерны дикого типа A17, растения трансформировали штаммом A. rhizogenes, содержащим конструкцию pМtWOX5::GUS. После инокуляции трансгенных корней таких растений штаммом ризобий S.meliloti 2011 исследовали локализацию активности GUS в образовавшихся примордиях/клубеньках на различных сроках (9, 12, 14, 21 и 27 дпи).

У суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 активность GUS в пределах примордия/клубенька была значительно более высокой, чем у растений дикого типа на всех проанализированных стадиях развития клубенька (см. рис. 7).

Рисунок 7. Локальный анализ экспрессии WOX5 (pMtWOX5::GUS) в клубеньке люцерны дикого типа (А1-A3) и мутанта sunn-3 (B1-B3) на 12 (А1, B1), 14 (А2, B2) и (А3, B3) день после инокуляции (толщина срезов 50 мкм) В то время как у дикого типа активность WOX5 в клетках формирующегося клубенька смещалась к периферии и сохранялась в основном в области проводящих пучков, у мутанта sunn-3 активность WOX5 оставалась на очень высоком уровне и наблюдалась во всей внутренней зоне примордия клубенька. На более поздних этапах развития клубенька (к 21 дпи) активность WOX5 у дикого типа сохранялась только в области окончания проводящих пучков, тогда как мутанта sunn-3 зона активности WOX5 смещалась к апикальной части клубенька (в область меристемы) и оставалась на значительно более высоком уровне, чем в клубеньках дикого типа.

Сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 при развитии клубенька у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn-3 и растений люцерны дикого типа A17 показал, что у мутантов sunn-3 (несущих мутацию в CLV1 подобном гене) значительно увеличен уровень экспрессии WOX5 и область его экспрессии в пределах примордия/клубенька, по сравнению с растениями дикого типа.

Полученный результат подтверждает высказанное ранее предположение о том, что экспрессия гена WOX5 при развитии клубенька регулируется CLV1-подобным геном, причем CLV1-подобный ген регулирует экспрессию WOX5 не только системно (у мутантов по CLV1-подобному гену увеличено число сайтов закладки клубеньков), но и локально (поскольку у мутантов по CLV1-подобному гену значительно увеличен уровень экспрессии WOX5 в примордиях/клубеньках, по сравнению с диким типом).

Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на клубенькообразование гороха дикого типа Было установлено, что ген WOX5 экспрессируется в клубеньках и является мишенью действия CLAVATA-подобной системы, работающей в побеге. Таким образом, в данном случае система CLV должна дистанционно подавлять экспрессию гена WOX5. Это отличает данную систему от регуляции экспрессии гена WOX в ПАМ, где компоненты системы CLAVATA и ее мишень – ген WUS – экспрессируются в одной ткани. Вместе с этим известно, что лигандом CLAVATA в ПАМ является CLE пептид. У бобовых растений также был обнаружен специфичный для клубенькообразования CLE-пептид, регулирующий развитие клубеньков, который экспрессируется в меристеме клубенька (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010). Было высказано предположение о том, Кол-во клубеньков что такой CLE-пептид, специфично образующийся в клубеньках, способен транспортироваться в побег и связываться со своим предполагаемым рецептором – компонентом CLV-подобной системы (Okamoto et al. 2009).

В нашей работе была исследована взаимосвязь между действием CLE-пептидов, клубенькообразованием и GUS-OE CLE-OE GUS-OE CLE-OE экспрессией WOX5. В частности, Frisson Rondo было изучено влияние Рисунок 8. Влияние сверхэкспрессии гена MtCLE сверхэкспрессии гена, на количество образующихся клубеньков (CLE-OE - сверхэкспрессия гена MtCLE13, GUS-OE - кодирующего специфичный на сверхэкспрессия гена бета-глюкоронидазы, контроль) клубенькообразования CLE пептид (MtCLE13), на Представлены средние значения ± 95% ДИ.

проявление суперклубенькообразующего фенотипа у мутантов гороха. У растений дикого типа Rondo и Frisson, трансформированных конструкциями CLE-OE или GUS-OE (контроль), проводили подсчет количества клубеньков на растение (рис. 8).

MtCLE13, Сверхэкспрессия гена кодирующего специфичный для клубенькообразования CLE-пептид, приводит к системному подавлению клубенькообразования у растений дикого типа (Frisson и Rondo). Таким образом, продемонстрировано, что ген люцерны MtCLE13 функционирует в геноме близкородственного вида, гороха посевного, и оказывает влияние на процесс клубенькообразования у гороха.

Как известно по литературным данным, аналогичный эффект на процесс клубенькообразования у дикого типа оказывала сверхэкспрессия CLE-пептида у люцерны (MtCLE13) и лядвенца (LjCLE-RS1, LjCLE-RS2) (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010).

Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на фенотип суперклубенькообразующих мутантов гороха с нарушением побеговой системы авторегуляции P88 (sym 29) и P64 (sym 28) и с нарушением корневой системы авторегуляции P79 (nod3) Был проведен анализ влияния сверхэкспрессии MtCLE13 на фенотип суперклубенькообразующих мутантов гороха sym29 и sym28. Мутант sym29 имеет нарушения в CLV1-подобном гене. Как предполагается в литературе на основании фенотипа мутанта sym28, в частности, наличия фасциаций стебля (Sagan and Duc, 1996), мутант sym28 также содержит мутацию в CLV-подобном гене, возможно, кодирующем CLV2-подобную киназу (Li et al., 2009). На основании результатов экспериментов с прививками известно, что мутант sym28 характеризуется нарушениями в побеговой системе авторегуляции (Sagan and Duc, 1996). Можно предположить, что продукт гена PsSYM28 (предположительно, CLV2-подобный белок) функционирует в побеге совместно с CLV1-подобной киназой, кодируемой геном PsSym29, формируя CLV1/CLV2-подобный комплекс, по аналогии с комплексом CLV1/CLV2 в меристеме побега.

Если предположение о том, что CLE-пептид способен передвигаться в побег и взаимодействовать с CLAVATA-подобным рецепторным комплексом в побеге верно, то у мутантов с нарушением побеговой системы CLAVATA должна быть нарушена рецепция CLE – и следовательно, у таких мутантов сверхэкспрессия CLE (при которой CLE-пептид экспрессируется не только в клубеньках, но и в побеге) не должна оказывать ингибирующий эффект на клубенькообразование. Действительно, в отличие от растений дикого типа, сверхэкспрессия MtCLE13 (CLE-OE) не оказывала никакого эффекта на клубенькообразование у суперклубенькообразующих мутантов гороха. Корни трансформированных растений характеризовались суперклубенькообразующим фенотипом как в контрольном варианте (GUS-OE), так и при сверхэкспрессии MtCLE13 (CLE-OE). Как показано на рис. 9, при сверхэкспрессии MtCLE13 трансгенные корни мутантов гороха sym29 и sym28, содержащих конструкцию CLE-OE (о чем свидетельствует свечение репортерного белка GFP (рис. 9: A2,B2), сохраняют суперклубенькообразующий фенотип. У суперклубенькообразующих мутантов гороха sym29 и sym28 сверхэкспрессия специфичного для клубенькообразования CLE-пептида не приводила к изменению суперклубенькообразующего фенотипа. Отсутствие подавления клубенькообразования у мутантов sym28 и sym29 при сверхэкспрессии CLE подтверждает предположение о том, что CLV-система побега может участвовать либо непосредственно в рецепции CLE-пептида, либо в восприятии сигнала от CLE пептида для подавления клубенькообразования.

MtCLE Данные об отсутствии влияния сверхэкспрессии на суперклубенькообразующий фенотип мутанта sym29, несущего мутацию в CLV1 подобном гене, согласуются с известными ранее в литературе данными, полученными для мутантов лядвенца и люцерны, несущих мутации в ортологичных генах (LjHAR1, MtSUNN, соответственно) (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010). Это подтверждает наличие сходных механизмов авторегуляции клубенькообразования с участием CLE-пептидов у различных видов бобовых растений.

Особый интерес представляло изучение влияние сверхэкспрессии MtCLE13 на фенотип мутанта nod3 – у которого сохраняется функционирующая CLAVATA-подобная система в побеге – но нарушен корневой компонент Рисунок 9. Суперклубенькообразующий авторегуляции. Как показано на рис. фенотип трансгенных корней мутантов С1,С2, при сверхэкспрессии MtCLE sym 29 (A1, A2), sym 28 (B1, B2) и nod3 nod3, трансгенные корни мутанта (С1, С2) со сверхэкспрессией MtCLE13 содержащие конструкцию CLE-OE (CLE-OE). (подтверждением трансгенности корней является свечение репортерного белка GFP (рис. 9, С2)) сохраняют суперклубенькообразующий фенотип. Таким образом, ингибирующий сигнал от CLE пептида не оказывает действия на процесс клубенькообразования у мутанта nod3.

В связи с тем, что у мутанта nod3 нарушена корневая система авторегуляции, мы предположили, что нарушения в системе авторегуляции могут происходить на этапе: 1) восприятия сигнала от CLE-пептида на уровне корня, в случае если CLE пептид клубеньков не передвигается в побег, а взаимодействует с рецепторной системой (CLV-подобной), функционирующей в корне – одним из компонентов которой может являться продукт гена PsNOD3;

либо 2) передачи сигнала от CLE пептидов из клубеньков в побег, в случае, если CLE-пептид сам непосредственно не является лигандом CLV-подобного рецепторного комплекса в побеге (компонентом которого является CLV1-подобная киназа MtSUNN/PsSym29), Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на экспрессию гена WOX5 у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn- Нами было выявлено, что CLE-пептид подавляет клубенькообразование, и для его действия необходимы две системы – 1) CLV-подобная система- компонент побеговой системы авторегуляции, и 2) корневая система авторегуляции. Остается нерешенным вопрос – действует ли CLE-пептид на экспрессию гена WOX5 при клубенькообразовании?

Для изучения влияния CLE-пептида на Относит. ед.

экспрессию гена WOX5 был проведен анализ экспрессии гена WOX5 в трансгенных корнях MtCLE13.

люцерны со сверхэкспрессией Поскольку у растений люцерны дикого типа сверхэкспрессия MtCLE13 полностью подавляла процесс клубенькообразования, мы не смогли проверить эффект сверхэкспрессии MtCLE13 на экспрессию WOX5 при клубенькообразовании с использованием растений дикого типа. Напротив, у мутанта sunn-3 на трансгенных корнях со GUS-OE CLE-OE сверхэкспрессией MtCLE13 клубенькообразование Рисунок 10. Экспрессия гена не подавлялось, поэтому анализ влияния CLE WOX MtWOX5 у мутанта sunn-3 при пептидов на экспрессию при сверхэкспрессии гена MtCLE13 клубенькообразовании проводили с (CLE-OE) и гена GUS (GUS-OE – использованием этих мутантов. Кроме того, контроль) на 5 дпи изучение влияния сверхэкспрессии MtCLE13 на экспрессию WOX5 у мутанта, содержащего мутацию в CLV1-подобном гене, позволяет понять, необходима ли функционирующая CLV-подобная система для регуляции экспрессии WOX5 с участием CLE-пептида. С этой целью было изучено влияние сверхэкспрессии гена MtCLE13 (35S::MtCLE13) на экспрессию гена WOX5 у мутанта sunn-3. Для этого с помощью штамма A. rhizogenes Arqua, несущего конструкцию 35S::MtCLE13, трансформировали растения sunn-3. В качестве контроля проводили также трансформацию растений конструкцией GUS-OE.

Наличие сверхэкспрессии MtCLE13 в трансгенных корнях, содержащих конструкцию 35S::MtCLE13, было подтверждено с помощью количественного анализа экспрессии.

У мутанта sunn-3 в трансгенных корнях со сверхэкспрессией MtCLE13 мы наблюдали снижение экспрессии WOX5 в 3,25 раза, по сравнению с контролем (GUS-OE) (см.

рис. 10). Таким образом, у мутанта sunn-3, имеющего нарушения в CLAVATA комплексе побега, но у которого при этом сохраняется нормально функционирующая корневая система авторегуляции, происходит частичное подавление экспрессии гена MtWOX5. Этот факт свидетельствует о том, что помимо CLV-подобной системы, функционирующей в побеге, которая нарушена у мутанта sunn-3, в восприятии сигнала от CLE-пептида задействованы другие рецепторные системы. Мы предполагаем, что такой рецепторной системой, участвующей в восприятии CLE пептида, может быть другая CLAVATA-рецепторная система, функционирующая в корнях растений.

Таким образом, в совокупности, наши эксперименты подтверждают участие двух систем - CLV-подобной побеговой системы и корневой - в регуляции клубенькообразования, восприятии сигнала от CLE-пептида и подавлении экспрессии WOX5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ WOX Выявленные особенности регуляции экспрессии при клубенькообразовании указывают на существование общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток с участием генов WOX в апикальных меристемах и при развитии специализированного органа – клубенька бобовых растений. Экспрессия гена WOX5 при клубенькообразовании также регулируется CLAVATA-подобной системой и CLE-пептидом, аналогично гомологу гена WOX5– гену WUS, работающему в побеге. Однако особенность регуляции экспрессии гена WOX5 при клубенькообразовании заключается в том, что она осуществляется как системно, так и локально с участием двух систем: побеговой (CLV-подобная система, функционирующая в побеге) и корневой системы авторегуляции.

ВЫВОДЫ Впервые выявлен ген WOX5 у гороха Pisum sativum L. Показано, что ген 1.

PsWOX5 вовлечен в контроль развития клубенька бобовых растений, что установлено на основании анализа динамики его экспрессии при клубенькообразовании и экспериментов по РНК-интерференции.

Экспрессия гена WOX5 регулируется CLV-подобной системой при 2.

клубенькообразовании как системно (регулируется число сайтов в тканях корня, в которых активируется экспрессия гена WOX5), так и локально (в переделах отдельного развивающегося клубенька).

Формирование клубеньков у гороха P. sativum регулируется с участием CLE 3.

пептида, при этом для проявления ингибирующего действия CLE-пептида на клубенькообразование необходимы как побеговая система авторегуляции, компоненты которой кодируются генами PsSYM29 (CLV1-подобный рецептор) и PsSYM28, так и корневая система авторегуляции, компонентом которой является продукт гена PsNOD3.

Анализ действия CLE-пептида у близкородственного вида Medicago truncatula 4.

показал, что экспрессия гена WOX5 при клубенькообразовании также регулируется с участием двух систем авторегуляции – побеговой, компонентом которой является CLV1-подобный рецептор, кодируемый геном M. truncatula SUNN, и корневой.

Выявленные особенности регуляции экспрессии гена WOX5 при 5.

клубенькообразовании указывают на существование общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток с участием генов WOX в апикальных меристемах и при развитии специализированного органа – клубенька бобовых растений.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи:

1. Л. А. Лутова, Е. А. Долгих, И.Е. Додуева, М. А. Осипова, Е. Л. Ильина. Изучение системного контроля деления и дифференцировки клеток растений на примере опухолевого роста у редиса // Генетика. 2008. Т. 44, N 8. С. 1075-1083.

2. Осипова М.А., Долгих Е.А., Лутова Л.А. Роль транскрипционных факторов WOX и KNOX в развитии растений и опухолеобразовании // Экологическая генетика, 2006, Т.IV, Вып. 4. стр. 3- 3. Dolgikh E.A., Leppyanen I.V., Osipova M.A., Tikhonovich I.A. Role of signal exchange in control of Rhizobium - legume symbiosis specificity. Ecological genetics. 2008. V. 6, N 2. P. 27-34.

Тезисы конференций:

1. Osipova M.A., Lutova L.A. and Dolgikh E.A. Role of WOX5 gene in nodule organogenesis. 9-th European Nitrogen Fixation Conference. Geneva, Switzerland.

September 6 -10, 2010. P.103.

2. Осипова М.А. Изучение роли меристем-специфичных генов в регуляции клеточных делений в норме и при аномалиях развития. Сборник материалов XIV Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов. Санкт-Петербург, 2009. С.76.

3. Осипова М.А., Долгих Е.А., Лутова Л.А. Гены, контролирующие развитие клубенька гороха // Сборник материалов V Съезда ВОГИС. 21-28 июня, 2009. Ч.1. С.

152.

4. Osipova M.A., Lutova L.A. and Dolgikh E.A. Genes Working out an approach to study factors involved in nodule meristem regulation // AB-RMS Conference. 2008. November - December 5. P. 15.

5. Leppyanen I.V., Osipova M.A., Lutova L.A., Dolgikh E.A. Genes involved in nodule meristem formation. 8-th European Nitrogen Fixation Conference. Gent, Belgium. August 30 - September 3, 2008. P. 170.

6. Осипова М.А., Долгих Е.А., Лутова Л.А. Меристем-специфичные гены в развитии клубенька гороха. Сборник материалов конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XX1 века". Петрозаводск, Россия. 23- сентября, 2008. Ч. 1. С. 288-289.