Молекулярно-цитогенетическое изучение половых хромосом у видов humulus lupulus и humulus japonicus.
На правах рукописи
АЛЕКСАНДРОВ Олег Сергеевич МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ У ВИДОВ HUMULUS LUPULUS И HUMULUS JAPONICUS.
Специальность: 03.02.07 – генетика, 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2010
Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева Научные руководители:
Кандидат биологических наук Г.И. Карлов Кандидат биологических наук М.Г. Дивашук
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук Т.А. Ежова Кандидат биологических наук В.В. Соболев
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН
Защита состоится «23» декабря 2010 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 49.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан «22» ноября 2010 г. и размещён на сайте университета www.timacad.ru Учёный секретарь Диссертационного совета Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Изучение генетических систем детерминации пола у живых организмов пользуется широким интересом как область научного познания (Charlesworth et al., 2005;
Ezaz et al., 2006;
Smith & Voss, 2007;
Jamilena et al., 2008). Часто в качестве объектов таких исследований используют животных, однако, многие факты эволюции систем половых хромосом были установлены благодаря изучению раздельнополых растений.
Одними из популярных растительных объектов с половыми хромосомами являются представители рода Humulus – хмель обыкновенный, используемый человеком в пивоваренной, лекарственной, косметической промышленности, и декоративный хмель японский. Согласно схеме, предложенной Ming et al.
(2007), половые хромосомы видов рода Humulus находятся на поздней стадии эволюции половых систем и являются хорошими моделями для изучения этой стадии. Применение современных информативных методов молекулярной биотехнологии и цитогенетики на слабо исследованных в данном плане геномах растений рода Humulus способно внести значительный вклад в теоретическое понимание феномена пола у растений.
Кроме большого теоретического интереса работа по выявлению молекулярных и цитогенетических особенностей хромосом хмеля, как, в частности, маркирование половых хромосом, является актуальной и для селекционной практики. Типовое кариотипирование нормальных растений хмеля с использованием цитогенетических маркеров на половые хромосомы даёт возможность осуществления контроля хромосомного состава полиплоидов и анеуплоидов, а также растений с нарушениями нормального проявления пола.
К тому же в связи с трудностью определения пола на ранних стадиях развития растений широкое распространение получило применение полоспецифичных молекулярных маркеров, разработка которых напрямую связана с изучением полоспецифичных регионов половых хромосом. В случае с представителями рода Humulus, особенно с хмелем японским, данное направление разработано слабо.
Характеристика геномов видов хмеля, основанная на молекулярно цитогенетических аспектах пола, а также создание эффективных полоспецифичных цитогенетических и молекулярных маркеров позволит существенно расширить представление биологической науки об эволюции половых хромосом.
Цель и задачи работы. Провести молекулярно-цитогенетическое изучение половых хромосом у видов Humulus lupulus и Humulus japonicus.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Клонировать высококопийные повторяющиеся последовательности геномов хмеля обыкновенного и хмеля японского;
2. Изучить клонированные последовательности c помощью методов биоинформатики;
3. Изучить организацию выделенных последовательностей в геномах хмеля обыкновенного и хмеля японского;
4. Изучить локализацию найденных последовательностей на хромосомах соответствующих видов хмеля;
5. Провести кариотипирование и идентификацию половых хромосом.
Выявить локализацию псевдоаутосомного региона на половых хромосомах.
6. Выявить нуклеотидные последовательности, специфичные для Y хромосом изучаемых видов хмеля.
Научная новизна. Результаты по молекулярно-цитогенетическому маркированию половых хромосом H. lupulus и H. japonicus с помощью высококопийных последовательностей, специфических для соответствующих геномов, являются оригинальными и обладают научной новизной. Впервые выделены маркерные последовательности хмеля, с помощью которых возможна дифференциация половых хромосом. Впервые показано присутствие субтеломерных повторов в прицентромерном районе короткого плеча Х хромосомы хмеля обыкновенного. Впервые использовано маркирование на основе повторяющихся последовательностей при изучении хромосом хмеля в мейозе. Впервые разработан эффективный цитогенетический маркер для чёткого отличия половых хромосом хмеля японского друг от друга.
Разработан эффективный полоспецифичный ISSR-маркер для хмеля японского и расширен сиквенс Y-хромосомспецифичной области хмеля обыкновенного AJ831218.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Научное наследие Н.И.
Вавилова – фундамент отечественного и мирового сельского хозяйства», Москва (2007), Съезде генетиков и селекционеров, посвящённом 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2009), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в развитие инноваций аграрной науки», Москва (2009), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию Академии имени К.А.Тимирязева, Москва (2010), Международной научной конференции «Современная биотехнология сельскохозяйственных растений и биобезопасность», Одесса (2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на _ страницах машинописного текста и включают рисунок. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список цитируемой литературы включает наименований, из них иностранных.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В работе использовали следующий растительный материал: мужские и женские растения хмеля обыкновенного местных популяций (г. Москва) и культурных сортов, предоставленных ВНИПТИХ (г. Цивильск, Чувашия);
мужские и женские растения хмеля японского сорта Самурай и сорта фирмы Флос.
Выделение ДНК. Выделение ДНК производили из молодых листьев растений согласно методике Bernatsky, Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.
Рестрикицонный анализ. Выделение высококопийных последовательностей генома осуществляли путём проведения рестрикционного анализа тотальной ДНК с рядом эндонуклеаз рестрикции: AluI, DraI, EcoRI, Hin6I, HincII, HindIII, KpnI, NotI, PstI, XmiI, BcI, HaeIII, Vha464I, BamHI, NcoI, TaqI. Условия реакции соответствовали требованиям для оптимальной работы каждой из рестриктаз. Электрофоретическое разделение продуктов осуществляли в 0,7%-ном агарозном геле при напряжении 3 В/см в течение 5 ч.
Изучение высококопийных последовательнотей ПЦР-анализ.
осуществляли с использованием оригинальных разработанных праймеров.
Разработку полоспецифичного ДНК-маркера для хмеля японского проводили путём эмпирического подбора RAPD- и ISSR-праймеров с использованием в качестве матрицы для ПЦР смеси ДНК отдельно мужских и женских образцов с последующим индивидуальным анализом мужских и женских растений в случае выявления полиморфизма.
AL-PCR. Расширение Y-хромосомспецифичного участка хмеля обыкновенного проводили с использованием техники ПЦР с лигированным адаптором или AL-PCR (adaptor ligation PCR), согласно предложенному алгоритму (Zhang et al., 2001).
Клонирование фрагментов ДНК. Клонирование продуктов рестрикции и ПЦР осуществляли с помощью векторной системы pUC19 и набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, U.S.A.) в соответствии с инструкцией фирмы производителя.
Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программного обеспечения GenDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002.
Copyright © by K. Nicholas);
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0.;
Lasergene ver.7.1, Comprehensive Software for DNA & Protein Sequence Analysis. Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытой базе генетических данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Локализацию высококопийных рестрикционных фрагментов на хромосомах осуществляли согласно методике проведения FISH, оптимизированной для хмеля, по Karlov et al. (2003).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Изучение сателлитной ДНК растений рода Humulus.
1.1 Выделение высококопийных последовательностей у растений рода Humulus. Одним из распространённых направлений геномных исследований на начальных этапах является изучение повторяющей ДНК. Среди способов выделения специфических единиц повторов часто применяется расщепление тотальной ДНК с помощью ферментов рестрикции.
А) Б) Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения продуктов рестрикции тотальной ДНК: А) – хмеля обыкновенного (М – мужское растение, Ж – женское растение, – AluI, 2 – DraI, 3 – EcoR, 4 – Hin6I, 5 – HincII, 6 – HindIII, 7 – KpnI, 8 - NotI, 9 – PstI, 10 – XmiI), Б) – хмеля японского (1 – HindII, 2 – XbaI, 3 – PsiI, 4 – KpnI, 5 – FaeI, 6 – Sse9 I, 7 – FblI). Стрелками указаны бэнды KpnI-фрагментов.
В анализе ДНК хмеля обыкновенного использовались эндонуклеазы рестрикции AluI, DraI, EcoRI, Hin6I, HincII, HindIII, KpnI, NotI, PstI, XmiI, BcI, HaeIII, Vha464I, BamHI, NcoI, TaqI. В анализе ДНК хмеля японского – HindII, XbaI, PsiI, KpnI, FaeI, Sse9I, FblI. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции в агарозном геле показало наличие бэндов в случае расщепления рестриктазами EcoRI, KpnI, HaeIII и TaqI, но наиболее отчётливые бэнды, соответствующие размеру около 380 п.о., наблюдались в варианте с KpnI (рис.1).
Вырезанные из геля KpnI-фрагменты обоих видов хмеля были клонированы в векторе pUC19 и секвенированы, что позволило уточнить их размеры (KpnI-фрагмент H. lupulus GU831574 – 384 п.о., H. japonicus GU – 380 п.о.) и провести сравнительный анализ их внутренней структуры.
Как показало выравнивание с помощью программы GenDoc, для исследуемых сиквенсов характерно наличие нескольких общих блоков различной протяжённости, среди которых преобладают АТ-богатые участки (105 – 110;
152 – 157;
166 – 170;
287 – 302). Наиболее протяжёнными общими блоками являются участки 244 – 256 (13 п.о.), 287 – 302 (16 п.о.) и 389 – 6 ( п.о.). В качестве существенной особенности также стоит отметить присутствие 6-нуклеотидной делеции (135 – 141) у KpnI-фрагмента хмеля японского (рис.2).
Сопоставление сиквенсов изучаемых KpnI-фрагментов с помощью BLAST показало Max score = 55.4 при идентичности наиболее схожего участка 73%.
Рис. 2. Сравнение сиквенсов KpnI-фрагментов H. lupulus и H. japonicus с помощью программы GenDoc.
Проведённый BLAST-анализ с помощью www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST не выявил достаточно высокого уровня гомологии GU831573 и GU831574 с известными последовательностями других организмов. Было отмечено лишь некоторое сходство небольших участков GU831574 с фрагментом локуса СТ009625.1 Aegilops taushii (Total score = 48,2) и GU831573 с локусом АС214096.1 Populus trichocarpa (Total score = 50,0).
1.2. Дизайн праймеров на основе выделенных высококопийных последовательностей. Изучение инвертированных повторов. Секвенирование выделенных KpnI-фрагментов GU831573 и GU831574 позволило разработать пары праймеров для выделения пула им подобных KpnI-последовательностей.
Продукты ПЦР с каждой пары праймеров показали при электрофоретическом разделении лестницеообразные структуры (рис.3). Это косвенно свидетельствует о том, что амплифицируемые KpnI последовательности представляют собой тандемно повторяющиеся единицы.
Рис. 3. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов: праймер ХО-1 (дорожки 1 – 6);
праймер ХО-2 (дорожки 7 – 12);
праймер ХU (дорожки 13 – 18);
М – маркер молекулярного веса 100 bp.
С целью выявления особенностей организации данных KpnI-повторов в геноме проводили ПЦР только с одним (каждым из трёх пар) праймером. В данном случае удачная амплификация является признаком присутствия инвертированных участков. Для большинства праймеров были получены паттерны бэндов из совокупности фрагментов широко варьирующей длины, что показывает разнообразие вариантов организации инвертированных локусов.
Пул ПЦР-продуктов с каждой пары праймеров и с одиночных праймеров подвергался лигированию с вектором pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, U.S.A.) и клонированию. Анализ сиквенсов клонированных фрагментов позволил установить, что последовательности KpnI-повторов, выделенных для каждого вида хмеля с помощью ПЦР, имеют между собой лишь небольшие нуклеотидные различия. ПЦР-продукты, полученные с единичных праймеров, представляли собой уникальные участки генома с инвертированными последовательностями.
Межповторный Межповторный фрагмент 53 п.о фрагмент 38 п.о.
Порядковые номера нуклеотидов GU 274-384 1-217 270-1 332- Единицы Часть единицы Часть единицы прямого повтора обратного повтора обратного повтора Рис. 4. Схема нуклеотидной организации вставки клона XM-7-18.
Было установлено, что инверсионные события в сателлитной ДНК двух видов хмеля, некоторые результаты которых были проанализированы благодаря ПЦР с единичными праймерами, сопровождались и другими мутационными явлениями, такими, как делеции и инсерции (рис.4).
1.3. Изучение локализации найденных высококопийных последовательностей с помощью FISH. Для определения локализации найденных KpnI-повторов на хромосомах проводили флюоресцентную in situ гибридизацию на препаратах митотических хромосом мужского и женского растений хмеля обыкновенного и хмеля японского с зондами последовательностей ДНК GU831574 и GU831573. Детекция сигналов показала, что данные KpnI-последовательности представляют собой субтеломерные повторы (рис.5).
Рис.5. Метафазная пластинка митотических хромосом мужского и женского растений хмеля обыкновенного с FISH-сигналом высококопийной последовательности GU831574.
При более подробном изучении метафазных пластинок хмеля обыкновенного были обнаружены хромосомы с сигналом KpnI-повтора в прицентромерной области короткого плеча вместо субтеломерного района.
Мужские пластинки несли одну такую хромосому, а женские – две. Этот факт свидетельствует о том, что данная хромосома является Х хромосомой. К тому же мужские пластинки несли ещё и одну непарную хромосому, самую короткую по абсолютному размеру и не имеющую сигнала на одном из концов (Y хромосома).
Анализ мейоза хмеля обыкновенного с помощью FISH подтвердил выводы о расположении сигналов KpnI-повтора GU831574 на половых хромосомах (рис.6).
При рассмотрении открытого бивалента половых хромосом наблюдался сигнал GU831574 в прицентромерной области короткого плеча более длинной хромосомы (Х хромосома), подобно митотическим хромосомам, определённым ранее как Х хромосомы. Концевая хиазма в половом биваленте, как и ожидалось, образуется между длинными плечами Х и Y хромосом, о чём свидетельствует сигнал субтеломерного повотора между ними и отсутствие такового сигнала на противоположном конце Y хромосомы.
Рис. 6. FISH с сигналами высококопийной последовательности GU831574 (зелёный) и 45S рДНК (красный) на мейотических хромосомах хмеля обыкновенного на стадии диакинеза (слева). Открытый половой бивалент с сигналами высококопийной последовательности GU831574 (справа).
На рисунке 6 помимо сигналов субтеломерного повтора (зелёный) также хорошо заметна локализация 45S рДНК в дистальной области хромосомы 6.
Эта хромосома несёт яркий сигнал 45S рДНК, что легко отличает её от других хромосом на стадии диакинеза, а также характеризуется преждевременным исчезновением хиазм у плечей с 45S рДНК и визуализируется как открытый бивалент, напоминающий букву «Y».
Анализ метафазных пластинок хмеля японского выявил различное распределение сигналов KpnI-повтора GU831573 на половых хромосомах, подобно сигналам GU831574 у хмеля обыкновенного (рис.7).
Согласно данным Soo-Young Kim et al. (2008), половые хромосомы хмеля японского – Х, Y1 и Y2 – являются самыми длинными в наборе и трудноотличимы друг от друга в митозе. Изучение метафазных пластинок мужских растений, содержащих все три половые хромосомы, показало, что одна из них имеет сигналы на обоих концах, другая – только на конце одного из плеч, а третья – вовсе не имеет сигналов. Поскольку женские пластинки несли две длинных хромосомы с сигналом только на одном плече, был сделан вывод о том, что это Х хромосомы. Следовательно, оставшиеся хромосомы – с двумя сигналами и без сигналов – являются хромосомами Y1 и Y2. Показанное распределение сигналов KpnI-повтора GU831573 на половых хромосомах хмеля японского теоретически подтверждает выводы о том, что средняя хромосома в половом триваленте – это Х хромосома.
Рис.7. Метафазные пластинки митотических хромосом мужского (слева) и женского растений (справа) хмеля японского с FISH-сигналами высококопийной последовательности GU831573.
FISH, проведённая с зондом KpnI-повтора хмеля обыкновенного GU831574 на препаратах митотических хромосом хмеля японского, не выявила отчётливых сигналов, что свидетельствует о видоспецифичности KpnI-повторов изучаемых видов хмеля несмотря на существование общих консервативных блоков. Это даёт основание говорить о том, что выделенные KpnI-повторы являются эффективными цитогенетическими маркерами на хромосомы соответствующих видов хмеля, с помощью которых возможна идентификация половых хромосом.
1.4. Кариотипирование. На основании анализа метафазных пластинок было произведено кариотипирование хмеля обыкновенного (рис.8) и хмеля японского (рис.9) с флюоресцентными сигналами соответствующих KpnI повторов.
Изучение кариотипов хмеля обыкновенного показало, что первые три пары хромосом как женского, так и мужского растений легко отличаются по абсолютному размеру от остальных и являются метацентрическими. Сигналы высококопийной последовательности, локализованые в субтеломерных районах обоих плеч этих хромосом, примерно одинаковы по интенсивности, за исключением сигнала на коротком плече хромосомы 2. Хромосомы 4, 5, 7 и тоже являются метацентрическими и несут практически не отличающиеся по интенсивности сигналы, отличаясь друг от друга только абсолютным размером.
Хромосомы 6 и 8 – субметацентрические, причём хромосома 6 имеет сигнал субтеломерного повтора только на длинном плече. Именно у этой хромосомы было выявлено наличие более тёмных бэндов в субтеломерном регионе короткого плеча при контрокрашивании пропидий-йодидом в процессе FISH.
Это связано с локализации в данном регионе повторов 45S рДНК (Karlov et al., 2003).
Рис. 8. Кариотипы мужского (вверху) и женского (внизу) растений хмеля обыкновенного.
Х хромосома является, как и большинство аутосом, метацентрической, но чётко отличается от них наличием сигнала не в субтеломерном районе короткого плеча, а прицентромерной области. Такое расположение сигналов совпадает с расположением DAPI-бэндов, показанным Karlov et al. (2003). Y хромосома – самая маленькая по абсолютному размеру хромосома мужского кариотипа хмеля. Она несёт только один сигнал в дистальной части длинного плеча, что является чётким цитогенетическим маркером, облегчающим её выявление на препаратах.
Анализ кариотипов хмеля японского показал, что кариотип мужских растений данного вида состоит из 17 хромосом и включает 5 метацентрических (пара 3 и хромосомы X, Y1, Y2), 3 пары субметацентрических (пары 1, 2 и 4) и пары акроцентрических хромосом (пары 5, 6 и 7). Выявленная структура кариотипа вполне согласовывается с данными, полученными при кариотипировании хромосом хмеля японского с зондами повторов 5S и 45S (Soo-Young Kim et al., 2008).
Локализация гибридизационной пробы КpnI-повтора GU831573 на большинстве хромосом была представлена субтеломерным расположением сигналов в дистальных районах обоих плеч, кроме пар хромосом 6, 7, а также Х и Y2. Хромосомы 7 и Y2 вовсе не несут сигналов данной пробы. Х хромосома несёт один сигнал в дистальном районе длинного плеча, а у хромосомы 6, по наличию сигнала в дистальном районе короткого плеча наблюдается полиморфизм. Вероятно, данный полиморфизм связан с произошедшей когда то негомологичной рекомбинацией, подобно случаю, описанному Kihara (1929), когда наблюдалось образование цепочки из 3 половых хромосом и пары аутосом.
Половые хромосомы четко отличаются друг от друга по распределению сигналов КpnI-повтора GU831573. Х хромосома несёт сигнал данного повтора только на длинном плече, Y1 – на обоих плечах, а Y2. – совсем не несёт сигнала, как и было предварительно отмечено при анализе метафазных пластинок.
Рис. 9. Кариотипы и идиограммы мужского (а, в) и женского (б, г) растений хмеля японского с FISH-сигналами повтора GU831573. Сверху указаны центромерные индексы.
2. Анализ последовательностей ДНК хмеля обыкновенного и хмеля японского, связанных с полом.
2.1. Расширение полоспецифичной области у хмеля обыкновенного.
Поиск полоспецифичных участков генома хмеля обыкновенного стал весьма актуальной задачей в связи потребностью селекционной практики в молекулярных маркерах, связанных с полом для быстрого скрининга растений на ранних стадиях развития. Эффективные полоспецифичные молекулярные маркеры для определённых групп сортов были созданы Polley et al. (1997), Patzak et al. (2002), Danilova & Karlov (2006). Однако полоспецифичные регионы представляют также интерес для изучения теоретических основ проявления пола. Секвенирование большого количества полоспецифичных участков необходимо для выявления консервативных последовательностей, связанных с полом и установления принципов организации связанной с полом ДНК.
Эффективное решение вопроса по выявлению новых полоспецифичных регионов на хмеле обыкновенном было осуществлено с помощью метода ПЦР с лигированным адаптором или AL-PCR (adaptor ligation PCR) при использовании в качестве якорной последовательности фрагмента AJ831218 – одного из Y-хромосомспецифичных маркерных локусов. После расщепления тотальной ДНК с помощью рестриктазы BstFnI было произведено лигирование рестрикционных фрагментов с адаптором, согласно Zheng et al. (2001), и проведена ПЦР по типовой схеме (рис.10).
Рис. 10. Схема проведения AL-PCR. А – амплификация неизвестной последовательности между правой фланкирующей областью известного сиквенса и адаптором поэтапно с внешних (RB1 и AP1) и внутренних (RB2 и AP2) праймеров. В амплификация неизвестной последовательности между левой фланкирующей областью известного сиквенса и адаптором поэтапно с внешних (LB1 и AP1) и внутренних (LB2 и AP12) праймеров (по Zhang et al., 2001).
Полученные в результате AL-PCR продукты были клонированы и секвенированы. Контроль достоверности того, что полученные сиквенсы включают фланкирующие последовательности локуса AJ831218, осуществлялся с помощью сравнения в программе GenDoc. После обрезания соответствующих фланкирующих AJ831218 последовательностей было установлено, что сиквенс данного локуса был расширен на 264 п.о. в сторону 5’-конца и на 102 п.о. – в сторону 3’-конца.
BLAST-анализ с помощью www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST показал гомологию области 5’-конца расширенного сиквенса к микросателлитному локусу хмеля обыкновенного AY588386 и к участку полоспецифичной последовательности хмеля японского EU882086, что свидетельствует о существовании консервативных блоков в полоспецифичных последовательностях хмеля обыкновенного и хмеля японского.
2.2. Разработка полоспецифичных молекулярных маркеров на хмеле японском. Крайне слабая изученность генома хмеля японского в молекулярном плане создаёт значительные трудности при изучении механизмов детерминации пола. Так как характеристика связанных с полом участков для слабо изученных геномов с половыми хромосомами является одной из приоритетных задач, были проведёны RAPD- и ISSR-анализ параллельно в мужской и женской части популяции хмеля японского. На первом этапе в качестве ДНК-матрицы для ПЦР использовалась смесь ДНК всех мужских растений и смесь ДНК всех женских растений популяции. RAPD- и ISSR-праймеры, по которым был выявлен полиморфизм, использовали в дальнейшем для анализа индивидуальных растений, чтобы подтвердить связь полиморфных элементов электрофоретического профиля с полом.
Рис. 11. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов с ISSR-праймера К-16 у мужских (М) и женских (Ж) образцов хмеля японского. Стрелкой указан бэнд полоспецифичных фрагментов.
Таким образом, из 52 изучаемых молекулярных маркеров было отобрано 7 маркеров, по которым был выявлен полиморфизм. Анализ индвидуальных растений подтвердил высокую эффективность в качестве полоспецифичного только одного ISSR-маркера – К-16. Он показывал стабильную амплификацию бэнда около 300 п.о. у всех мужских образцов по отдельности и отсутствие данного бэнда у всех женских образцов (рис.11).
ВЫВОДЫ.
1. Клонированы новые высококопийные повторяющиеся последовательности: KpnI-повторы хмеля обыкновенного GU831574 длиной 384 п.о. и хмеля японского GU831573 длиной 380 п.о. BLAST-анализ показал, что они не имеют значительного сходства с известными сиквенсами других организмов, однако при сравнении их между собой выявляется несколько небольших консервативных блоков, что косвенно свидетельствует об их общем происхождении.
2. С помощью флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) показана субтеломерная локализация выделенных KpnI-повторов на хромосомах соответствующих видов хмеля. Крис-кросс гибридизация не выявила подобных сигналов, то подтверждает видоспецифичность данных KpnI-повторов.
3. Результаты ПЦР-анализа и секвенирования свидетельствуют о тандемной организации выделенных KpnI-фрагментов в блоках сателлитной ДНК (сатДНК) у изучаемых видов хмеля. Однако встречаются и участки сатДНК, включающие инвертированные единицы KpnI-повторов или части таких единиц и имеющие вставки длиной 38-53 п.о., что указывает на эволюционную пластичность изучаемых повторов.
4. Показана специфическая локализация KpnI-повторов на половых хромосомах, что позволяет использовать их как эффективные цитогенетические маркеры при идентификации половых хромосом. Х хромосома хмеля обыкновенного имеет характерный прицетромерный сигнал KpnI-повтора на коротком плече, а Y хромосома имеет сигнал только на конце длинного плеча.
Х хромосома хмеля японского имеет сигнал KpnI-повтора только на одном из плеч, Y1 – на обоих плечах, а Y2 – не имеет сигналов. Данные факты свидетельствуют об активном участии сатДНК субтеломер в эволюции половых хромосом.
5. С помощью цитогенетического маркирования на основе KpnI повтора GU831574 показана ориентация плеч половых хромосом хмеля обыкновенного в биваленте на стадии диакинеза и определено, что псевдоаутосомный регион расположен в терминальной области длинных плеч Х и Y хромосом и включает мощный субтеломерный блок GU831574.
6. С помощью AL-PCR (adaptor ligation PCR) расширен сиквенс Y хромосомспецифического локуса AJ831218 хмеля обыкновенного на 264 п.о. в сторону 5’-конца и на 102 п.о. – в сторону 3’-конца. BLAST-анализ показал гомологию области 5’-конца расширенного сиквенса к микросателлитному локусу хмеля обыкновенного AY588386 и к участку полоспецифичной последовательности хмеля японского EU882086, что свидетельствует о существовании консервативных блоков в полоспецифичных последовательностях хмеля обыкновенного и хмеля японского.
7. Скрининг молекулярных маркеров (25 ISSR- и 27 RAPD-маркеров) позволил выявить полоспецифичный ISSR-маркер (К-16) на хмеле японском (длина маркерного бэнда у мужских образцов составила 300 п.о.). Полученные данные подтверждают высокую эффективность применения ISSR для поиска полоспецифичных участков, формирование которых связано с накоплением и распределением повторяющейся ДНК.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.
1. Дивашук М.Г., Александров О.С., Карлов Г.И. Клонирование и анализ субтеломерного повтора ДНК хмеля (Humulus lupulus). // Материалы международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова – фундамент отечественного и мирового сельского хозяйства», 27-28 ноября 2007. М.:
ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева.– 2007, С. 163 – 164.
2. Дивашук М.Г., Александров О.С., Карлов Г.И., Клонирование субтеломерной повторяющейся ДНК и её использование для идентификации половых хромосом хмеля обыкновенного и хмеля японского. // Съезд генетиков и селекционеров, посвящённый 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва. – 2009 – Часть I, С. 219.
3. Александров О.С., Дивашук М.Г. Карлов Г.И. Изучение субтеломерных повторов растений рода Humulus. // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в развитие инноваций аграрной науки». Сборник статей. РГАУ-МСХА им. К.А.
Тимирязева, 23-24 апреля 2009 – С. 5-8.
4. Александров О.С. Цитогенетическое маркирование половых хромосом хмеля японского (Humulus japonicus Sieboid & Zucc). // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 145-летию Академии имени К.А.Тимирязева, 1-2 июня 2010 – Т.1.– С. 3-5.
5. Александров О.С., Дивашук М.Г., Фесенко И.А., Карлов Г.И.
Клонирование прилегающих регионов Y-хромосомспецифичной последовательности ДНК хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.). // Известия ТСХА, вып.3, 2010 – С. 5-11.