Изучение сферических частиц, образующихся при термической перестройке вируса табачной мозаики, и области их применения
На правах рукописи
ТРИФОНОВА Екатерина Алексеевна ИЗУЧЕНИЕ СФЕРИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ, ОБРАЗУЮЩИХСЯ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОЙ ПЕРЕСТРОЙКЕ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ, И ОБЛАСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ 03.02.02 - Вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Карпова Ольга Вячеславовна
Официальные оппоненты:
Долгих Дмитрий Александрович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им.
академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, руководитель лаборатория биоинженерии белка.
Эльдаров Михаил Анатольевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» РАН, руководитель группы гетерологичной экспрессии.
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена РАН.
Защита состоится 23 мая 2013 г. в 11.00 часов на заседании Совета Д.501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет, ауд. 389.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).
Автореферат разослан « » апреля 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук: Крашенинников И.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Изучение структуры вирионов фитовирусов и вирусных белков оболочки, а также возможностей их модификации и структурной перестройки является важной задачей современной молекулярной вирусологии. Структурная модификация частиц вирусов растений может быть не только направлением защиты сельскохозяйственных растений, но также открывает возможности создания новых биотехнологий в медицине и ветеринарии.
Вирусы и вирусоподобные частицы (макромолекулярные структуры белка оболочки вируса, не содержащие геном) широко применяют для разработки новых подходов в создании вакцин и бионеорганических комплексов, а также в адресной доставке целевых веществ и в биоконтрастировании. При этом вирусы растений обладают безусловным преимуществом при получении новых функциональных и биологически активных материалов, в частности кандидатных вакцин, так как они не патогенны для млекопитающих, в том числе для человека. Большинство современных вакцин создаются на основе ослабленных и инактивированных форм инфекционных агентов. Живые вакцины обладают высокой протективной активностью, однако при этом остается возможность их реверсии к патогенной форме. Инактивированные вакцины значительно безопаснее, но для индукции эффективного иммунного ответа требуется несколько актов ревакцинации (Jennings and Bachman, 2008). Субъединичные вакцины, основанные на индивидуальных пептидах и белках инфекционного агента, более безопасны, но существует проблема их низкой иммуногенности. Связывание антигенов патогенов с высокомолекулярным носителем (платформой) может существенно повысить иммунный ответ и обеспечить защиту организма от инфекции (Lico et al., 2008).
Настоящая работа посвящена изучению структуры и свойств сферических частиц, образующихся при термической перестройке вируса табачной мозаики и его белка оболочки, и исследованию возможности их применения в качестве платформы для презентации биологически активных молекул, в частности антигенов инфекционных агентов человека, животных и растений.
Цели и задачи исследования Целями данной работы являлись отработка условий получения и характеристика сферических частиц (СЧ), формирующихся в процессе термической перестройки вируса табачной мозаики (ВТМ), а также создание и изучение свойств комплексов СЧ с биологическими активными молекулами.
Для достижения поставленных целей решались следующие основные задачи:
1. Исследование условий образования СЧ из вириона и белка оболочки (БО) ВТМ.
2. Изучение свойств СЧ с использованием физико-химических, иммунохимических и иммунологических методов.
3. Проведение сравнительного анализа структурных различий белка в составе нативного вируса и сферических частиц.
4. Изучение адсорбционных свойств СЧ и возможности создания на их основе комплексов с белками различного аминокислотного состава и молекулярной массы, в частности с антигенами патогенов человека, животных и растений.
5. Исследование антигенных и иммуногенных свойств композиций СЧ-целевой белок.
6. Изучение адъювантных свойств СЧ.
Научная новизна и практическая ценность работы Все результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.
Показано, что при нагревании ВТМ до 94°С происходит денатурация БО, и формируются сферические частицы контролируемого размера и свободные от вирусной РНК. Обнаружено, что СЧ могут быть получены из различных форм БО ВТМ, не содержащих генетический материал вируса. Продемонстрирована высокая стабильность, иммуногенность и биодеградируемость СЧ. Показано, что СЧ уникальны по своей структуре и не имеют аналогов среди вирусов и других биологических объектов.
С использованием ряда физико-химических методов получены данные о структурных различиях БО ВТМ в составе нативного вируса и белка в составе сферических частиц.
Впервые показано, что СЧ обладают уникальными адсорбционными свойствами. На основе СЧ in vitro созданы антигенно и иммуногенно активные комплексы с антигенными детерминантами патогенов человека, животных и растений, отличающихся по аминокислотному составу и размерам, в том числе с антигенами таких актуальных для медицины инфекционных агентов, как вирус гриппа и вирус краснухи. Продемонстрировано, что связанные с поверхностью СЧ чужеродные белки способны реагировать со специфическими антителами и, следовательно, сохраняют свои антигенные свойства в составе полученных комплексов. Установлено, что СЧ проявляют свойства эффективного адъюванта и активно стимулируют иммунный ответ на антиген, иммобилизованный на их поверхности.
Имуногенные комплексы, полученные на основе СЧ, могут быть использованы для создания кандидатных вакцин нового типа, которые будут полностью биобезопасными, так как они создаются на основе белковых структур фитовируса, а также для получения дешевых диагностических антител.
Апробация работы Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на семинарах кафедры вирусологии и на международных конференциях: на ХVII и ХХ Международных научных конференциях «Ломоносов» (Москва, 2010, 2013);
на III и IV Международных форумах по нанотехнологиям (Москва, 2010, 2011);
на V и VI Международных конференциях «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2011, 2012);
на 36-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (FEBS) «Biochemistry for tomorrow’s medicine» (Италия, 2011), на 2-й Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и Наномедицина» (Московская область, 2011);
на Международной конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012);
На 37-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (FEBS), объединенным с 22-м конгрессом Международного объединения биохимиков и молекулярных биологов (IUBMB), проходящим под общим названием «From Single Molecules to Systems Biology» (Испания, 2012);
на VII Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013).
Личный вклад автора Основные результаты получены при непосредственном участии автора в планировании и проведении экспериментов. Исследования с помощью метода рамановской спектроскопии проведены совместно с к.б.н. н.с. Е.Ю. Паршиной, кафедра биофизики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Исследования с помощью спектроскопии кругового дихроизма и флуоресцентной спектроскопии проводились совместно с к.б.н. м.н.с. В.В. Макаровым, к.х.н. с.н.с. А.Л. Ксенофонтовым, д.б.н.
профессором Е.Н. Добровым, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского.
Публикации По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа. Из них статей в реферируемых журналах – 3, патентов РФ – 2, международных патентных заявок (PCT) – 1, материалов международных и российских конференций – 15.
Структура работы Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы». Работа содержит список цитируемой литературы ( _ ссылок), 40 рисунков, 3 таблицы. Общий объем диссертации _ страниц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Вирус табачной мозаики (ВТМ) – представитель рода Tobamovirus, семейства Virgaviridae. Оболочка вируса состоит из 2130 идентичных белковых субъединиц (17.5 кДа), плотно упакованных в виде спирали за счет гидрофобных связей в жесткую палочку диаметром 18 нм и длиной 300 нм. Внутри вирионной оболочки расположена вирусная РНК длиной 6395 нуклеотидов (Klug, 1999;
Butler, 1999;
Zaitlin and Israel, 1975).
Влияние повышенных температур на структуру вируса табачной мозаики (ВТМ) начали изучать более 70 лет назад. Было продемонстрировано, что ВТМ высоко термостабилен, а его температурная инактивация тесно связана с денатурацией белка оболочки (Lauffer and Price, 1940). В 1956 году было показано, что при нагревании ВТМ до 98С происходит преобразование палочковидных вирионов в шарообразные структуры («ball-like particles») с объемом близким к объему исходного вируса (Hart, 1956). К сожалению, эти наблюдения не были продолжены или подтверждены.
1. Термическая обработка вируса табачной мозаики приводит к его структурной перестройке в сферические частицы Показано, что нагревание водного раствора вируса табачной мозаики (ВТМ) до 94°С приводит к образованию частиц сферической формы. Обнаружено, что процесс образования сферических частиц (СЧ) из ВТМ является двухстадийным (Рис. 1.). На первой стадии при нагревании вируса до 90С происходит сворачивание вириона ВТМ с одного или двух концов и образование промежуточной формы (Рис. 1., б). Последующее повышение температуры до 94С приводит к 100% преобразованию промежуточных форм в сферические частицы (Рис. 1., в).
б а в Рисунок 1. Образование сферических частиц из вируса табачной мозаики в процессе термической перестройки: (а) нативные вирионы ВТМ, размер метки 100 нм;
(б) переходные формы, являющиеся предшественниками СЧ, размер метки 100 нм;
(в) сферические частицы, размер метки 500 нм. Просвечивающая электронная микроскопия, окрашивание 2% уранил ацетатом С помощью методов просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии были проанализированы сферические частицы, образующиеся при 94°С из препаратов нативного ВТМ с концентрацией 0.1, 1 и 10 мг/мл (Рис. 2.).
а б в г д е Рисунок 2. Сферические частицы, полученные при нагревании до 94°С препаратов нативного ВТМ с исходной концентрацией вируса: (а, г) 0.1 мг/мл;
(б, д) 1 мг/мл;
(в, е) 10 мг/мл. Просвечивающая электронная микроскопия, окрашивание 2% уранил ацетатом (а, б, в);
сканирующая электронная микроскопия, напыление золото палладий (г, д, е).
Продемонстрировано, что диаметр СЧ, образующихся в процессе термической перестройки ВТМ, зависит от исходной концентрации нативного вируса. С использованием методов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), динамического рассеяния света и метода анализа траекторий наночастиц (Nanoparticle tracking analysis) было показано, что из препаратов ВТМ c исходной концентрацией 0.1, 1 и 10 мг/мл можно получить СЧ с диаметром 68-100, 225-250, 500-590 нм соответственно. Это позволило нам в дальнейшей работе регулировать размеры СЧ, то есть получать частицы заданного диаметра.
Анализ ультратонких срезов СЧ с помощью ПЭМ позволил установить, что СЧ, формирующиеся при нагревании ВТМ до 94С, не содержат внутренних полостей.
Дальнейшие эксперименты показали, что СЧ являются объектами с высокой электронной плотностью и не требуют дополнительного контрастирования при анализе с помощью ПЭМ.
2. Изучение биохимического состава сферических частиц, образующихся при термической перестройке ВТМ На следующем этапе работы было важно выяснить, происходит ли деградация нуклеиновой кислоты или БО ВТМ в процессе термической денатурации и преобразования вирионов ВТМ в СЧ. Сферические частицы, полученные при нагревании препарата ВТМ с концентрацией 1 мг/мл, осаждали при помощи низкоскоростного центрифугирования (ЦФ).
Анализ методом ПЭМ показал, что в этих условиях все СЧ, находящиеся в коллоидном растворе, переходят в осадок. Был проведен сравнительный анализ содержания РНК в надосадочной жидкости и осадке после ЦФ СЧ. В связи с тем, что полученный супернатант не содержал СЧ, нуклеиновую кислоту из надосадочной жидкости осаждали с помощью 96% раствора этанола. Из осадка СЧ РНК выделяли методом фенольной депротеинизации.
Анализ препаратов проводили с помощью электрофореза в агарозном геле (Рис. 3.). В качестве контроля была использована РНК, выделенная из равного количества нативного препарата ВТМ.
1 2 РНК ВТМ 6395 нт тРНК ~ 90нт Рисунок 3. Характеристика РНК, выделенной из СЧ, электрофоретический анализ в 1% агарозе. 1. РНК ВТМ (контроль), 2. РНК, выделенная из супернатанта, после осаждения СЧ при 2 000g, 3. РНК, выделенная из осадка СЧ. В пробы 2 и 3 в качестве соосадителя добавляли тРНК. Окрашивание метиленовым синим.
Показано, что в супернатанте после центрифугирования СЧ содержится деградированная нуклеиновая кислота (Рис 3., дорожка 2), тогда как в осадке не было обнаружено вирусной РНК (Рис. 3., дорожка 3). Таким образом, было продемонстрировано, что РНК ВТМ деградирует и освобождается в процессе образования сферических частиц.
С целью изучения состояния полипептидной цепи белка в составе сферических частиц равное количество по белку СЧ и ВТМ прогревали при 95°С в денатурирующем буфере и анализировали методом электрофореза. Как видно из результатов, представленных на рисунке 4, молекулярные массы БО ВТМ (Рис. 4., дорожка 2) и белка в составе СЧ (Рис. 4., дорожка 3) идентичны. При этом количество белка, входящего в состав СЧ, соответствует количеству белка ВТМ, использованного для получения СЧ. Следовательно, при термической обработке ВТМ БО вируса не деградирует, и полипептидная цепь белка, входящего в состав, СЧ соответствует по своим размерам полипептидной цепи БО в составе ВТМ.
1 2 кДа 21. 14. Рисунок 4. Анализ белкового состава СЧ, полученных при термической обработке ВТМ. Электрофоретический анализ в 8-20% ДСН-ПААГ: 1. Маркеры молекулярной массы, 2. ВТМ (контроль) 1 мкг, 3. Сферические частицы 1 мкг. Окрашивание Кумасси G-250.
3. Сферические частицы образуются при термической перестройке различных форм белка оболочки ВТМ В связи с тем, что СЧ не содержат в своем составе нуклеиновой кислоты, была исследована возможность термической перестройки четырех основных форм, которые может образовывать в различных условиях БО ВТМ, свободный от вирусной РНК (Рис. 6.): 1) вирусоподобных частиц со спиральной структурой, аналогичной структуре вириона, 2) 20S дисков, 3) A-белка 4) мономеров БО ВТМ.
Было обнаружено, что уже при 65°С все формы БО ВТМ, независимо от исходной концентрации препарата, претерпевают термическую перестройку, и образуют СЧ, гетерогенные по своим размерам (Рис. 5.). Дальнейшее повышение температуры термообработки до 94-98°С не влияло на размеры и форму, образующихся СЧ. Поскольку СЧ могут быть получены при термоденатурации БО ВТМ в форме А-белка или 2S белка, можно сделать вывод, что спиральная структура вириона или вирусоподобных частиц не является необходимой для преобразования белка оболочки в сферическую частицу.
Важно отметить, что процесс образования СЧ из различных форм БО ВТМ, не содержащих вирусную РНК, имеет два важных отличия от процесса образования СЧ из вирионов: 1) одностадийность процесса (не обнаружена переходная форма);
2) размеры полученных СЧ не зависят от исходной концентрации БО. На рисунке 6 представлено схематическое изображение условий получения СЧ из нативного ВТМ и вирусного белка оболочки.
а б в г Рисунок 5. Анализ СЧ, образующихся при термической обработке различных форм белка оболочки ВТМ, не содержащих вирусную РНК, полученных из вирусоподобных частиц со спиральной структурой (а), из 20S дисков БО (б), из А-белка (в), из индивидуальных субъединиц БО (г). Температура термической обработки препарата 65°С. Размер метки 0.5 мкм.
Рисунок 6. Схематическое изображение образования СЧ из препарата нативного ВТМ и из препаратов различных, свободных от РНК, форм БО ВТМ. Цифры показывают концентрацию нативного ВТМ (слева) или белка оболочки (справа), нагретых до 94 C или до 65 C соответственно.
4. Сравнительный анализ свойств и структуры белка оболочки в составе нативного ВТМ и белка в составе сферических частиц Мы предположили, что при термической перестройке палочковидных вирионов ВТМ в СЧ, должны происходить существенные изменения в свойствах и структуре белка, входящего в состав сферических частиц, по сравнению с БО ВТМ в составе вириона. В связи с этим, на данном этапе работы были поставлены следующие задачи: 1) изучить влияние термической перестройки на способность белка, входящего в состав СЧ к реполимеризации;
2) исследовать устойчивость СЧ к воздействию протеолитических ферментов;
3) сравнить антигенные и иммуностимулирующие свойства СЧ и нативных вирионов ВТМ;
4) определить плотность СЧ и наличие изменений в структуре белка, образующего сферические частицы.
Было продемонстрировано, что белок, выделенный из СЧ и проинкубированный в условиях реполимеризации нативного БО ВТМ, образует неструктурированные агрегаты, то есть термическая денатурация БО ВТМ при образовании СЧ является необратимой и связана с изменениями в его структуре.
Вирионы нативного ВТМ устойчивы к действию протеолитических ферментов (Fraenkel-Conrat and Singer, 1999). Как видно из представленных микрофотографий, в результате гидролиза смеси СЧ и нативного ВТМ (Рис. 7., а) протеиназой К произошел селективный протеолиз СЧ, в то время как частицы ВТМ остались устойчивыми к действию фермента (Рис. 7., б).
а б ВТМ ВТМ Рисунок 7. Анализ препаратов СЧ и ВТМ после обработки протеиназной K.
Микрофотографии смеси СЧ и нативного ВТМ до (а) и после (б) обработки протеиназной К. Просвечивающая электронная микроскопия, контрастирование 2% уранил ацетатом.
При сравнении антигенных свойств СЧ и нативных вирионов было показано, что они являются антигенно отдаленно родственными. По-видимому, при термической денатурации вириона ВТМ и образовании СЧ появляются новые конформационные эпитопы, хотя нативные вирионы и СЧ состоят из идентичных по размеру и аминокислотному составу белков. Однако СЧ частично сохраняют возможность взаимодействия с антисывороткой и иммуноглобулинами к нативному вирусу, что свидетельствует о наличие некоторых общих поверхностных антигенных детерминант у ВТМ и СЧ.
Был проведен сравнительный анализ иммуногенных свойств ВТМ и СЧ. Для этого мышей иммунизировали сферическими частицами или вирионами ВТМ. Полученные сыворотки исследовали с помощью метода непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).
Данные представленные на рисунке 8 показывают, что титр антител к СЧ в 20 раз превышает титр к вирусу табачной мозаики, который способен эффективно стимулировать иммунный ответ (McCormick and Palmer, 2008). По-видимому, СЧ обладают высоким иммуностимулирующим потенциалом.
1. 1. 1. 1. А 0. 0. 0. 0. 1 10 100 1000 Разведение антисыворотки, х Рисунок 8. Сравнение иммуностимулирующих свойств ВТМ () и СЧ () с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА). () неимунная мышиная сыворотка.
Антисыворотки титровали на БО ВТМ в концентрации 10 мкг/мл.
Далее была определена плотность СЧ, которая составила 1.43 г/см3, что значительно отличалось от плотности нативного ВТМ (1.31 г/см3) и вирусоподобных частиц со спиральной структурой, полученных из препарата БО ВТМ (1.19 г/см3), проанализированных в той же концентрации. Эти данные еще раз подтвердили то, что при термической перестройке вируса происходят значительные структурные изменения в БО ВТМ, приводящие к образованию СЧ с более высокой плотностью, чем многие спиральные вирусы растений (Siegal and Hudson, 1959;
Sehgal et al., 1959).
Для того чтобы получить сведения о структуре белка в составе СЧ и его отличиях от нативного БО ВТМ, были использованы методы кругового дихроизма, флуоресцентной спектроскопии и рамановской спектроскопии (спектроскопии комбинационного рассеяния КР). Известно, что нативный БО ВТМ содержит около 50% -спиралей и 10% -слоев (Namba et al., 1989).
Спектры КР для СЧ имели существенные отличия от спектра ВТМ.
Продемонстрировано, что при термической перестройке ВТМ и образовании СЧ, спиральная структура БО ВТМ почти полностью исчезает, и появляется значительная фракция -структур в составе белка формирующего СЧ.
Чтобы предсказать вторичную структуру белка в составе СЧ на основе полученного спектра кругового дихроизма в области от 188-250 нм была использована программа K2D2.
Было получено следующее процентное соотношение вторичной структуры белка в составе СЧ: 14% -спиралей, 34% -структуры, 54% неупорядоченной структуры. Принято считать, что кросс--структура является характерным признаком формирования амилоидоподобной структуры. Чтобы показать наличие или отсутствие кросс--структуры у СЧ был использован тест на интенсивность флуоресценции тиофлавина Т, который широко применяется для выявления амилоидоподобных структур в белках (Nilsson, 2004). В случае нативного ВТМ наблюдался только небольшой пик на спектре флуоресценции при значении длины волны 490 нм. Тогда как для спектров СЧ наблюдался пик с высокой интенсивностью при том же значении длины волны, что подтверждает наличие -структуры в СЧ и предполагает формирование амилоидоподобной структуры.
Таким образом, было показано, что в отличие от нативного БО ВТМ белок СЧ имеет значительно меньшее количество -спиралей и большее количество -структур. Кроме того, СЧ взаимодействуют с тиофлавином Т, что может являться признаком амилоидоподобной структуры СЧ.
Вероятно, именно структура белка, входящего в состав СЧ, является причиной их высокой стабильности. В отдельной серии экспериментов было показано, что СЧ не изменяют свои размеры, форму и степень агрегации под воздействием различных внешних факторов: 1) повторное нагревание до 98°C, 2) замораживание при -20°С с последующим оттаиванием при комнатной температуре, 3) хранение при 4°С в течение года, 4) осаждение ЦФ при 10 000g c последующим ресуспендированием осадка.
5. Изучение адсорбционных свойств СЧ В предварительных экспериментах было показано, что значение изоэлектрической точки (pI) СЧ равно 3.7-3.9. Следовательно, при значении рН среды 3.9 СЧ имеют отрицательный поверхностный заряд. В качестве модельного белка для адсорбции на поверхности СЧ был выбран зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ) (30 кДа), на С-конец которого были добавлены 5 аминокислотных остатков аргинина, c целью повышения суммарного заряда белка, чтобы усилить электростатические взаимодействия между модельным антигеном и СЧ.
б в а Рисунок 9. Образование комплекса СЧ-ЗФБ. (а) схематичное изображение комплекса (серым цветом обозначена отрицательно заряженная СЧ, зеленым цветом обозначены молекулы рекомбинантного ЗФБ), (б) флуоресцентная микроскопии, (в) фазовый контраст. Размер метки 2 мкм.
Сравнение изображения комплексов СЧ-ЗФБ, полученного методом флуоресцентной микроскопии (Рис. 9., б), с изображением, полученным методом фазового контраста (Рис. 9., в), продемонстрировало, что все СЧ и молекулы модельного антигена были вовлечены в образование комплекса, так как в исследуемом препарате отсутствовали нефлуоресцирующие сферические частицы, и агрегаты ЗФБ, не связанного с поверхностью СЧ.
На следующем этапе была изучена способность СЧ адсорбировать на своей поверхности белки, различные по своему аминокислотному составу и молекулярной массе. С этой целью БО ВТМ (17.5 кДа), БО Х-вируса картофеля (ХВК) (25 кДа) и бычий сывороточный альбумин (БСА) (66 кДа) ковалентно связывали с флуоресцентной меткой – флуоресцеин изотиоционатом (ФИТЦ) (Рис. 10.).
а б б Рисунок 10. Комплексы СЧ-БО ХВКФИТЦ: (а) флуоресцентная микроскопия, (б) фазовый контраст. Размер метки 3 мкм.
Сравнение флуоресцентного изображения комплекса СЧ-БО ХВКФИТЦ (Рис. 10., а) с изображением, полученным методом фазового контраста (Рис. 10., б) показало отсутствие СЧ, свободных от белка меченого ФИТЦ. Аналогичные результаты были получены при исследовании комплексов СЧ-БО ВТМФИТЦ и СЧ-БСАФИТЦ. Важно отметить, что после инкубации СЧ с белками и формирования комплексов, в исследуемых препаратах отсутствовали флуоресцирующие агрегаты, несвязанные с поверхностью сферических частиц, соответствующие не входящим в состав комплекса целевым белкам (ЦБ). Это свидетельствует о том, что весь белок в инкубационной смеси участвовал в образовании композиции СЧ-ЦБ. Таким образом, можно утверждать, что поверхность СЧ способна адсорбировать совершенно разные по аминокислотному составу и молекулярной массе белки.
Была определена поверхностная емкость СЧ, то есть, выяснено количество ЦБ, которое может быть адсорбировано на поверхности сферических частиц. С помощью метода спектрофотомерии (А495) было показано, что на поверхности 50 мкг сферических частиц может быть адсорбировано до 10 мкг БО ХВКФИТЦ, после чего адсорбция прекращалась, и в супернатанте можно было зафиксировать появление не связанного с поверхностью СЧ белка.
Аналогичный эксперимент был проведен с БСАФИТЦ и БО ВТМФИТЦ. Количества БСАФИТЦ, связавшегося с поверхностью 50 мкг СЧ, составило 6 мкг, а количество БО ВТМФИТЦ – 7 мкг.
Важно отметить, что адсорбированные на поверхности СЧ (pI=3.7-3.9) белки имели не только существенные различия в молекулярной массе (от 17.5 до 66 кДа), но и разные значения изоэлектрической точки. Для БСА и БО ВТМ значение pI известны из литературных данных и составляют 4.6-4.8 (Maidment et al., 1980) и 4.3-4.6 (Smith and Lauffer, 1968) соответственно. Значение pI для БО ХВК (6.72) было рассчитано теоретически по аминокислотной последовательности с помощью программы ProtParam (http://www.expasy.org). Меньшее количество белка, способное адсорбироваться на СЧ в случае белков с более низким значением pI, может указывать на определенный вклад электростатических взаимодействий при образовании комплекса СЧ-ЦБ. Однако гидрофобные взаимодействия между СЧ и белками, скорее всего, тоже присутствуют, так как в случае БСА и БО ВТМ разница со значением изоэлектрической точки СЧ недостаточна для эффективных электростатических взаимодействий и формирования комплекса СЧ-ЦБ в воде.
Для того чтобы оценить вклад электростатических взаимодействий при образовании комплекса СЧ-ЦБ, была изучена их стабильность в солевом растворе. Было показано, что комплексы СЧ-БО ХВКФИТЦ начинали терять связанный белок при концентрации NaCl 0.05 0.1 M и полностью диccоциировали при концентрации соли 0.15 M. Аналогичный результат был получен для БСАФИТЦ.
Известно, что концентрация NaCl в плазме крови и тканевых жидкостях составляет примерно 0.15 М. В связи с этим, если рассматривать СЧ, как платформы для презентации биологически активных молекул, в том числе антигенов патогенов человека и животных, комплексы СЧ-ЦБ должны выдерживать физиологические условия и не диссоциировать. Для стабилизации комплексов СЧ-ЦБ в физиологических условиях, были отработаны условия фиксации целевого белка на поверхности сферических частиц с помощью формальдегида (ФА) и изучена их стабильность в солевом растворе. Было показано, что комплексы CЧ-БО ХВКФИТЦ, предварительно стабилизированные ФА (0.05%), оставались устойчивы к солевому воздействию в диапазоне концентрации NaCl от 0.05 до 0.4 M.
6. Характеристика структуры и свойств комплексов СЧ-целевой белок Комплексы СЧ-БО ХВК, стабилизированные формальдегидом, были охарактеризованы с помощью метода Вестерн-блот анализа. ХВК относится к важным сельскохозяйственным патогенам и приводит к потерям урожая различных видов семейства Пасленовых (Solanaceae). Была исследована способность комплексов СЧ-БО ХВК взаимодействовать с антисыворотками к БО ХВК (Рис. 11., а) и к СЧ (Рис. 11., б). В качестве контролей на гель наносили индивидуальные препараты СЧ и БО ХВК.
Полосы, соответствующие свободному БО и свободному белку СЧ, четко детектировались в контролях с помощью специфических антител (Рис. 11., а, дорожка 2;
Рис.
11., б, дорожка 1). Не наблюдалось неспецифического взаимодействия антисыворотки к СЧ с БО ХВК и антисыворотки, полученной к БО ХВК с СЧ (Рис 11., а, дорожка 1;
Рис. 11., б, дорожка 2). Из рисунка 11 видно, что в опытных образцах, содержащих обработанные формальдегидом комплексы СЧ-БО ХВК (Рис 11., а, б, дорожка 3), обнаруживались полосы, значительно превышающие по молекулярной массе как свободный белок СЧ (Рис. 11., б, дорожка 1), так и БО ХВК (Рис 11., а, дорожка 2).
1 2 3 1 2 антисыворотка к СЧ антисыворотка к БО ХВК а б б БО ХВК СЧ Рисунок 11. Изучение взаимодействия комплексов СЧ-БО ХВК с антисыворотками к БО ХВК (а) и к СЧ (б) методом Вестерн-блот анализа. 1. Сферические частицы;
2.
Белок оболочки ХВК;
3. Комплекс СЧ-БО ХВК. Белки разделяли методом электрофореза в градиентном ДСН-ПААГ (8-20%), после чего переносили на мембрану Hybond-P и инкубировали с антисыворотками специфичными к БО ХВК (а) или к СЧ (б).
Важно отметить, что большая часть высокомолекулярных продуктов выявлялась одновременно как антителами к БО ХВК, так и антителами к СЧ. Однако также наблюдались продукты, специфически реагирующие только с антисывороткой к СЧ или с антисывороткой к ХВК и обладающие меньшей электрофоретической подвижностью, чем свободные БО ХВК и СЧ, но большей, чем основная масса детектируемых полос. Можно предположить, что эти продукты соответствовали димерам или мультимерам молекул БО ХВК или белка СЧ соответственно. Это свидетельствует о том, что не все белковые субъединицы сферических частиц связаны ковалентно с БО ХВК. Вероятно, это можно объяснить стерическими затруднениями, которые могут появляться в случае взаимодействия каждой молекулы белка СЧ с антигеном. Важно отметить, что полосы соответствующие свободному БО ХВК или белку, не связанному с поверхностью СЧ, полностью отсутствует на дорожке, на которую был нанесен препарат комплекса (Рис. 11., а, дорожка 3). Следовательно, можно сделать вывод, что соотношение СЧ : целевой антиген подобрано таким образом, что все молекулы БО ХВК находятся в составе комплекса и связаны с поверхностью СЧ, и в препарате нет СЧ, свободных от молекул БО ХВК.
Архитектура комплекса СЧ-БО ХВК была исследована с помощью метода иммуноэлектронной микроскопии, который позволил оценить расположение БО ХВК на поверхности СЧ в составе комплекса СЧ-БО ХВК. Композиции СЧ-БО ХВК последовательно инкубировали сначала с первичными антителами, специфичными к БО ХВК, а затем с вторичными видоспецифичными антителами, конъюгированными с коллоидным золотом диаметром 12 нм. Показано, что комплексы СЧ-БО ХВК связаны с множеством частиц коллоидного золота, что свидетельствует о том, что поверхность СЧ равномерно покрыта молекулами БО ХВК (Рис. 12., а). В случае отрицательного контроля (комплексы, не инкубированные с первичными антителами) на поверхности СЧ частицы коллоидного золота не наблюдались, что показывает отсутствии неспецифической реакции вторичных антител с БО ХВК или СЧ (Рис. 12., б).
а б Рисунок 12. Иммуноэлектронная микроскопия композиций СЧ-БО ХВК. В качестве первичных антител были использованы антитела к БО ХВК, а в качестве вторичных антител – видоспецифичные антитела, конъюгированные с коллоидным золотом (а).
(б) – отрицательный контроль: комплекс, обработанный так же, как в (а), но без первичных антител, специфичных к БО ХВК.
На основании представленных результатов можно сделать вывод, что БО ХВК располагается на поверхности СЧ равномерно и с определенной регулярностью, и сохраняет свою антигенную активность.
Представленные данные позволяют утверждать:1) получен стабильный комплекс СЧ БО ХВК, в котором СЧ использованы в качестве платформы, на поверхности которой равномерно распределен целевой антиген – БО ХВК;
2) подобрано оптимальное соотношение БО ХВК : СЧ, при котором отсутствуют СЧ, свободные от молекул целевого белка, и БО ХВК, не связанный с поверхностью СЧ;
3) БО ХВК на поверхности СЧ сохраняет свою антигенную активность.
7. Создание антигенно активных комплексов, полученных на основе СЧ, содержащих антигены вируса гриппа и вируса краснухи На следующей стадии исследования были созданы композиции на основе СЧ с рядом рекомбинантных антигенов патогенов человека и животных, актуальных для создания кандидатных вакцин: 1) белок, содержащий в своем составе четыре повтора антигенной детерминанты А гликопротеина E1 вируса краснухи (21-22 кДа) (тетраэпитоп вируса краснухи);
2) белок, состоящий из молекулы дегидрофолатредуктазы слитой на С-конце с M2e эпитопом белка M2 вируса гриппа А человека длиной 23 аминокислотных остатка ( кДа) (M2e эпитоп);
3) белок, представляющий собой полиэпитоп гемагглютинина (ГА) (с по 212 аминокислотный остаток) штамма А/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) вируса гриппа птиц (17 кДа) (полиэпитоп ГА/Kurgan);
4) белок, представляющий собой рецептор связывающий домен ГА вируса гриппа А/California/07/2009 (H1N1), содержащий аминокислотные остатки с 63 по 286 молекулы гемагглютинина (25 кДа) (полиэпитоп ГА/California).
При создании комплексов крайне важно было убедиться в антигенной активности и специфичности белков/антигенных детерминант вируса гриппа и вируса краснухи, расположенных на поверхности СЧ. Выбранные антигены инкубировали со СЧ в соотношении 10 мкг антигена на 50 мкг СЧ. Все комплексы дополнительно стабилизировались ФА. Для детектирования образования комплекса СЧ-антиген и характеристики его антигенной активности был использован метод непрямой иммунофлуоресценции. К антигенным комплексам добавляли первичные антитела, специфичные к соответствующим антигенам. В роли вторичных антител выступали антивидовые антитела, конъюгированные с флуорофором Alexa 488 (зеленый) или с флуорофором Alexa 546 (оранжевый). В качестве отрицательного контроля использовали антигенные комплексы СЧ-антиген, которые инкубировали только с вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором.
Препараты анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии (Рис. 13.). В контрольных образцах (в отсутствии первичных антител) флуоресценции флуорофоров, конъюгированных с вторичными неспецифическими антителами, зафиксировано не было.
Следовательно, неспецифическое связывание вторичных антител с комплексами отсутствовало. Было показано, что рекомбинантные белки полностью покрывали поверхность СЧ. При сравнении изображений комплексов СЧ-полиэпитоп ГА/Kurgan и СЧ полиэпитоп ГА/California, полученных в режиме флуоресценции и фазового контраста, не было выявлено СЧ, свободных от молекул целевого антигена (Рис. 13., а, б;
Рис. 13., д, е).
Аналогичные результаты были получены для комплексов СЧ-тетраэпитоп вируса краснухи и СЧ-М2е эпитоп. Данные флуоресцентной микроскопии показали, что антигены были доступны для взаимодействия с соответствующими специфическими антителами.
Следовательно, белки в составе комплекса СЧ-целевой антиген сохраняют свою антигенную специфичность.
а б в г е е д Рисунок 13. Антигенные комплексы, состоящие из СЧ и связанных с их поверхностью рекомбинантных антигенов: (а, б) полиэпитоп ГА/Kurgan, (а) флуоресцентная микроскопия, (б) фазовый контраст;
(в) тетраэпитоп вируса краснухи, флуоресцентная микроскопия;
(г) эпитоп М2е, флуоресцентная микроскопия;
(д, е) полиэпитоп ГА/California, (д) флуоресцентная микроскопия, (е) фазовый контраст. Размер меток:
(а-г) – 3 мкм, (д, е) – 2 мкм.
Следует отметить, что при исследовании образцов не были обнаружены агрегаты свободных белков, которые могли быть выявлены первичными и вторичными антителами, то есть в инкубационной смеси отсутствовали свободные несвязанные со СЧ антигенные детерминанты. Таким образом, созданы комплексы СЧ-целевой антиген, содержащие в своем составе СЧ, полученные при термической обработке ВТМ, и антигены вируса гриппа А человека, вируса гриппа А птиц или вируса краснухи. СЧ эффективно связывались со всеми использованными целевыми антигенами, что еще раз указывает на высокие адсорбционные свойства СЧ.
8. Создание антигенно активных комплексов, состоящих из СЧ и двух различных антигенов, одновременно адсорбированных на поверхности сферических частиц Была изучена возможность одновременной посадки БО ХВК и M2e эпитопа на поверхность СЧ. В качестве первичных антител использовали кроличью антисыворотку к БО ХВК, которая не реагировала с эпитопом M2e и мышиную антисыворотку к эпитопу М2е, для которой было показано отсутствие неспецифической реакции с БО ХВК. В роли вторичных антител выступали видоспецифичные антитела, конъюгированные с флуорофором Alexa 488 (зеленый) и с флуорофором Alexa 546 (оранжевый). Различие в максимуме флуоресценции флуорофоров позволило дифференцированно оценить возможность одновременной адсорбции антигенов на поверхности одних и тех же СЧ.
Отрицательным контролем служили комплексы, необработанные первичными антителами.
Как видно из рисунка 14, с помощью флуоресцентной микроскопии было выявлено, что оба антигена были связаны с поверхностью всех СЧ исследуемого образца и сохраняли свою антигенную активность. В случае отрицательного контроля флуоресценция на поверхности СЧ не наблюдалась. Полученные результаты, свидетельствующие о возможности поверхности СЧ одновременно адсорбировать два целевых белка различной природы при сохранении их антигенной специфичности, предоставляют возможность создания поливалентных кандидатных вакцин.
а б в Рисунок 14. Антигенные комплексы, состоящие из СЧ и двух антигенов, одновременно иммобилизованных на их поверхности (БО ХВК и эпитоп М2е): (а) изображение в фазовом контрасте, (б) изображение, полученное в режиме, фиксирующем флуоресценцию от вторичных антител, конъюгированных с флуорофором Alexa 546 и детектирующих БО ХВК на поверхности СЧ, (в) изображение, полученное в режиме, фиксирующем флуоресценцию от вторичных антител, конъюгированных с флуорофором Alexa 488 и детектирующих эпитоп М2е. Размер меток – 3 мкм.
Таким образом, на основании полученных результатов можно утверждать, что СЧ могут стать перспективной платформой для презентации на их поверхности антигенов патогенов человека, животных и растений, различных по молекулярной массе и аминокислотному составу.
9. Изучение иммуногенных свойств композиций СЧ-антиген, стабилизированных и нестабилизированных формальдегидом В опытах по изучению иммуногенных свойств комплексов СЧ-антиген в качестве модельной была использована композиция СЧ-БО ХВК стабильность, антигенная активность и архитектура которой были подробно исследованы на предыдущих этапах работы.
Иммуногенность композиций СЧ-БО ХВК, обработанных и необработанных ФА исследовали в опытах на лабораторных животных. В опыте было использовано 5 групп мышей:1) первую группу мышей иммунизировали раствором индивидуального БО ХВК, чтобы оценить эффективность гуморального иммунного ответа на свободный антиген;
2) вторую группу мышей иммунизировали СЧ, на поверхность которых за счет электростатических взаимодействий был адсорбирован БО ХВК;
3) электростатические взаимодействия между СЧ и БО ХВК могли оказаться нестабильными в физиологических условиях, что приводило бы к диссоциации комплекса, в связи с этим третью группу мышей иммунизировали антигенными комплексами, состоящими из СЧ и БО ХВК, стабилизированными формальдегидом (ФА);
4) четвертую группу мышей иммунизировали cвободным БО ХВК в присутствии полного адъюванта Фрейнда в качестве положительного контроля, чтобы оценить иммуностимулирующие свойства СЧ по сравнению с одним из самых сильных из известных на данный момент времени адъювантов (Brunner et al., 2010);
5) пятую группу мышей иммунизировали раствором PBS (отрицательный контроль).
Данные, представленные на рисунке 15, показывают, что титр антисыворотки, полученной при иммунизации свободным белком, составляет 1/10 000. Титры антисывороток, полученных при иммунизации мышей смесью СЧ и БО ХВК или композициями СЧ-БО ХВК, обработанными ФА, практически не отличались друг от друга, и их значение составляло около 1/140 000. В физиологических условиях антигенные комплексы, нестабилизированные формальдегидом, могли диссоциировать на СЧ и БО ХВК.
Поэтому, скорее всего, в этом случае СЧ могли выступать не как высокомолекулярный носитель (платформа) для антигена, а в качестве адъюванта иммунного ответа на свободный БО ХВК. Следует отметить, что адьювантные свойства СЧ были сопоставимы с действием адъюванта Фрейнда. Титр антисыворотки, полученной при иммунизации мышей БО ХВК с полным адъювантом Фрейнда, составил 1/240 000, следовательно, превышал всего 1.7 раза титр антисывороток, полученных при иммунизации животных смесью СЧ и БО ХВК или композициями, стабилизированными ФА. Таким образом, было продемонстрировано, что СЧ способны эффективно стимулировать гуморальный иммунный ответ на антиген, находящийся с ними в смеси или иммобилизованный на их поверхности, и повышать титр получаемых антисывороток примерно в 14 раз по сравнению с раствором свободного белка.
Рисунок 15. Изучение способности СЧ стимулировать гуморальный иммунный ответ на целевой антиген. Кривые титрования мышиных антисывороток к БО Х-вируса картофеля (ХВК), полученных при иммунизации животных смесью БО-ХВК и СЧ () или композициями из СЧ и БО-ХВК, фиксированного на их поверхности ФА ();
() антисыворотка к свободному БО ХВК;
(Х) сыворотка, полученная к БО ХВК в присутствие адъюванта Фрейнда;
() неимунная мышиная сывортка. Представлены усредненные результаты титрования, полученные из трех независимых экспериментов.
Антиген БО ХВК 10 мкг/мл.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Показано, что при нагревании спиральных частиц ВТМ до 94°С происходит перестройка вирусного белка оболочки, и формируются сферические частицы контролируемого размера, отдаленно антигенно родственные вирионам ВТМ, обладающие более высокой плотностью, чем вирионы фитовирусов со спиральной структурой, свободные от вирусной РНК и биодеградируемые, в отличие от ВТМ. Обнаружено, что сферические частицы могут быть получены из различных форм БО, не содержащих генетический материал вируса, в том числе из препаратов А-белка и мономерной формы БО. С использованием ряда физико-химических методов получены данные о структурных различиях белка оболочки ВТМ в составе нативного вируса и белка, входящего в состав сферических частиц. Продемонстрировано, что в отличие от нативного БО ВТМ белок, из которого состоят сферические частицы, имеет в своем составе меньшее количество спиралей и большее количество -структур. Кроме того, было показано, что СЧ взаимодействуют с тиофлавином Т, что может являться признаком амилоидоподобной структуры сферических частиц.
Продемонстрирована высокая стабильность СЧ к воздействию различных внешних факторов. Показано, что СЧ обладают более высокой иммуногенностью по сравнению с нативными вирионами ВТМ. Можно утверждать, что СЧ уникальны по своим свойствам и структуре и не имеют аналогов среди вирусов, вирусоподобных частиц и других биологических объектов.
Впервые показано, что СЧ обладают исключительными адсорбционными свойствами.
На основе СЧ in vitro созданы антигенно и иммуногенно активные комплексы с антигенными детерминантами патогенов человека, животных и растений, отличающихся по аминокислотному составу и молекулярной массе, в том числе с антигенами таких актуальных для медицины инфекционных агентов, как вирус гриппа и вирус краснухи.
Продемонстрировано, что связанные с поверхностью СЧ чужеродные белки способны реагировать со специфическими антителами и, следовательно, сохраняют свои антигенные свойства в составе полученных комплексов. Установлено, что СЧ проявляют свойства эффективного адъюванта и активно стимулируют иммунный ответ на антиген, адсорбированный на их поверхности. Иммуногенные комплексы, полученные на основе СЧ, могут быть использованы для создания кандидатных вакцин нового типа, которые будут полностью биобезопасными, так как они создаются на основе белковых структур фитовируса, а также для получения дешевых диагностических антител.
На основании опубликованных по данной работе статей недавно группой Dr. Steinmetz были получены комплексы СЧ-гадолиний, которые обладают значительно более высокой релаксационной эффективностью в сравнении с другими вирусными платформами, модифицированными гадолинием, что позволяет рассматривать их как перспективную платформу для разработки парамагнитных контрастных веществ для магнитно-резонансной томографии (Bruckman et al., 2013). Группа этих же авторов собирается использовать СЧ для диагностики атеросклероза.
ВЫВОДЫ 1. Продемонстрировано, что при нагревании вируса табачной мозаики (ВТМ) до 94°С происходит термическая двухступенчатая перестройка белка оболочки (БО) вириона, и образуются биодеградируемые сферические частицы (СЧ) контролируемого размера, свободные от РНК. СЧ могут быть получены при термической денатурации различных форм БО ВТМ, не содержащих РНК вируса.
2. Получены сведения о том, что термическая перестройка БО вириона сопровождается переходом значительной части -спиральных структур белка в неупорядоченные или структуры и увеличением плотности образующихся частиц по сравнению с вирионами ВТМ.
3. Выявлена высокая стабильность СЧ к воздействию различных внешних факторов.
4. Показано, что СЧ обладают значительно более высокой иммуногенностью по сравнению с нативным вирусом.
5. Продемонстрированы уникальные адсорбционные свойства СЧ. На основе СЧ in vitro созданы антигенно активные комплексы с антигенами патогенов человека, животных и растений.
6. Установлено, что СЧ проявляют свойства эффективного адъюванта и активно стимулируют иммунный ответ на антиген, адсорбированный на их поверхности.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи 1. Никитин Н.А., Малинин А.С., Рахнянская А.А., Трифонова Е.А., Карпова О.В., Ярославов А.А., Атабеков И.Г. Использование поликатионного спейсера для нековалентной иммобилизации альбумина на поверхности термически модифицированных вирусных частицах. // Высокомолекулярные соединения, Сер. А. 2011. Т. 53. №11. С. 1885-1891.
2. Karpova O., Nikitin N., Chirkov S., Trifonova E., Sheveleva A., Lazareva E., Atabekov J.
Immunogenic compositions assembled from tobacco mosaic virus-generated spherical particle platforms and foreign antigens. // Journal of General Virology. 2012. V. 93. №2. P. 400–407.
3. Dobrov E.N., Nikitin N.A., Trifonova E.A., Parshina E.Yu., Makarov V.V., Maksimov G.V., Karpova O.V., Atabekov J.G. -structure of the coat protein subunits in spherical particles generated by tobacco mosaic virus thermal denaturation. // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 2013. doi: 10.1080/07391102.2013.788983.
Патенты 1. Атабеков И.Г., Карпова О.В., Кирпичников М.П., Никитин Н.А., Трифонова Е.А., Чирков С.Н., Шевелева А.А. Иммуногенная композиция, содержащая чужеродные антигены на поверхности сферических носителей, полученных при термической денатурации спиральных вирусов. // Патент РФ №2440140 от 20.01.2012.
2. Атабеков И.Г., Карпова О.В., Кирпичников М.П., Никитин Н.А., Трифонова Е.А., Чирков С.Н., Шевелева А.А.. Способ усиления иммунного ответа. // Патент РФ №2442604 от 20.02.2012.
3. Atabekov I.G., Archipenko M.V., Karpova O.V., Kirpichnikov M.P., Nikitin N.A., Trifonova E.A., Chirkov S.N., Sheveleva A.A. Spherical nano- and microparticles derived from plant viruses for the display of foreign proteins or epitopes. // PCT WO 2012/078069 A1 от 14.06.2012.
Тезисы устных и стендовых докладов, материалы конференций и конгрессов 1. Трифонова Е.А., Никитин Н.А. Изучение возможности сборки антигенных комплексов на основе вирусов растений in vitro. // XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010»: Секция «Биология». Москва. 2010. С. 212.
2. Трифонова Е.А., Смирнов А.А. Разработка новых подходов для получения антител против вируса оспы сливы. // 14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – Наука XXI века». Пущино. 2010. Т. 2. С. 188-189.
3. Никитин Н.А., Трифонова Е.А. Создание нового типа наноплатформ на основе спиральных вирусов растений. // Международный форум по нанотехнологиям. Москва. 2010.
4. Никитин Н.А., Трифонова Е.А., Малинин А.С., Рахнянская А.А., Карпова О.В., Ярославов А.А., Атабеков И.Г. Создание функционально активных комплексов на основе нового типа сферических наночастиц. // Третья Международная конференция «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий к наноиндустрии». Ижевск. 2011. C. 109 110.
5. Трифонова Е.А., Никитин Н.А. Получение антигенно активных комплексов in vitro. // 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – Наука XXI века». Пущино. 2011. С. 309-310.
6. Трифонова Е.А., Никитин Н.А., Карпова О.В. Изучение свойств искусственных вирусных частиц. // 5-я Международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва. 2011. С. 52.
7. Trifonova E., Nikitin N., Karpova O., Atabekov J. In vitro assembly of compositions consisting of antigens and spherical nanoparticles generated by plant viruses. // FEBS Journal, Abstracts of 36th FEBS Congress «Biochemistry for tomorrow’s medicine». Italy. Torino. 2011. V.
278. Suppl. 1. P. 443.
8. Никитин Н.А., Трифонова Е.А., Карпова О.В., Атабеков И.Г. Создание антигенных комплексов на основе частиц структурно-модифицированных вирусов растений. // 2-ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и Наномедицина». Московская область. 2011. С. 89-90.
9. Trifonova E.A., Nikitin N.A. Antigenic nanocompositions based on plant virus spherical nanoparticles and foreign antigens. // International Competition for Scientific Papers in Nanotechnology for Young Researchers. IV Nanotechnology International Forum. Moscow. 2011.
10. Трифонова Е.А., Никитин Н.А., Шевелева А.А., Чирков С.Н., Карпова О.В., Атабеков И.Г. Создание кандидатных вакцин на основе структурно модифицированных вирусов растений. // Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2012. С. 265-266.
11. Никитин Н.А., Трифонова Е.А., Лазарева Е.А., Карпова О.В., Атабеков И.Г.
Исследование структуры нановакцин, собранных in vitro, с помощью различных методов бионаноскопии. // 6-я Международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва. 2012. С. 40.
12. Трифонова Е.А., Никитин Н.А., Карпова О.В. Изучение в жидкости антигенных свойств комплексов на основе структурно модифицированных вирусов растений. // 6-я Международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва. 2012.
С. 49.
13. Trifonova E., Nikitin N., Smirnov A., Putlyaev E., Chirkov S., Karpova O., Atabekov J. The novel type of candidate vaccine against influenza virus A based on spherical particles – structural remodeling tobacco mosaic virus. // FEBS Journal, Abstracts of the 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress «From Single Molecules to Systems Biology». Spain. Sevilla. 2012. V. 279. Suppl. 1. P.
333-334.
14. Трифонова Е.А., Никитин Н.А., Гмыль А.П., Лазарева Е.А., Карпова О.В., Атабеков И.Г. Создание иммуногенных композиций, состоящих из искусственных сферических частиц, полученных на основе вируса табачной мозаики, и икосаэдрических вирионов в качестве антигенов. // VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2013. Т. 1. С. 172-173.
15. Трифонова Е.А., Никитин Н.А. Изучение сферических частиц, полученных при термической денатурации вируса табачной мозаики, и их комплексов с антигенами с помощью метода анализа траекторий наночастиц. // XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013»: Секция «Биология». Москва. 2013. С. 76-77.