Растения западной монголии (скрининг, химический состав, перспективы использования)
На правах рукописи
Нямжав Мунхжаргал ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩИЕ РАСТЕНИЯ ЗАПАДНОЙ МОНГОЛИИ (СКРИНИНГ, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ, ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.00.05 – ботаника 03.00.12 – физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Томск – 2009
Работа выполнена в лаборатории фитохимии Сибирского ботанического сада ГОУ ВПО «Томский государственный университет» доктор химических наук, старший
Научный консультант:
научный сотрудник Зибарева Лариса Николаевна доктор биологических наук, профессор Научный консультант:
Ревушкин Александр Сергеевич доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Высочина Галина Ивановна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник Гуреева Ирина Ивановна.
Институт Биологии Коми научного
Ведущая организация:
центра Уральского отделения РАН
Защита состоится «» октября 2009 г. в часов на заседании диссерта ционного совета Д 212.267.09 в Томском государственном университете по ад ресу: 634050, Томск, пр. Ленина, 36. Факс: (3822)529601.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Том ский государственный университет» по адресу: 634050, Томск, пр. Ленина, 34 а.
Автореферат разослан «» сентября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Середина В. П.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Проведение поиска перспективных видов по содержанию и составу фитоэкдистероидов актуально, поскольку эти соединения обладают ши роким спектром биологического действия: анаболическим, тонизирующим, адаптогенным, гемореологическим, радиопротекторным, а их растительные ис точники могут быть основой для получения медицинских препаратов и чистых экдистероидов.
Изучение качественного состава, количества и динамики накопления экди стероидов у разных видов в различных условиях обитания может служить одной из важных предпосылок понимания функции этих соединений в онтогенезе рас тений.
В настоящее время на присутствие экдистероидсодержащих растений изуче ны флоры Европы, Японии, Узбекистана, отдельных регионов России, включая и некоторые районы Южной Сибири, граничащие с Монголией. Флора Монголии не исследована на наличие экдистероидсодержащих растений. В связи с этим большой интерес представляет изучение в этом отношении флоры Монголии и сопредельных регионов, поскольку в ней богато представлены как самобытные центральноазиатские виды, так и встречающиеся на территории России.
Цель работы. Поиск экдистероидсодержащих видов во флоре Западной Монголии и определение перспектив их использования.
Задачи исследования:
- проведение скрининга растений флоры Западной Монголии на присут ствие экдистероидов;
- выявление перспективных экдистероидсодержащих видов;
- исследование химического состава экдистероидов перспективных ви дов;
- изучение влияния условий обитания на качественный состав, количе ство и динамику накопления экдистероидов;
- исследование влияния некоторых микроэлементов на всхожесть семян, развитие растений и содержание экдистероидов в видах Silene.
Положения, выносимые на защиту:
1. Флора Западной Монголии содержит значительное количество видов - продуцентов экдистероидов.
2. Экзогенное введение микроэлементов – кобальта, марганца и молиб дена оказывает положительное влияние на развитие растений и уровень фитоэкдистероидов в видах рода Silene.
Научная новизна. Впервые исследована флора Монголии на присутствие экдистероидов. Из 297 проанализированных видов обнаружено 17 экдистероид содержащих, в том числе 7 новых продуцентов – Silene ichebogdo Grub., Silene mongolica Maxim., Silene turgida Bieb. ex Bunge, Elisanthe aprica (Turch. еx.
Fischer et Meyer) Peschk., Serratula marginata Tausch., Chenopodium frutescens C.
A. Meyer, Axyris prostrata L. Впервые экдистероиды обнаружены в роде Elisanthe (Fenzl) Reichb.
Впервые изучен состав экдистероидов Silene repens Patrin, Silene graminifolia Otth., Silene jeniseensis Willd., Elisanthe viscosa (L.) Rupr. в процессе выделения методом колоночной хроматографии и идентификации методом высокоэффек тивной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Исследовано влияние условий произрастания на состав и содержание экди стероидов в Silene repens. Проведено сравнительное изучение динамики накоп ления 20-гидроксиэкдизона (20Е) в образцах Silene repens монгольского и сибир ского происхождения.
Впервые изучено влияние некоторых микроэлементов на всхожесть семян, развитие растений и содержание экдистероидов в видах рода Silene.
Практическая значимость: Обнаружено 7 новых растительных источников экдистероидов, среди которых высоким содержанием 20-гидроксиэкдизона ха рактеризуются Serratula marginata и Axyris prostrata. Рекомендовано 4 вида Silene repens, S. jeniseensis, S. graminifloia, Elisanthe viscosa в качестве богатых источников мажорных экдистероидов – 20-гидроксиэкдизона, полиподина В, интегристерона А, 2-дезоксиэкдизона, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизона.
Выявлены экологические условия, способствующие высокому аккумулиро ванию искомых соединений.
Разработаны средства и способы увеличения биомассы растений и содержа ния в них фитоэкдистероидов путем экзогенного введения определенных кон центраций микроэлементов кобальта, марганца и молибдена.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях: 6 международных и 2 российских, в том числе на 13-й междуна родной научно-практической конференции «Природные и интеллектуальные ресурсы Сибири» (Кемерово, 2007), Шестой международной научно-практиче ской конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2007), международной конференции «Природные условия, история и культура Западной Монголии и сопредельных регионов» (Горно-Алтайск, 2007), второй международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, эко логии, географии, образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2008), «XVII Ecdysone Workshop» (Germany, 2008), международной конферен ции «Биоразнообразие, проблемы экологии Горного Алтая и сопредельных ре гионов» (Горно-Алтайск, 2008), всероссийской научно-практической конферен ции «Культуры и народы северной Азии и сопредельных территорий в контексте междисциплинарного изучения» (Томск, 2008), IV всероссийской научной кон ференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в опубликованных работах, 2 из которых в ведущих научных журналах, рекомен дованных ВАК. Подана заявка на патент и получена приоритетная справка в 2009 г. на «Способ увеличения биосинтеза экдистероидов в растительных объек тах», включающий обработку растений растворами солей микроэлементов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и 2 приложений. Работа изложена на 137 страницах, иллюстрирована 15 таблицами и 18 рисунками. Библиографический список включает 212 наименований.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю доктору химических наук профессору Ларисе Николаевне Зиба ревой и научному консультанту доктору биологических наук профессору Алек сандру Сергеевичу Ревушкину за постоянную поддержку и неоценимую помощь в осмыслении материала и написании работы.
За совместную работу при определении состава экдистероидов методом ВЭЖХ автор благодарит профессоров Рене Лафона (Парижский университет Пьера и Марии Кюри, Франция) и Лоуренса Дайнена (Эксетерский университет, Великобритания), за предоставление образцов и определение видов растений доцента Оюунчимэг Дамдинсурен (Ховдский университет, Монголия), доцента Александра Леоновича Эбеля, профессора Андрея Ильича Пяка (ТГУ), за ока занную помощь при определении микроэлементов научного сотрудника Елену Дмитриевну Агапову и доцента Сергея Ивановича Коноваленко (ТГУ), за по мощь и поддержку сотрудницу лаборатории фитохимии Валентину Ивановну Еремину и сотрудников кафедры физиологии растений и биотехнологии (ТГУ) и Сибирского ботанического сада (ТГУ).
ГЛАВА 1. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩИХ РАСТЕНИЙ В главе анализируются работы российских и зарубежных авторов, посвящен ные изучению химической природы экдистероидов, распространению, накопле нию и роли их в растениях, а также влиянию микроэлементов на биосинтез био логически активных веществ, в том числе и экдистероидов.
Известно, что фитоэкдистероиды являются довольно широко распространен ными вторичными метаболитами растений. К настоящему времени выделено более 407 экдистероидов, причем большая часть из них растительного происхо ждения. Встречаются они как в низших растениях: водорослях, грибах, так и в высших растениях: папоротникообразных, голосеменных и покрытосеменных.
Наибольшее число экдистероидсодержащих видов обнаружено в семействах Amaranthaceae (Takemoto et. al., 1967;
1968;
1971;
Ogawa et. al., 1971;
Ikan et. al., 1971;
Sarker et. al., 1996;
Savchenko et. al., 1998 а), Asteraceae (Яцюк, Сегаль, 1970;
Горовиц и др., 1974;
Володин и др., 1993;
2004, Volodin et. al., 2002;
Чадин 2001;
Dinаn et. al., 2001), Сaryophyllaceae (Imai, 1969;
Cаатов, 1979 а, б, Ревина и др., 1988, Bаthori et. al., 1995;
Зибарева, 1991;
Зибарева и др., 1995 а, б;
1996;
1997 а,б ;
1998;
1999;
2003;
2007;
2008, Zibareva et. al., 2000), Chenopodiaceae (Dinan 1990;
1991;
1992 a, b;
1995), Lamiaceae (Imai, 1969;
Ikan and Ravid, 1970;
1971 a;
Camps et. al., 1981;
1982;
1984), Ranunculaceae (Savchenko et. al., 1998 b, Dinan et. al., 2002), Solanaceae Juss. (Savchenko et. al., 2000) и др.
Cемейство Caryophyllaceae является одним из наиболее изученных среди се мейств покрытосеменных растений на содержание экдистероидов.
Л. Н. Зибаревой и др. (1999;
2003;
2008) проанализировано более 400 видов по рядка Caryophyllales, включая 266 видов семейства Caryophyllaсeae, принадле жащих 28 родам. Обнаружено 95 новых экдистероидсодержащих видов сем.
Caryophyllaсeae, включая 8 видов рода Lychnis L. и 75 видов Silene L., 4 вида Sagina L., 2 вида Saponaria L., 2 вида Petrocoptis A. Braun., 1 вид Dianthus L. и вида Melandrium Roehl. Наиболее перспективными по содержанию этих веществ оказался род Silene.
Проанализированы литературные данные об особенностях накопления экди стероидов в зависимости от фазы развития и органа растения. Внутри рода ха рактер изменений содержания экдистероидов в процессе развития растений раз личен, что, вероятно, связано с особенностями развития растений, функцией, выполняемой этими соединениями, условиями произрастания. Обсуждены гипо тезы о роли экдистероидов в растениях. Проанализированы сведения о влиянии микроэлементов на биосинтез биологически активных веществ.
На основе обобщения литературных данных определена актуальность про блемы исследования данной работы.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В главе дано описание природно-климатических условий районов исследова ния, изученных объектов и методик исследования.
Для химического скрининга на присутствие фитоэкдистероидов объектами исследований явились дикорастущие виды флоры Западной Монголии. Растения были собраны автором в Западной Монголии в течение 2006-2008 гг., часть об разцов была любезно предоставлена сотрудниками Ховдского университета Монголии и кафедры ботаники Томского государственного университета. Виды были определены при содействии Д. Оюунчимэг, А. Л. Эбеля и А. И. Пяка.
Для сравнения химического состава экдистероидов образцы собраны в пери од цветения в Хангае, Хэнтэе и Горном Алтае.
Скрининг на присутствие экдистероидов в образцах осуществляли хромато спектрофотометрическим методом (Якубова и др., 1978;
Патент…1994) на спек трофотометре UV-1800 («Shimadzu», Япония) в диапазоне 240-250 нм.
Выделение экдистероидов из растений Silene repens проводили методом ко лоночной хроматографии. Экдистероиды идентифицировали в 4 видах Silene repens, Silene graminifolia, Silene jeniseensis, Elisanthe viscosa методом высокоэф фективной жидкостной хроматографии в Парижском Университете. Определе ние экстрактивных веществ, влаги, золы, дубильных веществ, флавоноидов, ку маринов, алкалоидов проводили по соответствующим методикам (Государст венная фармакопея СССР, 1987, 1990).
Определение микроэлементов в почве и растениях проводили методом атом но-эмиссионного спектрального анализа в лаборатории минералогии и геохимии ТГУ.
Определение всхожести семян растений рода Silene проводили в лаборатор ных условиях после предварительной обработки 50 штук семян растворами сульфата марганца, молибдата аммония, нитрата кобальта различных концен траций – 10-1–10-5 М, с последующим проращиванием в чашках Петри в течение 12 дней. Семена контрольного образца проращивали на дистиллированной воде.
Определение влияния микроэлементов на развитие растений и биосинтез эк дистероидов проводили путем предпосевной, внекорневой, корневой подкормки растений растворами сульфата марганца, молибдата аммония, нитрата кобальта в концентрации 10-4 М. Семена высевали в ящики по 100 штук и выращивали в в оранжерейно-тепличном комплексе Сибирского ботанического сада ТГУ. Для анализа надземную часть растений собирали в фазу цветения.
Полученные экспериментальные данные обработаны с помощью программы Statistica 6.0 и MS Excel 2003. В таблицах и рисунках приведены средние ариф метические значения и их стандартные ошибки.
ГЛАВА 3. ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩИЕ РАСТЕНИЯ ЗАПАДНОЙ МОНГОЛИИ 3.1. Скрининг видов флоры Западной Монголии на присутствие экди стероидов хроматоспектрофотометрическом методом Исследование флоры Западной Монголии на наличие экдистероидов пред принято впервые. Скринингу на их присутствие подвергнуто 273 вида, произра стающие на территории Монголии, а также 36 видов Русского Алтая.
Изученные виды относятся к 50 семействам, 3 из которых являются одно дольными, 45 - двудольными цветковыми и 2 семейства - голосеменными.
Экдистероиды обнаружены в 3 семействах: Asteraceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae. Встречаемость экдистероидсодержащих продуцентов среди произвольно выбранных видов составила 5.7 %. На уровне семейств встречае мость искомых соединений выше: Asteraceae - 6 %, Caryophyllaceae – 40 %, Chenopodiaceae – 25 %.
В семействе Caryophyllaceae экдистероиды выявлены в 10 видах: Melandrium apetala, Silene chamarensis, Silene graminifolia, Silene ichebogdo, Silene jeniseensis, Silene mongolica, Silene repens, Silene turgida, Elisanthe aprica, Elisanthe viscosа.
Впервые экдистероиды выявлены в 4 видах: Elisanthe aprica, Silene ichebogdo, Silene mongolica, Silene turgida.
В семействе Asteraceae они обнаружены только у представителей трибы Cardueae: Stemmacantha uniflora, Serratula сentauroides, Serratula algida, Serratula marginata, в последнем виде впервые.
В семействе Chenopodiaceae обнаружены искомые соединения в 3 видах:
Chenopodium album, Chenopodium frutescens (триба Chenopodieae), Axyris prostratа (триба Atriplicaeae), в двух последних видах впервые.
Наиболее высоким содержанием 20Е отличаются следующие виды: Silene jeniseensis (2.2 %), Stemmacanta uniflora (1.3 %), Silene repens (1.1 %), Serratula marginata (1.0 %), Axyris prostrata (0.9 %), некоторые из них подвергнуты более глубокому химическому изучению.
3.2. Изучение химического состава биологически активных веществ, со путствующих экдистероидам В исследованных экдистероидсодержащих видах установлено наличие алка лоидов, флавоноидов, кумаринов, дубильных веществ. Дубильные вещества в этих растениях, а также биологически активные вещества Chenopodium frutenscensе изучены впервые. Установленный состав синтезируемых соедине ний учтен при разработке схемы выделения экдистероидов из перспективных видов.
3.3. Выделение фитоэкдистероидов из экстрактов растений Silene repens Выбор Silene repens в качестве объекта для выделения фитоэкдистероидов обусловлен 1) слабой изученностью их химического состава;
2) высоким содер жанием;
3) интересным набором синтезируемых экдистероидов;
4) широким распространением вида на территории Монголии. Из надземной части Silene repens выделено 5 экдистероидов: 2-дезоксиэкдизон, 2-дезокси-20 гидроксиэкдизон, полиподин В, 20-гидроксиэкдизон, интегристерон А (табл. 1, рис.1), структуры которых идентифицированы УФ-спектроскопией и ВЭЖХ.
Таблица 1 – Фитоэкдистероиды, изолированные из надземной части Silene repens № Экдистероиды Формула Масса выделенных Выход, экдистероидов, г % 1 2-Дезоксиэкдизон С27Н 44О5 0.0085 0. 2 2-Дезокси-20Е С27Н 44О6 0.0009 0. 3 Полиподин В С27Н 44О8 0.035 0. 4 20-Гидроксиэкдизон С27Н 44О7 0.390 0. 5 Интегристерон А С27Н 44О8 0.02 0. 1. R1 =R2= R3 = R4= H;
2. R1=R2 = R3= H;
R4= OH;
3. R1=Н;
R2= R3= R4= OH;
4. R1= R3 = Н;
R2= R4=OH;
5. R3= H;
R1= R2 = R4= ОH;
Рисунок 1 – Структуры экдистероидов, выделенных из Silene repens Таким образом, вид Silene repens, произрастающий на территории Монголии, является богатым источником фитоэкдистероидов.
3.4. Идентификация экдистероидов некоторых видов родов Silene и Elisanthe методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для изучения экдистероидного профиля выбраны Silene graminifolia, S.
jeniseensis, Elisanthe viscosa. Ранее сообщалось, что виды Silene repens, S. graminifolia, S. jeniseensis (Ревина и др., 1988) содержат 20-гидроксиэкдизон.
Имеются противоречивые данные о присутствии экдистероидов S. viscosa (Elisanthe viscosa) (Ревина и др., 1988;
Володин и др., 2002). В связи с этим пред ставляло интерес изучить химический состав экдистероидов этих видов.
Рисунок 2 – Хроматограммы ВЭЖХ бутанольных экстрактов некоторых видов родов Silene и Elisanthe Примечание – 1- 2-дезоксиэкдизон, 2- 2-дезоксиэкдизон-20-гидроксиэкдизон, 3 полиподин В, 4- 20-гидроксиэкдизон, 5- интегристерон А.
Разделение выделенных сумм экдистероидов осуществлено с помощью вы сокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматограммы комплексов эк дистероидов представлены на рисунке 2.
Установлено присутствие 2-дезоксиэкдизона, 2-дезокси-20 гидроксиэкдизона, 20-гидроксиэкдизона в экстрактах Silene graminifolia, Elisanthe viscosa, а в Silene jeniseensis - 20-гидроксиэкдизона и полиподина В.
Среди изученных видов рода Silene наиболее богатым составом экдистероидов отличается Silene repens, в которой наряду с перечисленными соединениями идентифицирован и интегристерон А.
В связи с этим проведен сравнительный анализ состава и содержания экди стероидов и других биологически активных веществ в зависимости от условий произрастания образцов Silene repens.
ГЛАВА 4. ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ И НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В РАСТЕНИЯХ SILENE REPENS 4.1. Содержание экдистероидов и некоторых биологически активных веществ в Silene repens в разных условиях обитания Естественная растительность Монголии соответствует местным климатиче ским условиям. Данная территория расположена на рубеже двух огромных резко различных по природным условиям субконтинентальных ботанико географических выделов Северной Азии и Центральной Азии, это ведет к быст рой смене растительности - от типично таежной на севере, до пустынной на юге.
Такие существенные различия позволяют оценить влияние условий произраста ния растений на качественный состав и содержание экдистероидов и других биологически активных веществ.
Проведен сравнительный анализ содержания экдистероидов в образцах дико растущих растений широко распространенной Silene repens из эколого географически удаленных мест Монголии и в образце, культивируемом в Запад ной Сибири. Качественный анализ экдистероидов образцов Silene repens из раз личных мест произрастания свидетельствут о присутствии во всех образцах 20 гидроксиэкдизона, 2-дезоксиэкдизона, полиподина В, интегристерона А. В об разцах, собранных на горе Богд и Улаандав, Эрдэнэбурен, Ховд помимо указан ных соединений содержится 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон.
Как следует из данных таблицы 2, содержание различных групп биологиче ски активных веществ в образцах Silene repens монгольского происхождения, изменяется в зависимости от высоты над уровнем моря - чем больше высота места сбора, тем выше количественные показатели дубильных веществ, алка лоидов, экдистероидов.
По всей вероятности, влияние оказывает не только высота над уровнем моря, но и влажность местности. Такой вывод сделан на основании того, что образцы и 4, произрастающие на высоте 2326 и 2167 м соответственно, но на берегах рек имеют такие же низкие значения, как и образцы 5 и 7, собранные на высоте и 1215 м.
Наибольшее содержание изученных биологически активных веществ обна ружено в образцах, произрастающих на высоте 2200-2348 м над уровнем моря, а наименьшее - на высоте 1215-1360 м.
Таблица 2 – Содержание биологически активных веществ в надземной части Silene repens в зависимости от условий произрастания № Место сбора Высота Содержание биологически активных образца над веществ, % уровнем 20- Дубильные Алкалоиды моря, м Гидрокси- вещества экдизон 1 Хребет Хантайшира, 2348 0.80±0.03 2.56±0.04 1.3±0. (лесная опушка) 2 Их Улан даваа 2326 0.20±0.01 1.25±0.03 0.4±0. (на берегу реки) 3 г. Богд 2246 1.10±0.03 2.10±0.03 1.5±0, (лесная опушка) 4 Хужирт 2167 0.40±0.02 1.08±0.03 0.5±0, (на берегу реки) 5 Салхит, Эрдэнэбу- 1360 0.35±0.01 0.93±0.02 0.3±0. рен, Ховд (межгор ная долина) 6 г. Улаандав, Эрдэнэ- 2200 0.71±0.03 1.62±0.04 1.2±0. бурен, Ховд 7 Харганат, Эрдэнэбу- 1215 0.35±0.01 0.70±0.02 0.5±0. рен, Ховд (на берегу реки) 8 Есонбулаг,Говь- 2150 0.63±0.02 1.23±0.03 0.6±0. Алтай (степь) Таким образом, растения, произрастающие на Хребте Хантайшира (2348 м) и горе Богд (2246 м), характеризуются наилучшими количественными показателя ми исследованных биологически активных веществ, обусловленными, вероятно, сухим климатом и значительной высотой над уровнем моря.
При изучении различных факторов, влияющих на синтез биологически актив ных веществ, исследован набор микроэлементов почв, на которых произрастали образцы растений. Атомно-эмиссионый анализ почв трех мест сбора образцов Silene repens в Монголии, а также почвы Сибирского ботанического сада - места интродукции показал, что в почве горы Богд содержание Cu, Mn, Bа, Ti, выше чем, у других образцов Монголии (табл. 3). Из литературных данных (Гринкевич и др., 1970;
1983;
Ноздрюхина, Гринкевич, 1980) известно, что марганец и медь активируют ферменты, участвующие в биогенезе изученных биологически ак тивных веществ. По всей вероятности, высокое содержание этих биологически активных веществ в некоторых образцах смолевки ползучей обусловлено также повышенным уровнем марганца в почвах.
Высокое содержание Mn и сравнительно одинаковое Co в почвах Сибирского ботанического сада (Томск), вероятно, не оказывают превалирующего действия на метаболизм исследованных биологически активных веществ в интродуциро ванных растениях в условиях с высокой влажностью.
Таблица 3 – Результаты количественного спектрального анализа микроэлемен тов почв в местах произрастания Silene repens (мкг/г) Образцы Cu Mn Ba V Cr Ni Ti Мо Co Zn г. Богд 48 688 335 114 23 17 3154 24 10 Есонбулаг, 43 674 330 118 646 62 2908 12 12 Говь-Алтай Харганат, Эрдэ- 19 539 288 114 54 27 3050 27 10 нэбурен, Ховд СибБС 46 688 290 109 77 34 4193 15 12 Подтверждение влияния отдельных микроэлементов на синтез экдистероидов получено в результате дальнейшего исследования (глава 5).
4.2. Динамика накопления экдистероидов в растениях Silene repens раз личного происхождения Изучено распределение 20Е в органах растений Silene repens, интродуциро ванных в Сибирском ботаническом саду с Алтая и Монголии в различные фазы вегетации. Наибольшее содержание 20Е в надземной части алтайского образца отмечается в фазу интенсивного роста и развития растений – цветение. Доста точно большое содержание отмечено в корнях, а наименьшее в стеблях в тече ние всего вегетационного периода (рис. 3). Максимальное количество 20Е отме чено в цветках и бутонах (1.07;
1.00 %). Сравнительный анализ динамики со держания 20Е в образцах Silene repens с Алтая и Монголии, интродуцированных в Западную Сибирь, свидетельствует об идентичности характера изменений в течение вегетации. Наблюдается высокое содержание 20Е в фазу цветения, а наименьшее в фазу плодоношения. Однако для интродуцента Silene repens мон гольского происхождения почвенно-климатические условия и высотный уровень на экспериментальном участке Сибирского ботанического сада ТГУ являются нетипичны ми. Возможно, этим и объясняется низкое содержание экдистероидов. Следует отме тить, что в надземной части интродуцента алтайского происхождения, из более сходного климатическим условиям Томского региона, уровень 20Е выше, чем у интродуцента, семена которого были собраны в Монголии (на берегу реки Хар ганат, 1215 м). При этом надземная часть дикорастущего образца в Монголии в фазе цветения содержала в 3 раза больше 20Е, чем интродуцированного. По всей вероятности, на содержание экдистероидов оказывает влияние как высота над уровнем моря, так и влажность воздуха. При этом сохраняется общий характер изменения содержания 20Е в течение вегетационного периода.
1, ьт 1, Содержание 20-гидроксиэкдизона, % o 0, 0, 0, 0, 0, Бутонизация Цветение Вегетация Плодоношение Фаза развития Стебель Лист Корень Цветы Бутон Плоды Рисунок 3 – Динамика содержания 20-гидроксиэкдизона в различных органах Silene repens с Алтая, выращиваемого в Сибирском ботаническом саду ТГУ Таким образом, синтез экдистероидов, дубильных веществ и алкалоидов у изученных образцов Silene repens сильно зависит от условий произрастания. Это выражается в количественных и качественных изменениях экдистероидного со става у растений из различных географических пунктов в связи с влиянием ме теорологических условий и переносом растений (семенами) из условий естест венных местообитаний в условия культуры. По-видимому, положительно влия ют на накопление экдистероидов дефицит увлажнения, высокие температуры в вегетационный период и большая продолжительность солнечного сияния, харак терные для Монголии.
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ НА ВСХОЖЕСТЬ СЕМЯН, РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ И УРОВЕНЬ ЭКДИСТЕРОИДОВ 5.1. Влияние микроэлементов на всхожесть семян и содержание экдисте роидов в Silene frivaldszkyana Hampe.
Из литературных данных (Бойченко, 1968;
Гринкевич и Сорокина, 1983;
Гринкевич и др., 1973;
Ковальский и др., 1974) следует, что на синтез терпенои дов (экдистероидов, сердечных гликозидов, сапонинов и др.) оказывают влияние следующие микроэлементы: Mn, Mo, V, B, Se. Ранее было показано (Алексеева, 2007), что марганец, экзогенно введенный в Ajuga reptans L., незначительно по вышает содержание экдистероидов.
Изучено влияние этого микроэлемента, а также других на синтез экдистерои дов в видах рода Silene. В качестве модельных растений выбраны виды флоры Европы – Silene frivaldszkyana, Silene linicola, которые впервые рекомендованы в качестве источников экдистероидов Л. Н. Зибаревой и сотрудниками (1997) и успешно интродуцированы в Сибирском ботаническом саду ТГУ.
Влияние микроэлементов на прорастание семян оценивали по всхожести, а его действие на рост проростков - по длине побега и содержанию экдистероидов (табл. 4).
Таблица 4 – Влияние микроэлементов на всхожесть семян, рост и содержание экдистероидов в проростках Silene frivaldszkyana Микро- Концентрация Всхожесть, Высота про- Содержание элементы растворов, М % ростков,см 20Е, мг/г Контроль - 94±0.4 1.41±0.01 6.5±0. 10- Mn 80±0.5 0.43±0.01 1.0±0. 10-2 94±0.4 0.99±0.02 4.1±0. 10-3 95±0.6 1.31±0.01 5.4±0. 10-4 98±0.6 1.40±0.02 9.7±0. 10-5 96±0.5 1.41±0.02 7.1±0. 10- Мо 0 0 3.3*±0. 10-2 93±0.3 0.31±0.01 4.0±0. 10-3 94±0.5 0.48±0.02 6.0±0. 10-4 95±0.3 1.33±0.02 9.0±0. 10-5 95±0.3 1.32±0.03 7.4±0. 10- Со 52±0.3 0 3.2*±0. 10-2 92±0.4 0.23±0.02 3.3±0. 10-3 94±0.5 0.35±0.02 4.0±0. 10-4 96±0.6 1.52±0.03 10.0±0. 10-5 96±0.6 1.50±0.03 9.8±0. Примечание – *содержание 20Е определено в обработанных семенах При обработке семян раствором сульфата марганца концентрации 10-4 М проростки и первые пары листьев появились на один день раньше, а у семян, обработанных раствором концентрации 10-1 М проростки появились на 4 дня позже, чем в контроле. Высокие концентрации (10-1 М) снижали как всхожесть семян (14 %) так и содержание 20Е (в 6.5 раз) по сравнению с контролем.
Концентрированный раствор (10-1 М) молибдата аммония полностью подав лял всхожесть семян, тогда как при обработке раствором нитрата кобальта (10- М) уменьшилась на 42 % по сравнению с контролем.
При использовании всех солей в концентрациях 10-2 - 10-3 М наблюдалось в меньше степени ингибирование ростовых процессов растений Silene frivaldszkyana. Низкие концентрации солей 10-4 - 10-5 М стимулировали как всхожесть, рост и развитие опытных растений, так и синтез экдистероидов.
Высокое содержание 20Е наблюдалось в проростках, обработанных 10-4 М растворами всех микроэлементов, в 1.4-1.5 раза выше, по сравнению с контро лем.
Для дальнейшего изучения влияния микроэлементов на различные показате ли растений, использованы растворы солей в оптимальной концентрации 10-4 М.
5.2. Влияние микроэлементов на развитие растений и содержание экди стероидов Silene linicola C.C. Gmelin.
В качестве объекта исследования выбран однолетний вид Silene linicola. Рас тения обрабатывали различными способами (предпосевным, внекорневым и корневым) растворами солей марганца, молибдена, кобальта в концентрации 10- М. Из данных, приведенных в таблице 5 следует при предпосевной обработке раствором сульфата марганца содержание 20Е сохраняется на уровне контроля, тогда как при внекорневой и корневой увеличивается в 2 и 2.4 раза соответст венно. При корневой подкормке наблюдается незначительное увеличение роста Таблица 5 – Некоторые показатели надземной части растений Silene linicola (фаза цветения) Микро- Способ Сухая масса, Высота рас- Содержание элементы обработки г/растение тения, см 20Е, мг/г Контроль 0.21 ± 0.02 43.64 ± 1.5 4.7 ± 0. Предпосевной 0.18 ± 0.02 42.85 ± 1.0 4.7 ± 0. Mn Внекорневой 0.23 ± 0.01 42.71 ± 1.52 9.4 ± 0. Корневой 0.23 ± 0.01 44.35 ± 1.27 11.1 ± 0. Предпосевной 0.23 ± 0.02 45.37 ± 1.63 8.4 ± 0. Mo Внекорневой 0.16 ± 0.01 39.0 ± 0.41 1.8 ± 0. Корневой* - - Предпосевной 0.17 ± 0.01 47.50 ± 1.14 9.6 ± 0. Co Внекорневой 0.26 ± 0.02 47.27 ± 1.2 13.5 ± 0. Корневой 0.27 ± 0.02 47.75 ± 1.3 7.1 ± 0. Примечание – * растения погибли до фазы цветения растений, а при предпосевной и внекорневой уменьшение по сравнению с кон тролем.
Молибдат аммония подавлял развитие опытных растений при корневой под кормке, в результате чего они погибли до фазы цветения, а при внекорневой на блюдается уменьшение всех показателей. Тогда как предпосевная обработка привела к их увеличению содержания экдистероидов на 3.7 мг/г (в 1.8 раза) по сравнению с контролем.
Раствор нитрата кобальта благоприятно влиял на содержание 20Е во всех ва риантах обработок. Наблюдалось увеличение его содержания на 8.8, 4.9 и 2. мг/г при внекорневой, предпосевной и корневой обработках соответственно.
Все виды обработок нитратом кобальта способствовали увеличению и биологи ческих показателей, за исключением биомассы при предпосевном способе.
Таким образом, максимальное положительное влияние на биологические и химические параметры оказал раствор нитрата кобальта в концентрации 10-4 М при внекорневой обработке.
Изучение содержания экдистероидов в семенах обработанных растений Silene linicola показало, что на биологические и химические характеристики се мян благотворно влияли кобальт при предпосевной и внекорневой обработке, а также марганец при опрыскивании надземной части. Следует заметить, что мак симальное увеличение уровня экдистероидов наблюдалось при внекорневой об работке раствором нитрата кобальта и составило 6.6 мг/г (в 2 раза). Кроме того, масса семян, количество плодов и плодоносящих растений в этом варианте больше, чем в контрольных образцах.
Внекорневая обработка сульфатом марганца привела к некоторому увеличе нию содержания экдистероидов в семенах (на 1.13 мг/г) по сравнению с контро лем. В результате предпосевной обработки биосинтез экдистероидов в плодах уменьшился на 1.5 мг/г. При всех способах обработок раствором молибденсо держащей соли содержание искомых соединений в семенах меньше, чем в кон троле.
Предположение о влиянии таких микроэлементов, как марганец, молибден и кобальт на ростовые процессы и синтез экдистероидов вызвало интерес к изуче нию их содержания как в растениях, так и в почвах. При корневой и внекорневой обработке солью марганца наблюдается значительное увеличение внесенного микроэлемента в растениях (2.4 и 2 раза), в то время как в почве оно сохраняется примерно на одном уровне. Эти же способы обработок раствором молибдена аммония привели к повышению его уровня как в почвах, так и в растениях, и уменьшению содержания экдистероидов в 6.7 и 2.6 раза по сравнению с контро лем. Визуально наблюдалась токсичность молибдена по отношению к растени ям, и, по всей вероятности, по этой причине растения погибли, не достигнув ге неративных фаз развития.
В зависимости от способа экзогенного введения кобальт аккумулируется ли бо в почве (корневой), либо растениях (внекорневой). Максимальное содержание 20Е отмечено при опрыскивании растений.
Проведенные эксперименты свидетельствуют о влиянии кобальта, марганца, и молибдена на биосинтез экдистероидов и развитие растений. Поскольку в био генезе стероидных соединений велика роль коэнзима А (Гудвин и Мерсер, 1986), являющегося универсальным предшественником стероидов растительного про исхождения, включая фитоэкдистероиды, для синтеза которого необходимы в качестве катализаторов наряду с АТФ, марганец и молибден, то, по всей вероят ности, экзогенное введение микроэлементов и обусловило повышение уровня фермента, а следовательно и экдистероидов.
ВЫВОДЫ 1. Исследование флоры Западной Монголии на присутствие экдистероидсо держащих видов показало, что из 297 проанализированных видов обнаружено продуцентов экдистероидов, в том числе 7 новых. Среди покрытосеменных рас тений экдистероиды впервые обнаружен в 4 видах семейства Саryophyllaceae:
Silene ichebogdo, Silene mongolica, Silene turgidа, Elisanthe aprica, двух предста вителях Chenopodiaceae: Chenopodium frutescens, Axyris prostrata, а также Serratula marginata (Asteraceae). В роде Elisanthe экдистероиды обнаружены впервые.
2. В экдистероидсодержащих видах установлено наличие алкалоидов, флаво ноидов, кумаринов, дубильных веществ. Впервые изучены дубильные вещества в этих растениях, а также биологически активные вещества Chenopodium frutescens.
3. Идентифицированы экдистероиды Silene repens, Silene graminifolia, Silene jeniseensis, Elisanthe viscosa методом колоночной и высокоэффективной жидко стной хроматографии. Наиболее богатым источником в качественном и количе ственном отношении является вид Silene repens, из которого выделено 5 экди стероидов: 2-дезоксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, полиподин В, 20 гидроксиэкдизон, интегристерон А.
4. Изучение влияния условий произрастания на состав и содержание биоло гически активных веществ в Silene repens показало, что с увеличением высоты над уровнем моря изменяется качественный состав экдистероидов и повышается содержание биологически активных веществ.
5. В результате сравнительного изучения динамики накопления 20 гидроксиэкдизона по органам и фазам в образцах Silene repens, культивируемых из Монголии и Алтая, установлено, что фазой максимального накопления явля ется цветение, однако уровень в монгольском интродуценте значительно ниже, чем в исходном и алтайском образцах.
6. Показано, что высокий уровень изученных биологически активных ве ществ Silene repens сопровождается большим содержанием Cu, Mn в почве.
7. Изучено влияние некоторых микроэлементов на всхожесть семян, развитие растений и содержание экдистероидов в видах рода Silene. Установлено, что Mn, Мо, Co благоприятно влияют на развитие растений и биосинтез экдистероидов при различных способах обработки растений.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Мунхжаргал Н. Поиск экдистероидсодержащих видов во флоре Монголии и Русского Алтая / Н. Мунхжаргал, Л. Н. Зибарева, Д. Оюунчимэг, А. И. Пяк // Вестник ТГУ. – 2007. № 305. – С. 192–207.
2. Зибарева Л.Н. Идентификация фитоэкдистероидов в некоторых видах рода Silene L (Caryophyllaceae) / Л. Н. Зибарева, Р. Лафон, Н. Мунхжаргал, Н. А. Иванова // Вестник ТГУ. – 2008. № 307. – С. 157–160.
В других изданиях:
3. Мунхжаргал Н. Поиск продуцентов анаболиков, адаптогенов, радиопро текторов во флоре Сибири и Монголии / Н. Мунхжаргал, Л. Н. Зибарева, А. И. Пяк, Д. Оюунчимэг // Природные и интеллектуальные ресурсы Сибири (СИБРЕСУРС-13-2007): Доклады (материалы) 13-й Международной научно практической конференции. – Кемерово, 2007. – С. 354–357.
4. Мунхжаргал Н. Экдистероидсодержащие виды во флоре Монголии и Ал тая / Н. Мунхжаргал, Л. Н. Зибарева, Д. Оюунчимэг, А. И. Пяк // Природные ус ловия, история и культура Западной Монголии и сопредельных регионов: Мате риалы международной конференции. – Горно-Алтайск, 2007. – С. 170–175.
5. Мунхжаргал Н. Хемотаксономический подход к поиску экдистероидов в семействе Caryophyllaceae флоры Сибири и Монголии / Н. Мунхжаргал, Л. Н. Зибарева, А. И. Пяк, Д. Оюунчимэг // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии: Труды 6-ой международной научно-практической конференции. – Барнаул, 2007. – С. 316–318.
6. Мунхжаргал Н. Флора Монголии – источник перспективных лекарствен ных растении / Н. Мунхжаргал, Л. Н. Зибарева // Культуры и народы северной Азии и сопредельных территорий в контексте междисциплинарного изучения. – Томск, 2008. – Вып. 2.– С. 309–310.
7. Мунхжаргал Н. Влияние некоторых микроэлементов на всхожесть семян и содержание экдистероидов Silene frivaldszkyana Hampe. / Н. Мунхжаргал, Л. Н. Зибарева // Проблемы биологии, экологии, географии, образования: исто рия и современность: Материалы 2-ой международной научно-практической конференции. – СПб., 2008. – С. 108–110.
8. Zibareva L. N. Chemotaxonomic usefulness of phytoecdysteroid profiles in the genus Silene (Caryopyllaceae) / L. N. Zibareva, V. I. Yeromina, N. Munkhjargal, J.
P. Girault, L. Dinan, R. Lafont // XVII Ecdysone Workshop, Ulm. – Germany, 2008. – 111 p.
9. Мунхжаргал Н. Виды семейства Gentianaceae – перспективные источники экдистероидов, ксантонов и иридоидов / Н. Мунхжаргал [и др.].
// Биоразнообразие, проблемы экологии Горного Алтая и сопредельных регио нов: Материалы международной конференции. – Горно-Алтайск, 2008. – С. 101– 104.
10. Зибарева Л. Н. Новые фитоэкдистероиды в видах рода Silene L.
(Caryophyllaceae) / Л. Н. Зибарева, Р. Лафон, Н. Мунхжаргал // Новые достиже ния в химии и химической технологии растительного сырья: IV всероссийской научной конференции. – Барнаул, 2009. – C. 220-222.