Анализ аллельных вариантов waxy-генов и межмикросателлитных маркеров сортов triticum aestivum l. среднего и южного урала
На правах рукописи
БОБОШИНА ИРИНА ВИКТОРОВНА АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ WAXY-ГЕНОВ И МЕЖМИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ СОРТОВ TRITICUM AESTIVUM L. СРЕДНЕГО И ЮЖНОГО УРАЛА 03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2013
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ)
Научный консультант: доктор биологических наук, доцент Боронникова Светлана Витальевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Горбунова Валентина Юрьевна ФГБОУ ВПО Башкирский государственный педагогический университет им. М. Акмуллы, профессор кафедры генетики доктор биологических наук, профессор Нецветаев Владимир Павлович ГНУ Белгородский научно-исследовательский институт сельского хозяйства РАСХН, заведующий лабораторией селекции и семеноводства пшеницы Ведущее учреждение: ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева
Защита состоится 21 ноября 2013 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71.
ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН:
ibg.anrb.ru e-mail: [email protected] Автореферат разослан 21 октября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.
Актуальность темы. Пшеница мягкая (Triticum aestivum L.), под посевами которой занято 216 млн. га, является основной зерновой культурой для 35% населения земного шара (Vasil, 2007). Возможность улучшения хозяйственно ценных признаков при внутривидовых (межсортовых) скрещиваниях в настоящее время ограничивается тем, что в существующих селекционных программах используются наборы одних и тех же основных элитных сортов (Абугалиева и др., 2012). По этой причине актуальным является исследование генетического разнообразия сортов T. aestivum – задачи, важной для совершенствования селекционной работы за счет использования всего генетического потенциала вида (Sofalian et al., 2009). Для изучения и мониторинга внутривидового генетического разнообразия, как в разных географических регионах, так и в коллекциях, сохраняющих генофонд вида, а также для выявления подлинности сортов и их родословных, все более важной проблемой становится регистрация сорта, его сертификация и защита авторских прав селекционеров (Zhu et al., 2011;
Новосельская-Драгович и др., 2013).
Молекулярное маркирование сортов пшеницы мягкой в настоящее время осуществляется с использованием различных подходов, среди которых использование мультилокусных ДНК-маркеров (Pasqualone et al., 2000;
Салина и др., 2008;
Tagizad et al., 2010;
Milad et al., 2011;
Abouzied, 2011;
Funda, Ahu, 2013;
Mitrofanova et al., 2013) и идентификация аллельных вариантов генов, контролирующих хозяйственно важные признаки (Nakamura et al., 2002;
Vanzetti et al., 2009;
Saito et al., 2010;
Климушина и др., 2012;
Потокина и др., 2012;
Абдулина и др., 2013;
Чеботарь и др., 2013). Однако анализ аллельных вариантов генов Wx и межмикросателлитных маркеров сортов пшеницы мягкой, используемых в таких регионах рискованного земледелия Среднего и Южного Урала как Пермский край и Республика Башкортостан, климат которых характеризуется холодной продолжительной и снежной зимой, теплым коротким летом и ярко выраженными температурными инверсиями (Назаров, 2006;
Давлетшин, Атнагулов, 2010), ранее не проводился.
Цель исследований – анализ генетического разнообразия, выявление межмикросателлитных маркеров и аллельных вариантов Waxy-генов у 41 сорта T. aestivum, допущенных к использованию, снятых с испытания и проходящих сортоиспытания в Пермском крае и в Республике Башкортостан.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) провести анализ полиморфизма межмикросателлитных (ISSR – Inter Simple Sequence Repeats) маркеров у 41 сорта T. aestivum;
2) определить генетические расстояния между изученными сортами T. aestivum и их сходство на основании данных межмикросателлитного анализа;
выявить полиморфные их сочетания или 3) ISSR-маркеры, сортоспецифичные ISSR-маркеры для каждого сорта T. aestivum;
4) изучить у 41 сорта T. aestivum аллельные варианты генов Waxy, кодирующих гранул-связанную синтазу крахмала и детерминирующих содержание амилозы в зерновке, оценить возможность их использования для ранжирования изучаемых сортов по содержанию амилозы в эндосперме зерновки;
определить коэффициенты генетической оригинальности (КГО) 5) используемых сортов T. aestivum;
разработать подход и провести молекулярно-генетическую 6) идентификацию изучаемых сортов T. aestivum с использованием ISSR-маркеров и маркеров к генам Waxy.
Научная новизна работы. Проведен молекулярно-генетический анализ сорта T. aestivum, допущенных к использованию, снятых с испытания и проходящих сортоиспытание в Пермском крае и в Республике Башкортостан;
дана оценка генетического сходства сортов пшеницы мягкой с использованием полиморфизма межмикросателлитных маркеров. Получены и систематизированы данные о генетическом разнообразии 41 сорта T. aestivum, используемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан, по аллельным вариантам Waxy генов, детерминирующих содержание амилозы в зерновке. У трех сортов выявлен полиморфизм по функциональным аллелям гена Установлены Wx-B1.
коэффициенты генетической оригинальности изученных сортов. Впервые разработаны подходы и проведена идентификация 41 сорта T. aestivum, используемых в Пермском крае и Республике Башкортостан, на основе двух типов молекулярных маркеров – ISSR-маркеров и маркеров к генам Waxy. Полученные результаты наглядно представлены в молекулярно-генетической формуле изученных сортов.
Практическая значимость диссертационной работы заключается в оценке генетического разнообразия 41 сорта T. aestivum на основании надежной и недорогой методики анализа полиморфизма ISSR-маркеров и распределения аллельных вариантов Waxy-генов, детерминирующих содержание амилозы в зерновке. В зависимости от специфики генетического разнообразия сорта предложены три подхода молекулярно-генетической идентификации изученных сортов. Результаты исследований и практические рекомендации диссертации предлагаются для использования Министерством сельского хозяйства РФ, научными учреждениями, селекционными станциями, высшими учебными заведениям, для разработки программ селекции сортов для T. aestivum, генетической идентификации сортов пшеницы мягкой с целью защиты авторских прав селекционеров, включая сертификацию и регистрацию сортов. Информация о степени генетического сходства сортов, полученная по данным межмикросателлитного анализа, облегчит подбор родительских пар при гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в гибридном потомстве, что позволит повысить эффективность селекционного процесса. Результаты исследований могут быть использованы для оптимизации методов сортовой идентификации и селекции сортов с высокими технологическими свойствами зерна и хорошими хлебопекарными свойствами муки. Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» и ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н.
Прянишникова», что подтверждено 2 актами внедрения.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (2010- гг.), НИР «Оценка состояния генофондов и популяционных систем ресурсных видов растений при естественных колебаниях и антропогенной трансформации среды с использованием новых геномных и биоинформационных технологий» государственного задания на оказание услуг Министерства образования и науки РФ (2012-2014 гг.), программы развития ПГНИУ как национального исследовательского университета «Рациональное природопользование:
технологии прогнозирования и управления природными и социально экономическими системами» (2010-2019 гг.).
Личный вклад автора. Автором лично проведены выбор молекулярных маркеров и методов молекулярно-генетического анализа, сбор материала, лабораторные исследования, выполнена обработка, анализ, обобщение и интерпретация результатов, сопоставление их с литературными данными, написание и оформление диссертационной работы. Подготовка публикаций выполнена лично или при активном участии автора.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы были представлены и обсуждались на 15 научных и научно-практических конференциях, в их числе 8 международных: «ЕС – Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» (Уфа, 2010);
«Антропогенная трансформация природной среды» (Пермь, 2010);
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов на-Дону, 2011);
«Актуальные проблемы ботаники и экологии» (Киев, 2011);
«Биология растений и биотехнология» (Белая Церковь, Украина, 2011);
«Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование» (Пермь, 2011);
«Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва-Звенигород, 2011);
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013);
4 Всероссийских конференциях: «Fundamental Medicine: From Scalpel Toward Genome, Proteome and Lipidome» (Kazan, 2011);
«Актуальные проблемы генетики человека, растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012);
«Актуальность наследия Н.И.Вавилова для развития биологических и сельскохозяйственных наук» (С.-Петербург, 2012);
««Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии» в рамках фестиваля науки» (Уфа, 2012);
3 Всероссийских с международным участием: «Симбиоз-Россия 2011» (Воронеж, 2011);
«Симбиоз Россия 2012» (Тверь, 2012);
«Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых журналах из перечня ВАК и публикаций в других журналах и материалах конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 8 рисунков. Список литературы включает 263 источника, в том числе 115 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за семена сортов пшеницы мягкой сотрудникам ГНУ «Пермский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (г. Пермь), Ординского и Березовского ГСУ Пермского края, Абзелиловского и Давлекановского ГСУ Республики Башкортостан и ГНУ «Башкирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» (г. Уфа), к.с-х.н., заведующему лабораторией озимых культур Н.И.
Лещенко и заведующему лабораторией яровых культур к.с.-х.н. В.И. Никонову Чишминского селекционного центра БНИИСХ;
за информацию по характеристикам сортов – сотруднику Ординского ГСУ Пермского края Т.А. Федосеевой, заведующему отделом селекции ГНУ «Ульяновский научно исследовательский институт сельского хозяйства» В.Г. Захарову и научному сотруднику лаборатории селекции яровой пшеницы ГНУ «Воронежский научно исследовательский институт сельского хозяйства имени В.В. Докучаева» РАСХН А.А. Хорину. Искренняя благодарность за поддержку выражается коллегам по лаборатории.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы Приведено ботаническое описание объекта исследования – Triticum aestivum L. (Флора СССР, 1934;
Фляксбергер, 1935;
Жуковский, 1971;
Тахтаджян, 1987;
Дорофеев и др., 1987;
Амосова, Бадаева, 2008);
рассмотрены вопросы молекулярно-генетического анализа и генетического картирования T. aestivum (Zietkiewicz еt al.,1994;
Nakamura et al., 2002;
Беккужина, Кочиева, 2005, 2008;
Пшеничникова и др., 2006, 2008;
Вдовиченко, Глазко, 2007;
Петрова и др., 2007;
Sofalian et al., 2009;
Vanzetti et al., 2009;
Saito et al., 2010;
Milec et al., 2011;
Shcherban et al., 2011;
Климушина и др., 2012;
Нецветаев и др., 2012;
Brenchley et al., 2012;
Абдулина и др., 2013). Особое внимание уделено исследованиям по сортовой идентификации T. aestivum (Созинов, 1985;
Chen et al., 1994;
Kim, Ward, 2000;
Малышев и др., 2006;
Кудрявцев, 2007;
Панин, 2011а;
Панин, 2011б).
Регионы и объекты исследований В качестве объектов исследований избраны сорта пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.), допущенные к использованию, снятые с испытания и проходящие сортоиспытания (табл. 1) в Пермском крае и в Республике Башкортостан, входящих в состав Приволжского федерального округа. Пермский край расположен на западном склоне Уральских гор, в бассейне верхней и средней Камы. Республика Башкортостан занимает большую часть Южного Урала и прилегающие к нему равнины Башкирского Предуралья и возвышенно-равнинную полосу Башкирского Зауралья.
Таблица Исследованные сорта T. aestivum № № в Госреестре / год Сорт Регион допуска п/п включения Московская 1 9501070 / 1999 2,3,4,5,7, Волжская К 2 9907408 / 2004 2,3,4,5,7,9, Иргина 3 8800359 / 1991 1,2, Ирень 4 9601678 / 1998 1, 2, 3, 4, 9, 10, Стрела исключен 5 Красноуфимская 6 9908498 / 2003 2,4, Свеча 7 9610100 / 2006 1, Горноуральская 8 9359827 / 2009 4, Терция 9 9300473 / 1995 9,10, Экада 10 9553774 / 2007 4, 7, Экада 11 8953944 / 2013 4, 5, 7, Штру 06 на испытании – Штру 05 на испытании – Икар 14 9900772 / 2001 4, Баженка 15 9154791 / 2011 Гамлет на испытании – Диаблон на испытании – Терси на испытании – Уралосибирская 19 9052749 / 2012 9,10, Ярица на испытании – Красноуфимская 110 на испытании – Башкирская 4 исключен – Башкирская 23 9905570 / 2004 Башкирская 24 9253353 / 2010 Жница исключен – Фотос (линия 40959) исключен – Башкирская 27 9252106 / 2010 4, Башкирская 9 исключен – Лютесценс 29 9003320 / 1993 Сертори на испытании – Черноземноуральская 31 9052688 / 2013 Сурская Юбилейная на испытании – Башкирская 24 исключен 33 Салават Юлаев 34 9464124 / 2008 Ватан 35 9253739 / 2010 Тулайковская Золотистая 36 9811632 / 2006 7,8, Тулайковская 37 9908226 / 2003 3, 4, 5, 7, Окончание таблицы № № в Госреестре / год Сорт Регион допуска п/п включения Тюменская 31 на испытании – Ульяновская 39 9052790 / 2012 7, ЦХ Кампала на испытании – Сударыня 41 9052538 / 2012 2,3, Примечание: регионы допуска обозначены в соответствии с Государственным реестром селекционных достижений Российской Федерации.
Жирным шрифтом выделены: 4 – Волго-Вятский регион, к которому относится Пермский край, 9 – Уральский регион, к которому относится Республика Башкортостан (Государственный реестр…, 2013).
С 2009 по 2013 годы были проведены исследования 41 сорта T. aestivum категорий «элита» и «суперэлита», семена которых были получены из ГНУ «Пермский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (г.
Пермь), Ординского и Березовского ГСУ Пермского края, Абзелиловского и Давлекановского ГСУ Республики Башкортостан, ГНУ «Башкирский научно исследовательский институт сельского хозяйства» (БНИИСХ, г. Уфа) и Чишминского селекционного центра БНИИСХ. Выбор сортов T. aestivum в качестве объектов исследований из двух субъектов Российской Федерации обоснован возможностью изучения используемых сортов в одном долготном меридиане на протяжении около 1000 км, что предполагает высокое генетическое разнообразие сортов и их адаптацию к различным условиям окружающей среды.
Исследования проведены в молекулярно-генетической лаборатории кафедры ботаники и генетики растений биологического факультета и в НИЛ «Молекулярной биологии и генетики» ЕНИ ПГНИУ.
Методы исследований Для выделения ДНК и проведения молекулярно-генетического анализа, семена сортов T. aestivum были пророщены в лабораторных условиях (ГОСТ 12038-84). Выделение ДНК из проростков проведено по методике А. Торрес и др.
(Torres et al., 1993) с небольшими модификациями. Материал для молекулярно генетического анализа взят в нескольких повторностях для верификации полученных данных. У каждого изучаемого сорта проанализировано не менее проростков в течение 3-х лет (2010-2012 гг.). Концентрация и спектральная характеристика ДНК определены на приборе SpectrofotometrTM NanoDrop («Thermo scientific», США). Для ПЦР-анализа была использована геномная ДНК с концентрацией 10 нг/мкл в TE-буфере. Молекулярно-генетический анализ проведен с использованием ISSR (Inter-Simple-Sequence-Repeats)-метода (Zietkiewicz et al., 1994). Амплификация ДНК проведена с использованием реакционной смеси типичного для ISSR-метода состава в термоциклерах Gene Amp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США) и MyCycler («BioRad», США) по стандартной для межмикросателлитного анализа программе (Молекулярная генетика…, 2007). Эффективность выявления полиморфизма ISSR-праймеров рассчитана в соответствии со шкалой 1–5 (Календарь, Боронникова, 2007).
Протестированы 23 ISSR-праймера, из которых были отобраны для дальнейшего анализа 5: M1 (AC)8CG, M3 (AC)8CT, M27 (GA)8C, X10 (AGC)6C, Х11 (AGC)6G.
При проведении ПЦР температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 46°С до 56°С. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь вместо ДНК добавлено 5 мкл деионизированной воды.
Продукты амплификации разделены электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в х ТВЕ буфере, окрашены бромистым этидием и сфотографированы в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR («Bio-Rad», США). Для определения размеров амплифицированных фрагментов использованы маркер длины фрагментов ДНК (100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder, ООО «СибЭнзим М», Москва) и программа Quantity One («Bio-Rad», США). Для проверки достоверности полученных результатов ПЦР повторены не менее четырех раз.
Компьютерный анализ полиморфизма ДНК проведен с помощью общепринятых компьютерных программ (Yeh et al., 1999) с определением доли полиморфных локусов (Williams et al., 1990) при Р95, абсолютного ( n a ) и эффективного ( n e ) числа аллелей (Kimura еt al., 1964), ожидаемой гетерозиготности ( Н Е ) (Nei, 1987).
Генетическое расстояние между сортами ( D ) определено по формуле M. Нея (Nei, Li, 1979). На основе матриц бинарных признаков были рассчитаны матрицы генетических различий (Nei, 1972). Далее на основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA – unweighed pair-grup method using arithmetic average) при помощи компьютерных программ Treecon 1.3b и POPGENE 1.32 были построены дендрограммы, отражающие степень сходства исследуемых сортов по ISSR-спектрам.
Для молекулярно-генетического анализа содержания амилозы в зерновке пшеницы мягкой избраны три гомеологичных гена Waxy, которые расположены (Chao et al., 1989) в хромосомах 7AS (Wx-A1), 4AL (Wx-B1) и 7DS (Wx-D1). Данные гены определяют соотношение амилоза/амилопектин в пшеничном крахмале, что имеет большое значение для технологических свойств крахмала и муки, производимой из зерновок пшеницы мягкой. Для детекции аллельных вариантов Waxy генов амплификация проведена в термоциклерах Amp PCR System («Applied Biosystems», США) и MyCycler («BioRad», США) по программам, рекомендованным разработчиками праймеров (Vrinten et al., 1999;
Nakamura et al., 2002;
Vanzetti et al., 2009). Для идентификации аллельных вариантов Wx генов T. aestivum и верификации полученных результатов были использованы по две пары праймеров к каждому гену (табл. 2).
Таблица Праймеры для идентификации аллелей Waxy-генов T. aestivum Гены Wx Праймеры Последовательности праймеров 5’-TCGTGTTCGTCGGCGCCGAGATGG-3’ AFC 5’-CCGCGCTTGTAGCAGTGGAAGTACC-3’ AR Wx-A 5’-CCCCAAAGCAAAGCAGGAAAC-3’ Wx-A1b-F-MH 5’-CGGCGTCGGGTCCATAGATC-3’ Wx-A1b-R-MH 5’-CTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACT-3’ BDFL 5’-CTGACGTCCATGCCGTTGACGA-3’ BRD Wx-B 5’-CGCAGGGGAAGACGTGGT-3’ Wx-B1L 5’-CGTTGACGATGCCGGTGATG-3’ Wx-B1R 5’-TAGTGCGTCCAGACTCACAG-3’ Wx-D1-1-F 5’-GAGATGGTCAAGAACTGCAT-3’ Wx-D1-1-R Wx-D 5’-CTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACT-3’ BDFL 5’-CTGTTTCACCATGATCGCTCCCCTT-3’ DRSL Для детекции аллелей генов Waxy реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 1 буфер для Taq-ДНК-полимеразы («Силекс», Россия), 1,0 U Taq ДНК-полимеразы («Силекс», Россия), 200 М каждого dNTP («Силекс», Россия), 0,2 М каждого праймера и 5 мкл ДНК. Концентрация хлорида магния составляла 2,5 мМ. В качестве внутреннего положительного контроля при выявлении аллелей генов Wx был использован сорт Экада 109, который по состоянию аллельных вариантов Waxy-генов ранее был изучен И.Р. Абдулиной и другими (Абдулина и др., 2013). Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2-3%-ном агарозном геле в 1 х ТВЕ-буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR («BioRad», США). В качестве маркеров длины фрагментов ДНК использованы маркеры «100 bp + 50 bp DNA Ladder» (ООО «СибЭнзим-М», Россия) и «100 bp GeneRuler» («Fermentas», Литва).
Молекулярно-генетическая идентификация сортов T. aestivum проведена на основании технологии, предложенной С.В. Боронниковой (2008), с учетом полиморфизма ISSR-маркеров и дополнением для сортов T. aestivum аллельного полиморфизма генов Waxy. Проверка всех выявленных идентификационных молекулярных маркеров у исследованных сортов проведена не менее трех раз.
Выявление специфичности ISSR-маркеров сортов T. aestivum проведено с использованием коэффициента генетической оригинальности – КГО (Потокина, Александрова, 2008). Статистическая обработка данных молекулярно генетического анализа проведена с использованием стандартных для генетических исследований программ (Yeh et al., 1999) и методов (Животовский, 1991).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ генетического разнообразия сортов T. aestivum с использованием ISSR-маркеров При молекулярно-генетическом анализе 41 сорта T. aestivum, используемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан, выявлен 71 ISSR-маркер. Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировало в зависимости от праймера от 11 (праймер Х11) до 18 (праймер Х10), а их размеры изменялись от 170 п.н. до 1370 п.н. В среднем при ISSR-анализе полиморфизма ДНК сортов T. aestivum один праймер инициировал синтез 14,2 фрагментов ДНК (рис. 1).
Рис. 1. Фрагмент ISSR-спектра сорта Башкирская 4 с праймером М1;
цифрами обозначены номера проб ДНК, М – маркер длины фрагментов ДНК Доля полиморфных локусов ( Р95 ) у изученных сортов, определенная в результате ПЦР с пятью ISSR-праймерами, в среднем составила 0,873.
Абсолютное число аллелей ( n a ) составило 1,001, а эффективное число аллелей ( n e ) равно 1,000. Генетическое расстояние ( D ) между изученными сортами T. aestivum варьировало от 0,043 (между сортами Башкирская 24 и Сертори, Икар и Баженка, Ирень и Красноуфимская 100) до 0,736 (между сортами Тулайковская 10 и Красноуфимская 100). Сходство по ISSR-спектрам изученных сортов T. aestivum демонстрирует дендрограмма (рис. 2), которая выявила разделение 41 сорта пшеницы мягкой на шесть основных кластеров. Межсортовые группировки каждой клады поддерживались высокими значениями бутстрепа (от 53 до 98%).
Рис. 2. UPGMA-дендрограмма генетического сходства 41 сорта T. aestivum;
цифрами указаны значения бутстрепа в % Изученные сорта характеризуются высоким межсортовым полиморфизмом, что объясняется, отчасти, использованием их в 10 из 12 регионах допуска, выделенных в соответствии с Государственным реестром селекционных достижений РФ (2013). Если в первой (I) и четвертой (VI) подгруппах превалируют сорта, используемые в Пермском крае, а в третьей (III), пятой (V) и шестой (VI) – сорта, используемые в Республике Башкортостан, то вторая подгруппа (II) объединила сорта, используемые и проходящие сортоиспытание в обоих регионах.
Распределение аллельных вариантов Waxy генов у изученных сортов T. aestivum Ген Wx-A1. Для идентификации гена Wx-A1 и верификации полученных результатов были использованы две пары праймеров (табл. 2). При использовании в ПЦР праймеров AFC и AR2 при наличии аллеля дикого типа амплифицируются фрагменты размером 389 п.н. (Wx-A1a), а при наличии нуль-аллеля – 370 п.н. (Wx A1b). При применении этих праймеров у изученных нами сортов T. aestivum идентифицирован аллель Wx-A1a (рис. 3).
Рис. 3. Фрагмент электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных с праймерами AFC и AR2. Цифрами обозначены пробы ДНК сортов: 1 – Московская 39, 2 – Волжская К, 3 – Иргина, 4 – Ирень, 5 – Стрела, 6 – Красноуфимская 100, 7 – Свеча, 8 – Горноуральская;
М – маркер длины фрагментов ДНК;
стрелкой указан фрагмент, характерный для аллели Wx-A1a ( п.н.) Праймеры Wx-A1b-F-MH и Wx-A1Bb-R-MH (табл. 2) амплифицируют фрагмент 671 п.н. у растений, несущих аллель Wx-A1а, и фрагмент 652 п.н. у растений, несущих аллель Wx-A1b. Продукты амплификации аллелей Wx-A1a (671 п.н.) и (652 п.н.) трудно различимы в геле, поэтому Wx-A1b последовательность аллеля Wx-A1a (671 п.н.) разрезалась рестриктазой HindIII на два фрагмента – 495 п.н. и 176 п.н. У последовательности аллеля Wx-A1b рестрикция отсутствует. При использовании в ПЦР праймеров Wx-A1b-F-MH и Wx-A1Bb-R-MH у изученных сортов установлен аллель Wx-A1a. Таким образом, изученный нами 41 сорт T. aestivum из Пермского края и Республики Башкортостан несут аллели дикого типа - Wx-A1a.
Ген Wx-В1. Для идентификации гена Wx-В1 и верификации полученных результатов были также использованы две пары праймеров. Первая пара праймеров BDFL и BRD (табл. 2), при наличии аллеля дикого типа (Wx-В1a) амплифицировала три фрагмента размером 497 п.н., 455 п.н. и 425 п.н. При наличии нуль-аллеля (Wx-В1b) в геле идентифицируются только два фрагмента, а самый легкий фрагмент (425 п.н.) отсутствует. У всех изученных сортов детектирован фрагмент 425 п.н., что указывает на наличие аллеля Wx-В1a (рис. 4).
Рис. 4. Фрагмент электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных с праймерами BDFL и BRD. Цифрами обозначены пробы ДНК сортов: 1-2 – Ватан, 3-4 – Тулайковская Золотистая, 5-6 – Тулайковская 10, 7-8 – Тюменская 31;
М – маркер длины фрагментов ДНК;
стрелками указаны детектируемые фрагменты Вторая пара праймеров Wx-B1L и Wx-B1R амплифицирует в ПЦР фрагмент 461 п.н. у проб ДНК T. aestivum, несущих аллель Wx-В1a. Отсутствие амплифицированного фрагмента указывает на наличие нуль-аллеля Wx-В1b. Кроме того, при использовании этих праймеров в ПЦР, на геле может быть виден фрагмент немного большей длины по сравнению с аллелем дикого типа (495 п.н.), характерный для функционального аллельного варианта Wx-В1е (Vanzetti et al., 2009). Анализ изученных нами сортов T. aestivum показал, что 37 сортов являются носителями аллеля Wx-В1a, 3 сорта (Башкирская 4, Башкирская 26 и Башкирская 28) несут функциональный аллель Wx-В1е. На электрофореграмме сорта Ульяновская 100 были видны два фрагмента (рис. 5), длиной 461 п.н. и 491 п.н.
Подобный результат был получен И.Р. Абдулиной с соавторами (2013). Они предположили, что наличие двух фрагментов связано с несвойственной в данном случае генерацией аллеля гена Wx-A1 длиной 491 п.н.
Рис. 5. Фрагмент электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных с праймерами Wx-B1L и Wx-B1R. Цифрами обозначены пробы ДНК сортов: 1 – Башкирская 4, 2 – Башкирская 26, 3 – Башкирская 28, 4 – Ульяновская 100;
М – маркер длины фрагментов ДНК;
темной стрелкой указан фрагмент, характерный для Wx-A1 аллеля (491 п.н.), светлой стрелкой – фрагмент, характерный для аллеля Wx-В1а (461 п.н.) Таким образом, изученные нами сорта T. aestivum характеризуются различными функциональными аллельными вариантами гена Wx-B1.
Ген Для определения аллельного состояния гена Wx-D1. Wx-D применялись две пары праймеров. При использовании BDFL и DRSL при наличии аллеля дикого типа амплифицировались фрагменты размером 2307 п.н. (Wx-D1a), а при наличии нуль-аллеля – 1731 п.н., что соответствует аллелю Wx-D1b (Nakamura et al., 2002). Из изученного нами 41 сорта T. aestivum у 35 отмечен аллель дикого типа, а у 6-ти сортов (Московская 39, Иргина, Башкирская 10, Лютесценс 9, Башкирская 24 и Салават Юлаев) в геле не выявлено амплифицированных фрагментов ДНК, что может быть вызвано ингибированием ПЦР в отдельных образцах (Nakamura et al., 2002). Вторая пара праймеров Wx-D1 1-F и Wx-D1-1-R (Vrinten et al., 1999) у сортов, несущих аллель дикого типа, амплифицирует фрагменты размером 930 п.н. (Wx-D1a), а у сортов, несущих нуль аллель – 342 п.н. (Wx-D1b). Было показано, что все исследуемые нами сорта несли аллели Wx-D1a, то есть аллели дикого типа. Таким образом, у изученных нами сортов T. aestivum, используемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан, выявлены аллели дикого типа – Wx-D1a.
Молекулярно-генетическая идентификация сортов T. aestivum с использованием ISSR-маркеров и маркеров к генам Waxy Использованные в работе ISSR-праймеры позволили получить для каждого сорта оригинальный спектр ампликонов и показали высокую информативность и стабильность. Нами выявлены семь ISSR-маркеров, характерных для всех исследованных сортов T. aestivum, и семь ISSR-маркеров, характерных для представителей только одного конкретного сорта, то есть сортоспецифичные. В частности, у сорта Московская 39 выявлен один уникальный ISSR-маркер размером 670Х10. Нами идентифицированы маркеры, специфичные для сортов Волжская К (850Х11), Фотос (200Х10), Сурская Юбилейная (500Х10), Тулайковская 10 (1350Х10), Тюменская 31 (1250Х10) и Салават Юлаев (610М3).
Установлено, что коэффициент генетической оригинальности выше у сортов, снятых с испытания (КГО=1,514), что свидетельствует о большей доле редких генотипов и их специфичности. У сортов, допущенных к использованию в Пермском крае и в Республике Башкортостан этот показатель равен 0,806 и 1, соответственно. У сортов, находящихся на сортоиспытании, КГО составил 1,068.
Это обусловлено меньшей долей редких генотипов и свидетельствует о типичности ISSR-спектров сортов T. aestivum, допущенных к использованию и находящихся на испытании.
Для каждого сорта T. aestivum был получен индивидуальный спектр ISSR маркеров, который использован нами при составлении молекулярно-генетических формул. Четко воспроизводимые ISSR-маркеры, выявленные у всех 41 сортов, были названы «видовыми» и обозначены «v» от «vid», так как эти маркеры четко воспроизводятся у всех особей изучаемого вида. Видовые ISSR-маркеры являются мономорфными. Маркеры, которые были выявлены только у некоторых сортов, были обозначены как полиморфные – «р» от «polymorph». Мономорфные маркеры позволили нам определить принадлежность особи к виду, а полиморфные маркеры при их различных сочетаниях – к конкретному сорту. Сортоспецифичные маркеры были обозначены как «us» от «unique + sort» (уникальный сортовой). С использованием установленных специфичных для каждого сорта сочетаний ISSR маркеров для идентификации сортов были отобраны минимальные наборы маркеров, позволяющие надежно идентифицировать изученные сорта.
Для составления молекулярно-генетических формул 41 сорта T. aestivum, нами использованы три подхода:
1) Для идентификации сортов пшеницы мягкой с сортоспецифичными маркерами, было отобрано по 4 видовых, 4 полиморфных и 1 сортоспецифичному ISSR-маркеру. Таким образом, были составлены формулы 7 сортов: Фотос, Московская 39, Волжская К, Сурская Юбилейная, Тулайковская 10, Тюменская и Салават Юлаев. Молекулярно-генетическая формула сортов, идентифицированных с помощью первого подхода, показана на примере в таблице 3. У всех 7 сортов T. aestivum этой группы выявлены аллели дикого типа по Waxy-генам, что позволяет прогнозировать нормальный уровень амилозы в крахмале эндосперма зерновок этих сортов.
Таблица Молекулярно-генетическая формула сорта Тулайковская 10 T. aestivum Обозначение Тип фрагментов Молекулярно-генетическая формула сорта ДНК vid Tav680X11, Tav460M1, Tav370X10, Tav240M polymorph Ta_Тул10p750М1, Ta_Тул10p1430М3, Ta_Тул Ta_Тул10p320М27, Ta_Тул10p920Х unique + sort Ta_Тул10us1350Х Примечание: Ta_ Тул10 – T. aestivum сорт Тулайковская 2) Для идентификации сортов T. aestivum, у которых нами был обнаружен молекулярный полиморфизм по аллельному состоянию гена Wx-B1, мы использовали сочетания ISSR-фрагментов и маркеров к Waxy генам. Для сортов Башкирская 4, Башкирская 26 и Башкирская 28 было отобрано по 4 видовых, полиморфных и 1 сортоспецифичному маркеру к гену Wx-B1, к сорту Ульяновская 100 отобрано 4 видовых, 2 полиморфных и 1 сортоспецифичный маркер к гену Wx-B1. Пример молекулярно-генетической формулы сортов, идентифицированных с использованием второго подхода, приведен в таблице 4.
Таблица Молекулярно-генетическая формула сорта Башкирская 4 T. aestivum Обозначение Тип фрагментов Молекулярно-генетическая формула сорта ДНК vid Tav680X11, Tav460M1, Tav370X10, Tav240M Ta_Б4 polymorph Ta_Б4р530М1, Ta_Б4р1770Х10, Ta_Б4р720М unique + sort Ta_Б4usWxB1e Примечание: Ta_Б4 – T. aestivum сорт Башкирская 3) Для идентификации 30 сортов пшеницы мягкой мы использовали сортоспецифичные сочетания видовых и полиморфных ISSR-фрагментов.
Молекулярно-генетическая формула сортов, идентифицированных посредством третьего подхода, представлена в таблице 5. Таким образом, были составлены молекулярно-генетические формулы следующих сортов: Иргина, Ирень, Стрела, Красноуфимская 100, Свеча, Горноуральская, Терция, Экада 70, Экада 109, Штру 06, Штру 05, Икар, Баженка, Гамлет, Диаблон, Терси, Уралосибирская, Ярица, Красноуфимская 110, Жница, Башкирская 10, Башкирская 9, Лютесценс 9, Сертори, Черноземноуральская 2, Башкирская 24, Ватан, Тулайковская Золотистая, ЦХ Кампала, Сударыня.
Таблица Молекулярно-генетическая формула сорта Иргина T. aestivum Обозначение Тип фрагментов Молекулярно-генетическая сорта ДНК формула vid Tav680X11, Tav460M1, Tav370X10, Tav240M Ta_ Иргp320М27, Ta_Иргр590Х11, Ta_Ирг polymorph Ta_Иргр920Х11, Ta_Иргр840Х Примечание: Ta_Ирг – T. aestivum сорт Иргина У 30 сортов T. aestivum третьей группы по Waxy-генам выявлены аллели дикого типа, что согласуется с наличием нормального уровня амилозы в крахмале эндосперма зерновок этих сортов.
Для апробации разработанных нами подходов идентификации 41 сорта T. aestivum было проведено анонимное тестирование неизвестного сорта пшеницы мягкой. Показано, что можно четко определить тестируемый сорт пшеницы мягкой на основании разработанных нами подходов молекулярно-генетической идентификации.
Таким образом, наши исследования позволили провести молекулярно генетическую идентификацию допущенных к использованию, снятых с испытания и проходящих сортоиспытание в Пермском крае и в Республике Башкортостан сорта пшеницы мягкой. Полученные сочетания являются ISSR-маркеров сортоспецифичными, стабильными и воспроизводимыми.
Полученные результаты позволили разработать следующие рекомендации:
При сортоиспытании рекомендуется определять генетическое 1.
разнообразие сортов с использованием как минимум двух типов молекулярных маркеров: ISSR-маркеров (пригодных для массового анализа) и аллельных вариантов позволяющих прогнозировать технологические Waxy-генов, характеристики зерна и хлебопекарные качества муки.
Для молекулярно-генетической идентификации изученных сортов 2.
T. aestivum рекомендуется использовать три подхода: первый – на основе видовых и сортоспецифических второй – на основе сочетания ISSR-маркеров;
полиморфных ISSR-маркеров с указанием аллельных вариантов Waxy-генов для прогноза качества хлебопекарной муки, третий – на основе сочетания мономорфных видовых и полиморфных межсортовых ISSR-маркеров.
С целью исключения гибридизации генетически близких сортов 3.
пшеницы мягкой рекомендуется для подбора родительских пар при скрещиваниях использовать сорта T. аestivum, характеризующиеся высокими показателями генетического разнообразия, обладающие различным сочетанием полиморфных ISSR-маркеров, с учетом их типичности и специфичности на основании подсчета коэффициента генетической оригинальности.
ВЫВОДЫ У изученного 41 сорта выявлен 1. T. aestivum ISSR-маркер.
Исследованные сорта на основании полиморфизма T. aestivum межмикросателлитных маркеров характеризуются высокими параметрами генетического разнообразия ( Р95 =0,873;
n a =1,001;
n e =1,000).
У исследованных сортов T. aestivum установлен широкий диапазон 2.
межсортового полиморфизма – генетические расстояния ( D ) варьируют от 0, (между сортами Башкирская 24 и Сертори, Икар и Баженка, Ирень и Красноуфимская 100) до 0,736 (между сортами Тулайковская 10 и Красноуфимская 100). Изученные сорта формируют на дендрограмме шесть кластеров в соответствии со сходством профилей их ISSR-маркеров.
Установлены семь мономорфных ISSR-маркеров, характерных для всех 3.
изученных 41 сорта У 7 сортов выявлены по одному T. aestivum.
сортоспецифичному для каждого сорта ISSR-маркеру, а для каждого из остальных 34 сортов пшеницы мягкой установлены уникальные сочетания мономорфных и полиморфных ISSR-маркеров, которые не повторяются ни у одного из изученных сортов.
Выявлено, что у всех изученных сортов T. aestivum гены Wx-A1 и Wx-D1, 4.
связанные с контролем соотношения амилоза/амилопектин в крахмале пшеницы мягкой, характеризуются наличием аллелей дикого типа.
Показано, что исследованные сорта T. aestivum обладают различными 5.
функциональными аллельными вариантами гена Wx-B1: 38 сортов являются носителями аллеля Wx-В1a;
3 сорта (Башкирская 4, Башкирская 26 и Башкирская 28) несут функциональную аллель Wx-В1е, не приводящую к блокированию синтеза амилозы в крахмале.
Обнаружено, что сорта T. aestivum, снятые с испытаний, обладают 6.
большей долей редких генотипов (КГО=1,514), то есть характеризуются более высокой степенью специфичности по сравнению с сортами, уже допущенными к использованию в Пермском крае (КГО=0,806) и в Республике Башкортостан (КГО=1,398) и сортами, находящимися на сортоиспытании (КГО=1,068).
Выявлены идентификационные молекулярные маркеры, разработан 7.
подход и проведена идентификация 41 изученного сорта T. aestivum с использованием трех вариантов сочетаний мономорфных, полиморфных и сортоспецифичных ISSR-маркеров и маркеров к Waxy-генам.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Бобошина И.В., Боронникова С.В. Изучение генетического полиморфизма некоторых сортов Triticum aestivum L. с использованием ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала. 2012. № 5 (97). С. 19-20.
2. Бобошина И.В., Боронникова С.В. Идентификация перспективных для Урала сортов пшеницы мягкой с использованием межмикросателлитного анализа полиморфизма ДНК // Фундаментальные исследования. 2013. № 6 (ч. 1). С. 92 97.
3. Бобошина И.В., Боронникова С.В. Аллельные варианты Waxy-генов сортов пшеницы мягкой, возделываемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17, № 3. С.
535-540.
Публикации в других изданиях 1. Бобошина И.В., Боронникова С.В., Светлакова Т.Н., Бельтюкова Н.Н.
Молекулярно-генетическая идентификация, штрихкодирование и паспортизация растений // Материалы международной конференции с элементами научной школы для молодежи в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. Уфа, 2010. С. 65-67.
2. Бельтюкова Н.Н., Боронникова С.В., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В.
Технология оценки состояния популяционных систем и генетических ресурсов редких и практически значимых видов растений // Антропогенная трансформация природной среды: материалы Международной конференции.
Пермь, 2010. Т.3. С. 276-279.
3. Boboshina I.V., Boronnikova S.V., Beltyukova N.N., Svetlakova T.N. Genomic technologies for improving the quality of life / Kazan (Volga Region) Federal University. Pax Grid virtual conferences «Fundamental medicine: from scalpel toward genome, proteome and lipidome». Proceedings of First International Conference Kazan, 25-29 April 2011. P.13.
4. Бобошина И.В., Боронникова С.В. ISSR-маркирование генома Triticum aestivum L. // Симбиоз Россия 2011: материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов, Воронеж, 23–27 мая 2011 г.: в 2 т. / Воронежский государственный университет, Всероссийская биологическая ассоциация «Симбиоз Россия». – Воронеж: Изд во Воронежского государственного университета, 2011. С. 205-207.
5. Боронникова С.В., Бельтюкова Н.Н., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В. Анализ полиморфизма ДНК на основе тандемных повторов геномов растений // Материалы IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону, 22– сентября 2011 г. Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. С. 44-45.
6. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Бельтюкова Н.Н., Горохова Т.В., Боронникова С.В. Применение ISSR-маркирования в современных ботанических исследованиях // Материалы международной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (9-13 августа 2011 года, г. Березно, Ровенская область, Украина). Киев, 2011. С. 201-202.
7. Бобошина И.В., Боронникова С.В. Использование ISSR-метода для выявления генетического полиморфизма сортов Triticum aestivum L. // Материалы первой конференции молодых ученых «Биология растений и биотехнология». г. Белая Церковь, Украина, 2011. С. 58.
8. Бобошина И.В. Молекулярно-генетический анализ трех сортов Triticum aestivum L. // Материалы международной научной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование». Пермь, 2011. С. 282-285.
9. Боронникова С.В., Бельтюкова Н.Н., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Нечаева Ю. С., Кольцов С.А. Анализ полиморфизма ДНК геномных маркеров растений с целью изучения биоразнообразия // Материалы международной научной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего:
проекты, технологии, оборудование». Пермь, 2011. С.288-292.
10. Бобошина И.В., Боронникова С.В. Анализ полиморфизма ДНК сортов Triticum aestivum L. // Тезисы 2-й Международной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях – 2011». Институт общей генетики им.
Н.И.Вавилова РАН. Москва-Звенигород, 2011. С. 23.
11. Бобошина И.В., Семукова Е.П., Боронникова С.В. Результаты молекулярного маркирования сортов Triticum aestivum L. // Материалы Всероссийской школы конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, растений и микроорганизмов». Уфа, 2012. С. 20-24.
12. Бобошина И.В., Семукова Е.П., Боронникова С.В. Изучение генетического разнообразия некоторых сортов Triticum aestivum L. на Урале // Материалы научной конференции аспирантов и молодых ученых «Актуальность наследия Н.И. Вавилова для развития биологических и сельскохозяйственных наук».
С.-Петербург, 2012. C. 56-61.
13. Бобошина И.В., Семукова Е.П., Лацугин М.С., Боронникова С.В. Молекулярно генетический анализ практически значимых растений // Тезисы докладов всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии в рамках фестиваля науки». Уфа, 2012. С. 8.
14. Бобошина И.В., Семукова Е.П., Боронникова С.В. Анализ полиморфизма ДНК сортов Triticum aestivum L., районированных в Республике Башкортостан и в Пермском крае // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического Конгресса молодых ученых «Симбиоз-Россия Тверь 2012». Тверь, 2012. С. 215-217.
15. Бобошина И.В., Боронникова С.В. Распределение аллелей гена Wx-B1 в коллекции сортов Triticum aestivum L., перспективных для выращивания на Урале // Сборник тезисов VI Всероссийского с международным участием биологического Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013».
Иркутск, 2013. С. 264-265.
16. Бобошина И.В., Боронникова С.В. Оценка генетической оригинальности сортов пшеницы мягкой, возделываемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан // Материалы V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины».
Ростов-на-Дону, 2013. С. 427-428.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ КГО – коэффициент генетической оригинальности ПЦР – полимеразная цепная реакция ISSR – Inter-Simple Sequence Repeats PCR TE – Tris-HCl-EDTA-MilliQ ТВE – Tris-Borate-EDTA UPGMA – unweighed pair-group method using arithmetic average Wx – Waxy гены, кодирующие гранул связанную синтазу крахмала