Регуляция экскреторной функции печени крысы при холестазе: роль пролактина

На правах рукописи

Кушнарева Наталья Сергеевна РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ: РОЛЬ ПРОЛАКТИНА специальность 03.00.13 – физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009 1

Работа выполнена в лаборатории эндокринологии кафедры физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (заведующий кафедрой – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Ольга Вячеславовна Смирнова ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией физиологии мышечной деятельности Института возрастной физиологии РАО Валентин Дмитриевич Сонькин доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины МГУ им.

М.В. Ломоносова Владимир Борисович Кошелев ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится 21 декабря 2009 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 биологического факультета МГУ им.

М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Образование желчи – жизненно важная функция организма, ее нарушение ведет к синдрому холестаза. По современным представлениям под холестазом понимают нарушение синтеза, секреции и оттока желчи (Подымова, 2004). Синдром холестаза встречается при различных состояниях, которые могут быть объединены в 2 большие группы:

1) нарушение образования желчи (вирусные, алкогольные, лекарственные и токсические поражения печени, холестаз беременных, цирроз, бактериальные инфекции);

2) нарушение тока желчи (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, туберкулез, реакция отторжения трансплантата). Заболевания печени, сопровождающиеся холестазом, зависят от пола и многие из них являются преимущественно женскими (Радченко, 2005). Пик желчекамнеобразования у женщин совпадает с репродуктивным периодом. Физиологическая беременность как пусковой момент патологических процессов в желчевыводящей системе послужила поводом к причислению заболеваний желчного пузыря ко «вторым женским заболеваниям после гинекологических» (Торчинов и др., 2006).

За последнее десятилетие расширилось понимание патогенеза холестаза.

Появляется много данных о работе гепатобилиарной транспортной системы в печени, почках и кишечнике, регуляции транспортеров, участвующих в образовании желчи и нарушениях при холестазе. Показано, что не все изменения в экспрессии транспортеров гепатобилиарной системы носят «про холестатический», «негативный» характер, - некоторые перестройки в клетках печени и почках представляют собой компенсаторный (анти-холестатический) механизм, защищающий организм от повреждений (Zollner et al., 2006).

Половая дифференцировка показана в уровне экспрессии и регуляции транспортеров, участвующих в процессе желчеобразования. Показано участие половых гормонов в регуляции работы гепатобилиарной транспортной системы при холестазе (Shimizu et al., 2007).

Билирубин – один из физиологически значимых анионов, являющихся важными компонентами желчи, селективно захватывается транспортерами базолатеральной мембраны гепатоцита из крови, с последующей конъюгацией с глюкуроновой кислотой. Скорость транспорта конъюгированного билирубина из печени в желчь лимитируется его экскрецией через транспортеры каналикулярной (апикальной) мембраны гепатоцита (Решетняк, 2003).

Чувствительность печени к пролактину, одному из женских половых гормонов, оценивая по уровню его рецепторов, очень высока и сопоставима с чувствительностью молочной железы (Varas et al., 2005, Bogorad, 2006, Simon Holtorf et al., 2006,). Известны отдельные молекулярные мишени действия пролактина на печень (Cao et al., 2004, Taffetani et al., 2007), однако его конечные физиологические эффекты на желчевыделительную и другие функции печени остаются неясными. Экспрессия рецепторов пролактина в печени зависит от пола: у особей женского пола уровень рецепторов данного гормона выше, чем у мужского (Розен и др., 1991, Smirnova et al., 1994).

Известны несколько функционально различных изоформ рецептора пролактина. Длинная изоформа рецептора опосредует основные изученные эффекты пролактина посредством активации конститутивно ассоциированной с рецептором тирозинкиназы JAK2 (Janus kinase 2) и транскрипционных факторов STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription), главным образом STAT5 (Bole-Feysot et al., 1998). Короткие изоформы рецептора пролактина не способны активировать STAT5 белки и являются негативными регуляторами JAK2/STAT5 сигнализации, из-за образования гетеродимеров с длинной формой рецептора, препятствующих активации STAT-каскада.

Однако недавно было показано, что короткие изоформы рецептора пролактина обладают достаточно широким спектром собственных эффектов, связанных с тканеспецифическими сигналами пролактина, с активацией/ингибированием многих транскрипционных факторов независимо от действия гормона через длинную изоформу рецептора пролактина. (Devi et al., 2009). Спектр эффектов пролактина определяется типом ткани-мишени, а также соотношением изоформ рецептора гормона (Huang et al., 2008).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что обструктивный холестаз дифференциально регулирует характер экспрессии рецепторов пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах у крысы: в гепатоцитах он действует преимущественно на соотношение изоформ рецепторов пролактина, повышая долю длинной изоформы независимо от пола животных. В холангиоцитах он существенно повышает общий уровень мРНК рецепторов пролактина, повышая уровень длинной изоформы и увеличивая экспрессию короткой (Богорад, 2004;

Остроухова, 2008). Однако роль пролактина и его рецепторов в процессе патогенеза синдрома холестаза и зависимости от пола его развития остается не ясной.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышесказанного, целью настоящей работы было исследование регуляции экскреторной функции печени крысы при холестазе для оценки вклада пролактина в развитие патогенеза данного синдрома.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать изменения концентрации билирубина в желчи и крови, скорости желчетока, относительной массы печени (в дальнейшем – показатели экскреторной функции печени) при холестазе и в начальный постхолестазный период у самок крыс.

2. Изучить изменения показателей экскреторной функции печени самок крыс в зависимости от длительности гиперпролактинемии при холестазе и в начальный постхолестазный период.

3. Проанализировать половые особенности показателей экскреторной функции печени при индукции и снятии холестаза и их изменение на фоне гиперпролактинемии.

4. Проанализировать влияние длительной гиперпролактинемии на экспрессию мРНК изоформ рецептора пролактина и их соотношение в гепатоцитах и холангиоцитах самок крыс при холестазе.

5. Осуществить поиск возможных молекулярных мишеней действия пролактина на гепатоциты и холангиоциты самок крыс на фоне холестаза при длительной гиперпролактинемии.

Научная новизна полученных результатов. В результате проведенного исследования установлено, что на фоне холестаза крыс действие пролактина на скорость желчетока и концентрацию билирубина в желчи существенно усиливается по сравнению с нормой и зависит от длительности гиперпролактинемии. В начальный постхолестазный период впервые выявлена половая зависимость в показателях экскреторной функции печени: у самок скорость восстановленного желчетока ниже, а концентрация билирубина в желчи выше, чем у самцов. Показано, что в условиях гиперпролактинемии на фоне обструктивного холестаза исчезают половые различия в концентрации билирубина в постхолестазной желчи и скорости желчетока и выявляются половые особенности альтернативных путей выведения билирубина у крыс.

Впервые показано, что при холестазе в сочетании с длительной гиперпролактинемией в гепатоцитах самок крыс чувствительность к пролактину увеличивается за счет равномерного усиления экспрессии обеих изоформ рецептора при неизменном соотношении изоформ, а в холангиоцитах увеличивается доля короткой изоформы рецептора при неизменном уровне длинной. Установлено, что длительная гиперпролактинемия на фоне холестаза у самок крыс не оказывает существенного влияния на экспрессию мРНК транспортера MRP3 базолатеральной мембраны гепатоцитов и холангиоцитов, снижает экспрессию мРНК транспортера MRP2 апикальной мембраны гепатоцитов, не действует на экспрессию мРНК этого транспортера в холангиоцитах и существенно повышает экспрессию мРНК специфичного для апикальной мембраны холангиоцитов транспортера CFTR.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные важны для фундаментальной и клинической гепатологии в плане понимания компенсаторных и патологических изменений функций различных типов клеток печени в условиях обструктивного холестаза и роли пролактина в этих изменениях. Результаты исследования позволяют направленно осуществлять поиск транскрипционных факторов, участвующих в патогенезе холестаза при тканеспецифическом действии пролактина. Результаты работы свидетельствуют о необходимости учета возможного двоякого (про- и антихолестатического) действия пролактина в патогенезе данного синдрома.

Обнаруженные нами половые особенности в исследуемых показателях экскреторной функции печени позволяют обосновать новые подходы к зависимой от пола терапии холестаза в будущем, а рецепторы пролактина могут служить одной из потенциальных мишеней терапевтического воздействия. Эксперименты с длительной гиперпролактинемией в сочетании с холестазом у самок крыс могут служить в качестве модели для изучения встречающегося у людей синдрома «известковой желчи». Используемую нами модель сочетания гиперпролактинемии и холестаза у самок крыс можно применять при изучении синдрома холестаза беременных.

Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Россия, Москва, 2008), V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Россия, Москва, 2008), XXI Европейском конгрессе эндокринологов «ECE 2009» (Турция, Стамбул, 2009), ежегодном съезде Британского Физиологического Общества «Physiology 2009» (Ирландия, Дублин, 2009), XXXVI Международном конгрессе физиологов «IUPS 2009» (Япония, Киото, 2009), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Россия, Санкт-Петербург, 2009) и на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Россия, Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в их числе 3 статьи (1 из них в печати) в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. Работа проводилась на половозрелых самцах и самках беспородных белых крыс массой 190-250 г. Количество животных, вид операции, биоматериал и описание экспериментальных групп приведено в Таблице 1. Крысы обоего пола были распределены на 3 экспериментальные группы: с нормальным уровнем пролактина, с 2-х недельной и 4-х недельной гиперпролактинемией. В каждой группе были контрольные животные без холестаза, крысы на фоне холестаза и после его снятия в начальный постхолестазный период. У крыс каждой группы собирали желчь и кровь, взвешивали печень, дренировали общий желчный проток.

Дифференциальное выделение гепатоцитов и холангиоцитов. Часть экспериментов проводили на двух типах клеток печени самок крыс:

гепатоцитах и холангиоцитах. Способ выделения фрагментов желчных протоков основан на методе, предложенном группами проф. Альпини и Альваро (Alpini, Phillips et al, 1994, Alpini, Ulrich et al, 1994, Mennone et al, 1995, Alvaro et al, 1997). В ходе выделения гепатоцитов и фрагментов внутрипеченочных желчных протоков проводили контроль качества разделения клеток: 1) по морфологии фрагментов протоковых структур и гепатоцитов;

2) по экспрессии специфических генов-маркеров методом ПЦР в «реальном» времени (см. ниже): для гепатоцитов – это глюкозо-6-фосфатаза, а для холангиоцитов – цитокератин 19 (Alpini et al, 1994).

Таблица 1. Число животных, тип биоматериала и вид операции в каждой экспериментальной группе.

БЕЗ ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЛИТЕЛЬНАЯ НА УРОВЕНЬ ГИПЕР- ГИПЕР ПРОЛАКТИНА В КРОВИ ПРОЛАКТИНЕМИЯ ПРОЛАКТИНЕМИЯ (2-х недельная) (4-х недельная) гонадэктомированны ОПЕРАЦИИ биоматериал интактные е интактные интактные САМЦЫ САМКИ САМЦЫ САМКИ САМЦЫ САМКИ САМКИ желчь 36 44 11 9 12 10 кровь 3 3 - - 3 3 печень 5 7 - - 3 4 БЕЗ дренирование ХОЛЕСТАЗА желчного протока 36 43 11 9 12 10 выделение гепатоцитов - 3 - - - - желчь 26 16 10 9 10 12 кровь 16 13 4 3 5 6 печень 19 13 5 4 6 8 С выделение ХОЛЕСТАЗОМ гепатоцитов - 4 - - - - выделение холангиоцитов - 4 - - - - желчь 8 12 5 4 4 4 Ток желчи кровь 8 10 5 4 4 4 не восстановился В печень 8 10 5 4 4 НАЧАЛЬНЫЙ ПЕРИОД СНЯТИЯ дренирование Ток желчи ХОЛЕСТАЗА желчного протока 8 12 5 4 4 4 не восстановился Хирургические методы. Все хирургические вмешательства проводили под легким эфирным наркозом. За день до операций крысам не давали есть при свободном доступе к воде. После операций животным восстанавливали доступ к пище и воде.

Гонадэктомию крыс проводили согласно классическому методу (Киршенблат, 1969), удаляя у самцов - семенники и эпидидимисы, у самок яичники. Животных брали в основные эксперименты через 4 недели после гонадэктомии.

Перевязка и дренирование общего желчного протока крысы.

Обструктивный холестаз индуцировали перевязкой общего желчного протока в течение 14 дней. На проток накладывали две лигатуры, затем осуществляли перевязку и разрез протока между лигатурами. Через две недели производили забор скопившейся желчи, декапитацию животного, собирали кровь и мочу, взвешивали печень, вычисляя коэффициент масса печени/масса крысы, для оценки степени тяжести патологии. У части крыс через 14 дней из печени в дальнейшем дифференциально выделяли гепатоциты и холангиоциты. В исследование включали только крыс с признаками желтухи (как типичное проявление холестаза). Дренирование общего желчного протока проводили при введении в него полиэтиленового катетера крысам с нормальной работой печени до перевязки протока и крысам с признаками обструктивного холестаза (декомпрессию протока проводили через 14 дней после его перевязки).

Начальным постхолестазным периодом считали момент через 3 часа после декомпрессии. После дренирования животных декапитировали, собрав желчь, кровь и мочу, взвешивали печень. У части крыс из печени в дальнейшем дифференциально выделяли гепатоциты и холангиоциты.

Трансплантация гипофиза под капсулу почки – модель создания гиперпролактинемии. Персистирующую гиперпролактинемию (постоянно повышенный уровень пролактина в крови) вызывали классическим методом пересадки гипофиза донора под почечную капсулу реципиента того же пола. В работе были использованы две модели гиперпролактинемии: двухнедельная (в дальнейшем, гиперпролактинемия) и четырехнедельная (в дальнейшем, длительная гиперпролактинемия). В первом случае пересадку гипофиза производили одновременно с перевязкой общего желчного протока. Во втором – сначала пересаживали гипофиз, а через 14 дней после этого перевязывали общий желчный проток на фоне уже стабильно повышенного уровня пролактина. В качестве доноров гипофизов для трансплантации использовали половозрелых крыс, у которых сразу после декапитации извлекали гипофиз.

Одновременно с этим у экспериментального животного делали небольшой надрез капсулы левой почки, под почечную капсулу немедленно пересаживали выделенный гипофиз. Общее время данной операции не превышало 2 минут.

Трансплантацию считали успешной, если через 14 дней после операции чётко была видна васкуляризация гипофиза под оболочкой почки и отходящий сосуд. Определение пролактина крысы в сыворотке иммуноферментным методом в соответствии с протоколом производителя с использованием набора для определения пролактина в сыворотке крысы EIA 4493 (DRG, USA) показало, что пересадка гипофиза вызывает 2-3 кратное повышение концентрации гормона в сыворотке крови по сравнению с соответствующей группой без трансплантации гипофиза.

Определение концентрации билирубина в собранной желчи, сыворотке, моче крыс производили с помощью готовых наборов реактивов для определения билирубина BIL 100S (PLIVA- Lachema Diagnostika, Чехия), используя метод азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой в соответствии с методикой, рекомендованной производителем.

Фотометрирование проводили на спектрофотометре GENESYS 20. В сыворотке крыс также определяли конъюгированную форму билирубина и вычисляли ее % содержание в крови (концентрация конъюгированного билирубина/концентрация общего билирубина в крови) для оценки тяжести патологии. Значения концентрации билирубина в желчи измеряли в получасовой пробе на 150-180 мин после начала дренирования протока.

В работе использовали средние величины показателей экскреторной функции печени при различных состояниях, в ряде случаев для оценки влияния холестаза использовали также средние величины разницы показателей до и после индукции холестаза, измеренные индивидуально у каждого животного.

Определение скорости желчетока. Интенсивность секреции желчи определяли каждые 10 мин в течение 3 часов после введения катетера в общий желчный проток. Через час после начала дренирования значение скорости желчетока выходило на плато, и мы вычисляли среднее значение скорости в последней получасовой пробе на 150-180 мин после начала дренирования протока. Значения концентрации билирубина и скорости желчетока нормировали на массу тела животного.

Молекулярно-биологические методы. Выделение РНК проводили с помощью реагента TRIzol в соответствии с протоколом производителя из 5- млн клеток печени: гепатоцитов и холангиоцитов. Выделенную тотальную РНК всех использованных в исследовании образцов клеток для избежания контаминации геномной ДНК обрабатывали ДНКазой I. Обработанную ДНКазойI РНК очищали с помощью набора колонок для очистки малого количества РНК (RNeasy Plus Mini Kit, “Qiagen”,США). Для дальнейшего синтеза кДНК использовали набор для обратной транскрипции (ImProm-IITM Reverse Transcription System, «Promega», США) в соответствии с протоколом производителя.

Полимеразная цепная реакция в «реальном» времени (ПЦР-РВ).

Синтезированную кДНК использовали как матрицу для проведения ПЦР-РВ на амплификаторе Rotor-Gene 3000 («Corbett-Research», Австралия) с набором реактивов, включающим интеркалирующий краситель SYBR Green I (смесь №М-427, «Синтол», Россия) в соответствии с методикой, рекомендованной производителем. В реакционную смесь со всеми необходимыми компонентами добавляли праймеры в конечной концентрации 160 нМ и синтезированную кДНК в трех разведениях с каждой парой праймеров.

В нашей работе мы использовали праймеры к 1) кДНК hprt (гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы) - основного house-keeping гена;

2) кДНК pgk1 фосфоглицераткиназы 1 (добавочного house-keeping гена);

3) кДНК -актина (второго добавочного house-keeping гена);

4) кДНК транспортера MRP2 (rat multidrug resistance protein 2), 5) кДНК транспортера MRP3 (rat multidrug resistance protein 3), 6) кДНК транспортера CFTR (rat cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 7) кДНК короткой изоформы рецептора пролактина, 8) кДНК длинной изоформы рецептора пролактина, 9) кДНК глюкозо-6-фосфатазы (маркер для гепатоцитов), 10) кДНК цитокератин 19 (маркер для холангиоцитов). Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Beacon Designer 6.00.

Условия проведения ПЦР-РВ: денатурация - в течение 5 минут при 95оС, далее проводили 47 циклов ПЦР в следующем режиме: денатурация 95оС, 10 с, отжиг 59оС 17 с;

элонгация 72оС 20 с. Интенсивность флуоресценции SYBR Green, связанного с двухцепочечной ДНК, определяли в конце стадии элонгации каждого цикла при 72 оС на канале FAM/Sybr. После последнего цикла снимали кривую плавления полученных продуктов ПЦР.

В каждую экспериментальную постановку включали контрольные реакции: два отрицательных контрольных образца, в первом есть все компоненты реакции кроме матричной ДНК (оценка загрязнения оборудования или реактивов) и во втором - в качестве матрицы 4 мкг выделенной РНК (контроль на присутствие в результате ПЦР продукта, полученного с геномной ДНК) и положительный контрольный образец, в котором реакция должна пройти обязательно (оценка правильного приготовления реакции и качества используемых реактивов) (Ребриков, 2009).

Уровень экспрессии мРНК изоформ рецептора пролактина, их соотношения и транспортеров клеток печени рассчитывался с использованием гена «домашнего хозяйства» hprt в качестве внутреннего контроля. В настоящее время, при нормировании результатов с использованием генов «домашнего хозяйства», для увеличения точности результатов, принято оценивать уровень экспрессии не одного, а нескольких генов «домашнего хозяйства» (Wong and Medrano, 2005). Мы провели сравнение результатов уровней изучаемых в работе мРНК, рассчитанных в процентах от содержания в данном образце мРНК гена «домашнего хозяйства»: hprt и двух других - pgk и -актина, которые по литературным данным наиболее стабильно экспрессируются в печени даже при жестких условиях эксперимента (Pohjanvirta, 2006). Результаты сравнения показали стабильность экспрессии выбранных генов «домашнего хозяйства». В дальнейшем уровень изучаемых в работе мРНК рассчитывался в процентах от содержания в данном образце мРНК гена hprt.

Амплифицированные продукты анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Сравнение со стандартным набором маркеров показало, что длины всех продуктов амплификации соответствуют ожидаемым значениям. В каждом опыте в пробах без матрицы продукты амплификации отсутствовали. Секвенирование всех продуктов амплификации кДНК подтвердило их полное соответствие ожидаемым нуклеотидным последовательностям. В работе учитывали только те результаты ПЦР, когда температура плавления продуктов амплификации и их электрофоретическая подвижность соответствовали ожидаемым.

Статистическая обработка данных. Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0 («Statsoft Inc.», США). Для определения достоверности различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия с р0,05.

Все данные представлены как средние значения ± стандартные ошибки среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЛИЯНИЕ ПРОЛАКТИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ САМОК КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ И СНЯТИИ ХОЛЕСТАЗА 1.1. Показатели экскреторной функции печени у самок крыс в норме, при холестазе и в начальный постхолестазный период Для исследования влияния пролактина на экскреторную функцию печени крыс мы измеряли два важных показателя работы печени – концентрацию билирубина и скорость желчетока, которые кардинально изменяются в условиях холестаза. При механической обструкции общего желчного протока и последующей декомпрессии в нашей экспериментальной модели произошли ожидаемые изменения данных показателей: 1) при обструкции - остановка желчетока, желтуха, увеличение концентрации билирубина в крови (в основном за счет конъюгированной формы) и относительной массы печени, 2) при декомпрессии - достоверное снижение концентрации конъюгированного пигмента в крови, при этом % конъюгированного билирубина в крови не менялся, снижение относительной массы печени и достоверно ускоренное восстановление желчетока по сравнению с нормой (Табл. 2).

Изменения концентрации билирубина в моче во всех экспериментальных группах были недостоверны в связи с большим разбросом, данные в автореферате не приведены.

1.2. Влияние гиперпролактинемии на показатели экскреторной функции печени самок крыс в норме и на фоне холестаза Мы выявили отсутствие влияния гиперпролактинемии на исследуемые показатели у самок крыс в норме. Однако на фоне холестаза гиперпролактинемия у самок привела к резкому увеличению концентрации конъюгированного билирубина в крови, при этом изменения процента конъюгированного билирубина в крови не отмечалось. Снятие холестаза на фоне гиперпролактинемии вызвало достоверное падение концентрации пигмента в крови в 4 раза, в результате чего отличия с нормой в данном показателе нивелировались. Гиперпролактинемия вызывала при снятии холестаза достоверное снижение скорости желчетока при отсутствии выраженного влияния на желчеток в норме (Табл. 2).

Таблица 2. Влияние гиперпролактинемии (гиперПРЛ) на показатели экскреторной функции печени используемых в работе экспериментальных групп крыс (M±sem).

Концентрация Масса билирубина, печени/ Скорость Группы крыс мкмоль/л/кг масса желчетока, крысы, мкл/мин/кг % в желчи в крови 470 ± 26 самки 2,7 ± 0,1 36 ± (44) (3) (7) (43) Интактные 479 ± 20 10 2,8 ± 0,1 35 ± самцы (36) (3) (5) (36) 505 ± 32 10 3,2 ± 0,1 31 ± самки Интактные + (10) (3) (4) (10) 474 ± 41 10 2,9 ± 0,1 35 ± гиперПРЛ самцы (12) (3) (3) (12) 577 ± 68 Интактные + 2,9 ± 0,3 35 ± (5) (3) длительная самки (3) (5) гиперПРЛ 467 ± 98 519 ± 59 6,2 ± 0,3 Остановка самки С холестазом (16) (13) * (13) * желчетока 217 ± 37 455 ± 40 6,6 ± 0,2 Остановка (16) (26),# самцы (19) желчетока 617 ± 70 1029 ± 140 6,6 ± 0,5 Остановка С холестазом + самки (12) (6) # (8) желчетока гиперПРЛ 271 ± 70 515 ± 37 6,3 ± 0,3 Остановка самцы (10) (5) (6) желчетока С холестазом + 68 ± 26 598 ± 51 6,1 ± 0,5 Остановка длительная самки (10) # (8) (8) желчетока гиперПРЛ 2241 ± 237 296 ± 33 5,4 ± 0,4 56 ± самки (12) (10) # (10) (12) * После 1385 ± 248 318 ± 54 6,4 ± 0,3 75 ± декомпрессии (8) (8) (8) (8) самцы После 1861 ± 477 240 ± 48 44 ± 5,1 ± 0, самки (4) (4) (4) (4) декомпрессии + гиперПРЛ 2022 ± 220 418 ± самцы 5,6 ± 0,4 50 ± (4) (4) (4) (4) * р 0,05 по сравнению с показателем у интактных самок # р 0,05 по сравнению с показателем у самок с холестазом р 0,05 по сравнению с показателем у самок после декомпрессии желчного протока р 0,05 по сравнению с показателем у самок соответствующей группы с гиперпролактинемией р 0,05 по сравнению с показателем у интактных самцов Показатель концентрации билирубина в желчи при холестазе оказался вариабельным. При измерении у части животных индивидуальной разницы концентрации билирубина между холестазной и нормальной желчью было установлено, что на фоне холестаза концентрация билирубина в желчи всегда снижалась по сравнению с исходным уровнем и разница концентраций показателя между холестазной и нормальной желчью всегда была отрицательной. На Рис. 1 видно, что на фоне гиперпролактинемии концентрация билирубина в желчи росла при холестазе по отношению к исходному уровню, разница в его уровне была положительной и достоверно отличалась от разницы, наблюдаемой у животных c нормальным уровнем пролактина.

в холестазной и нормальной желчи Разница концентраций билирубина * А Б 10 (12) (10) - - - - Рис. 1. Степень и направленность изменений концентраций билирубина в желчи на фоне обструктивного холестаза у самок крыс с нормальным (А), повышенным (Б) уровнем пролактина (М±sem). В скобках – число животных, * р 0,05 по сравнению с показателем у самок без гиперпролактинемии.

Итак, повышение уровня пролактина в крови у крыс в норме не оказывало влияние на показатели экскреторной функции печени, а при холестазе было показано усиление действия данного гормона. Возможность такого развития событий вытекает из некоторых данных литературы. Известно, что первым этапом действия пролактина является связывание с мембранными рецепторами (Bole-Feysot et al., 1998). При обструктивном холестазе изменяется уровень и компартментализация рецепторов пролактина в клетках печени, особенно в холангиоцитах (Смирнова и др., 1998;

Остроухова, 2008). Центральную роль при развитии как компенсаторных, так и патологических изменений, возникающих в ответ на холестатические повреждения печени, играют клетки желчных протоков (Marzioni et al., 2002), которые активно пролиферируют при холестазе и достигают 20% от массы печени по сравнению с 3% в норме (Alpini, 1994), при этом в данном типе клеток существенно возрастает уровень рецепторов пролактина (Bogorad, 2006;

Taffetani et al., 2007).

1.3. Влияние длительной гиперпролактинемии на показатели экскреторной функции печени самок крыс с нормальной работой печени и на фоне холестаза. В нашей работе впервые показана зависимость действия пролактина на фоне холестаза от длительности гиперпролактинемии у самок.

Считается, что за две недели после трансплантации гипофиза под почечную капсулу крысы происходит увеличение концентрации пролактина в крови с выходом на плато (Tudpor, 2005). При длительной гиперпролактинемии в холестазной желчи билирубин практически отсутствовал, наблюдался синдром так называемой «известковой» (или «молочно-кальциевой») желчи (Маев, 1997). При использовании нашего способа дренирования протока мы не смогли добиться восстановления тока желчи у крыс данной экспериментальной группы (Табл. 2).

Следовательно, можно отметить двухфазное действие пролактина на перераспределение пула билирубина при холестазе у самок крыс – увеличение концентрации пигмента как желчи, так и в крови, затем снижение в крови и почти полное исчезновение в желчи. В начальный постхолестазный период с увеличением длительности гиперпролактинемии скорость восстановленного желчетока замедляется вплоть до полной остановки.

Обнаруженные кардинальные нарушения экскреторной функции печени при холестазе на фоне длительной гиперпролактинемии возможно связаны с изменением работы апикальной мембраны клеток желчных протоков.

Согласно литературным данным, до 50 % кислотонезависимого желчетока обеспечивает секреция ионов HCO3-. Секреция бикарбоната происходит главным образом на уровне холангиоцитов в ответ на стимуляцию гормонами и нейропептидами (Trauner, 2003). Известно, что белок CFTR апикальной поверхности эпителиальных клеток обеспечивает секрецию хлоридов, ускоряет поступление анионов бикарбоната за счет регуляции работы других транспортеров (Li et al., 2005). Недавно было обнаружено, что пролактин стимулирует секрецию Cl- в эпителиальных клетках эндометрия свиньи, осуществляя действие через свою короткую изоформу, которая экспрессируется преимущественно на базолатеральной мембране этих клеток (Deachapunya et al., 2008). Следовательно, возможно, что пролактин участвует в регуляции уровня экспрессии и/или экспонирования на мембране транспортеров апикальной мембраны холангиоцитов при холестазе. Это заставило нас проследить влияние пролактина на экспрессию CFTR в холангиоцитах (см далее). Разный эффект действия пролактина в зависимости от длительности воздействия его воздействия можно объяснить возможным различным действием короткой изоформы рецептора пролактина на ряд транскрипционных факторов клеток печени (Devi et al., 2009), что требует дальнейшего исследования (см. далее).

2. ПОЛОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭКСКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ И СНЯТИИ ХОЛЕСТАЗА И ИХ ИЗМЕНЕНИЕ ПРИ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ 2.1. Половые особенности перераспределения пулов билирубина при индукции и снятии холестаза у крыс. Мы показали зависимое от пола изменение работы печени на фоне обструктивного холестаза, в то время как в условиях нормальной работы органа половые отличия исследуемых показателей отсутствовали (Рис. 2). При холестазе у самцов произошло более резкое по сравнению с самками снижение концентрации билирубина в желчи.

В нашей работе показано, что зависимость от пола показателей экскреторной функции печени наиболее ярко проявляется в начальный период снятия холестаза. У самцов при декомпрессии общего желчного протока ток желчи восстанавливался с большей скоростью при более низком содержании билирубина в желчи, чем у самок. При предварительной гонадэктомии все выявленные половые различия нивелировались.

3000 самки А * Концентрация общего билирубина в самцы желчи, мкмоль/л/кг * норма холес таз дек омп рес с ия норма г/э холес таз г/э дек омп рес с ия г/э (19)(9) (9)(12) (8) (5) (9) (11) (9) (10) (4) (5) Скорость желчетока, мкл/мин/кг 120 Б * норма декомпрессия норма г/э декомпрессия (18) (9) (8) (5) (9) (11) (4) г/э(5) Рис. 2. Половые различия концентрации общего билирубина в желчи (А) и скорости желчетока (Б) у крыс в норме, на фоне холестаза и при декомпрессии (М±sem).

Темные столбцы – самцы, светлые столбцы – самки.

В скобках – число животных, г/э – Гонадэктомированные животные, * р 0,05 по сравнению с показателем у самок соответствующей группы Зависимость от пола исследуемых показателей экскреторной функции печени в условиях обструктивного холестаза при отсутствии их в норме может быть связана с изменением работы зависимых от пола транспортеров клеток печени, участвующих в переносе билирубина в желчь и регулирующих желчеток. Известно, что экспрессия в печени интактных крыс мРНК и белкового продукта белка 2 множественной устойчивости к лекарствам (MRP2), участвующего в транспорте билирубина в желчь, дифференцирована по полу с преобладанием у самок. Однако в норме эти половые различия физиологически не проявляются, так как при этом не выявляется зависимости от пола уровня экспонирования MRP2 на апикальной мембране гепатоцитов, что определяет эффективность действия этого транспортера (Simon, 2006). При холестазе крыс снижается экспрессия мРНК и белка MRP2, происходит также изменение клеточной локализации MRP2: удаление из каналикулярной мембраны за счет возврата в периканаликулярные везикулы, что сочетается со снижением желчетока (Veggi, 2005). Возможно, обструктивный холестаз является таким состоянием, когда скрытая половая дифференцировка экспрессии MRP2 начинает проявляться и отражаться на скорости удаления белка из мембранного компартмента и скорости его повторного встраивания при снятии холестаза, что может реализоваться в виде ползависимого влияния на скорость желчетока при декомпрессии.

Также, вероятно, различия в концентрации и паттерне секреции пролактина у животных разного пола (Розен и др., 1991) в сочетании с изменением экспрессии рецептора пролактина в гепатоцитах и особенно в холангиоцитах (Богорад, 2004) тесно связаны с появлением половых особенностей перераспределения пулов билирубина при обструктивном холестазе.

2.2. Изменение половых особенностей перераспределения пулов билирубина при индукции и снятии холестаза на фоне гиперпролактинемии крыс. Исследование изменения половой зависимости показателей экскреторной функции печени крыс проводили, используя модель двухнедельной гиперпролактинемии. Установлено усиление влияния пролактина на исследуемые показатели в сочетании с холестазом при отсутствии влияния у крыс с нормальной работой печени. Впервые показано, что гиперпролактинемия при снятии холестаза приводит к нивелированию половых различий ряда показателей экскреторной функции печени (концентрация билирубина в постхолестазной желчи, относительная масса печени и скорость желчетока) и появлению половых особенностей альтернативных путей выведения билирубина (Табл. 2). При этом в условиях обструктивного холестаза при гиперпролактинемии сохранилась и стала более выражена зависимость от пола концентрации общего билирубина в желчи, с преобладанием у самок.

Известно, что холестаз приводит к появлению альтернативного пути выведения билирубина и желчных кислот через базолатеральную мембрану гепатоцита обратно в системный кровоток и удалению пигмента из организма через почки с мочой (Zollner, 2006). В нашей работе мы показали (Табл. 2), что при сочетании гиперпролактинемии и холестаза у самок крыс в 2 раза повышается концентрация билирубина в крови (в основном за счет конъюгированной формы) по сравнению с самцами соответствующей экспериментальной группы и самками на фоне холестаза без изменения уровня пролактина в крови. Половые отличия в концентрации билирубина в крови не исчезли через 3 часа после декомпрессии протока, однако, из-за более резкого падения данного показателя у самок (в 4 раза), концентрация пигмента была выше у самцов в связи с небольшим изменением после снятия холестаза (в 1, раза – см. Табл. 2).

Обнаруженное в работе зависимое от пола влияние пролактина на перераспределение пулов билирубина и желчевыделительную функцию печени может быть связано с участием этого гормона в регуляции уровня экспрессии и экспонирования на мембране транспортеров билирубина и желчных кислот, таких как белки множественной устойчивости к лекарствам и 3 (MRP2, MRP3), натрий-таурохолат-котранспортер (NTCP) и некоторые другие, экспрессия которых меняется при обструктивном холестазе и в исследованных случаях зависит от пола (Simon et al., 2006;

Zollner et al., 2006;

Cheng et al., 2007). Выраженное влияние персистирующей гиперпролактинемии на самцов связано, очевидно, с тем, что создаваемый повышенный уровень пролактина имитирует малофлюктуирующий, женский паттерн секреции этого гормона (Розен и др., 1991), что у самцов не только увеличивает его общий уровень, но и меняет паттерн его секреции на женский.

3. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ НА ЭКСПРЕССИЮ ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ САМОК КРЫС ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ Как уже было показано в предыдущих работах нашей лаборатории и других исследованиях короткая и длинная изоформы рецептора пролактина выявлялись и в гепатоцитах, и в холангиоцитах интактных животных (Bogorad, 2006, Taffetani et al., 2007, Остроухова, 2008). Относительное количество рецептора пролактина (как длинной, так и короткой изоформ) в гепатоцитах выше, чем в холангиоцитах (Bogorad, 2006, Остроухова, 2008). При этом в гепатоцитах интактных самок крыс доминирует короткая изоформа рецептора, соотношение мРНК короткой и длинной изоформ рецептора в холангиоцитах ниже, чем в гепатоцитах (Остроухова, 2008). По данным нашей лаборатории обструктивный холестаз дифференциально регулирует характер экспрессии мРНК рецепторов пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах: 1) в гепатоцитах он действует преимущественно на соотношение изоформ рецепторов пролактина, повышая долю длинной изоформы, 2) в холангиоцитах он существенно повышает общий уровень мРНК рецепторов пролактина, главным образом, за счет длинной изоформы, и индуцирует увеличение короткой (Богорад, 2004).

В данном исследовании при анализе результатов мы опирались на ранее полученные данные по экспрессии мРНК рецептора пролактина в холангиоцитах и гепатоцитах крысы с нормальной работой печени.

Впервые в нашей работе продемонстрировано, что при холестазе в сочетании с длительной гиперпролактинемией пролактин сохранял свое позитивное влияние на короткую и длинную форму рецепторов пролактина в гепатоцитах и дополнительно увеличивал долю короткой формы в холангиоцитах. В гепатоцитах чувствительность к пролактину на фоне холестаза в сочетании с длительной гиперпролактинемией увеличилась за счет относительно равномерного усиления экспрессии мРНК обеих изоформ рецептора, в холангиоцитах увеличилась доля короткой изоформы рецептора пролактина без существенного влияния на длинную (Табл. 3).

Таблица 3. Влияние длительной гиперпролактинемии (гиперПРЛ) на экспрессию мРНК и соотношение изоформ рецептора пролактина в клетках печени самок крыс мРНК короткой мРНК длинной Соотношение Тип клеток, состояние изоформы изоформы уровней мРНК животного рецептора рецептора короткой и пролактина, пролактина, длинной изоформы % от мРНК hprt % от мРНК hprt рецептора пролактина ГЕПАТОЦИТЫ 60 ± 6 25 ± 1 2,4 ± 0,3 (4) С холестазом (4) (4) С холестазом + 118 ± 7 40 ± 3 3,0 ± 0,3 (5) длительная (5) * (5) * гиперПРЛ ХОЛАНГИОЦИТЫ 16 ± 3,0 14 ± 1,4 1,1 ± 0,1 (3) С холестазом (3) (3) С холестазом + 30 ± 5,5 17 ± 3,4 1,7 ± 0, длительная (3) (3) (3) * гиперПРЛ Значения уровня мРНК выражены в % от содержания мРНК гена hprt (M±sem).

В скобках - число животных, * p0,05 по сравнению с соответствующей группой без гиперпролактинемии.

Характер ответа клетки на пролактин определяется соотношением изоформ рецептора. Ответ целого органа складывается из соотношения ответов его клеточных элементов. Таким образом, основываясь на наших данных, можно предположить, что при обструктивном холестазе на фоне длительной гиперпролактинемии в гепатоцитах происходит усиление Jak/STAT каскада, а пропорциональное увеличение обеих форм, возможно, говорит о том, что относительный вклад негативного влияния короткой формы на проведение сигнала длинной существенно не изменилось. В холангиоцитах в данных условиях, вероятно, увеличивается доля «тканеспецифических» каскадов за счет относительного повышения экспрессии короткой изоформы рецептора пролактина, что предполагает усиление ее эффектов на известные зависимые от нее транскрипционные факторы – например, возможная активация ERK (Huang et al., 2008), ингибирование Sp1 и Galt (Devi et al., 2009, Halperin et al., 2008).

4. ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНЫХ МИШЕНЕЙ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА ЭКСКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ПЕЧЕНИ САМОК КРЫС НА ФОНЕ ХОЛЕСТАЗА Белки множественной устойчивости к лекарствам MRP2 и MRP3 и белок трансмембранного регулятора муковисцидоза CFTR - ключевые транспортеры в образовании кислотонезависимого желчетока, экспрессия которых сильно меняется при холестазе. Выбор данных транспортеров основан на полученных нами результатах при выполнении физиологических экспериментов:

отсутствие восстановления скорости желчетока и практическое исчезновение билирубина из желчи на фоне длительной гиперпролактинемии при сочетании с холестазом у самок крыс.

Мы предположили, что повышение чувствительности печени крысы на фоне холестаза к пролактину, может отражать многогранную роль данного гормона в механизмах регуляции изменения экскреторной функции печени.

Таким образом, мы решили изучить особенности экспрессии мРНК транспортеров MRP2, MRP3 и CFTR различных типов клеток печени на модели длительной гиперпролактинемии в сочетании с холестазом самок крыс.

4.1. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК транспортеров MRP2 и MRP3 клеток печени разного типа у самок крыс при холестазе. Показано, что экспрессия мРНК транспортера MRP2 в норме в гепатоцитах высока, а экспрессия мРНК транспортера MRP3 низка. При холестазе происходило достоверное снижение экспрессии мРНК транспортера MRP2 и соответствующий рост экспрессии мРНК транспортера MRP3 (см.

Рис. 3) в гепатоцитах, что привело к росту уровня общего и конъюгированного билирубина в крови (как было показано ранее). Такое реципрокное изменение системы транспортеров MRP2/MRP3 согласуется с литературными данными и считается компенсаторным, антихолестатическим процессом (Zollner, 2006), происходящим в условиях холестаза.

Впервые нами установлено, что в гепатоцитах длительная гиперпролактинемия на фоне холестаза снижает экспрессию мРНК транспортера MRP2. Этим, очевидно, можно хотя бы частично объяснить выявленное нами снижение концентрации билирубина в желчи и затруднение восстановления желчетока в начальный постхолестазный период у соответствующей группы самок крыс. При длительном воздействии пролактин на фоне холестаза не оказывает существенного влияния на экспрессию мРНК MRP3 в гепатоцитах (Рис. 3).

В холангиоцитах экспрессия мРНК системы транспортеров MRP2 и существенно не изменилась в данных условиях.

Однако можно отметить, что в случае действия короткой двухнедельной гиперпролактинемии в сочетании с холестазом у самок крыс, возможно обратное действие пролактина на транспортеры – увеличение экспрессии (или стимуляция встраивания данного транспортера в мембрану из везикул) мРНК MRP2 апикальной мембраны клеток (т.к. показано увеличение билирубина в желчи) и увеличение (или стимуляция встраивания данного транспортера в мембрану из везикул) экспрессии мРНК MRP3 базолатеральной мембраны клеток (т.к. показано достоверно резкое увеличение билирубина в крови), что требует дальнейшего исследования экспрессии мРНК данных транспортеров и изучения траффика внутриклеточного пула везикул.

Содержание мРНК MRP2, % от мРНК * А # hprt норма (3) норма с холестаз (4) холестаз с гиперПРЛ (4) гиперПРЛ (4) Содержание мРНК MRP3, % от мРНК Б * hprt норма (3) норма с холестаз (4) холестаз с гиперПРЛ (4) гиперПРЛ (4) Рис. 3. Влияние длительной гиперпролактинемии (гиперПРЛ) на содержание мРНК транспортеров MRP2 (А) и MRP3 (Б) в изолированных гепатоцитах самок крыс в норме и на фоне холестаза (М±sem). В скобках – число животных, * р 0,05 по сравнению с показателем в норме # р 0,05 по сравнению с показателем при холестазе Следовательно, в исследуемой нами модели пролактин может оказывать частичное антихолестатическое действие, участвуя в снижении экспрессии мРНК MRP2 в гепатоцитах. Ингибирование экспрессии мРНК данного транспортера может происходить через активацию Jak/STAT каскада, индуцируемое пролактином через длинную изоформу своего рецептора, так как в гене MRP2 показано наличие STAT элементов (Simon et al., 2006).

Однако пролактин может также осуществлять ингибирование экспрессии транскрипционного фактора sp1 через короткую форму рецепторов (Devi et al., 2009), что в свою очередь, приводит к снижению экспрессии мРНК MRP2, так как в гене MRP2 есть чувствительный элемент для sp1 (Iida et al., 2001, Kauffmann et al., 2001).

4.2. Влияние гиперпролактинемии на экспрессию мРНК специфического для холангиоцитов транспортера CFTR у самок крыс при холестазе. В нашей работе мы показали, что длительная гиперпролактинемия в сочетании с холестазом приводит к существенному повышению экспрессии CFTR холангиоцитов у самок крыс (Рис. 4).

Содержание мРНК CFTR, * % от мРНК hprt холестаз (4) холестаз+гиперПРЛ (4) Рис. 4. Влияние длительной гиперпролактинемии (гиперПРЛ) на содержание мРНК транспортера CFTR в изолированных холангиоцитах самок крыс при холестазе (М±sem). В скобках – число животных, * р 0,05 по сравнению с показателем при холестазе В исследуемой нами модели мы показали появление белой «известковой» желчи у крыс на фоне длительной гиперпролактинемии в сочетании с холестазом. По литературной данным появление белой желчи говорит о снижении экспрессии MRP2 (что мы подтвердили в нашей работе), повышении секреции HCO3- и более длительном течении холестаза у больных (Zsembery, 2000). Также в «известковой желчи» определяют диффузный преципитат карбоната кальция. Сильно изменяется рН желчи в сторону ощелачивания, что приводит к кристаллизации с образованием осадка (Маев, 1997).

В нашей работе мы показали, что пролактин стимулировал экспрессию мРНК, но и, вероятно, активацию работы CFTR на мембране холангиоцитов, вызывая повышенную секрецию бикарбоната, что создает базу для образования известковой желчи, и стимулируя поступление воды, что приводит к снижению концентрации билирубина в желчи. Действие гормона в холангиоцитах может происходить, возможно, через короткую изоформу рецептора.

Следовательно, в исследуемой нами модели пролактин при длительном воздействии может оказывать и выраженное прохолестатическое действие в патогенезе холестаза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные нами данные свидетельствуют о существенной роли пролактина в регуляции экскреторной функции печени крысы при холестазе. На фоне гиперпролактинемии у крыс а) исчезают половые различия ряда показателей экскреторной функции печени, б) снижается скорость желчетока при декомпрессии желчного протока, в) изменяется уровень и соотношение изоформ рецептора пролактина, зависимое от типа клеток печени, г) изменяется экспрессия мРНК ключевых транспортеров, определяющих кислотонезависимый желчеток и транспорт билирубина в желчь.

Результаты нашей работы показали наличие скрытой половой зависимости ряда показателей экскреторной функции печени в норме, которая проявилась при обструктивном холестазе, что говорит об участии половых гормонов в регуляции патогенеза данного синдрома.

Автор выражает глубокую и искреннюю признательность сотрудникам лаборатории молекулярной эндокринологии Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН и лаборатории генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.

Ломоносова за неоценимую помощь и ценные советы при проведении молекулярно-биологических исследований.

ВЫВОДЫ 1. Действие пролактина на скорость желчетока и концентрацию билирубина в желчи существенно усиливается на фоне холестаза у крыс по сравнению с нормой.

2. Влияние гиперпролактинемии на перераспределение пулов билирубина при холестазе самок зависит от ее длительности: при 2-х-недельном воздействии содержание билирубина растет в желчи и крови, а скорость восстановленного желчетока замедляется, при 4-х-недельном – концентрация билирубина резко снижается в желчи и приходит к контрольному уровню в крови, а желчеток не восстанавливается.

3. В начальный постхолестазный период выявлена половая зависимость в показателях экскреторной функции печени: у самок скорость восстановленного желчетока ниже, а концентрация билирубина в желчи выше, чем у самцов.

4. В условиях гиперпролактинемии на фоне обструктивного холестаза исчезают половые различия в концентрации билирубина в постхолестазной желчи и скорости желчетока и выявляются половые особенности альтернативных путей выведения билирубина у крыс.

5. Влияние длительной гиперпролактинемии на уровень и соотношение мРНК короткой и длинной изоформ рецептора пролактина при холестазе самок крыс зависит от типа клеток печени: в гепатоцитах чувствительность к пролактину увеличивается за счет равномерного усиления экспрессии обеих изоформ рецептора при неизменном соотношении изоформ, в холангиоцитах увеличивается доля короткой изоформы рецептора при неизменном уровне длинной.

6. Длительная гиперпролактинемия на фоне холестаза самок крыс: а) достоверно снижает экспрессию мРНК транспортера гепатоцитов MRP2 (белка 2 множественной устойчивости к лекарствам), не действуя на экспрессию мРНК данного транспортера в холангиоцитах;

б) не оказывает существенного влияния на экспрессию мРНК транспортера гепатоцитов и холангиоцитов MRP3 (белка 3 множественной устойчивости к лекарствам);

в) существенно повышает экспрессию мРНК специфичного для холангиоцитов хлорного канала CFTR.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Половые особенности перераспределения пулов общего билирубина при индукции и снятии холестаза у крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т. 146, №11. С. 495-498.

Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Влияние пролактина на показатели 2.

экскреторной функции печени при индукции и снятии холестаза у самок крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.

2009. Т. 148, №11. С. 511-514.

Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Изменение половых особенностей 3.

перераспределения пулов билирубина при индукции и снятии холестаза на фоне гиперпролактинемии крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010 (в печати).

Кушнарева Н.С. Влияние гиперпролактинемии на различные 4.

показатели экскреторной функции печени в модели индукции и снятии холестаза у крыс // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». 8-11 апреля 2008. Москва. Секция «Биология». С. 25.

Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Скорость желчетока и экскреция 5.

билирубина с желчью в модели индукции и снятия холестаза в зависимости от пола крысы // Тезисы к докладу V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». 19- мая 2008. Москва. №6. С. 237-238.

Kushnareva N., Sergeeva M., Smirnova O. Influence of hyperprolactinemia 6.

on prolactin receptor manifestation and hepatic bilirubin excretory activity under condition of female rat obstructive cholestasis // Endocrine Abstracts for the 11th European Congress of Endocrinology. 25-29 April 2009.

Istanbul, Turkey. V. 20. P620.

Kushnareva N., Smirnova O. Restoration of bile bilirubin excretion rate 7.

after cessation of obstructive cholestasis is suppressed by hyperprolactinemia in rats // Abstracts for the Annual meeting of the Physiological Society “Physiology 2009”. University College Dublin. 7- July 2009. Dublin, Ireland. Proc Physiol Soc 15. C 88.

Kushnareva N., Smirnova O. Gender differences in redistribution of 8.

bilirubin pools in the model of induction and cessation of cholestasis in rats // Abstracts for the The Journal of Physiological Sciences, V. 59, Suppl. 1, 2009. Proceedings of the XXXVI International Congress of Physiological Sciences “IUPS 2009”. July 27–August 1, 2009. Kyoto, Japan. P3PM-15-5.

Кушнарева Н.С., Сергеева М.И., Смирнова О.В. Влияние 9.

гиперпролактинемии на уровень экспрессии транспортера MRP3 в клетках печени самок крыс в условиях обструктивного холестаза и его снятии // Тезисы к докладу VII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 160-летию со дня рождения И.П. Павлова «Механизмы функционирования висцеральных систем».

29 Сентября – 2 Октября 2009. Санкт-Петербург, Россия. С. 240.