Молекулярные механизмы регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия

На правах рукописи

КАРПИЧЕВА Ольга Евгеньевна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТРОПОМИОЗИНОМ АКТИН-МИОЗИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 03.00.25 – Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитоло гии РАН.

Научный консультант: доктор биологических наук, проф.

Юрий Сергеевич Боровиков Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, проф.

Владимир Иосифович Воробьев Институт цитологии РАН доктор биологических наук, проф.

Дмитрий Иванович Левицкий Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Ведущая организация: Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН

Защита состоится 18 декабря 2009 года в 15 ч. на заседании Диссертационно го совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института цито логии РАН.

Автореферат разослан 17 ноября 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Молекулярные механизмы мышечного сокращения являются предметом ин тенсивных исследований многих лабораторий. Актуальность этих исследований обу словлена тем, что, несмотря на огромный объем имеющихся данных, многие фун даментальные аспекты мышечного сокращения и его регуляции остаются до сих пор невыясненными. Кроме того, при различных заболеваниях сердечных и скелетных мышц, таких как дилятационная и гипертрофическая кардиомиопатии, немалиновая миопатия, обнаружены мутации в генах сократительных и регуляторных белков, приводящие к серьезным функциональным нарушениям. Выяснение молекулярных механизмов нарушения сократительной функции мышц может иметь существенное значение для ранней диагностики и генной терапии мышечных болезней.

Известно, что в основе мышечного сокращения лежит циклическое взаимо действие головок миозина с актином, сопровождаемое гидролизом аденозинтри фосфорной кислоты (АТФ). В скелетных и сердечных мышцах основная регуляция взаимодействия миозина с актином осуществляется Са2+-зависимым образом тро понин-тропомиозиновым комплексом (ТН-ТМ), расположенным на актиновой нити.

Наиболее популярная в настоящее время модель стерического блокирования пред полагает, что регуляция мышечного сокращения осуществляется движением тропо миозина по поверхности актиновой нити относительно областей взаимодействия миозина с актином [1, 2]. Считается, что связывание ионов Са2+ тропонином индуци рует структурные перестройки ТН-ТМ, вследствие которых тропомиозин смещаясь к центру тонкой нити открывает области взаимодействия миозина с актином. В глад ких мышцах функцию тропонина, вероятно, выполняют кальдесмон (CaD) и Са2+ связывающие белки [3, 4]. Активация сокращения гладких мышц, также как и попе речно-полосатых мышц, сопровождается движением тропомиозина на тонкой нити.

Однако в гладких мышцах при ингибировании АТФазы миозина тропомиозин не за крывает потенциальные области связывания миозина на актиновой нити [5]. Разли чие в расположении тропомиозиновой молекулы относительно актина в разных мы шечных системах становится не столь существенным, если предположить, что каль десмон в гладких мышцах и тропонин в поперечно-полосатых мышцах во взаимо действии с тропомиозином способны изменять структурное состояние актина [6].

Возможно, что регуляция тонкой нити осуществляется не только в результате меха нического блокирования тропомиозином областей взаимодействия миозина с акти ном, но также аллостерически – вследствие сложных конформационных изменений всего ансамбля мышечных белков. Возможность такого способа регуляции поддер живается биохимическими данными (см. обзор: [7]) и может разрешить многие про тиворечия модели стерического блокирования актин-миозинового взаимодействия.

Однако механизмы аллостерической регуляции мышечного сокращения остаются малоизученными. Таким образом, актуальность изучения молекулярных механизмов регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия, и, в частности, кон формационных изменений сократительных и регуляторных белков, не вызывает со мнений.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных механизмов регуляции скелетным и гладкомышечным тропомиозина ми актин-миозинового взаимодействия. В задачи исследования входило:

1. Исследовать конформационные перестройки актина и миозина, происходящие в мышечном волокне в цикле гидролиза АТФ.

2. Изучить молекулярные механизмы регуляции тропонин-тропомиозиновой и кальдесмон-тропомиозиновой регуляторными системами актин-миозинового взаи модействия.

3. Исследовать влияние точечных мутаций Glu117Lys и Gln147Pro тропомиози на, связанных с немалиновой миопатией, на регуляцию взаимодействия миозина с актином в АТФазном цикле.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В цикле гидролиза АТФ существует несколько промежуточных структурных состояний ансамбля мышечных белков (актина, миозина и тропомиозина), находя щихся в динамическом равновесии. Эти состояния отличаются друг от друга кон формацией головок миозина и мономеров актина, характеризующейся различной пространственной организацией и подвижностью SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. Каждому промежуточному состоянию актомиозина соответствует опреде ленное структурное состояние тропомиозина, характеризуемое различной позицией и подвижностью этого белка на поверхности актиновой нити.

2. Регуляция актин-миозинового взаимодействия ТН-ТМ может осуществляться взаимозависимыми конформационными перестройками актина, миозина и тропо миозина. При низкой концентрации Са2+ ТН-ТМ ингибирует АТФазный цикл актомио зина, смещая тропомиозин к периферии тонкой нити, огранивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя актин в «выключенном» состоянии, при котором миозиновые головки, связанные с актином, не способны генерировать силу. При вы сокой концентрации Са2+ тропонин сдвигает тропомиозин ближе к центру тонкой ни ти при формировании сильной формы связывания миозина с актином и дальше к периферии тонкой нити при слабом связывании этих белков, таким способом увели чивая амплитуду внутримолекулярных движений тропомиозина и актомиозина в цикле гидролиза АТФ, что может приводить к увеличению эффективности работы поперечных мостиков.

3. В гладкомышечной регуляторной системе дефосфорилированный кальдесмон ингибирует АТФазный цикл актомиозина, сдвигая тропомиозин к периферии тонкой нити, ограничивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя конфор мацию актина в «выключенном» состоянии.

4. Мутации Glu117Lys и Gln147Pro тропомиозина, связанные с наследственной немалиновой миопатией, вызывают смещение тропомиозинового тяжа к периферии тонкой нити и ингибируют движения тропомиозина на поверхности актина в цикле гидролиза АТФ, что может вызвать нарушение согласованной работы ансамбля мы шечных белков, сдвигая равновесие сократительной системы к слабосвязанному структурному состоянию.

Научная новизна исследований. Впервые показано, что в мышечном волок не в АТФазном цикле существует несколько структурных состояний актомиозиновой системы, отличающихся друг от друга подвижностью и пространственной организа цией SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. Каждому промежуточному состоя нию актомиозина соответствует определенное структурное состояние тропомиозина, характеризуемое различной подвижностью и позицией этого белка на поверхности актиновой нити. Получены приоритетные данные о том, что регуляция актин миозинового взаимодействия в скелетных и гладких мышцах может осуществляться взаимозависимыми конформационными перестройками актина, миозина и тропо миозина. Показано, что тропонин и Са2+ способны модифицировать влияние нуклео тидов на структурное состояние ансамбля актина, миозина и тропомиозина, что мо жет быть причиной активации гидролиза АТФ при высокой концентрации Са2+ и ин гибирования гидролиза при низкой концентрации Са2+. Обнаружено, что дефосфо рилированный кальдесмон, фиксируя тропомиозин на периферии тонкой нити, инги бирует смещение субдомена 1 актина и SH1 спирали миозина к периферии тонкой нити и подавляет формирование сильных форм связывания актомиозина, что может приводить к ингибированию гидролиза АТФ. Впервые показано, что одной из причин ослабления сократительной функции скелетных мыщц при немалиновой миопатии является ингибирование движения тропомиозина по поверхности тонкой нити в цик ле гидролиза АТФ.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные рас ширяют и углубляют представления о молекулярных механизмах клеточной подвиж ности и могут быть использованы при чтении курсов лекций по цитологии, клеточной биологии, биофизике, биохимии и физиологии. Впервые обнаруженное нами ингиби рование движения скелетного тропомиозина по поверхности тонкой нити в цикле гидролиза АТФ, вызванное мутациями Glu117Lys и Gln147Pro тропомиозина, имеет большое значение для выяснения молекулярных механизмов ослабления сократи тельной функции скелетных мышц при наследственной немалиновой миопатии. Ре зультаты работы могут быть полезны при разработке методов диагностики некото рых болезней мышечной ткани.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 статей в рецензи руемых изданиях и 13 тезисов. Материалы диссертации были представлены на Ев ропейских мышечных конференциях (Монпелье, Франция, 2003;

о. Эльба, Италия, 2004;

Хортобадь, Венгрия, 2005;

Стокгольм, Швеция, 2007;

Оксфорд, Великобрита ния, 2008), на международном симпозиуме “Биологическая подвижность” (Пущино, 2004) и на научных семинарах лаборатории Молекулярных основ клеточной подвиж ности ИНЦ РАН.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой под держке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 01-04 49310, № 05-04-48812a, № 08-04-00960), Программы «Ведущие научные школы РФ» (НШ-9396.2006.4;

НШ-1961.2008.4), ФАНИ (Госконтракты № 02.445.11.7338 от 09.06.2006 и № 02.512.11. 2108 от 01.06.2007 г.), ИНТАС (проект 01-0516), стипендии Федерации Европейских биохимических обществ (FEBS) и гранта Администрации г.

Санкт-Петербурга.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материа лы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка цитируе мой литературы, включающего 249 источников. Иллюстративный материал пред ставлен 25 рисунками и 4 таблицами.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В главе рассмотрены структура и функции мышечных белков: актина, миози на, тропомиозина и кальдесмона. Особое внимание уделено описанию имеющихся в литературе данных о молекулярных механизмах регуляции тропомиозином актин миозинового взаимодействия в скелетных и гладких мышцах. Приведены данные ис следований влияния точечных мутаций в тропомиозине, связанных с различными наследственными заболеваниями, на структуру и функцию этого регуляторного бел ка. В заключение представлены результаты изучения механизмов мышечного со кращения, полученные с помощью метода поляризационной флуориметрии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Работа выполнена на одиночных «теневых» мышечных волокнах скелетных мышц кролика, в которые были инкорпорированы скелетный тропомиозин и тропонином или гладкомышечный тропомиозин и кальдесмон и субфрагмент- миозина [8, 9]. В некоторых экспериментах в теневые волокна инкорпорировали G актин. Гладкомышечный тропомиозин и кальдесмон получали из мускулатуры же лудка утки или курицы [10]. Миозин и актин выделяли из скелетных мышц кролика [11, 12]. Субфрагмент-1 миозина получали перевариванием миозина химотрипсином в весовом соотношении 1:300 [13]. Концентрацию белков определя ли с помощью спектрофотометра СФ-46, используя известные коэффициенты по глощения. Тропомиозин и тропонин скелетных мышц человека экспрессировали в клетках BL21(DE3)pLysS Escherichia coli (Novagen®) [14]. Точечные мутации Glu117Lys и Gln147Pro встраивали в нормальную последовательность ДНК тропо миозина методом сайт-направленного мутагенеза. Образцы ДНК были сиквенирова ны в Отделе биохимии Университета г. Оксфорда. Белки очищали методом ионооб менной хроматографии. Для реконструкции тропонинового комплекса субъединицы С, Т и И смешивали в равном молярном соотношении и диализовали в несколько этапов с постепенным снижением ионной силы. Полученные препараты мышечных белков визуализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) [15].

Окрашивание мышечных белков флуоресцентными красителями. Цис субфрагмента-1 миозина и Цис374 G-актина специфически окрашивали N йодоацетил-N’-(5-сульфо-1-нафтил)этилен-диамином (1,5-IAEDANS) [16, 17]. F-актин теневых волокон метили с помощью фаллоидина, связанного с флуоресцеин-5 изотиоцианатом (FITC) или тетраметилродамин-изотиоцианатом (TRITC) [18]. Каль десмон окрашивали акрилоданом по Цис580 [19]. Связывание TRITC-фаллоидина к актину теневого волокна контролировали с помощью конфокального микроскопа TSC2 (Leica). Рекомбинантный -тропомиозин, содержащий в своей структуре один цистеиновый остаток Цис36, окрашивали 5-йодоацетоамидо-флуоресцеином (5-IAF) [20]. Мечение Цис36 и Цис190 гладкомышечного тропомиозина осуществляли без диссоциации - и -субъединиц с помощью 1,5-IAEDANS и 5-IAF, соответственно.

Специфичность окрашивания препаратов определяли методом SDS-электрофореза в ПААГ с последующей визуализацией гелей в ультрафиолетовом свете.

Метод поляризационной микрофлуориметрии. Флуоресцентные зонды, связанные с белками мышечного волокна, повторяют строго упорядоченное про странственное расположение этих белков и соответствующих аминокислотных ос татков, с которыми они связаны. Анизотропное расположение флуорофоров приво дит к появлению поляризованной флуоресценции, анализ которой позволяет выяс нить, как в среднестатистической молекуле белка расположены флуоресцентные зонды и какова их подвижность. При анализе результатов настоящей работы ис пользовали модель-зависимый метод [21-25]. Предполагали, что, элементарные ак ты поглощения и излучения света осуществляются линейными диполями поглоще ния (A) и излучения (E), жестко связанными с молекулой флуорофора. Углы ориен тации диполей поглощения А или излучения Е, а также относительное количест во хаотически расположенных флуорофоров N вычисляли, измерив интенсивности четырех компонентов поляризованной флуоресценции зонда при ориентации мы шечного волокна параллельно (||I||, ||I) и перпендикулярно (I, I||) плоскости поля ризации возбуждающего света [21, 25, 26]. Регистрацию интенсивностей поляризо ванной флуоресценции производили с помощью поляризационного флуориметра [27]. Флуоресценцию акрилодана, 5-IAF, FITC- и TRITC-фаллоидина регистрировали в области 500-600 нм после возбуждения при 437±5 нм. Для 1,5-IAEDANS длина возбуждающего света составляла 365 ± 5 нм.

Поскольку поляризованная флуоресценция красителя чувствительна к изме нению конформации белка, с которым он связан, а присутствие красителя не оказы вает существенного влияния на свойства белка [16, 20, 28, 29], то изменения пара метров поляризованной флуоресценции красителя можно рассматривать как свиде тельство конформационных перестроек белка, происходящих при мышечном сокра щении. Изменение значений Е (или А) и N интерпретировали как изменение в ори ентации участка полипептидной цепи относительно оси мышечного волокна в облас ти локализации зонда и изменение подвижности этого участка, соответственно. Ха рактер изменения A, как правило, совпадал с характером изменения E и поэтому при анализе результатов работы представлены значения только одной из этих вели чин. Изменения параметров поляризованной флуоресцении зондов были обратимы во всех экспериментах. Статистическую достоверность изменений оценивали с по мощью критерия Стьюдента 0,05%.

Измерения осуществляли в растворе, содержащем 10 мМ КCl, 3 мМ МgCl2, 6, мМ фосфатный буфер, рН 7,0, 4 мМ этиленгликольтетраацетат (EGTA) (рСа 7) или 0,1 мМ CaCl2 (рСа 5). Моделирование промежуточных структурных состояний ак томиозинового комплекса осуществляли с помощью нуклеотидов или их аналогов: мM MgATP, 25 мM MgATPS или 15 мМ MgAMP-PNP для симуляции слабых форм связывания и 2,5 мМ MgADP или в отсутствие нуклеотида для моделирования силь ных форм связывания миозина с актином [30-32].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние скелетного тропомиозина, тропонина и Cа2+ на структурное состояние субфрагмента-1 миозина и актина в АТФазном цикле.

Согласно современным представлениям, генерация силы миозиновым попе речным мостиком осуществляется при изменении ориентации регуляторного домена головки миозина в процессе гидролиза АТФ [33]. Актиновая нить рассматривается как относительно пассивный компонент сократительной системы. Результаты на стоящей работы существенно дополняют эти представления, указывая на то, что в цикле гидролиза АТФ происходят многоступенчатые и взаимозависимые структур ные перестройки моторного домена головки миозина и актина, которые, по видимому, определяют эффективность работы актомиозинового мотора (рис. 1). Ре гуляция взаимодействия миозина с актином реализуется не только стерическим бло кированием тропонин-тропомиозиновым комплексом сайтов связывания миозина на актине, а также аллостерически – с помощью сложных конформационных перестро ек ансамбля мышечных белков (актина, миозина и тропомиозина).

S1-AEDANS Как следует из рис. 1, а, б, каж а б 0, дой моделируемой стадии цикла гид- Актин-S * * N (отн. ед.) 52 +ТМ 0, Ф () о ролиза АТФ соответствует опреде- 0, E ленная ориентация и подвижность 0, 0, зондов 1,5-IAEDANS, связанных с - ADP AMP-PNP ATPS ATP - ADP AMP-PNP ATPS ATP Цис707 в области SH1 спирали суб- Актин-AEDANS в 58 г 0, фрагмента-1 миозина (S1-AEDANS). Актин-S +ТМ N (отн. ед.) 0, Ф () Согласно интерпретации, предложен о 0, * E * ной ранее (см. обзоры: [34], [35]), из- * 0, * 0, менение угла ориентации диполей Е - ADP AMP-PNP ATPS ATP - ADP AMP-PNP ATPS ATP S1-AEDANS свидетельствует о накло- Рис. 1. Значения Е и N для S1-AEDANS (а, б) или актин-AEDANS (в, г) при моделировании в теневом не SH1 спирали, содержащей краси- волокне промежуточных стадий АТФазного цикла в отсутствие (белые колонки) и в присутствии (зеле тель, относительно оси волокна, а ве- ные и синие колонки) ТМ. Символами * показаны недостоверные изменения значений относительно личину подвижности N можно рас данных для теневых волокон, которые не содержа ли ТМ (белые колонки), в остальных случаях эти сматривать как показатель сродства изменения достоверны, p0,05.

S1 к актину. При моделировании пе рехода актомиозина из слабой (в присутствии АТФ) в сильную (в отсутствие нуклео тида) форму связывания значения Е и N для S1-AEDANS постепенно уменьшаются на 6° и 0,13 отн. ед. (на 32%), соответственно. Следовательно, в цикле гидролиза АТФ происходит многоступенчатый наклон SH1 спирали моторного домена миозина по направлению к оси тонкой нити и иммобилизация головок миозина, связанных с актином. Поскольку считается, что SH1 спираль участвует в передаче конформаци онных изменений от активного центра на регуляторный домен миозина [36], то на блюдаемые изменения параметров флуоресценции S1-AEDANS отражают, по видимому, конформационные перестройки всего моторного домена миозина.

Изменения в активном центре головки миозина передаются не только на SH спираль миозина, но также на актин, вызывая нуклеотид-зависимые изменения ори ентации и подвижности субдомена 1 актина в тонких нитях (рис. 1, в, г). Изменение угла ориентации зондов 1,5-IAEDANS, связанных с Цис374 актина (актин-AEDANS), мы интерпретировали как вращение всего субдомена 1 актина, поскольку ранее бы ло показано, что зонды, расположенные в разных областях субдомена 1, изменяют свою ориентацию относительно оси волокна однонаправлено, что указывает на дви жение всего субдомена 1 актина, как жесткого тела [27]. Переход актомиозина из слабой в сильную форму связывания вызывает увеличение Е для актин-AEDANS на 7° (рис. 1, в) и снижение N на 0,12 отн.ед. (на 30%) (рис. 1, г), что свидетельствует о вращении субдомена 1 актина от оси тонкой нити и о его иммобилизации при сильном связывании S1 [27].

Таким образом, в цикле гидролиза АТФ каждому промежуточному конформа ционному состоянию головки миозина соответствует определенная пространствен ная организация и подвижность субдомена 1 актинового мономера. Самые заметные изменения ориентации и подвижности субдомена 1 актина происходят при переходе от слабой формы связывания актомиозина в присутствии AMP-PNP или ATPS к сильной форме в присутствии ADP, то есть на тех стадиях АТФазного цикла, на ко торых, вероятно, происходит генерация силы [37], и соответствуют наибольшему сдвигу и изменению подвижности SH1 спирали миозина.

Присоединение скелетного тропомиозина к актину вызывает значительные изменения Е и N для S1-AEDANS или актин-AEDANS (рис. 1), что позволяет пред положить, что этот регуляторный белок индуцирует изменения пространственной ор ганизации SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. В присутствии тропомиозина значения Е зондов, связанных с миозином или актином, в целом характерны для более сильной формы связывания миозина с актином. При этом амплитуда движе ния SH1 спирали и субдомена 1 актина при переходе из слабой в сильную форму связывания увеличивается соответственно на 22 и 12% (рис. 2). Поскольку считает ся, что изменение конформации активного центра миозина передается на регуля торный домен при участии SH1 спирали, что играет ключевую роль в развитии силы б [37-39], то увеличение амплитуды а Актин-AEDANS S1-AEDANS движения SH1 спирали в АТФазном ФЕ (%) цикле может указывать на то, что ФЕ (%) тропомиозин увеличивает эффектив- 24 % 71 % 22 % 19 % 12 % -5 % 0 ность работы каждого поперечного +C +TN -C TN M a 2+ a 2+ +C +TN +T + -C T N M a 2+ M M a 2+ +T +T +T M + мостика.

M +T +T Рис. 2. Влияние скелетного ТМ, ТН и Са2+ на ампли Тропонин Са2+-зависимым об- туду изменений Е для S1-AEDANS (а) или актин AEDANS (б), наблюдаемых при моделировании пере разом модифицирует влияние тро хода актомиозина из слабой в сильную форму связы помиозина на структурное состояние вания. За контроль принято значение Е при пере ходе актомиозина из слабой в сильную форму связы S1 миозина и актина в цикле гидро- вания в теневом волокне, декорированном S1 в от сутствие ТН и ТМ.

лиза АТФ (рис. 3).

При моделировании сильных S1-AEDANS а 54 б форм связывания миозина с актином ** N (отн. ед.) 0, * в присутствии Са2+ (рСа 5) тропо Ф () о 0, E нин усиливает влияние тропомиози 0, на на взаимодействие актина с мио 0, - ADP AMP-PNP ATPS ATP - ADP AMP-PNP ATPS ATP зином, стимулируя формирование Актин-AEDANS в г более сильных структурных состоя 0, * 56 N (отн. ед.) ний актомиозина. Это, по-видимому, ** Ф () о ** 0, E * обусловлено увеличением стерео 50 0, ** специфичности взаимодействий ме 0, - ADP AMP-PNP ATPS ATP - ADP AMP-PNP ATPS ATP жду актином и миозином вследствие Рис. 3. Влияние ТН и Са2+ на значения Е и N для S1-AEDANS (а, б) или актин-AEDANS (в, г) при мо- изменения позиции тропомиозина на делировании промежуточных стадий АТФазного тонкой нити (см. раздел 3). При этом цикла в теневом волокне, содержащем ТМ и S1 (зе леные и синие колонки) или ТМ, S1 и ТН при низкой амплитуда движений SH1 спирали и и высокой концентрации Са2+ (соответственно оранжевые и бордовые колонки). Символами * по субдомена 1 актина при переходе из казаны недостоверные изменения значений относи тельно тонких нитей, не содержащих ТН (зеленые, слабой в сильную форму связывания синие или красные колонки), в остальных случаях эти изменения достоверны, p0,05. увеличивается на 71% и 19%, соот ветственно (рис. 2). Наоборот, при низкой концентрации Са2+ (рСа 7) тропонин ока зывает противоположное влияние на Е и N для S1-AEDANS и актин-AEDANS, что свидетельствует, по-видимому, об ослаблении актин-миозинового взаимодействия.

Интересно отметить, что амплитуда движений SH1 спирали при трансформации ак томиозина из слабой в сильную форму связывания не изменяется (рис. 2, а), тогда как амплитуда движения субдомена 1 актина ингибирована на 5% (рис. 2, б). Это указывает на то, что тропомиозин и тропонин при низких концентрациях Са2+ спо собны разобщить согласованные конформационные изменения головки миозина и актина в АТФазном цикле. Похожие нарушения согласованной работы актина и мио зина обнаружены нами при исследовании механизмов регуляции АТФазного цикла гладкомышечным тропомиозином и кальдесмоном (см. раздел 2).

2. Влияние гладкомышечного тропомиозина и кальдесмона на структур ное состояние субфрагмента-1 миозина и актина в АТФазном цикле.

Достаточно оснований считать, что кальдесмон играет важную роль в регуля ции сокращения гладких мышц, связанной с тонкими нитями [4, 9, 41, Pronina (Karpi cheva) et al., 2007а]. В настоящей работе мы показали, что актиновые нити, содер жащие дефосфорилированный кальдесмон, практически теряют свою способность изменять структурное состояние в цикле гидролиза АТФ (рис. 5, а, б), в то время как S1 миозина в этих экспериментальных условиях сохраняет способность изменять свою конформацию (рис. 5, в, г).

Чтобы продемонстрировать влияние кальдесмона на структурное состояние актина, мы окрашивали актин теневых волокон FITC-фаллоидином, который связы вается с тремя соседними мономерами актина [42]. Специфичность связывания кра сителя к актину демонстрирует фотография теневого волокна, содержащего мече ный актин (рис. 4), на которой можно наблюдать избирательное окрашивание краси телем тонких нитей [Pronina (Karpicheva) et al., 2007а].

Согласно интерпретации, предложенной ра нее [43], изменения Е и N актин-FITC-фаллоидина свидетельствуют соответственно об аксиальном вращении актиновых мономеров относительно оси волокна и об изменении их подвижности. Связыва ние тропомиозина и S1 с актином в отсутствие нук леотида вызывает уменьшение Е и увеличение Рис. 4. Фотография теневого во N для актин-FITC-фаллоидина (рис. 5, в, г), что локна, содержащего актин, окра шенный TRITC-фаллоидином.

можно интерпретировать как поворот актиновых мономеров по направлению к оси волокна и увеличение их подвижности [Borovikov, Pronina (Karpicheva) et al., 2006]. В присутствии ADP этот эффект усиливается. В противоположность этому, при моделировании слабых форм связывания миозина с актином происходит увеличение Е, что указывает на вращение актиновых мономе ров от оси мышечного волокна. Похожие изменения мы наблюдали для SH1 спирали миозина, окрашенной 1,5-IAEDANS (рис. 5, а). Данные показывают, что активация актиновой нити при сильном связывании S1 сопровождается синхронным однона правленным аксиальным вращением SH1 спирали миозина (рис. 5, а) и мономеров актина (рис. 5, в) к оси мышечного волокна. При этом субдомен 1 актина движется в противоположном направлении – от оси мышечного волокна (рис. 1, в).

Связывание кальдесмона с S1-AEDANS а б тонкой нитью оказывает заметное Актин-ТМ-S1 0, N (отн. ед.) +CaD 0, Ф () влияние на значения Е и N зондов, о 0, E 0, связанных с актином или S1 миозина 42 0, (рис. 5). При этом характер этих из 40 0, - ADP AMP-PNP ATPS ATP - ADP AMP-PNP ATPS ATP Актин-FITC-фаллоидин менений в АТФазном цикле для S1 в 52 г 0, Актин-ТМ-S AEDANS и актин-FITC-фаллоидина 50 +CaD 0, N (отн. ед.) Ф () различается. Параметры флуорес о 46 0, * E 0, ценции актин-FITC-фаллоидина при 40 0, P P S S P +Т н P +Т н P PN P моделировании АТФазного цикла в М PN М P P ти AT ти AT AD AD AT P AT Ак P Ак AM AM Рис. 5. Значения Е и N для S1-AEDANS (а, б) или присутствии кальдесмона изменяют актин-FITC-фаллоидина (в, г) при моделировании ся слабо. Если в отсутствие каль промежуточных стадий АТФазного цикла в теневом волокне, содержащем ТМ и S1, в отсутствие (зеле десмона наблюдали многоступенча ные и синие колонки) и в присутствии (желтые колон ки) CaD. Белые и бордовые колонки представляют тые изменения наклона и подвижно значения для тонких нитей в отсутствие и в присутст вии ТМ, соответственно. Символами * показаны не- сти актиновых мономеров, то акти достоверные изменения значений относительно дан новые нити, содержащие кальдес ных для тонких нитей, не содержащих CaD (зеленые или синие колонки), в остальных случаях эти измене мон, практически теряют свою спо ния достоверны, p0,05.

собность изменять структурное состояние при связывании S1 с различными нуклео тидами. Амплитуда изменений Е актин-FITC-фаллоидина при переходе из слабой в сильную форму связывания актомиозина в присутствии кальдесмона снижается на 52%. Следовательно, кальдесмон переводит актин в состояние, при котором резко ингибируется способность актина к конформационным перестройкам [Borovikov, Pro nina (Karpicheva) et al., 2006].

В противоположность актину, S1 миозина в присутствии кальдесмона сохра няет в значительной степени способность изменять свою конформацию при модели ровании промежуточных стадий цикла гидролиза АТФ. Согласно рис. 5, а, связыва ние кальдесмона к актину вызывает увеличение Е S1-AEDANS на каждой модели руемой стадии АТФазного цикла, что характерно для перехода структурного состоя ния головки миозина в слабую форму связывания с актином. Кальдесмон уменьшает амплитуду изменений Е S1-AEDANS при переходе из слабой в сильную форму свя зывания актомиозина на 14%. Увеличение N в присутствии кальдесмона для S1 AEDANS и актин-FITC-фаллоидина также указывает на то, что свойства актин миозинового комплекса в присутствии кальдесмона близки к свойствам, характер ным для слабой формы связывания миозина с актином, и отражает, по нашему мне нию, снижение сродства S1 к актину, которое, в свою очередь, может являться след ствием уменьшения области контакта головки миозина с актиновой нитью [38].

Поскольку актин и головка миозина испытывают согласованные и взаимосвя занные конформационные изменения (рис. 5), то эффект кальдесмона на структур ное состояние S1 можно объяснить стабилизацией структуры актина в выключенном состоянии, при котором нарушается согласованность конформационных перестроек миозина и актина и головка миозина в АТФазном цикле работает неэффективно.

Тропомиозин в этом случае, по-видимому, играет важную роль в передаче конфор мационных изменений мономеров актина вдоль тонкой нити. Подобное разобщение работы актомиозина мы наблюдали в теневом волокне, содержащем S1, ТМ и ТН при низкой концентрации Са2+ (рис. 3). Возможно, что для различных мышечных тка ней существует похожий аллостерический механизм регуляции актомиозинового мо тора в цикле гидролиза АТФ.

3. Конформационные перестройки скелетного и гладкомышечного тро помиозинов в цикле гидролиза АТФ.

Ранее было предположено, что тропомиозин изменяет свою позицию относи тельно актина, сдвигаясь или «перекатываясь» по поверхности тонкой нити при её активации [44]. Данные, полученные в настоящей работе с использованием скелет ного и гладкомышечного тропомиозинов, меченных флуоресцентными зондами, ука зывают на то, что тропомиозин дей ТМ-AF а б 0, ствительно изменяет свою позицию N (отн. ед.) 0, на актине, «перекатываясь» по по Ф () о E 0, верхности тонкой нити в АТФазном 0, цикле [Kulikova, Pronina (Karpicheva) 52 0, - ADP AMP-PNP ATPS ATP - ADP AMP-PNP ATPS ATP et al., 2006].

Рис. 6. Влияние ТН и Са2+ на значения Е (а) и N (б) Согласно рис. 6, каждому для ТМ-AF при моделировании в теневом волокне промежуточных стадий АТФазного цикла. Красные структурному состоянию миозиново- колонки показывают данные для тонких нитей, со держащих ТМ и S1. Оранжевые и бордовые колонки го поперечного мостика соответст- показывают данные для тонких нитей, содержащих ТМ, S1 и ТН при низкой и высокой концентрации вует определенное значение Е и N Са2+, соответственно. Символами * показаны недос товерные изменения значений относительно данных для зондов 5-IAF, связанных с Цис для тонких нитей, не содержащих ТН (красные ко лонки), в остальных случаях эти изменения досто скелетного тропомиозина (TM-AF).

верны, p0,05.

Мы рассматривали вращение диполей красителя к оси мышечного волокна (умень шение Е) как сдвиг тропомиозина по поверхности тонкой нити к внешнему домену актина (на периферию), тогда как вращение зонда от оси мышечного волокна (уве личение угла Е) как смещение тропомиозина по направлению к внутреннему доме ну актина (к центру нити). Такая интерпретация подтверждается корреляцией между изменениями величины Е, наблюдаемыми в наших экспериментах, и данными электронной микроскопии о движении тропомиозина по поверхности тонкой нити [45, 46].

Следовательно, трансформация актомиозина от слабой к сильной форме свя зывания сопровождается постепенным сдвигом тяжа тропомиозина к центру тонкой нити. При этом величина N снижается, что можно объяснить увеличением сродства тропомиозина к актину при формировании сильных форм связывания актомиозино вого комплекса [Kulikova, Pronina (Karpicheva) et al., 2007].

Тропонин Са2+-зависимым образом модифицирует структурное состояние тропомиозина в АТФазном цикле. При высокой концентрации Са2+ тропонин умень шает значение Е TM-AF при моделировании слабых форм связывания актомиози на, и увеличивает значение этого параметра при симуляции сильных форм. Следо вательно, в присутствии тропонина и Са2+ тяж тропомиозина сдвинут дальше к пе риферии тонкой нити при формировании слабой формы связывания актомиозина и ближе к центру нити при сильном связывании миозина с актином. При низкой кон центрации Са2+ тропонин инициирует снижение значений Е для ТМ-AF на каждой стадии АТФазного цикла, указывая на смещение регуляторного белка к периферии тонкой нити. Амплитуда изменений Е для ТМ-AF при переходе из слабой в сильную форму связывания миозина с актином снижается на 23% при низкой концентрации Са2+ и, наоборот, увеличивается на 23% при высокой концентрации Са2+. Мы пред положили, что структурное состояние тропомиозина и его позиция на поверхности тонкой нити, обусловленная этой конформацией, играют решающую роль в ингиби ровании АТФазы, поскольку при низкой концентрации Са2+ даже при моделировании сильных форм связывания тропомиозин занимает позицию, характерную для слабо связанного состояния (рис. 6), амплитуда движений тропомиозина снижается, а ак томиозин формирует слабую форму связывания (рис. 3). По-видимому, разобщение согласованных конформационных изменений в миозине и актине и стабилизирова ние актомиозина в «выключенном» состоянии происходит вследствие блокирования миозин-зависимых движений тропомиозина в цикле гидролиза АТФ.

Похожее ингибирование движений тропомиозина мы наблюдали для гладко мышечной изоформы белка в присутствии кальдесмона. Оказалось, что гладкомы шечный тропомиозин также изменяет свою позицию на актиновой нити в АТФазном цикле. Данные, полученные с помощью специфического окрашивания C- или N концевых областей белка 5-IAF или 1,5-IAEDANS, соответственно, указывают на то, что тропомиозин, возможно, «перекатывается» по актиновой нити.

smTM-AF а б 0, Актин-TM-S - -цепь +CaD N (отн. ед.) 0, Ф () * о - -цепь А 0, 0, 0, P S P P S P P P PN P PN P AT AD AT AD AT P AT P AM AM smTM-AEDANS в г 0, Актин-ТМ-S +CaD N (отн. ед.) 0, - -цепь Ф () о - -цепь А 0, * 0, 0, NP P S S P P P P P PN P AT AT AD AD P-P AT AT P AM AM Рис. 8. Значения Е и N для S1-AEDANS (а, б) или актина-FITC-фаллоидина (в, г) в теневых волок нах, содержащих ТМ и S1, при моделировании промежуточных стадий АТФазного цикла в отсутст вие (зеленые и синие колонки) и в присутствии (желтые колонки) CaD. Символами * показаны не достоверные изменения значений относительно данных для теневых волокон, декорированных S в отсутствие CaD (зеленые или синие колонки), в остальных случаях эти изменения достоверны, p0,05. Справа представлены фотографии препаратов ТМ, полученные с помощью SDS электрофвизуализированных в ультрафиолетовом свете.

Согласно рис. 8, характер изменений А для зондов 5-IAF и 1,5-IAEDANS, свя занных с гладкомышечным тропомиозином (smTM-AF и smTM-AEDANS), в АТФаз ном цикле различается. Так, если при переходе актомиозина из слабой в сильную форму связывания значение А smТМ-AF увеличивается, что указывает на враще ние диполей красителя от оси волокна, то значение А smТМ-AEDANS, наоборот, уменьшается, что свидетельствует о наклоне диполей к оси мышечного волокна.

Амплитуда изменений А для smТМ-AF и smТМ-AEDANS составила соответственно 2,2° и 1,6°. Полученные данные указывают на то, что в цикле гидролиза АТФ зонды, расположенные в С- или N-концевой областях тропомиозина, движутся в противопо ложных направлениях. Такие изменения в ориентации зондов можно объяснить «пе рекатыванием» тяжа тропомиозина по поверхности актина [Kulikova, Pronina (Karpicheva) et al., 2006]. Это предположение согласуется с данными FRET, указы вающими на то, что при связывании S1 расстояние между актином и красителем в N концевой области гладкомышечного тропомиозина увеличивается, а расстояние ме жду актином и красителем в С-концевой области тропомиозина, наоборот, уменьша ется [47].

Присоединение кальдесмона к актину теневого волокна, содержащего гладко мышечный тропомиозин и S1 в отсутствие нуклеотида, вызывает уменьшение А для smТМ-AF (рис. 8, а) и увеличение А для smТМ-AEDANS (рис. 8, в). Подобные изменения ориентации зондов, связанных с C- и N-концевыми областями тропомио зина, характерны для слабого связывания миозина с актином. При этом подвижность зондов, связанных с С- и N-концевыми областями тропомиозина, значительно уве личивается соответственно на 0,10 и 0,25 отн. ед. (на 29 и 53%), что, вероятно, ука зывает на то, что кальдесмон уменьшает сродство тропомиозина к актину.

При переходе из слабого в сильное состояние связывания миозина с актином мы наблюдали ингибирование кальдесмоном изменений ориентации зондов, свя занных с C- и N-концевыми областями тропомиозина соответственно на 73 и 50%.

По-видимому, кальдесмон ограничивает движение тропомиозина, индуцируемое го ловкой миозина в АТФазном цикле и таким способом ингибирует актин-миозиновое взаимодействие.

Полученные данные указывают на то, что кальдесмон в гладких мышцах и тропонин в поперечно-полосатых мышцах играют важную роль в позиционировании тропомиозина на актине, что подтверждает возможность стерического блокирования взаимодействия головок миозина с актином. Вместе с тем, вышеизложенные резуль таты, на наш взгляд, свидетельствуют о существовании также аллостерического ме ханизма регуляции, согласно которому во время АТФазного цикла миозин индуцируемый сдвиг тяжей тропомиозина от периферии к центру тонкой нити, влияя на конформацию актина, увеличивает область стереоспецифических и гидрофобных связей между головкой миозина и актиновой нитью (рис. 9). Это, в свою очередь, приводит к увеличению эффективности взаимодействия миозина с актином. Тропо нин модулирует этот эффект тропомиозина Са2+-зависимым образом. При высокой концентрации Са2+ тропомиозин под влиянием тропонина сдвигает субдомен-1 акти на к периферии тонкой нити, и, увеличивая область стереоспецифических и гидро фобных взаимодействий актомиозина, способствует образованию более сильных форм связывания актомиозина и таким образом увеличивает эффективность работы актомиозинового мотора. При низкой концентрации Са2+ ТН-ТМ, наоборот, ингибиру ет работу актомиозинового мотора, ограничивая миозин-зависимые движения тро помиозина и фиксируя конформацию актина в состоянии, типичном для слабой формы актин-миозинового взаимодействия [Borovikov, Karpicheva et al., 2009]. Де фосфорилированный кальдесмон, так же, как и тропонин при низкой концентрации Са2+, ингибирует внутримолекуляр ные движения актомиозина в АТ Фазном цикле, ограничивая миозин зависимые движения ТМ и фикси руя структуру актина в выключен ном состоянии [Borovikov, Pronina (Karpicheva) et al., 2006;

Kulikova, ТН ТН Pronina (Karpicheva) et al., 2006].

Определенный характер и последовательность конформаци онных изменений во всех компо нентах ансамбля мышечных белков в цикле гидролиза АТФ, скорее все го, играют важную роль в высоко- Рис. 9. Схема, показывающая изменения ориентации моторного домена миозина, субдомена 1 актина и эффективном механизме работы тяжа тропомиозина, наблюдаемые при переходе из актомиозинового мотора [Borovikov, слабой к сильной форме связывания миозина с акти ном при низкой и высокой концентрации Са2+.

Karpicheva et al., 2009].

4. Влияние мутаций в скелетном тропомиозине Glu117Lys и Glu147Pro, связанных с немалиновой миопатией, на его структурно-функциональные свойства.

Опираясь на вышеизложенное, можно предположить, что даже точечные му тации тропомиозина могут вызвать нарушение регуляции актин-миозинового взаи модействия. Для подтверждения этого предположения мы экспрессировали в Escherichia coli скелетный -тропомиозин человека с нормальной последовательно стью (ТМ «дикого» типа) и с мутациями Glu117Lys (E117K) и Gln147Pro (Q147P), свя занными с развитием немалиновой миопатии, и изучили эффект этих мутаций на вторичную структуру белка, АТФазную активность актомиозина в присутствии тро помиозина, сродство тропомиозина к актину и конформационные перестройки тро помиозина в теневых мышечных волокнах при моделировании цикла гидролиза АТФ.

Вторичную структуру дикого и мутантных ТМ оценивали с помощью метода кругового дихроизма. Несмотря на то, что пролин очень резко изгибает полипептид ную цепь и в норме отсутствует в структуре суперспиральных белков, включение в последовательность тропомиозина этого аминокислотного остатка при мутации Q147P не вызывает значительных изменений в спектре кругового дихроизма и тер мостабильности молекулы (результаты не показаны). Такой же эффект наблюдали и для тропомиозина с мутацией E117K. Эти данные свидетельствует о том, что мута ции Q147P и E117K не оказывают заметного влияния на вторичную структуру белка.

Однако при соосаждении комплекса актин-тропомиозин оказалось, что мутация Q147P резко снижает способность тропомиозина связываться с актином (рис. 10, б).

Тогда как мутация E117K не влияет на сродство белка к актину, но уменьшает коо перативность его связывания с актином (рис. 10, а) и существенно ингибирует АТ Фазную активность актомиозина в растворе (рис. 11).

a б 4. 0.15 0. Дикий ТМ Дикий ТМ Дикий ТМ АТФазная активность, сек- E117K ТМ Связанный ТМ/актин, M/M Связанный ТМ/актин, M/M Дикий/E117K E117K ТМ Q147P ТМ 3. 0.1 0. 2. 0.05 0. 1. 0 6 5. 7 5. 6.5 7 6.5 6 9 8 7 6 8. 7. 6. 5.

- log ([несвязанный ТМ]), - log ([несвязанный ТМ]), pCa2+ Рис. 10. Сравнение фракции связанного с ак- Рис. 11. Сравнение АТФазной активно тином ТМ в отсутствие и в присутствии мута- сти актомиозина в присутствии тропо ций Е117К (а) или Q147P (б) после соосажде- миозина дикого типа (синие символы), с ния комплекса актин-ТМ. Синие символы обо- мутацией Е117К (зеленые символы) и значают данные для ТМ дикого типа, зеленые смеси белков в соотношении 1:1 (жел и красные символы – для ТМ с мутациями тые символы).

E117K и Q147P, соответственно.

Для того чтобы объяснить уменьшение сродства к актину тропомиозина с му тацией Q147P и ингибирование АТФазной активности актомиозина в присутствии тропомиозина с мутацией E117K, мы сравнивали способность дикого и мутантных тропомиозинов изменять свою пространственную организацию в теневых мышечных волокнах при добавлении ТН, Са2+, S1 и нуклеотидов с помощью флуоресцентного зонда 5-IAF, связанного с Цис36 ТМ (ТМ-AF).

Как следует из рис. 12, а, в, д, обе мутации вызывают уменьшение угла ориен тации диполей излучения Е ТМ-AF, связанного с актином теневых волокон. Соглас но интерпретации, предложенной в разделе 3, можно предположить, что под дейст вием мутаций тропомиозин смещается к периферии тонкой нити, т.е. к блокирующей позиции, типичной для слабого связывания миозина с актином. Значение N для E117K ТМ практически не отличалось от ТМ дикого типа, тогда как мутация Q147P увеличивала значение этого параметра на 60% (с 0,20 до 0,32 отн. ед.) (рис. 12, б, г, е), что указывает на заметное уменьшение сродства Q147P ТМ к актину и хорошо согласуется с данными о снижении способности связывания этого ТМ к актину в рас творе (рис. 10, б).

При связывании тропонина значения Е и N изменяются Са2+-зависимым об разом для всех тропомиозинов (рис. 12). Следовательно, тропонин в зависимости от концентрации Са2+ способен изменять конформацию и позицию как дикого, так и му тантного тропомиозинов.

а в д WT ТМ-AF E117K ТМ-AF Q147P ТМ-AF 57 57 56 56 Ф (о) 55 55 E 54 54 * 53 53 52 52 - ADP ATP - - ADP ATP ADP ATP ТМ ТМ-ТН -Са2+ 2+ ТМ-ТН +Са ТМ-ТН +S1 -Ca2+ ТМ-ТН +S1 +Ca2+ б г е 0,45 0,45 0, 0,40 0,40 0, N (отн. ед.) * 0,35 0,35 0, 0,30 0,30 0, 0,25 0,25 0, 0,20 0,20 0, 0,15 0,15 0, - - ADP ATP ADP ATP ADP ATP Рис. 12. Влияние мутаций в ТМ E117K и Q147P на значения Е и N ТМ-AF в теневых волокнах в от сутствие и в присутствии ТН, Са2+, S1 и нуклеотидов. Белые колонки представляют данные для тене вых волокон, содержащих ТМ. Красные и синие колонки обозначают данные для теневых волокон, содержащих ТМ и ТН соответственно при низкой и высокой концентрации Са2+. Зеленые и оранжевые колонки обозначают данные для теневых волокон, содержащих ТМ, ТН и S1 при низкой и высокой концентрации Са2+, соответственно, без нуклеотида или в присутствии ADP или ATP. Символами * показаны недостоверные изменения значений относительно данных для мышечных волокон, содер жащих ТМ дикого типа (а, б), в остальных случаях эти изменения достоверны, p0,05.

Присоединение S1 к тонким нитям, содержащим ТМ и ТН, вызывает измене ния Е и N при моделировании АТФазного цикла (рис. 12). Однако для мутантных тропомиозинов величина Е была меньше, чем для ТМ дикого типа. Это означает, что мутантные тропомиозины, связываясь с актином теневого волокна в присутствии S1, как и в отсутствие S1, располагаются ближе к периферии тонкой нити по сравне нию с ТМ дикого типа.

При моделировании перехода актомиозина из слабой (в присутствии АТФ) в сильную форму связывания (в отсутствие нуклеотида или в присутствии АДФ) зна чения Е для всех ТМ-AF постепенно увеличиваются как при низкой, так и при высо кой концентрации Са2+ (рис. 12, а, в, д), указывая на смещение тропомиозина к цен тру тонкой нити. Однако мутации не позволяют этому белку занимать позиции на тонкой нити, характерные для сильного связывания актомиозина. Кроме того, значе ние N мутантных тропомиозинов в целом выше, чем для тропомиозина дикого типа, что указывает на уменьшение сродства этих тропомиозинов к актину. Мутация Q147P вызывает наибольшее снижение сродства этого белка к актину, что согласу ется с данными, полученными при соосаждении комплекса актин-тропомиозин (рис.

10). Наиболее значительное уменьшение Е наблюдали для Q147P ТМ. Таким обра зом, структурное состояние мутантных тропомиозинов в цикле гидролиза АТФ харак терно для образования слабых форм связывания актина с миозином.

Мутации E117K и Q147P уменьшают амплитуду изменений Е при переходе актомиозина из слабой в сильную форму связывания на 33 и 46% при высокой кон центрации Са2+ и на 11 и 33% при низкой концентрации Са2+, соответственно, по сравнению с ТМ дикого типа. Снижение амплитуды изменений Е для Е117К ТМ коррелирует с ингибированием АТФазной активности актомиозина в присутствии этого мутантного белка в растворе (рис. 11).

Возможно, механизм действия мутаций связан с тем, что замены E117K и Q147P происходят в позиции e гептоповторов тропомиозина и способны нарушать образование солевых мостиков между аминокислотными остатками в позициях e и g различных субъединиц тропомиозина. Нарушение формирования солевых мостиков может дестабилизировать суперспираль тропомиозина и приводить к изменению ак тин-тропомиозинового взаимодействия. Кроме того, мутация Е117К может локально инвертировать отрицательный поверхностный заряд ТМ, поскольку при этих мутаци ях происходит замена отрицательно заряженного остатка глютамина на положи тельный остаток лизина [48]. Принимая во внимание электростатическую природу взаимодействия тропомиозина с актином, локальное изменение заряда способно вызвать смещение мутантного ТМ относительно F-актина в другое равновесное по ложение.

Как было показано ранее ([44], также см. раздел 3), тропомиозин может «пере катываться» по поверхности актиновой нити в цикле гидролиза АТФ. Этому способ ствует наличие в тропомиозине псевдоповторов, состоящих из - и -областей, ко торые взаимодействуют с актином в разных состояниях тонкой нити. Аминокислот ные остатки в позициях 117 и 147 располагаются в -участках псевдоповторов моле кулы ТМ, которые, как было предположено, участвуют во взаимодействии с актином при сильном связывании головок миозина с актином. Локальное изменение конфор мации ТМ в -участках может объяснить природу ингибирования движения ТМ при трансформации актомиозина из слабой в сильную форму связывания.

Недостаточная активация тонкой нити тропомиозином, содержащим амино кислотные замены Е117К и Q147P, на наш взгляд, может приводить к нарушениям в характере и последовательности взаимозависимых конформационных перестроек всего белкового ансамбля сократительной системы мышечной клетки и может быть одной из причин ослабления сократительной функции мышечной ткани [Pronina (Karpicheva) et al., 2007б], наблюдаемой в патологически измененных скелетных мышцах при немалиновой миопатии.

ВЫВОДЫ 1. В мышечном волокне в цикле гидролиза АТФ происходят многоступенчатые и взаимозависимые изменения конформации актина и миозина, которые сопровожда ются изменениями в ориентации и подвижности SH1 спирали миозина и субдомена актина. Каждому промежуточному состоянию актин-миозинового комплекса соответ ствует определенное структурное состояние и позиция тропомиозина на тонкой ни ти.

2. Регуляция актин-миозинового взаимодействия в цикле гидролиза АТФ осуще ствляется взаимозависимыми конформационными перестройками актина, миозина и тропомиозина. При высокой концентрации Са2+ тропонин смещает тропомиозин к центру тонкой нити и субдомен 1 актина к периферии тонкой нити и таким способом активирует формирование сильных форм связывания актомиозина. Тропонин при низкой концентрации Са2+ и дефосфорилированный кальдесмон ограничивают мио зин-зависимые движения тропомиозина и фиксируют конформацию актина и миози на в состоянии, типичном для слабых форм актин-миозинового взаимодействия.

3. Мутации Glu117Lys и Gln147Pro в тропомиозине смещают тропомиозин к пе риферии тонкой нити и ограничивают миозин-зависимые движения тропомиозина в цикле гидролиза АТФ, что может быть одной из причин мышечной слабости, наблю даемой при немалиновой миопатии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах:

1. Borovikov Y. S., Karpicheva O. E., Avrova S.V., Robinson P., Redwood C. S.

(2009) The effect of the dilated cardiomyopathy-causing mutation Glu54Lys of alpha tropomyosin on actin-myosin interactions during the ATPase cycle. Arch. Biochem. Bio phys. 489:20-4.

2. Borovikov Y. S., Karpicheva O. E., Chudakova G. A., Robinson P., Redwood C. S.

(2009) Dilated cardiomyopathy mutations in alpha-tropomyosin inhibit its movement during the ATPase cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 381:403-6.

3. Borovikov Y. S., Karpicheva O. E., Avrova S. V., Redwood C. S. (2009) Modulation of the effects of tropomyosin on actin and myosin conformational changes by troponin and Ca2+. Biochim. Biophys. Acta 1794:985-94.

4. Pronina O. E., Makuch R., Wrzosek A., Dbrowska R., Borovikov Y. S. (2007) Cal desmon inhibits both force development and transition of actin monomers from “OFF” to “ON” conformational state by changing its position in thin filaments. Int. Cell. Biol. 31:394 404.

5. Kulikova N., Pronina O. E., Dabrowska R., Borovikov Y. S. (2007) Caldesmon inhi bits the actin-myosin interaction by changing its spatial orientation and mobility during the ATPase activity cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357:461-6.

6. Kulikova N., Pronina O. E., Dabrowska R., Borovikov Y. S. (2006) Caldesmon re stricts the movement of both C- and N-termini of tropomyosin of F-actin in ghost fibers dur ing the actomyosin ATPase cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 345:280-6.

7. Borovikov Y. S., Kulikova N., Pronina O. E., Khaimina S. S., Wrzosek A., Dabrows ka R. (2006) Caldesmon freezes the structure of actin filaments during the actomyosin ATPase cycle. Biochim. Biophys. Acta 1764:1054-62.

8. Пронина О. Е., Копеланд О., Марстон С., Боровиков Ю. С. (2006) С-концевые сайты кальдесмона управляют циклом гидролиза АТФ, сдвигая промежуточные со стояния актомиозина к слабым формам взаимодействия миозина с актином.

Цитология 48:9-18.

9. Пронина О.Е., Вржосек А., Дабровска Р., Боровиков Ю. С. (2005) Влияние нук леотидов на ориентацию и подвижность субфрагмента-1 миозина в теневом мышеч ном волокне. Биохимия (Москва) 70:1382-8.

Тезисы докладов:

1. Karpicheva O.E., Berestovoy M.A., Chudakova G.A., Borovikov Y.S., Redwood C.S.

(2008) The effect of dilated cardiomyopathy-causing Glu40Lys and Glu54Lys mutations on -tropomyosin movement in ATPase cycle. In Abstracts of XXXVII European Muscle Con ference, Supplement, Oxford, United Kingdom, J. Muscle Res. Cell Motil. 29:282.

2. Borovikov Y.S., Karpicheva O.E., Avrova S.V., Redwood C.S. (2007) Force genera tion is regulated via conformational changes of actin and myosin initiated by changes in position and mobility of troponin-tropomyosin on thin filaments. In Abstracts of XXXVI Eu ropean Muscle Conference, Supplement, Stockholm, Sweden, 58.

3. Karpicheva O.E., Robinson P., Borovikov Y.S., Redwood C.S. (2007) Nemaline myopathy-causing mutations E117K and Q147P of -tropomyosin impair its function. In Abstracts of XXXVI European Muscle Conference, Supplement, Stockholm, Sweden, 34.

4. Pronina O.E., Robinson P., Borovikov Y. S., Redwood C. S. (2007) Alteration of tropomyosin function by nemaline myopathy-causing mutations E117K and Q147P. In Ab stracts of 51th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, MD, USA, Biophys. J., Supplement, poster B342.

5. Chudakova G.A., Pronina O.E., Kulikova N., Wrzosek A., Dabrowska R., Borovikov Y.S. (2006) Movement of smooth muscle tropomyosin on F-actin in ghost fibers during the actomyosin ATPase cycle. In Abstracts of International Symposium “Biological Motility:

Basic Research and Practice”, Pushchino, Russia, 20.

6. Khaymina S.S., Pronina O.E., Dabrowska R., Wrzosek A., Borovikov Y.S. (2005) Changes in axial tilting of cross-bridges (myosin heads and actin monomers) at interme diates of ATPase cycle in the absence or presence of caldesmon. In Abstracts of 49th An nual Meeting of Biophysical Society, Long Beach, CA, USA, Biophys. J. 88: poster B488.

7. Savkin D.Y., Chudakova G.A., Mikhailov G.V., Pronina O.E., Kulikova N., Wrzosek A., Dabrowska R., Borovikov Y.S. (2005) Caldesmon inhibits myosin-induced movement of smooth muscle tropomyosin during the actomyosin ATPase cycle. In Abstracts of XXXIV European Muscle Conference, Hortobagy, Hungary, J. Muscle Res. Cell Motil. 26: 70.

8. Borovikov Y.S., Pronina O.E., Khaimina S.S., Marston S.B. (2004) Change in orien tation of smooth muscle tropomyosin in response to different intermediates of myosin AT Pase cycle in ghost muscle fibers. In Abstracts of XXXIII European Muscle Conference, Elba Island, Italy, J. Muscle Res. Cell Motil. 25: 260.

9. Pronina O.E., Wrzosek A., Dabrowska R., Borovikov Y.S. (2004) Orientation and mobility of intermediates of 1.5-IAEDANS-labeled subfragment-1 in ghost muscle fibers. In Abstracts of XXXIII European Muscle Conference, Elba Island, Italy, J. Muscle Res. Cell Motil. 25: 247-248.

10. Pronina O.E., Wrzosek A., Dabrowska R., Borovikov Y.S. (2004) Myosin subfrag ment 1 orientation and mobility at intermediates of ATPase cycle. In Abstracts of Structural Mechanisms in Muscle Conference, London, United Kingdom, 22.

11. Pronina O.E., Wrzosek A., Dabrowska R., Borovikov Y.S. (2004) Effect of nucleo tides on orientation and mobility of subfragment 1 in ghost fibers. In Abstracts of Interna tional Symposium “Biological Motility”, Pushchino, Russia, 16.

12. Borovikov Y.S., Pronina O.E., Khaimina S.S., Copeland N., Marston S.B. (2003) Influence of caldesmon fragments H1, H2, H12 and 658C on orientation and mobility of S in the presence and absence of nucleotides. In Abstracts of XXXII European Muscle Con ference, Montpellier, France, J. Muscle Res. Cell Motil. 24: 325.

13. Pronina O.E., Wrzosek A., Dabrowska R., Borovikov Y.S. (2003) Effect of caldes mon and nucleotides on the binding between S1 and actin in ghost fibers. In Abstracts of XXXII European Muscle Conference, Montpellier, France, J. Muscle Res. Cell Motil. 24:

330.

Список цитированной литературы 1. Huxley H.E. (1972) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 37:361-76. 2. Hasel grove J. (1972) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 37:341-52. 3. Marston S.B., Red wood C.S. (1991) Biochem. J. 279:1-16. 4. Sen A., Chalovich J.M. (1998) Biochemistry 37:7526-31. 5. Vibert P., Craig R., Lehman W.J. (1993) Cell Biol. 123:313-21. 6. Perry S.V. (2001) J. Muscle Res. Cell Motil. 22:5-49. 7. Squire J.M., Morris E.P. (1998) FASEB J. 12:761-771. 8. Borovikov Y.S., Gusev N.B. (1983) Eur. J. Biochem. 136:363-9. 9. No wak E., Borovikov Y.S., Dabrowska R. (1989) Biochim. Biophys. Acta 999:289-92. 10.

Bretscher (1984) J. Biol. Chem. 259:12873-80. 11. Иванов И.И., Юрьев В.А. (1961) Мед гиз, Ленинград. 12. Spudich J.A., Watt S. (1971) J. Biol. Chem. 246:4866-71. 13. Okamo to Y., Sekine T. (1985) J. Biol. Chem. 98:1143-5. 14. Mirza M. et al. (2005) J. Biol. Chem.

280:28498-506. 15. Laemmli U.K. (1970) Nature 227:680-5. 16. Borejdo J., Putnam S.

(1977) Biochim. Biophys. Acta 459:578-95. 17. Miki M., dos Remedios C.G., Barden J.A.

(1987) Eur. J. Biochem. 168:339-45. 18. Gaazkiewicz B., Borovikov Y.S., Dabrowska R.

(1987) Biochim Biophys Acta. 916:368-75. 19. Szczesna D. et al. (1994) Biochemistry 33:6716-20. 20. Lamkin M., Tao T., Lehrer S.S. (1983) Biochemistry 22:3053-8. 21.

Yanagida T., Oosawa F. (1978) J. Mol. Biol. 126:507-24. 22. Andreev O.A., Takashi R., Borejdo J. (1995) J. Mus. Res. Cell Motil. 16:353-67. 23. Irving M. (1996) Biophys. J.

70:1830-5. 24. Каулин А.Б. (1968) Цитология 10:123-5. 25. Tregear R.T., Mendelson R.A. (1975) Biophys. J. 15:455-67. 26. Kakol I. et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 913:1 9. 27. Borovikov Y.S. et al. (2004) Biophys. J. 86:3020-9. 28. Prochniewicz-Nakayama E., Yanagida T., Oosawa F. (1983) J. Cell Biol. 97:1663-7. 29. Borovikov Y.S. et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1478:138-51. 30. Goody R.S., Hofmann W. (1980) J. Muscle Res.

Cell Motil. 1:101-15. 31. Roopnarine O., Thomas D.D. (1996) Biophys. J. 70:2795-806. 32.

Lymn R.W., Taylor E. W. (1971) Biochemistry 10:4617-24. 33. Cooke R. (1997) Physiol.

Rev. 77:671-97. 34. Borovikov Y.S. (1999) Int. Rev. Cytol. 189:267-301. 35. Borejdo J. et al. (2006) Biochim. Biophys. Acta 1763:137-40. 36. Onishi H., Morales M.F. (2007) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 104:12714-9. 37. Geeves M.A., Holmes K.C. (2005) Adv. Protein Chem. 71:161-93. 38. Rayment I. et al. (1993) Science 261:58-65. 39. Holmes K.C. (1997) Curr. Biol. 7:R112-8. 40. Geeves M.A. (1991) Biochem. J. 274:1-14. 41. Marston S.B., Fraser I.D.C., Huber P.A.J. (1994) J. Biol. Chem. 269:32104-9. 42. Oda T., Namba K., Maeda Y. (2005) Biophys. J. 88:2727-36. 43. Borejdo J. et al. (1982) J. Molec. Biol.

158:391-414. 44. Holthauzen L.M.F., Corra F., Farah C.S. (2004) J. Biol. Chem.

279:15204-13. 45. Lehman W., Craig R., Vibert P. (1994) Nature 368:65-7. 46. Vibert P., Craig R., Lehman W. (1997) J. Mol. Biol. 266:8-14. 47. Bacchiocchi C., Graceffa P., Lehrer S.S. (2004) Biophys. J. 86:2295-307. 48. Olson T.M. et al. (2001) J. Mol. Cell Cardiol.

33:723-32.