Бактериофаг ap22, лизирующий клинические штаммы acinetobacter baumannii: выделение и изучение молекулярно-биологических свойств
На правах рукописи
Попова Анастасия Владимировна БАКТЕРИОФАГ AP22, ЛИЗИРУЮЩИЙ КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ ACINETOBACTER BAUMANNII: ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Оболенск – 2012 2
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государ ственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Феде ральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный консультант: кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович
Официальные оппоненты:
Павлов Виталий Михайлович, доктор биологических наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», заведующий лабораторией микробиологии туляремии Сыкилинда Нина Николаевна – кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской ака демии наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биоинже нерии
Ведущая организация:
Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Защита состоится «21» декабря 2012 года в 11 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государ ственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по ад ресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиоло гии и биотехнологии»
Автореферат разослан « » ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Фурсова Надежда Константиновна
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Проблема нозокомиальных инфекций (НИ) яв ляется одной из важнейших для современного здравоохранения и с каждым го дом приобретает всё большую медицинскую и социальную значимость. Во многих странах наблюдается рост инфекционной заболеваемости в стационарах лечебных учреждений, что существенным образом связано с распространением штаммов микроорганизмов, устойчивых к различным антибактериальным пре паратам.
Одним из возбудителей НИ является представитель группы неферменти рующих грамотрицательных аэробных бактерий – Acinetobacter baumannii, иг рающий важную роль в инфекционной патологии у пациентов, находящихся на стационарном лечении. В отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), а также в ожоговых отделениях A. baumannii часто становится причи ной развития госпитальных пневмоний, раневых инфекций (в том числе у боль ных с термическими поражениями), менингитов (при нейрохирургических вмешательствах и травмах спинного мозга), эндокардитов, перитонитов, аб сцессов мозга и лёгких, урологических катетерных инфекций, постхирургич е ских осложнений, бактериемий и септицемий (Metan et al., 2007;
Rizos et al., 2007;
Peleg et al., 2008;
Towner, 2009).
Клиническая значимость A. baumannii существенно выросла за последние 20 лет. В первую очередь это связано с тем, что для данного микроорганизма характерны механизмы резистентности, обеспечивающие устойчивость к по давляющему большинству антимикробных препаратов (Van Looveren et al., 2004;
Peleg et al., 2008;
Zavascki et al., 2010). Другими клинически значимыми особенностями A. baumannii являются: устойчивость к дезинфицирующим средствам, высушиванию, ультрафиолетовому облучению, толерантность к де тергентам (Wendt et al., 1997;
Webster et al., 1998;
Towner, 2009). Высокая вы живаемость на объектах внешней среды и способность персистировать в теч е ние продолжительного периода в условиях больничного окружения увеличива ет риск передачи этого микроба через медицинский персонал или предметы обихода (Catalano et al., 1999;
de Oliveira & Damasceno, 2010).
На основании вышесказанного весьма актуальным является своевременное выявление A. baumannii, быстрая идентификация данного микроорганизма и, что особенно важно, поиск новых антибактериальных средств против инфек ций, вызванных A. baumannii. Одним из возможных путей решения последней проблемы может быть применение литических фагов. К настоящему времени накоплено множество данных об эффективном использовании бактериофагов для лечения бактериальных инфекций, в том числе госпитальных, вызванных, например, P. aeruginosa или S. aureus (Merabishvili et al., 2009;
Kutter et al., 2010). Однако ни в нашей стране, ни за рубежом нет препаратов бактериофагов для контроля внутрибольничных A. baumannii-инфекций.
Это связано, в первую очередь, с отсутствием коллекций перспективных фагов, которые могли бы быть использованы для разработки лечебных препа ратов, а также с узким спектром антибактериальной активности известных ли тических фагов, инфицирующих A. baumannii.
Цель исследования – выделение, молекулярно-генетическая характери стика и изучение биологических свойств вирулентного бактериофага, специфи чески инфицирующего и лизирующего широкий спектр клинических штаммов A. baumannii.
Задачи исследования:
1. Создание коллекции и молекулярно-генетическая характеристика кли нических штаммов A. baumannii.
2. Поиск бактериофагов, лизирующих бактерии рода Acinetobacter, в об разцах клинического материала и пробах из окружающей среды.
3. Определение таксономического положения и изучение биологических свойств бактериофага, обладающего широким спектром литического действия по отношению к клиническим штаммам A. baumannii.
4. Визуализация специфического взаимодействия бактериофага с бактери альной клеткой и характеристика различных стадий инфекционного процесса с помощью атомно-силовой микроскопии.
5. Изучение генома бактериофага с широким спектром литического дей ствия.
Научная новизна.
Впервые выделен литический бактериофаг AP22 семейства Myoviridae, инфицирующий широкий круг клинических штаммов A. baumannii (приоритет защищен патентом РФ № 2439151). Бактериофаг обладает выраженной видо специфичностью, высокой скоростью адсорбции при взаимодействии с бакте риальной клеткой и высокой урожайностью.
Впервые для бактериофагов, лизирующих A. baumannii, проведена визуа лизация специфического взаимодействия в системе «литический бактериофаг бактериальная клетка» и изучены различные стадии инфекционного процесса методом атомно-силовой микроскопии.
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность ДНК и по лучены данные о структуре генома бактериофага семейства Myoviridae, лизи рующего бактерии A. baumannii.
Практическая ценность работы.
Создана коллекция, включающая 130 идентифицированных и генетически типированных антибиотикоустойчивых штаммов A. baumannii, выделенных от больных крупных стационаров Европейской части России и Южного Урала в 2005-2010 гг.
Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганиз мов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») ФБУН ГНЦ ПМБ под номерами B-7125 – B-7134 десять штаммов A. baumannii – представителей разных генети ческих групп (Федеральный уровень внедрения).
Депонирован в «ГКПМ-Оболенск» под номером Ph42 охраноспособный бактериофаг AP22 (Федеральный уровень внедрения). Результаты изучения ли тических свойств и геномного анализа бактериофага AP22 позволяют рекомен довать его для разработки лечебных препаратов против A. baumannii-инфекций, а также использовать для идентификации A. baumannii при бактериологическом анализе клинического материала.
Размещена в Европейской базе данных EMBL под номером HE806280 и базе данных GenBank под номером NC_017984 полная нуклеотидная последо вательность ДНК бактериофага AP22 (международный уровень внедрения).
Результаты диссертационной работы использованы в лаборатории молеку лярной биоинженерии ФГБУН «Институт биоорганической химии им. акаде миков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН для клонирования, экспрес сии и изучения пространственной структуры белка фибрилл и белка выростов хвостового отростка фага.
Положения, выносимые на защиту 1. На протяжении нескольких лет (с 2005 по 2010 гг.) в стационарах круп ных городов России (Москва, Санкт-Петербург, Нижний Новгород, Челябинск) циркулируют две доминирующие генетически однородные группы бактерий A. baumannii, объединяющие 82 % клинических штаммов.
2. Бактериофаг AP22 принадлежит к семейству Myoviridae, является видо специфическим, обладает широким спектром литической активности по отно шению к клиническим штаммам A. baumannii, высокой скоростью адсорбции при взаимодействии с бактериальной клеткой и высокой урожайностью.
3. Геном бактериофага AP22 представлен двунитевой ДНК размером 46387 п.н., содержит 89 потенциальных генов, среди которых идентифицирова ны гены, кодирующие структурные протеины, ферменты, ответственные за ли зис бактериальной клетки-хозяина и компоненты системы репликации ДНК.
4. Атомно-силовая микроскопия является эффективным методом визуали зации специфического взаимодействия литического фага AP22 с бактериальной клеткой, а также изучения особенностей структуры данного бактериофага, бак териальных клеток A. baumannii и формируемых ими клеточных агрегатов.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно инженерных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные ис следования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Феде рации» (на 2011-2015 гг.);
Гос. регистрационный № 01201172662 (тема № «Разработка и исследование новых дезинфектантов, антимикробных и инсекти цидных препаратов»).
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором;
результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудниче стве с к.б.н. Воложанцевым Н. В., к.б.н. Жиленковым Е. Л., Мякининой В. П., к.б.н. Красильниковой В. М., к.б.н. Богуном А. Г., к.ф-м.н. Дубровиным Е. В., к.б.н. Платоновым М. Е., д.б.н. Игнатовым С. Г. и д.в.н. проф. Светочем Э. А.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представ лены, доложены и обсуждены на восьми российских и международных конфе ренциях: школе-конференции молодых учёных и специалистов научно исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защи ты прав потребителей и благополучия человека «Биобезопасность в современ ном мире», Оболенск, 2009 г. (III место на конкурсе устных докладов);
the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Иркутск, 2009 г.;
XII Международ ном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии, Москва, 2010 г. (I место на конкурсе постерных докладов);
«Microbial Viruses: Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine», Белфаст, Великобритания, 2011 г. (I место на конкурсе постерных докладов);
E-MRS 2011 Spring Meeting, Ницца, Франция, 2011 г.;
19th Biennial Evergreen International Phage Biology Meeting, Олимпия, США, 2011 г. (II место на конкурсе постерных докладов);
II Международном Конгрессе по внутрибольничным инфекциям, Москва, 2011 г.;
the EMBO conference «Viruses of Microbes», Брюссель, Бельгия, 2012 г.
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Уче ного совета ГНЦ ПМБ от 29 января 2009 г. (протокол № 1) с изменениями, утверждёнными на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 1 ноября 2012 г.
(протокол № 9). Результаты исследований доложены на заседании межлабора торного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 25 от 26 октября 2012 г.).
Публикации. Основное содержание работы
отражено в 12 научных пуб ликациях, в том числе в 3 статьях в рецензируемых журналах из перечня ВАК и в одном патенте РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 страни цах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, две главы результатов иссле дований, обсуждение результатов, выводы и указатель литературы, включаю щий 26 работ отечественных и 260 – зарубежных авторов. Работа иллюстриро вана 20 рисунками и 8 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В работе использовали 130 штаммов A. baumannii, выделенных из клини ческого материала от госпитализированных больных (раневое отделяемое, тка невые биоптаты, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, моча, желчь, кровь, содержимое дренажей, внутривенных катетеров) в стацио нарах различного профиля городов Челябинска (n = 89), Нижнего Новгорода (n = 20), Москвы (n = 12), Санкт-Петербурга (n = 9) в 2005-2010 гг., а также бак терии других геномовидов Acinetobacter: A. pittii (n = 2), A. genomospecies (n = 2), A. johnsonii (n = 1), A. shindleri (n = 1), A. lwoffii (n = 6), A. anitratus (n = 4), A. calcoaceticus (n = 2) и бактерии других родов и семейств: Pseudomo nas aeruginosa (n = 5), Escherichia coli (n = 3), Yersinia pseudotuberсulosis (n = 3), Yersinia enterocolitica (n = 3), Klebsiella pneumoniae (n = 3), Klebsiella oxytoca (n = 3), Enterobacter cloacae (n = 3), Pasteurella multocida (n = 3) и Salmonella En teritidis (n = 3), полученные из коллекции НИИ антимикробной химиотерапии СГМА г. Смоленска и «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.
Бактериальные культуры выращивали на жидких или плотных питатель ных средах Luria-Bertani (LB) и Nutrient Agar (Himedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. Чувствительность к антибак териальным препаратам определяли дискодиффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорга низмов к антибактериальным препаратам».
Идентификацию штаммов A. baumannii проводили методом оценки поли морфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов амплификации гена рРНК с использованием праймеров 16S A. baumannii SP2-16S (5-gat cat ggc tca gat tga acg c-3) и ASP2 -16S (5-gct acc ttg tta cga ctt cac cc-3) и эндонуклеазы рестрикции AluI, а также методом ПЦР с праймерами на видо специфические для А. baumannii последовательности blaOXA-51-подобных генов (Woodford et al., 2006).
Генетическое типирование штаммов А. baumannii проводили методом ПЦР с произвольными праймерами (RAPD): Wil2 (5-tac cga tgc a-3) (Williams et al., 1993) и 1247 (5-aag agc ccg t-3) (Akopyanz et al., 1992). Кластерный анализ для построения дендрограммы выполняли с помощью программного обеспечения Bionumerics 5.1 (Applied Math NV, Бельгия) с использованием метода Ward и ко эффициента Cosine.
Выделение бактериофагов, лизирующих бактерии рода Acinetobacter, из образцов клинического материала и проб из окружающей среды, а также нара ботку, очистку и концентрирование фаголизата проводили, как описано ранее (Popova et al., 2012).
Для изучения биологических свойств бактериофагов и параметров фаговой инфекции использовали методы, предложенные М. Adams (1959), с нашими модификациями (Popova et al., 2012;
Dubrovin et al., 2012).
Электронно-микроскопическое исследование нативных фаговых частиц проводили методом негативного контрастирования фаговых препаратов (Brenner, 1959).
Приготовление образцов для визуализации специфического взаимодей ствия фага с бактериальной клеткой и их анализ методом атомно-силовой мик роскопии осуществляли, как описано в работе E. Dubrovin et al. (2012).
Возможное наличие профага в геномной ДНК фагорезистентных клонов A. baumannii определяли с помощью мультиплексной ПЦР с двумя парами праймеров, специфичных к ДНК бактериофага AP22: AP22A-f (5 agt tcg ttc tgc tgt ttg g-3) и AP22A-r (5-tcc tca aca tac caa atc g-3);
AP22B-f (5 gtg ttc att tcg ttc tct ca-3) и AP22B-r (5-cga cat ttc tca aca tca gc-3). В качестве контроля прохождения реакции ПЦР использовали праймеры SP 2-16S и ASP2 16S на ген 16S рРНК A. baumannii.
Электрофоретическое разделение фаговых белков проводили в денатури рующих условиях в 12 % полиакриаламидном геле по стандартному протоколу (Laemmli, 1970). Молекулярную массу белков определяли по сканированному изображению электрофореграмм с помощью программы PhotoCaptMW.
ДНК бактериофагов выделяли методом депротеинизации очищенных в градиенте хлористого цезия фаговых частиц с использованием лизирующей смеси, содержащей 0,5 % SDS, 20 мМ ЭДТА и 50 мкг/мл протеиназы К. ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ (1:1) и переосаждали этиловым спир том с ацетатом натрия. Гидролиз ДНК бактериофагов эндонуклеазами рестрик ции проводили согласно инструкции производителя (Fermentas, Литва).
Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера на приборах ABI PRISM 310 (Applied BioSystem, США) и MegaBace (Amersham Biosciences, США) с программным обеспечением Cimarron 3.12.
Для фрагментации фаговой ДНК использовали эндонуклеазы рестрикции HindIII, DraI и RsaI и обработку ультразвуком. Клонирование фрагментов фаго вой ДНК в векторную плазмиду pUC19, приготовление компетентных клеток E. coli DH5 и их химическую трансформацию рекомбинантной ДНК проводи ли согласно руководству Т. Маниатис и др. (1984). Селекцию клонов с реком бинантными плазмидами осуществляли посевом на среду MacConky, содержа щую ампициллин (100 мкг/мл). Секвенирование клонированных фрагментов фаговой ДНК проводили с использованием праймеров M13 forward (-21): 5 tgt aaa acg acg gcc agt-3 и M13 reverse (-26): 5-cag gaa aca gct atg ac-3. Расчет праймеров для секвенирования c матрицы нативной ДНК фага и секвенирова ния ампликонов проводили с использованием компьютерной программы Vector NTI (Carlsbad, CША).
Сборку, редактирование и анализ нуклеотидной последовательности фага AP22, а также сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с по мощью пакета программ DNASTAR (Madison, США) и Vector NTI (Carlsbad, CША).
Открытые рамки считывания (ОРС), кодирующие возможные протеины, предсказывали с помощью биоинформационных программ GeneMark.hmm (http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark) (Lukashin & Borodovsky, 1998) и Soft Berry FGENE SB (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) (Mount Kisco, CША).
Функциональную аннотацию генома фага AP22 проводили с помощью сравнения транслированных ОРС с известными белковыми структурами, пред ставленными в международных базах данных, с использованием биоинформа ционного ресурса BLASTP (Altschul et al., 2005) и программного обеспечения HHPred (Sding et al., 2005).
Количественные значения экспериментов были представлены после их обра ботки с помощью статистических программ Windows Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Молекулярно-генетическая характеристика антибиотикорезистентных штаммов A. baumannii Для реализации цели диссертационной работы первоочередной задачей яв лялось создание представительной коллекции клинических штаммов A. baumannii, выделенных в разное время на географически разных территори ях, а также их генетическая идентификация и типирование.
В коллекцию были включены130 штаммов, выделенных от больных ОРИТ, ожогового, терапевтического и урологического отделений, отделений плановой и экстренной хирургии разнопрофильных стационаров Челябинска, Нижнего Новгорода, Москвы и Санкт-Петербурга в 2005-2010 гг. Основными источни ками выделения штаммов являлись раневое отделяемое (45 %), мокрота (18 %), отделяемое дренажей (13 %), смывы с объектов госпитальной среды (5 %) и др.
Выделенные штаммы были идентифицированы как A. baumannii на осно вании исследования культурально-морфологических и биохимических призна ков, проведённого в локальных лабораториях, и данных молекулярно генетического анализа.
Все генетически идентифицированные штаммы A. baumannii характеризо вались устойчивостью к антибиотикам разных функциональных классов:
амоксициллин-клавуланату, ампициллин-сульбактаму, амикацину, цефтазиди му, цефепиму, ципрофлоксацину, левофлоксацину, за исключением цефоперазон-сульбактама, имипенема и меропенема.
Генетическую внутривидовую вариабельность исследуемых штаммов А. baumannii изучали методом ПЦР с произвольными праймерами (RAPD).
На основании кластерного анализа RAPD-профилей 130 штаммов A. baumannii была построена дендрограмма, отражающая степень генетическо го родства исследуемых штаммов (рис. 1).
Рисунок 1 – Дендрограмма кластеризации штаммов A. baumannii. Для каж дого генотипа (RAPD-группы) отмечены: RAPD-профиль штамма-представителя;
1 буквенное обозначение генотипа;
2 - общее количество штаммов, входящих в гено тип;
3 - место выделения штаммов: Ч – Челябинск, НН – Нижний Новгород, М – Москва, СП – Санкт-Петербург При анализе дендрограммы было выявлено, что изучаемые штаммы входят в состав двух кластеров, условно обозначенных A и B (при степени гомологии более 90 %), каждый из которых включает по одной из двух доминирующих RAPD-групп (A1 и B1), объединяющих в целом 82 % (107 из 130) клинических штаммов A. baumannii, циркулирующих на протяжении нескольких лет в усло виях больничного окружения в стационарах разных городов РФ. Наличие уни кальных штаммов – представителей минорных RAPD-групп, по-видимому, яв ляется следствием генетических процессов, приводящих к постоянному форми рованию новых вариантов, что проявляется в генетической неоднородности госпитальной популяции A. baumannii.
Изучение бактериофага AP22, лизирующего клинические штаммы A. baumannii С целью поиска бактериофагов, специфически инфицирующих бактерии рода Acinetobacter, проведён анализ более 1500 образцов клинического матери ала и смывов с различных объектов внутрибольничной среды и около 200 проб из окружающей среды (образцы воды и почвы). Кроме того, с использованием митомицина С (5 мкг/мкл) была проведена индукция профагов из разных кли нических штаммов A. baumannii.
В результате было выделено девять фагов, взаимодействующих с предста вителями рода Acinetobacter, из которых только один бактериофаг, получивший авторское название AP22, обладал широким спектром антибактериального дей ствия по отношению к госпитальным штаммам A. baumannii. Данный бакте риофаг выделен из клинического материала, полученного в ожоговом центре Научно-исследовательского института скорой помощи им. Н.В. Склифосовско го (г. Москва).
На культуре чувствительных бактериальных штаммов A. baumannii бакте риофаг AP22 формирует круглые прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром около 2-3 мм, окружённые непрозрачными ореолами, кото рые увеличиваются в размере с течением времени (рис.2).
Рисунок 2 – Зоны лизиса бактериального «газона» штамма A. baumannii 1053, формируемые фагом AP22 на плотной питательной среде: A. Морфология нега тивных колоний фага с ореолами;
Б. Пятно лизиса бактериофага, окружённое ореолом (наверху: через 18 ч инкубации при температуре 37 С, внизу – через 30 ч последую щего хранения при температуре 4 С) С помощью электронной микроскопии препаратов фаговых частиц пока зано, что бактериофаг AP22 имеет головку икосаэдрической формы с расстоя нием между противоположными апикальными вершинами, равным 63-65 нм, и сокращающийся хвостовой отросток длиной 85-90 нм. Аппарат адсорбции AP22 представлен базальной пластинкой диаметром 22-23 нм, и хвостовыми фибриллами, каждая из которых имеет длину 42-43 нм. Фибриллы хорошо за метны у частиц с сокращёнными хвостовыми отростками (рис. 3).
Рисунок 3 – Электронные микрофотографии фага AP22: А. Очищенный в гради енте CsCl препарат бактериофага AP22;
Б. Интактная фаговая частица;
В. Фаговая ча стица с сокращённым хвостовым отростком;
Г. Фаговые частицы на поверхности бак териальной клетки A. baumannii 1053. Контрастирование 1 % уранилацетатом. Мас штаб: 50 нм В соответствии с морфологическими параметрами согласно Международ ной классификации и таксономии вирусов бактериофаг AP22 отнесен к семей ству Myoviridae, морфотипу А1.
В серии экспериментов по определению спектра антибактериального действия и специфичности фага установлено, что бактериофаг AP22 лизиру ет в общей сложности 68 % (89 из 130) клинических штаммов A. baumannii и не обладает литической активностью по отношению к представителям других ге номовидов Acinetobacter, а также бактериям других родов и семейств. При этом исследуемый бактериофаг обладает более выраженной литической активно стью по отношению к представителям доминантных RAPD-групп A. baumannii A1 и B1, распространённых в нескольких крупных стационарах России в тече ние длительного промежутка времени (2005-2010 гг.), лизируя 82 % (88 из 107) штаммов данных групп.
Необходимо отметить, что бактериофаг AP22 обладает наиболее широ ким спектром литического действия из всех ранее описанных фагов, инфици рующих A. baumannii.
К критическим параметрам, влияющим на литическую активность и ста бильность бактериофагов при хранении, относится ряд физико -химических факторов, в том числе значение pH, а также наличие хлороформа, обычно ис пользуемого в качестве инактивирующего бактерии агента. В экспериментах по определению влияния физико-химических факторов на стабильность и ли тическую активность бактериофага AP22 установлено, что титр бакте риофага не меняется в течение суток в случае инкубирования при значениях pH от 4 до 9. В то же время, экстремальные значения pH (pH 2 и pH 12) существен но влияют на стабильность фага, а, следовательно, и на его способность инфи цировать бактериальную клетку.
При изучении устойчивости фага AP22 к воздействию хлороформа про демонстрировано, что обработка хлороформом от 30 мин до 24 ч не оказывает влияния на активность фага. При этом воздействие хлороформа на индикатор ные бактериальные культуры A. baumannii в течение 15-30 мин вызывает инак тивацию исследуемых штаммов, что позволяет использовать его для удаления из фаголизата жизнеспособных бактерий.
Параметры инфекционного процесса фага AP22 изучены в эксперимен тах по определению времени адсорбции и одиночного цикла размножения бак териофага. Показано, что исследуемый бактериофаг адсорбируется на клетке хозяине штамма A. baumannii 1053 очень быстро: более 99 % фаговых частиц адсорбируются в течение 5 мин (рис. 4 A) независимо от присутствия в среде двухвалентных катионов. Константа скорости адсорбции составляет 1,5310-7 мл/мин.
Кривая одиночного цикла размножения (кривая репродукции) фага AP представлена на рис. 4 B. Длительность латентного периода (времени между инфицированием бактериальной клетки и выходом фагового потомства) для AP22 составляет 40 мин. Средний выход фаговых частиц (среднее число фагов в расчёте на одну инфицированную клетку) составляет около 240 частиц на од ну бактериальную клетку, что свидетельствует о высокой урожайности фага AP22.
Рисунок 4 – Анализ инфекционного процесса бактериофага AP22: A. Скорость адсорбции фага на клетках штамма A. baumannii 1053;
B. Кривая одиночного цикла размножения фага на клетках штамма A. baumannii 1053: L – латентный период;
BS – выход фаговых частиц В процессе изучения динамики инфекционного процесса путем спек трофотометрической детекции изменений, происходящих в ходе взаимодей ствия бактериофага AP22 с бактериальной клеткой, показано, что при значени ях множественности инфицирования (MOI) 50 и 5 фаговых частиц на одну бак териальную клетку бактериофаг полностью лизирует жидкую культуру штам ма-хозяина через 60 мин после начала фаговой инфекции, в то время как при MOI=0,5 лизис происходит через 2 ч (рис. 5) Рисунок 5 – Кривые изменения оптической плотности для неинфицированной фагом бактериальной культуры A. baumannii 1053 и бактериальных клеток, ин фицированных фагом при MOI=50, 5 и 0, Для визуализации специфического взаимодействия фага AP22 и бактери альных клеток штамма-хозяина A. baumannii 1053 использовали метод атом но-силовой микроскопии (АСМ), основанный на принципе механического ска нирования образцов без применения предварительного напыления металлов и облучения фотонами и электронами.
При анализе АСМ-изображений контрольных образцов фаговых частиц, помещенных на поверхность слюды, установлено, что среднее значение диа метра головки бактериофага, оценивается как 62±1 нм, а длина хвостового от ростка – 88±9 нм (рис. 6), что соответствует данным электронно микроскопического исследования.
Рисунок 6 – АСМ-анализ бактериофага AP22: A. АСМ-изображение фага, нанесён ного на слюду (режим прерывистого контакта, канал «высота»);
B. Гистограмма рас пределения высот головок бактериофага, нанесённого на слюду С помощью АСМ контрольных образцов бактериальных клеток A. baumannii 1053, выращенных в стационарных условиях при температуре 37 C, установлено, что бактерии располагаются на поверхности слюды в виде агрегатов, состоящих из нескольких десятков клеток (типичные наблюдаемые агрегаты представлены на рис. 7 A, B).
Рисунок 7 – АСМ-анализ клеток A. baumannii: A. АСМ-изображение нанесённых на слюду клеток A. baumannii, записанное по каналу «высота»;
B. АСМ-изображение нанесённых на слюду клеток A. baumannii, записанное по каналу «отклонение», со вставкой, демонстрирующей увеличенный участок вокруг бактериальных агрегатов с экзополисахаридами и пилями;
С. Профиль сечения вдоль линии с АСМ-изображения A;
D. Увеличенный участок поверхности A. baumannii. Представленные АСМ изображения получены при контактном режиме сканирования.
Наличие вокруг клеток относительно тонкого слоя предположительно вне клеточного матрикса (секретируемых экзополисахаридов) и густой сети окру жающих клетки пилей (увеличенный фрагмент на рис. 7 B) дают основания предположить, что наблюдаемые агрегаты являются начальной стадией форми рования биопленки или «протобиопленкой». В среднем, длина бактериальных клеток в составе агрегатов составляет 1-2 мкм, ширина – 0,75-1 мкм и высота – 0,4-0,5 мкм.
В серии экспериментов по исследованию различных стадий литического цикла бактериофага AP22 и изучению морфологии бактериальных клеток A. baumannii, инкубированных с фагом AP22 при температуре 37 C, установ лено, что адсорбция фагов на поверхности бактериальных клеток A. baumannii наблюдается уже с первой минуты их совместной инкубации (рис. 8 A,B), что хорошо согласуется с данными эксперимента по определению времени адсорб ции. Следует отметить, что с первых минут взаимодействия фага с бактериаль ными клетками происходит быстрое рассеивание протобиопленок. Это свиде тельствует о том, что бактериофаг AP22 является эффективным дезагрегирую щим фактором. Известно, что в большинстве случаев рассеивание биопленки опосредовано действием экзополисахарид-деградирующих ферментов, которые несут фаги (Sutherland et al., 2004). Очень быстрое рассеивание клеточных агре гатов A. baumannii при взаимодействии с бактериофагом AP22, наблюдаемое в наших экспериментах, также предполагает наличие фаговой экзополисахарид деполимеразы, что подтверждается образованием ореолов вокруг негативных колоний бактериофага (см. рис. 2). Количество адсорбированных на бактери альную поверхность фагов существенно увеличивается в течение последующих 10 мин (рис. 8 C-F). В отличие от фагов, помещенных на поверхности слюды, большинство бактериофагов, адсорбированных на поверхности бактерий, име ют пустую головку. Это указывает на то, что высвобождение ДНК происходит достаточно быстро или немедленно после фаговой адсорбции на клетке хозяине.
Рисунок 8 – АСМ-изображения клеток A. baumannii, инкубированных с фагом в течение одной (A), трёх (C) и шести (E) мин (контактный режим сканирования, канал «отклонение»);
В, D, F - увеличенные трёхмерные изображения соответствующих бактериальных поверхностей Взаимодействие фага AP22 с клетками A. baumannii в течение 15, 30 и 60 мин представлено на рис. 9. Через 15 мин после начала фаговой инфекции можно наблюдать высокую плотность адсорбированных на поверхности бакте рий фаговых частиц, что указывает на наличие большого количества соответ ствующих рецепторов, и, начиная с 30 мин инкубации, существенные измене ния формы клеток A. baumannii. Бактериальные клетки становятся неоднород ными по своей длине, их высота варьирует от 70 до 200 нм (рис. 9 D-I), что в 2 5 раз ниже, чем высота клеток, определённая на АСМ-изображениях контроль ных клеточных образцов (рис. 7 A-C). Через 60 мин инкубации наблюдается разрушение бактериальных клеток, о чём можно судить по потере клетками нормальной формы и по выходу из инфицированных клеток новых фаговых ча стиц (рис. 9 G-I).
Рисунок 9 – Записанные по каналу «отклонение» (A, D) и «высота» (G) АСМ изображения клеток A. baumannii, инкубированных с фагом в течение 15 мин (A), 30 мин (D) и 60 мин (G) (контактный режим сканирования);
B, E, H - профили сече ния вдоль пунктирных линий с соответствующих АСМ-изображений;
C,F, I - увели ченные трёхмерные изображения соответствующих бактериальных поверхностей.
Таким образом, использование АСМ является эффективным подходом для визуализации инфекционного процесса и характеристики литического цикла бактериофага AP22.
Для того чтобы экспериментально продемонстрировать литическую при роду фага проведен анализ фагорезистентных клонов A. baumannii. Частота образования устойчивых к данному фагу клонов, образующихся в зоне фаголи зиса газона A. baumannii, составляет 10-6 на одну бактериальную клетку. Для того чтобы проверить, являются ли такие клоны фагорезистентными мутантами (например, адсорбционно-устойчивыми) или лизогенными вариантами со встроенным профагом, 50 очищенных трёхкратным пересевом фагоустойчивых клонов проверяли на способность подвергаться спонтанной или направленной индукции в присутствии различных концентраций митомицина С. Во всех слу чаях индукции бактериофагов не отмечено. Для более строгого доказательства отсутствия ДНК фага AP22 в составе суммарной ДНК фагорезистеных клонов была проведена мультиплексная ПЦР с двумя парами праймеров, специфичных к фаговой ДНК. В качестве контроля прохождения реакции использовали праймеры на ген 16S рРНК A. baumannii (рис. 10). В ходе проведенных экспе риментов фаговой ДНК в составе геномной ДНК 50 фагоустойчивых клонов A. baumannii не выявлено.
Рисунок 10 – Определение возможного наличия профага в геномной ДНК фаго резистентных клонов с помощью мультиплексной ПЦР: A. Устойчивые к бакте риофагу AP22 клоны в зоне фаголизиса A. baumannii 1053;
B. Электрофореграмма продуктов ПЦР c тремя парами праймеров (AP22A-f –AP22A-r и AP22B-f – AP22B r22, специфичных к фаговой ДНК, и SP 2-16S – ASP 2-16S на ген 16S рРНК A. baumannii), проводимой для определения возможного присутствия профага в гено ме фагорезистентных клонов: Ph –бактериофаг AP22, 1, 2, 3 – фагорезистентные кло ны, Ab – штамм A. baumannii 1053, L – маркер молекулярных масс 100bp Ladder (Fer mentas, Литва) При анализе белкового состава очищенного препарата бактериофага AP22 методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле выявлено четыре основных и три минорных структурных белка с молекулярными массами: 84,8;
67,2;
46,3;
31,3;
27,7;
23,1;
17,4 кДа, определёнными с помощью программы PhotoCaptMW (рис. 11).
Рисунок 11 – Электрофоретическое разделение белков бактериофага AP22 в 12 % SDS-полиакриламидном геле, окраска Кумасси G-250;
M – маркер молекулярной мас сы Можно предположить, что мажорный белок с молекулярным весом около 31 кДа является основным структурным элементом головки бактериофага, а мажорные белки с молекулярными весами 46 и 17 кДа – основными компонен тами хвостового отростка.
Рестрикционный анализ ДНК бактериофага AP22, проведённый с ис пользованием 28 эндонуклеаз рестрикции, показал, что ДНК фага расщепляется ферментами HindIII, DraI, VspI, SspI, TaqI, AluI, RsaI, HinfI, MspI, CfrI, EcoRI, частично гидролизуется EcoRV, PstI, SalI, XmiI, SmiI, ClaI, BamHI, PvuII, BglII, EcoR91I, NcoI, NheI и не гидролизуется ферментами SmaI, ApaI, NotI, DraII, Eco52I. Для определения размера генома фага AP22 проводили двойной и тройной гидролиз фаговой ДНК эндонуклеазами рестрикции NheI и PstI, SmiI и PstI, SmiI и EcoRV, NheI, EcoRV и PstI (рис. 12).
Рисунок 12 – Электрофореграммы продуктов гидролиза ДНК фага AP22 ре стрикционными эндонуклеазами VspI (1), SspI (2), HindIII (3), DraI (4), NheI (5), SmiI (6), PstI (7), EcoRV (8), NheI и PstI (9), SmiI и PstI (10), SmiI и EcoRV (11), NheI, EcoRV и PstI (12, рестрикционные фрагменты отмечены треугольниками);
L – гидро лиз ДНК фага эндонуклеазой HindIII;
М – маркер молекулярных масс 1-kb DNA Ladder (Fermentas, Литва). Сумма размеров рестрикционных фрагментов (для 9-12) указана в kb Размер генома фага AP22, определённый на основании обработки рестрик ционных профилей фаговой ДНК с помощью программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad), составил 46,4 т.п.н.
Для определения полной нуклеотидной последовательности генома бактериофага AP22 проводили секвенировнание геномных библиотек (shotgun sequencing), полученных при клонировании в векторную плазмиду pUC фрагментов фаговой ДНК, образованных при ферментативном расщеплении ДНК эндонуклеазами рестрикции HindIII, DraI и RsaI, а также при обработке фаговой ДНК ультразвуком. В результате клонирования было отобрано в об щей сложности 224 клона, содержащих рекомбинантную ДНК со вставками ДНК бактериофага AP22 размером от 170 до 3800 п.н.
Несколько циклов секвенирования клонированных фрагментов ДНК фага позволили получить перекрывающиеся фрагменты, объединённые затем в бо лее крупные контиги. Для объединения контигов в единую последовательность проводили прямое секвенирование генома фага, используя олигонуклеотидные праймеры, комплементарные 5- и 3-концевым последовательностям ранее се квенированных фрагментов и контигов фага, а также секвенирование отдель ных ампликонов, наработанных в ПЦР с использованием тех же праймеров. В результате каждый нуклеотид в составе фаговой ДНК был прочитан как мини мум три раза.
Проведённые эксперименты показали, что геном бактериофага представ лен двухцепочечной кольцевой ДНК размером 46387 п.н. с Г-Ц составом 37,74 %.
С помощью биоинформационных программ GeneMark.hmm и Soft Berry FGENE в геноме фага AP22 было выявлено 89 открытых рамок считыва ния (ОРС), кодирующих предполагаемые пептиды размером не менее 35 а.о., из которых 77 ОРС располагаются на прямой, 12 – на обратной цепях ДНК. ОРС организованы как минимум в 17 транскрипционных единиц, определённых с помощью биоинформационной программы GeneMark.hmm.
Установлено, что геном бактериофага AP22 имеет модульную организа цию и включает гены, кодирующие структурные протеины (белок капсида, белки хвостового отростка, базальной пластинки, хвостовых фибрилл и выр о стов), ферменты, ответственные за лизис бактериальной клетки-хозяина (фаго вый лизоцим – эндолизин и потенциальный холин) и компоненты системы ре пликации ДНК (рис. 13).
При сравнении аминокислотных последовательностей потенциальных бел ков фага AP22 с известными протеинами, определены возможные функции 25 % (22 из 89) из них;
60 % (54 из 89) ОРС кодируют гипотетические белки с неизвестными функциями, представленные в базах данных;
а предполагаемые продукты 15 % ОРС (13 из 89) не имеют сходства с какими-либо фаговыми или бактериальными протеинами.
Показано, что 18 % (16 из 89) ОРС AP22 кодируют полипептиды, облада ющие гомологией с протеинами Acinetobacter spp. с неизвестной функцией, 57 % (51 из 89) ОРС гомологичны фаговым протеинам.
Сравнительный геномный анализ выявил существенную гомологию между бактериофагом AP22 и фагом AB1 (Yang et al., 2010), также инфицирующим A. baumannii: гомология определена для 53 из 89 предполагаемых генов. Кроме того, по одному из предсказанных протеинов AP22 обладают гомологией с бел ками следующих бактериофагов: фага Staphylococcus 52A (ORF032), фага Salmonella E1 и фага Burkholderia BcepC6B (gp36).
Следует отметить, что в геноме фага AP22 не идентифицировано ни одно го гена, кодирующего токсины или какие-либо известные факторы вирулентно сти. Кроме того, не выявлены гены, определяющие умеренный (лизогенный) путь развития бактериофага (в составе профага).
Таким образом, в результате проведённых экспериментов впервые опреде лена полная нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага семейства Myoviridae, лизирующего бактерии A. baumannii. Аннотированная последова тельность генома фага AP22 депонирована в Европейской базе данных EMBL под номером HE806280 и базе данных GenBank под номером NC_017984.
Рисунок 13 – Геномная карта бактериофага AP22 с указанием функций предска занных белковых продуктов В заключение стоит подчеркнуть, что к важнейшим характеристикам, не обходимым для отбора литических фагов как оптимальных терапевтических агентов, можно отнести широту спектра литического действия, относительную простоту получения фага в высоком титре, быстрое размножение фага (мини мальный латентный период, высокий урожай, отсутствие задержки лизиса), устойчивость к процедурам очистки от бактерий и некоторые другие признаки.
В ходе проведенных исследований было установлено, что бактериофаг AP обладает всеми вышеперечисленными свойствами.
Таким образом, на основании данных микробиологического, геномного и биоинформационного анализов бактериофаг AP22 можно рассматривать в ка честве потенциального компонента препарата для лечения инфекций, вызван ных A. baumannii, и использовать для идентификации бактерий данного вида при бактериологическом анализе клинического материала.
ВЫВОДЫ 1. Создана коллекция, включающая 130 штаммов A. baumannii, выделен ных в период с 2005 по 2010 гг. в крупных стационарах Европейской части Рос сии и Южного Урала.
2. Среди изученных штаммов выявлено 10 генетических групп, из которых две доминирующие группы объединяют 82 % (107 из 130) клинических штам мов A. baumannii.
3. Выделено девять бактериофагов, инфицирующих бактерии рода Acinetobacter. Бактериофаг AP22 семейства Myoviridae с широким спектром ан тибактериального действия выделен из клинического материала, полученного в ожоговом центре.
5. Бактериофаг AP22 специфически инфицирует и лизирует 68 % (89 из 130) штаммов A. baumannii, обладает высокой скоростью адсорбции к бактери ям (более 99 % фаговых частиц адсорбируются в течение 5 мин) и высокой урожайностью – 240 фаговых частиц на одну инфицированную бактериальную клетку.
6. Методом атомно-силовой микроскопии изучена морфология фага AP и проведена визуализация его литического цикла. Установлено, что с первой минуты совместной инкубации данного фага и протобиопленок, формируемых A. baumannii в стационарных условиях роста, наблюдается рассеивание клеточ ных агрегатов и адсорбция фаговых частиц.
7. Определена полная нуклеотидная последовательность генома бакте риофага AP22, представленного двунитевой ДНК размером 46387 п.н. с Г-Ц со ставом 37,74 %. В геноме выявлены 89 открытых рамок считывания и опреде лены вероятные функции 22 из них.
8. В геноме фага AP22 не идентифицировано ни одного гена, кодирующего пептиды, подобные токсинам или каким-либо известным факторам вирулент ности, представленным в международных базах данных, а также гены, опреде ляющие умеренный путь развития фага.
По теме диссертации опубликованы следующие работы:
а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК 1. Popova, A. V. Isolation and characterization of wide host range lytic bacteri ophage AP22 infecting Acinetobacter baumannii / A. V. Popova, E. L. Zhilenkov, V. P. Myakinina, V. M. Krasilnikova, N. V. Volozhantsev // FEMS Microbiol. Lett. – 2012. – Vol. 332. – N 1. – P. 40-46.
2. Dubrovin, E. V. Atomic force microscopy analysis of the Acinetobacter bau mannii bacteriophage AP22 lytic cycle / E. V. Dubrovin, A. V. Popova, S. V. Kraev skiy, S. G. Ignatov, T. E. Ignatyuk, I. V. Yaminsky, N. V. Volozhantsev // PLoS ONE. – 2012. – Vol. 7. – N 10. – e47348.
3. Попова, А. В. Молекулярно-генетическая характеристика антибиотико устойчивых штаммов Acinetobacter baumannii и оценка их чувствительности к бактериофагу AP22 / А. В. Попова, В. П. Мякинина, М. Е. Платонов, Н. В. Во ложанцев // Мол. генетика, микpобиол., виpусол. – 2012. – № 4. – С. 18-22.
б) патенты 4. Пат. № 2439151 C1 РФ, МПК C12N7/00, C12R1/19. Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АР22 для идентификации бактерий Acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для по лучения препарата против внутрибольничных A. baumannii-инфекций / А. В.
Попова, Н. В. Воложанцев, Е. Л. Жиленков, В. П. Мякинина, М. А. Попова, Т. Г. Спиридонова, Э. А. Светоч – заявлено 24.06.2010;
опуб. 10.01.2012.
в) тезисы научных конференций 5. Попова, А. В. Изучение эффективности применения бактериофагов в комплексном лечении ожоговых больных / А. В. Попова, М. А. Попова, И. А.
Худяков // Материалы школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биобезопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.). – Оболенск, 2009. – С. 249-251.
6. Kuzhelnaya, E. N. Multidrug Resistant Acinetobacter Nosocomial Strains Collected from Russian Hospitals in 2003-2008: Phenotypes of the resistance / E. N.
Kuzhelnaya, А. V. Popova, N. K. Fursova, А. N. Kruglov, S. V. Sidorenko, E. А.
Svetoch // Abstracts of the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections» (Ir kutsk, 21-25 September 2009). – P. 38.
7. Попова, А. В. Молекулярно-генетическое типирование и изучение устойчивости к антибактериальным препаратам нозокомиальных штаммов Аci netobacter baumannii / А. В. Попова, Е. Н. Кужельная, М. А. Попова, Н. В. Во ложанцев, Н. К. Фурсова // Тезисы XII Международного конгресса МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 18-20 мая 2010 г.).
Клин. микробиол. и антимикроб. химиотерапия. – 2010. – T. 12. – № 2, прилож.
1. – C. 42-43.
8. Popova, A. V. Isolation and characterization of Myoviridae bacteriophage ly tic for Acinetobacter baumannii / A. V. Popova, V. P. Myakinina, E. L. Zhilenkov, V. M. Krasilnikova, N. V. Volozhantsev // Abstracts of «Microbial Viruses: Geno mics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine» (Belfast, 19-20 April 2011). – P. 53.
9. Dubrovin, E. V. Use of atomic force microscopy for investigation of bacterio phage infection cycle / E. V. Dubrovin, A. V. Popova, S. V. Kraevsky, T. E. Ignat yuk, S. G. Ignatov, I. V. Yaminsky, N. V. Volozhantsev // Abstracts of «E-MRS Spring Meeting» (Nice, France, 9-13 May 2011). – P. 13.
10. Popova, A. V. Characterization of Acinetobacter baumannii bacteriophage AP22 isolated from Russian hospital / A. V. Popova, E. V. Dubrovin, V. P. Mya kinina, E. L. Zhilenkov, S. V. Kraevsky, T. E. Ignatyuk, N. V. Volozhantsev // Pro gram and abstracts of the 19th Biennial Evergreen International Phage Biology Meet ing (Olympia, 7-12 August 2011). – P. 84.
11. Гончаров, А. Е. Эпидемические клоны Acinetobacter baumannii в рос сийских стационарах / А. Е. Гончаров, Л. П. Зуева, Н. В. Воложанцев, А. В. По пова, Т. Н. Суборова, А. П. Соломенный, Н. Р. Сагиева // Материалы II Между народного Конгресса по внутрибольничным инфекциям (Москва, 23-24 ноября 2011 г.). Инфекционные болезни. – 2011. – T. 9, прилож. 3. – C. 24-25.
12. Popova, A. V. Genomic organization of lytic Acinetobacter baumannii bac teriophage AP22 / A. V. Popova, A. G. Bogun, N. V. Volozhantsev // Program and abstracts of the EMBO conference «Viruses of Microbes» (Brussels, 16-20 July 2012). – P. 57.
Благодарности Глубоко признательна научному руководителю моей кандидатской дис сертации к.б.н. Воложанцеву Николаю Валентиновичу, а также моим соавторам и коллегам, принимавшим участие в планировании, проведении экспериментов и обсуждении их результатов.
Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность Поповой М. А.
(Городская клиническая больница №6, Челябинск), Спиридоновой Т. Г. (НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского, Москва), Гординской Н. А. (Ниже городский НИИ травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России, Нижний Новгород), Гончарову А. Е. (Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И. И. Мечникова, Санкт-Петербург), Фурсовой Н. К. (ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск) и Эдельштейну М. В. (НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленск) за предо ставление бактериальных штаммов, клинических изолятов и образцов для про ведения исследований.
Выражаю искреннюю признательность ведущей организации, официаль ным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные заме чания, заданные вопросы и сделанные поправки, которые, по возможности, бы ли учтены.
Приношу особую благодарность моей маме – врачу Поповой Маргарите Александровне и врачу Худякову Илье Александровичу, профессионализм, от ветственность и энтузиазм которых побудили меня к выбору направления моей исследовательской деятельности.
Диссертация посвящена памяти Настоящего Ученого – Юрия Николаевича Ковалева.