Влияние экологических условий на разнообразие микробных сообществ солоноватых озер забайкалья
На правах рукописи
ЕГОРОВА Дарья Васильевна ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ СОЛОНОВАТЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.08 – экология (биологические наук
и) 03.02.03 – микробиология (биологические науки)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ - 2013 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИОЭБ СО РАН)
Научный консультант: кандидат биологических наук, ученый секретарь ИОЭБ СО РАН Козырева Людмила Павловна Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией микробиологии ИОЭБ СО РАН Намсараев Баир Бадмабазарович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Института эпидемиоло гии и микробиологии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН Данчинова Галина Анатольевна кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» Буянтуева Любовь Батомункуевна
Ведущая организация: научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете (г.Иркутск)
Защита состоится «23» мая 2013 г. в 1500 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, Биолого географический факультет, конференц-зал. Факс: (3012)21-05-88, e-mail:
[email protected], [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Бурятского государственного университета.
Автореферат разослан «…» апреля 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, А. Б. Гулгенова кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследований. Исследования микробных сообществ содовых и соленых водоемов являются объектом интенсивных исследований, которые не теряют своей актуальности в течение последних десятилетий. Это связано с выяснением роли микроорганизмов в функционировании данных экстремальных мест обитания и открытием новых видов алкало- и галофильных представителей микробного сообщества (Заварзин, 2004;
Жилина, 2001;
2005;
Pikuta et al., 2003;
Гарнова, 2003 и др.). Предметами исследования являлись разнообразие и функционирование микробных сообществ. При проведении этих исследований использованы классические микробиологические методы выявления и изучения физиологических групп, определения скоростей микробных процессов, выделения и описания культур микроорганизмов (Намсараев и др., 1999;
Намсараев, Намсараев, 2007;
Горленко и др., 1999;
Заварзин и др., 1999;
Sorokin et al., 2003;
Сорокин и др., 2001;
Ешинимаев и др., 2001;
Жилина и др., 2005;
Брянцева, 2000;
Jones et al., 1998;
Imhoff et al., 1979;
Oren, 2000;
и др.).
Использование методов молекулярной биологии позволило значительно расширить представление о разнообразии культивируемых и некультивируемых представителей различных местообитаний, в том числе содовых и соленых озер Африки, Америки, Китая и др. регионов (Rees et al., 2003;
Mesbah, Abou-El-Ela & Wigel, 2007;
Mwirichia et al., 2011;
Valenzuela-Encinas et al., 2009 и др.). Однако необходимость проведения этапа клонирования и независимого секвенирования фрагментов рибосомных генов позволяли проанализировать не более сотен последовательностей. Развитие новых технологий секвенирования (пиросеквенирование) сделали возможным одновременный анализ тысяч сотен тысяч последовательностей (Margulis et al., 2005), что открыло новые перспективы в изучении микробных сообществ различных экосистем (Shokralla et al., 2012;
Zinger et al., 2012). Проведение исследований микробного разнообразия содовых и соленых озер Забайкалья с использованием современных молекулярно-биологических методов дает возможность изучения этих экстремальных мест обитания на новом уровне.
Цель работы: изучить разнообразие культивируемого и некультивируемого микробного сообщества в зависимости от экологических условий и выявить функциональную роль доминирующих бактерий.
Задачи:
1. Определить физико-химические показатели исследуемых озер.
2. Определить численность бактерий деструкционного звена.
3. Определить таксономическое положение органотрофных бактерий, выделенных из воды и донных осадков солоноватых озер Забайкалья и идентифицировать доминирующих представителей.
4. Оценить влияние экологических условий в исследуемых озерах на разнообразие культивируемого и некультивируемого сообщества микроорганизмов.
5. Выявить функциональную роль доминирующих бактерий.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые с использованием методов молекулярной экологии проведена оценка разнообразия микробного сообщества различных экониш содово-соленых озер Забайкалья. Впервые с помощью высокопроизводительного секвенирования фрагментов генов 16S рРНК проведена качественная и количественная характеристика состава бактериальных сообществ донных осадков озер Соленое и Сульфатное, различающихся по содержанию основных анионов. Установлено, что в количественном отношении ведущая роль принадлежит бактериям серного цикла, состав которых зависит от конкретных условий в донных осадках. Показано, что фила Bacteroidetes, наиболее характерная для водной среды, играет большую роль в донных осадках, являясь субдоминантом филы Proteobacteria.
Выделен и описан новый представитель филы Bacteroidetes – аэробные, алкалофильные бактерии рода Belliella для которых предложено название «Belliella buryatiensis sp. nov.».
Полученные результаты расширяют представление о разнообразии культивируемого и некультивируемого сообщества содово-соленых озер Забайкалья. Данные по составу бактериального разнообразия донных отложений могут быть использованы для реконструкции путей метаболизма в сообществе и целенаправленном выделении организмов или генов для использования в разработках новых биотехнологий на основе соле- и щелоче-устойчивых ферментов. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе в курсах изучения микробиологии и экологии и подготовке учебно-методических пособий.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были апробированы в виде докладов на Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010;
2012);
Всероссийской конференции с международном участием «Современные проблемы микробиологии Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2010);
2-ой Международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011);
Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ – Улан-Батор, 2011);
Региональной научно практической конференции «Структура, функционирование и экологическая безопасность» (Улан-Удэ, 2012). По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорного анализа литературы, трех глав, изложенных на основании собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (… источников, из них … - зарубежных).
Объем работы составляет страниц машинописного текста, включающего … таблиц, … рисунка.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. Козыревой Л. П. и научному консультанту д.б.н. Намсараеву Б.Б. за общее научное руководство. Выражаю искреннюю благодарность за помощь на отдельных этапах работы и обсуждении результатов д.б.н. Плотниковой Е.Г. и к.б.н. Ананьиной Л.Н.
(ИЭГМ УрО РАН), д.х.н. Раднаевой Л.Д. и к.х.н. Тараскину В.В. (БГУ), а также всем сотрудникам лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН за помощь в работе и поддержку.
Работа выполнена в рамках бюджетного проекта № VI.51.1.8, а также поддержана грантами РФФИ № 10-04-01185_а, № 12-04-31187-мол_а, ФЦП Кадры Соглашение 8116, ФЦП №11.519.11.2011.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты исследования.
Объектами исследования явились солоноватые озера Забайкалья:
Верхнее и Нижнее Белое (В.Белое и Н.Белое), Белое, Соленое, Сульфатное (Бурятия). Для исследования были отобраны пробы воды, донных осадков и микробных матов в летний период с 2009 по 2012 гг. Предметами исследования служили микробные сообщества воды, осадков и микробных матов.
Методы исследования. В полевых условиях определение морфометрических и физико-химических параметров воды в местах отбора проб проводили с помощью портативных приборов и стандартными методами (Намсараев и др., 2006). В лабораторных условиях химический анализ воды выполнен аналитической группой (ИОЭБ СО РАН).
Содержание органического углерода (Сорг) в навеске донного осадка определяли методом мокрого сжигания по Тюрину И.В. в модификации Никитина Б.А. (Аринушкина, 1970).
Среды и условия культивирования. Определение численности аэробных и анаэробных бактерий-деструкторов осуществляли посевом проб на жидкую минеральную среду состава (г/л): КН2РО4 – 0,2;
MgCl 6Н2О – 0,1;
NH4Cl – 0,5;
КCl – 0,2;
дрожжевой экстракт – 0,01;
раствор микроэлементов по Пфеннигу – 1мл/л. В качестве субстратов вносили (г/л): для протеолитиков (ПБ) – пептон (15);
для целлюлолитиков (ЦРБ) – полоску фильтровальной бумаги, размером 0,5см10 см, для бактерий бродильщиков – глюкозу (4). Численность органотрофов определяли подсчетом колоний, выросших в чашках Петри при глубинном посеве проб на среду РПА:10 и Plate Count Agar:10 (PCA) («Difco Laboratories», США).
Значения рН и минерализации, соответствующие гидрохимии озер, устанавливали соотношениями NaHCO3, Na2CO3 и NaCl. 10% растворы гидрокарбоната и карбоната натрия стерилизовали отдельно. Численность протеолитиков, органотрофов и бродильщиков определяли через 3-5 суток культивирования, целлюлолитиков – 30 суток культивирования в термостате при 30оС.
Чистые культуры органотрофных бактерий выделяли из изолированных колоний на средах PСA (1:10) и РПА (1:1) (рН 9,0-9,5, NaCl – 3 и 10 г/л). Изоляты из оз. Соленое, отнесенные к роду Belliella, поддерживали на Морском агаре (МА) состава (г/л): бакто пептон – 5;
дрожжевой экстракт – 1;
Fe3+ - 0,1;
NaCl – 19,4;
MgCl2 – 5,9;
Na2SО4 – 3,2;
CaCl2 – 1,8;
КCl – 0,5;
Na2CO3 – 0,16;
KBr – 0,08;
SrCl2 – 0,034;
H3BO3 – 0,022;
Na-силикат – 0,004;
NaF – 0,002;
(NH4)NO3 – 0,001;
Na2HPO4 – 0,008;
агар – 15.
Типовой штамм Belliella pelovolcani CC-SALТ получен из Корейской коллекции типовых культур (КСТС).
Микроскопические методы исследования. Морфотипы бактерий, размеры, подвижность и спорообразование изучали микроскопированием препаратов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus («Karl Zeiss», Германия), оснащенного фотодокументирующей системой Axiovision и фазово-контрастной приставкой (1000).
Физиолого-биохимические методы. Оптимальные параметры роста и границы гало- и алкалотолерантности выделенных микроорганизмов определяли культивируя организмы в градиенте щелочности (рН 5,3-11,5) и солености (NaCl от 0 до 200 г/л). Различные значения рН устанавливали карбонат-бикарбонатным и фосфатным буферами (Справочник по биохимии, 1996). Температурные диапазоны развития бактерий устанавливали в градиентном термостате в диапазоне от 20 до 60С.
Определение физиолого-биохимических характеристик проводили на основе рекомендуемых стандартных тестов (Методы общей бактериологии, 1984;
Большой практикум…, 2005) и с применением наборов реактивов API 20E и API 50CH («BioМerieux», Франция).
Отношение к антибиотикам проверяли с использованием дисков (НИЦ фармакотерапии, СПб, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.
Пигменты экстрагировали из клеток ацетоном/метанолом в соотношении 7:2. Спектры абсорбции определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-mini («Shimadzu Scientific Instruments», Япония) в диапазоне длин волн от 350 до 1000 нм.
Определение состава клеточных жирных кислот выполнено на газовом хроматографе Agilent Packard HP 6890 («Agilent Technologies», США) на медицинском факультете БГУ (г. Улан-Удэ) MALDI-TOF анализ выполнен в ВКМ ИФБМ РАН (г. Пущино).
Молекулярно-биологические методы. Препараты ДНК из микробных матов, воды и чистых культур выделяли с помощью комплекта реагентов «РИБО-сорб», «ДНК-сорб» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) в соответствии с протоколом производителя и методом ферментативного лизиса (Белькова, 2004). Выделение ДНК из донных осадков проводили с использованием набора AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit («Axygen», США).
Амплификацию фрагментов рибосомных генов проводили с использованием набора реагентов «НТИ-Байкал» (г. Иркутск) в термоциклере БИС (г. Новосибирск). Для оценки разнообразия микробного сообщества использовали известные консервативные праймеры на основные филы доменов Bacteria и Archea (домен Eubacteria: 27F - 1492R, 500F - 1350R;
358F - 907R;
линия Cyanobacteria: CYA106F - CYA781R;
линия Bacteroidetes: CF319F - EUB1350R;
линия Actinobacteria: ACT235F EUB1350R;
линия Planctomicetes: EUB338L - PLA930R;
классы Alphaproteobacteria и Deltaproteobacteria: ADF681L - EUB1350R;
класс Alphaproteobacteria: ALF35L - EUB500R;
класс Betaproteobacteria: BET663L - EUB1350R, BET680L - EUB1350R;
класс Bacillus: BLS342L - EUB1350R;
домен Archaea: 109F - 915R, 344F - 958R). Праймеры синтезированы в ИХБФМ СО РАН.
Секвенирование продуктов амплификации выполняли в ЦКП СО РАН «Геномика» (г. Новосибирск) и ФГБУН Институт экологии и микроорганизмов (ИЭГМ) УрО РАН (г. Пермь).
Нуклеотидные последовательности изучаемых штаммов выравнивали с использованием программы ClustalW, первичный анализ сходства генов 16S рРНК проводили с помощью программного пакета BLAST (Altschul еt al., 2010) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon ver.
2.1 (http://www.eztaxon.org), построение филогенетического дерева выполнено в программе MEGA ver.5.01.
Денатурирующий градиентный гель-электрофорез выполнен в лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН в ходе стажировки в 2010 г.
Определение состава оснований ДНК и ДНК-ДНК- гибридизация выполнены к.б.н. Арискиной Е.В. (ИБФМ РАН).
Пиросеквенирование фрагментов гена 16S рРНК выполнено в компании Chunlab Inc. (Южная Корея, г. Сеул) на приборе Roche/ Genome Sequencer FLX Titanium с использованием бактериальных праймеров 27F (GAGTTTGATCMTGGCTCAG) и 518R (WTTACCGCGGCTGCTGG). Оценку таксономической сложности сообщества проводили с помощью пакета программ CLcommunity (ver 3.1).
Идентификация клонов выполнена с использованием сервера EzTaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/;
Kim et al., 2012).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика условий обитания микроорганизмов. В период проведенных исследований отмечено увеличение суммы солей, по сравнению с предыдущими исследованиями. Значения рН воды озер находились в щелочной области и варьировали от 8,9 в оз. Белое до 10,0 в оз. Верхнее Белое (табл.1).
Таблица 1. Физико-химические параметры исследуемых озер Содержание, мг/дм Озеро Глуби рН tC Дата на, м – Сl– солей О2 НСО3 СО32– SO42– Na+ K+ Ca2+ Mg2+ Соленое 1,8 9,7 25,6 9270 5,9 1400 400 135 3765 3380 84 10 В. Белое 2,5 10,0 27,6 9635 - 1600 1200 2385 1415 2960 28 8 06. Н. Белое 2,0* 9,8 30,4 4378 9,1 800 610 465 632 1760 28 12 Белое 2,1* 8,9 19,4 2048 5,9 200 81 195 451 760 28 40 Сульфат 4,7 9,2 20,8 12258 5,9 160 280 7035 1777 2520 84 54 ное Соленое 1,7 10,2 22,9 13419 4,0 2340 2013 165 4778 4000 65 10 В. Белое 2,0 10,2 20,4 12450 3,2 2400 2135 2100 1776 4000 10 8 07. Н. Белое 2,0* 10,7 28,7 8445 7,0 1710 1555 1605 778 2740 14 20 Белое 2,1* 10,1 25,0 3110 - 380 165 795 561 980 17 50 Сульфат 4,7 9,3 21,4 16962 3,3 300 91 10705 2007 3500 120 26 ное Примечание: «*» – данные предыдущих исследований;
«-» – нет данных.
Характеристика культивируемого сообщества Для количественной характеристики структуры микробного сообщества грунтов была определена численность бактерий аэробной и анаэробной деструкции ОВ (табл.2).
Таблица 2. Численность аэробных и анаэробных бактерий-деструкторов в донных осадках кл./см Озеро Органот Содержа Описание проб Бродил рофы, ние С донных осадков ПБ ЦРБ ьщики КОЕ/см орг,% 1 2 1 Соленое 8,4106 7,50±2,57 черный вязкий ил с 8 6 3 4 10 10 10 10 запахом H2S В. Белое крупный песок 106 104 106 105 107 4,8102 0,30±0, серого цвета Н. Белое 1,15±0,02 ил темно-серого 109 107 104 103 105 7, цвета Белое 0,90±0,48 мелкий песок серого 107 103 104 102 103 1, цвета Сульфатн 109 107 3,06±1,52 вязкий ил черного 107 106 108 1, ое цвета Примечание: 1 – аэробы;
2 – анаэробы.
Гидролитические бактерии, осуществляющие деполимеризацию белков и углеводов, в прибрежных донных осадках исследуемых содовых озер присутствуют в количестве от 100 клеток до 1 млрд. клеток в мл.
Наибольшая численность всех групп бактерий была отмечена в донных отложениях оз. Сульфатное, Соленое и Нижнее Белое. Во всех пробах озер отмечается преобладание численности аэробных бактерий в сравнении с анаэробными.
Из проб воды и грунтов содово-соленых озер был выделен изолят органотрофных бактерий. Для 33 изолятов были определены границы и оптимумы роста в диапазоне рН и NaCl. Штаммы растут в широком диапазоне рН, проявляя свойства алкалофилии и алкалотолерантности. По отношению к NaCl среди выделенных изолятов только 3 являлись умеренными галофилами с диапазоном роста в пределах 0-200г/л и оптимумом при 50 г/л NaCl. Большая группа изолятов имели верхнюю границу роста при 50 г/л и оптимумы 0-15 г/л. Большинство же штаммов являются галотолерантными и растут в интервале 0-200 г/л и оптимумом до 25 г/л (табл.3).
Идентификация выделенных нами изолятов и культур органотрофных бактерий из коллекции экстремофильных микроорганизмов лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, основанная на сравнении данных секвенирования продуктов амплификации генов 16S рРНК в мировых базах данных, выявила их сходство с известными культурами бактерий на уровне 97-99% (табл.3).
Анализ данных показал, что при выделении культур на средах, содержащих сложные белковые и углеводные компоненты, и параметрах рН и солености, соответствующих или приближенных к природным условиям, изолируются представители фил Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes и класса -proteobacteria. В микробном сообществе они являются деструкторами, окисляющими и сбраживающими ОВ. Их ближайшие гомологи, в основном, выделены из соленых (морских) и щелочных сред. При создании строгих селективных условий, направленных на выделение специализированных физиологических групп микроорганизмов (Сорокин и др., 2006), изолирована большая группа бактерий класса -proteobacteria. Большинство из них являются сероокисляющими бактериями. Среди выделенных -протеобактерий большинство принадлежит группе аноксигенных фототрофных бактерий (АФБ) (Брянцева, 2000;
Болдарева и др., 2008). Из филы Firmicutes выделены бактерии, осуществляющие гидролиз целлюлозы и сахаров (Жилина и др., 2005).
Таким образом, на настоящий момент, в культивируемом бактериальном сообществе содово-соленых озер Забайкалья наиболее представительна фила Proteobacteria (57,8%:
-26,6%, - 28,9%, - 2,2%).
Firmicutes составляют 22,2%, Actinobacteria 11,1% и Bacteroidetes 8,9%.
Таблица 3. Характеристика органотрофных бактерий и их ближайшие гомологи Изо- Характеристика Ближайший % Источник выделения лят гомолог/№ в базе гомо- /ссылка изолята данных логии 1С-5С рНlim/opt7-10/8;
8,5 Belliella pelovolcani 97,1- гряз. вулк., Тайвань/ CC-SAL 25T/ EU685336 97,8 Arun et al., NaCllim/opt 0-50/ 6С рНlim/opt 5,8-8,5/7,5 Paracoccus alcaliphi- 98,7 почва /Urakami et lus JSM 7364T /AY014177 al., NaCllim/opt 0-25/ 7С рНlim/opt 6,4- 9,5/7,1 корни растений/ Micrococcus 97, endophiticus YM 56238T/ Chen et al., NaCllim/opt 0-50/1 EU 8С рНlim/opt 5,8- 9,5/6,8 Rothia nasimurium 98,1 носовая полость мыши /Collins et al, CCUG 35957T/ AJ NaCllim/opt 0-100/5 СМ1, рНlim/opt 6-12/10,3 осадки оз.
Bogoriella caseolytica СМ2 Богория, Т HKI0088 /Y NaCllim/opt 0-100/15 Африка/Groth et al., рНlim/opt 7-12/10,2 NaCllim/opt 0-150/ СМ3 рНlim/opt 6-12/9,2 Bacillus pseudofirmus 98 прибреж. оз.осадки DSM 8715Т/ X76439 /Nielsen et al., NaCllim/opt 0-150/ СМ4 99 прибр.осадки, Aliihoeflea aestuarii рНlim/opt 7-11/8, strain N8T Корея/Roh et al., NaCllim/opt 0-50/25 СМ5 осадки, Японское рНlim/opt 6-12/9,2 Marinobacter excellens море/Gorshkova et al., KMM 3809T/ AY NaCllim/opt 0-100/100 4Су рНlim/opt 6,0-8,0/6,7 засушлив почвы/ Bacillus simplex 99, T Delaporte et al., NBRC 15720 / AJ NaCllim/opt 0-50/ 2Су NaCllim/opt 0-50/10 Bacillus idriensis SMC 95,1 кровь больного/ Ko et 4352-2T/AY904033 al., 3Су рНlim/opt 6,0-7,9/7,4 97,4 морская соль/ Yoon et Jeоtgalibacillus campisalis SF-57T/ al., AY NaCllim/opt 1-50/ 5Су рНlim/opt 6,0-10,0/7,1 морская вода /Yoon Sporosarcina 97, aquamarina SW28Т/ et al., NaCllim/opt 0-100/5 AF водоем, Япония/ 7Су рНlim/opt 5,8-10,3/7,5 Paenibacillus 99, glucanolyticus DSM Dasman et al. NaCllim/opt 0-50/10 5126T/ FJ 8 Су рНlim/opt 5,8-9,6/7,8 сол. сточ. воды Citricoccus zhacaensis 97, FS 24T/ EU305672 /Meng et al., NaCllim/opt 0-150/ 10 Су, рНlim/opt 5,8-10,0/7,6 Bacillus safensis FO 99,3 поверхн. косм-го аппарата T Be a /Satomi et al., 036b / AF NaCllim/opt 0-200/ Су10-, рНlim/opt 9,2- 99 микроб. мат, Loktanella Антаркт.
1, vestfoldensR NB10- 12/10,3;
8-10/8,0;
озера /Van Trappen, 9477/NR_029021. 15 NaCllim/opt 0-100/25 0-200/ Су10- рНlim/opt 7,0-10,5/8 99 нитриф. Инокулят/ Pseudomonas peli R 4 20805 /AM114534 Vanparys et al. NaCllim/opt 0-150/ Бе10- рНlim/opt 6-10,5/6,5 98 поверхн. растения, Rhodococcus Китай /Li et al., 6 cercidiphylli YIM 65003/ NaCllim/opt 0-50/0 EU Бе10- рНlim/opt 7-12,0/10,3 99 морские высолы, Marinibacillus Корея /Yoon et al., 7 campisalis strain SF NaCllim/opt 0-200/50 57/NR_025716. Бе10- рНlim/opt 7-11,0/8,0 загрязн водоемы Rhodobacter ovatus 98, 9 JA234/AM690348 /Srinivas et al. NaCllim/opt 0-50/ Бе10- рНlim/opt 7-10,0/8,4 нитрифиц. инокулят Pseudomonas peli R- 99, 10 20805 /AM114534 /Vanparys et al. NaCllim/opt 0-50/ содов озеро, Китай VB1 рНlim/opt 7,5-12,0/8,4 Litoribacter ruber YIM 95, CH208 /GU254164 /Tian et al. NaCllim/opt 0-200/ оз. Моно Лэйк/ VB6 рНlim/opt 8-12,0/10,3 Xanthomonas sp. ML- 99/96, пресный источник 122/ AF139997.1/ NaCllim/opt 0-50/1 данные NCBI/ Makk Tahibacter aquaticus PYM5-11/ AM981201 et al. содовое озеро, VB7 рНlim/opt 10-12,0/10 Bacillus aurantiacus 98, Венгрия /Borsodi et K1-5 /AJ NaCllim/opt 0-200/25 al., VB9, рНlim/opt 7-12,0/10,2 Halomonas ventosae 98,1 засоленные почвы, Испания /Martnez VB11 Al12/AY NaCllim/opt 0-200/50 Cnovas et al., Примечание: Изоляты 1С-5С, выделены из воды, СМ1-СМ-5- из осадков оз.
Соленое;
2Су-10Су - из осадков, Су 10-1, Су 10-4 из воды оз. Сульфат-ное;
Be a, Бе 10-6,7,9,10- из воды оз. Белое;
VB-1,6,7,9,11 – из осадков оз. Верхнее Белое;
NB 10 15 – из воды оз. Нижнее Белое.
Новый таксон рода Belliella филы Bacteroidetes.
Бактерии, относящиеся к филе Bacteroidetes, являются одним из доминирующих компонентов микробных сообществ пресноводных, морских, щелочных экосистем. Они характеризуются широким спектром утилизируемых субстратов и способностью адаптироваться к различным условиям обитания.
Из воды оз. Соленое были выделены 5 штаммов (1Сб, 2С, 3С, 4С и 5С), образующих на МА (рН 8) и PСА 1:10 (рН 8), колонии оранжево красного цвета, диаметром до 2,5мм. Клетки представляют собой грамотрицательные, неподвижные, аэробные палочки, размером Выделенные штаммы являются факультативными 2,90,4мкм.
алкалофилами (диапазон рН 7,0 – 10, оптимум при 8-9), умеренными галофилами – рост культур отмечен при концентрации NaCl от 0 до 50 г/л с оптимумами при 10-25 г/л (рис.1) и мезофилами – с оптимумами при 26 30°С.
0. Algoriphagus winogradskyi LMG 98 Algoriphagus yeomjeoni 9 Agoriphagus antarcticus LMG MSS- 9 Algoriphagus halophilus IMSNU 10 0 Algoriphagus lutimaris Algoriphagus alkaliphilus 9 S1- 9 Algoriphagus boritolerans T- AC 99 Algoriphagus hitonicola 7 Algoriphagus faecimaris UAH LYX Algoriphagus marincola Rhodonellum psychrophilum IMSNU SW- Nitritalea halalkaliphila LW 3 Belliella baltica BA Belliella pelovolcani CC-SAL- 5С 4С 2С Echinicola vietnamensis LMG Echinicola pacifica KMM Cyclobacterium lianum HY Cyclobacterium amurskyense 10 0 Cyclobacterium marinum LMG KMM Indibacter alkaliphilus LW Aquiflexum balticum BA Fontibacter flavus CC-GZM- Рис.1. Филогенетическое дерево, построенное с использованием метода “neighbor-joining”, отображающее положение изолятов в системе семейства "Cyclobacteriaceae". Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%).
Филогенетический анализ показал, что все изоляты являются членами семейства Cyclobacteriaceae в составе класса Cytophagia филы Bacteroidetes (рис.2). С типовым штаммом близкородственного вида Belliella pelovolcani CC-SAL-25Т исследуемые штаммы проявили до 98,7% сходства нуклеотидных последовательностей. Сравнительный анализ генов 16S рРНК выявил 100% сходство между изолятами 2С и 4С и отличие от них 1 нуклеотидной заменой в вариабельной области изолята 5С. Данное наблюдение может указывать на то, что изолят является другим штаммом или представителем близкородственного вида.
Штаммы 1С, 2С, 3С и 5С были подвергнуты дальнейшим исследованиям, основанным на методологии полифазной таксономии.
Уровень ДНК-ДНК гомологии с типовым штаммом вида Belliella pelovolcani CC-SAL-25Т показал сходство ниже 70%, что свидетельствует о принадлежности их к разным видам. Пара штаммов (2С и 5С) c уровнем гомологии выше 70% принадлежит к одному виду (табл.4).
Таблица 4. ДНК-ДНК гомология штаммов Belliella pelovolcani CC-SAL-25Т 1С 58,7±1,4% Belliella pelovolcani CC-SAL-25Т 2С 58.0±1,8% Belliella pelovolcani CC-SAL-25Т 3С 64,2±2% Belliella pelovolcani CC-SAL-25Т 5С 55,6±2,5% 2С 5С 87,7±1,4% Анализ данных штаммов с помощью MALDI-TOF масс спектрометрии целых клеток – относительно нового метода с высокой степенью таксономического разрешения, используемого для идентификации и классификации близких бактерий, преимущественно на уровне «вид-подвид» подтвердила данные ДНК-ДНК-гомологии. На дендрограмме, построенной на основе данных MPS, штамм 3С кластерируется с типовым штаммом B. pelovolcani CC-SAL-25Т. Штаммы 1С, 2С и 5С образуют на дендрограмме отдельный кластер, что служит доказательством принадлежности их к одному виду.
Доминирующими клеточными кислотами являются isoC15: 0 (25,8 26,2), isoC15: 1 G (6,77-7,88), isoС17:19cis (6,25-7,24). Спектральный анализ ацетон-метанольных экстрактов клеток выявил присутствие каротиноидных пигментов в области 450-550 нм.
На основе полученных данных штаммы 2С и 5С предложено выделить в новый вид «Belliella buryatiensis sp. nov.». Штаммы 1С, 2С, 3С и 5С депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номерами ВКМ В-2721, ВКМ В-2722, ВКМ В-2723, ВКМ В-2724.
Культуры 2С и 5С были депонированы в Корейской коллекции культур микроорганизмов под номерами KCTC 32193 и KCTC 32194.
Последовательность культуры 2С зарегистрирована в ENA под номером HF913423.
Описание «Belliella buryatiensis sp. nov.» «Belliella buryatiensis» (N.L. fem. adj. buryatiensis - относящийся к Бурятии, региону, где находится оз. Соленое, из которого был выделен этот организм). Клетки грам-отрицательные, аэробные, палочковидные с закругленными концами, неподвижные и не образующие спор, длиной 1,9 2,1 мкм и 0,4 мкм в диаметре. Максимального роста достигает к 36 часам культивирования на морском бульоне при 30 0С. На МА рост наблюдается после 24 часов инкубирования. Образует колонии оранжево-красного цвета, гладкие, блестящие и выпуклые, 2,5 мм в диаметре, не флюоресцирующие. Клеточными пигментами являются каротиноиды.
Доминирующие жирные кислоты isoC15: 0, isoC15: 1 G, isoС17:19cis.
Оптимальная температура для роста 29-300С. Рост наблюдается в интервале рН 7-10 (оптимум при 8-9), 0-50% NaCl (оптимум при 10-25 г/л).
Оксидазо- и каталазо- положительные. Окисляет следующие источники углерода (положительный тест API-50CH): глицерин, L-арабинозу, D ксилозу, D-глюкозу, D-фруктозу, метил-,D D-галактозу, глюкопиранозид, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, D-целлобиозу, D мальтозу, D-лактозу, D-мелибиозу, D-сахарозу, D-трегалозу, D-рафинозу, крахмал, гентибиозу, D-туранозу и калия 2-кетоглюконат. Слабо окисляет метил-,D D-арабинозу, D-манозу, L-сорбозу, L-рамнозу, маннопиранозид, инулин, D-мелицитозу, гликоген, ксилит и калия 5 кетоглюконат. С тестом API-20Е положительная реакция на галактозидазу, аргинингидролазу, триптофандеаминазу, желатиназу и образование индола. Чувствителен к следующим антибиотикам:
ампициллину+сульбактаму, тикарциллину, тикарциллину+клавулановой кислоте, пиперациллину, пиперациллину+тазобактаму, цефепиму, имипенему, меропенему, ципрофлоксацину, гентамицину.
Выделен из воды оз. Соленое (Кяхтинский р-он, Республика Бурятия).
Характеристика разнообразия микробного сообщества молекулярными методами.
Ограничения культуральных методов, позволяющих выделять в культуру не более 0,1-1% представителей микробного сообщества (Fendrich, 1988;
Gilbride et al. 2006), не позволяют охарактеризовать имеющееся разнообразие. В связи с этим, для оценки разнообразия необходимым условием является применение молекулярных методов, используемых в настоящее время для решения задач микробной экологии.
Нами для этой цели были использованы три метода – использование ПЦР с групп-специфичными праймерами, ДГГЭ-ПЦР и пиросеквенирование.
Оценка разнообразия с помощью ПЦР с групп-специфичными праймерами. С использованием групп-специфичных праймеров была получена начальная характеристика наличия различных филогенетических групп бактерий и архей в сообществах различных экотопов (рис.2). Во всех пробах положительная ПЦР – реакция была выявлена на домен Bacteria.
Доминирующие полосы были получены с праймерами на класс протеобактерий в пробах матов, по глубине колонки оз. Соленое, ила и заиленного песка оз. Сульфатное;
-, -протеобактерий в тех же пробах, за исключением грунтов оз. Сульфатное;
-протеобактерий – в матах и поверхностном слое прибрежных осадков оз. В.Белое;
CFB-группа (цитофаги-флавобактерии-бактероиды) доминировала в колонке оз.
Соленое, бациллы и актинобактерии – в пурпурном мате и заиленном песке оз. Соленое, планктомицеты доминировали в матах, там же выявлялись цианобактерии. Археи присутствовали в некоторых пробах матов и нижних горизонтах колонки оз. Соленое. Наибольшее разнообразие отмечено в грунтах озер, где активно идут различные процессы продукции и деструкции органического вещества.
Рис. 2. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР-амплификации с групп специфичными праймерами в пробах микробных матов и колонке донного осадка.
М – маркер молекулярных масс ДНК.
Оценка генетического разнообразия микробного сообщества с помощью ДГГЭ-анализа. К пробам оз. Соленое из различных экотопов (воды, илов, песка, матов, отобранных в прибрежной части озера) был применен ПЦР – ДГГЭ метод. Выявлено отличие образцов по числу таксономических групп бактерий и их составу. Так, в образцах илистого песка присутствовал один уникальный фрагмент 16S рДНК, в пробах поверхностного слоя воды и прибрежного ила три и два, соответственно.
Последующий анализ полученных характерных ДГГЭ-профилей полос с помощью невзвешенного парногруппового метода кластерного анализа (рис.3) показал, что таксономический состав бактерий зеленого и пурпурного матов был идентичным, но отличался от такового желтого мата, уровень сходства составил 94,2%. На дендрограмме маты формировали отдельный субкластер. Выявлен высокий уровень сходства таксономического состава бактерий матов и поверхностного слоя илистого песка, равный 88,3%. Фингерпринты проб поверхностного слоя воды и прибрежного ила проявили низкий уровень сходства с пробами матов и илистого песка - 53,0% и 58,9%, соответственно, и образовали отдельные ветви на дендрограмме. Полученные результаты показали высокое сходство таксономического состава бактериальных сообществ матов и поверхностного слоя илистых песков, с которых были отобраны маты, и его отличие от поверхностного слоя воды и прибрежного ила, что, вероятно, связано с физико-химическими характеристиками отобранных проб (насыщенность кислородом, рН, H2S и т.д.).
Рис.3 Схема электрофореграммы разделения фрагментов 16S рДНК (А) и дендрограмма сходства ДГГЭ-профилей фрагментов 16S рДНК (Б): 1-мат желтого цвета, 2-мат пурпурного цвета, 3 – мат зеленого цвета, 4 – поверхностный слой илистого песка, 5 – прибрежный ил, 6 – поверхностный слой воды Оценка разнообразия с помощью данных пиросеквенирования. Методом пиросеквенирования исследованы пробы поверхностного слоя (0-2 см) колонки донного осадка оз. Соленое и пробы прибрежного грунта оз.
Сульфатное и выявлены их различия.
В обоих образцах доминирует фила Proteobacteria (рис.4).
Субдоминантами в сообществе оз. Соленое в относительно равных долях являются Chloroflexi (19%), Firmicutes (17%) и Bacteroidetes (11%);
в сообществе оз. Сульфатное только фила Bacteroidetes присутствует в количестве, превышающем 10%. Существенные различия выявлены в разнообразии таксонов и их соотношений (рис.5). Среди Proteobacteria в пробе оз. Соленое доминируют классы -proteobacteria (22,3%) и proteobacteria (9,85%). Анализ их таксономического состава указывает на численное превосходство бактерий серного цикла. Так, в классе proteobacteria на долю рода Thioalkalivibrio, входящего в семейство Ectothiorodospiraceae, приходится 18 % последовательностей (к видам Th.
nitratireducens и Th. paradoxus со сходством 97-99% относится 11,6 % и 0,8%). Известные представители этого рода являются облигатно алкалофильными хемолитоавтотрофными сероокисляющими бактериями, выделенными из образцов содовых озер (Sorokin et al., 2001;
Banciu et al.
2005).
Рис. 4. Метагеномный анализ микробных сообществ поверхностного слоя донного осадка оз. Соленое (А) и прибрежного осадка оз. Сульфатное (Б) на основании анализа последовательностей гена 16S рРНК.
В классе -proteobacteria 6,33% всех последовательностей принадлежат физиологической группе сульфатредуцирующих бактерий.
Среди известных представителей алкалофильных сульфатредукторов со сходством выше 97% выявлен только Desulfonatronum lacustre (0,1%).
Большая же часть таксонов имеет сходство с ближайшими родственниками ниже ранга вида - на уровне родов и семейств. Только небольшое количество последовательностей имеет среди ближайших родственников культивируемые виды.
В другую многочисленную филу Chloroflexi, входят представители трех классов Caldilinea (8,08%), Anaerolinea (6,8%) и Dehalococcoidetes (3,89%). Последовательности, принадлежащие этим классам, не имели среди ближайших гомологов культивируемых представителей. Известные виды Caldilinea и Anaerolinea являются анаэробными нитчатыми бактериями с нейтральным рН оптимумом для роста (Yamada et al., 2006).
В филе Firmicutes доминируют классы Bacilli (3,82%) и Clostridia (11,7%) с преобладанием представителей порядков Natranaerobiales и Clostridiales. Почти половина последовательностей Bacilli (1,77%) принадлежит виду Pediococcus lollii (сем. Lactobacillaceae). Этот вид известен как продуцент D- и L-молочной кислоты. Существенная часть (0,5%) принадлежит виду Enterococcus durans (сем. Lactobacillaceae).
Natranaerobiales – анаэробным, галофильным, алкалитермофильным бактериям, впервые выделенным из содового озера Вади эн Натрум (Египет) и кластерирующимися с некультивируемыми клонами и не идентифицированными бактериями из щелочных и соленых местообитаний, принадлежат 6,98% последовательностей сообщества.
А Б Рис.5. «Горячая карта», показывающая % соотношения классов (А) и видов (Б) в образцах грунтов оз. Соленое и оз.Сульфатное (показаны таксоны, составляющие в сообществах более 2%). (AY548939, DQ394968 и др. – некультивируемые бактериальные клоны).
Единственный описанный представитель этого порядка Natranaerobius thermophilus в процессе ферментации на сахарозе образует в качестве основных продуктов формиат и ацетат. В порядке Clostridiales (4,71%) 2,5% принадлежат неклассифицированным таксонам, 0,7% составляют последовательности, близкие роду – анаэробным Tindalia ферментирующим бактериям из содовых и соленых озер.
Последовательности, близкие роду Anoxynatronum, включающего единственного валидно описанного представителя A. sibiricum алкалифильного сахаролитического анаэроба из оз. Нижнее Белое (Бурятия), составляют 0,46%.
Выявленные последовательности филы Bacteroidetes, относятся к классам Bacteroidia (4,1%), Cytophagia (2,33%), Flavobacteriia (4,04%), Sphyngobacteriia (0,42%). Следует отметить, что большая доля последовательностей этого фила имеет наибольшее сходство с некультивируемыми и неклассифицированными бактериями. Только 0,18% последовательностей являются близкородственными с культивируемым видом Rhodonellum psychrophilum – психрофильной и алкалофильной бактерией из Гренландии, а также близки к родам Balneola (0,2%), с валидным видом B. alkaliphila из Средиземного моря и Aquiflexum (0,035%) с единственным видом A. baltika из воды Балтийского моря.
В образце оз. Сульфатное среди протеобактерий доминируют представители классов - proteobacteria (19,4%) и -proteobacteria (16,6%).
Классы - и - proteobacteria составляют в сообществе 7,6 и 7,7% соответственно. Среди -proteobacteria 87% последовательностей принадлежат к группе сульфатредуцирующих бактерий из порядков Desulfobacterales (с равными долями сем. Desulforhopalus и Desulfobacteraceae) и Desulfuromonadales (с доминированием родов из сем.
Desulfuromonadaceae). Только 1,38% имели уровень гомологии выше 97% с известными видами сульфатредукторов - Desulfuromonas acetexigens, Desulfomicrobium baculatum и Desulfobacterium catecholicum.
В кл. -proteobacteria 7,5% последовательностей принадлежат р.
Thiobacillus (сем. Thiobacillus) – чрезвычайно гетерогенному роду, включающему хемолитоавтотрофные и хемоорганогетеротрофные бактерии, окисляющие молекулярную серу и ее минеральные восстановленные соединения до сульфата. 0,47% в сообществе составляют последовательности близкие виду Th. thiophilus - облигатно хемолитоавтотрофной тиосульфат-окисляющей бактерии из нефтезагрязненных осадков, 1,46% - виду Th. thioparus, развивающемуся в нейтральных и щелочных средах. Большинство же (5,58% в сообществе) имели ближайшими гомологами некультивируемые бактерии. С вышеназванными тиобациллами гомология была на уровне 94-95%.
Другим многочисленным видом класса -proteobacteria является Hydrogenophaga taeniospiralis (2,35%) из р. Hydrogenophaga (сем.
Comamonadaceae, пор. Burkholderiales). Род Hydrogenophaga объединяет хемооргано- и хемолитоавтотрофные бактерии, использующие окисление водорода для получения энергии. Вид H. taeniospiralis способен также и к гетеротрофной денитрификации нитрата (Willems et al., 1989).
К классу -proteobacteria сем. Ectothiorhodospiraceae, включающего сероокисляющие хемолитоавтотрофные бактерии, принадлежат 0,5 % последовательностей. Последовательности, относящиеся к роду Thioalkalivibrio, доминирующего в пробе оз. Соленое, составляли всего 0,32%.
Численное большинство (60%) в классе -proteobacteria составляют последовательности, принадлежащие пор. Rhodobacterales сем. Rhodobacteraceae. Это семейство представлено в образце таксонами родового ранга.
В филе Bacteroidetes (11% сообщества) к классам Bacteroidia относятся 64,8%, Sphyngobacteriia -15%, Cytophagia -10% и Flavobacteriia 8%. Так же, как и для пробы оз. Соленое, отмечается большая доля последовательностей имеющих наибольшее сходство с некультивируемыми и неклассифицированными бактериями.
В отличие от оз. Соленое, большую долю в сообществе оз.
Сульфатное занимают Cyanobacteria (7%), преимущественно из класса Клоны показывают отдаленное родство с Chroobacteria.
некультивируемым Synechococcus sp. AF400152 из щелочного гиперсоленого озера Моно Лэйк. В сообществе оз. Сульфатное не выявлены Natranaerobiales, широко представленные в осадках оз. Соленое;
существенно ниже доля кл. Caldilinea и Anaerolinea филы Chloroflexi.
Впервые для содовых озер Забайкалья в прибрежных осадках оз.
Сульфатное выявлены последовательности, принадлежащие кл. proteobacteria, представленные одним порядком Campylobacterales.
Таким образом, метагеномный анализ, проведенный для осадков двух солоноватых озер Забайкалья, показал, что для их бактериальных сообществ общей чертой является весомая доля бактерий, участвующих на разных этапах в биогеохимическом цикле серы. Окисление серы и ее восстановленных соединений в восстановленном осадке из срединной части оз. Соленое осуществляют сероокисляющие бактерии р.
Thioalkalivibrio. Численное превосходство Th. nitratireducens указывает на то, что в анаэробных условиях донных отложений озера окисление восстановленных серных соединений осуществляется с использованием нитратов в качестве конечного акцептора электронов. В прибрежных осадках оз. Сульфатное в процессе окисления восстановленных соединений серы участвуют аэробные бактерии р. Thiobacillus, отсутствующие в пробе оз. Соленое. Восстановление сульфатов в осадках озер осуществляется представителями разных родов. При этом типичные алкалифильные и галофильные сульфатредукторы р. Desulfovibrio, Desulfonatronjvibrio, Desulfonatronum, Desulfohalobium в пробах либо не выявлены (оз. Сульфатное), либо присутствуют в минорном количестве (оз. Соленое).
В продукции ОВ в прибрежных осадках оз. Сульфатное участвуют цианобактерии, отсутствующие в более глубоких осадках оз. Соленое, где значительная часть органического вещества продуцируется хемосинтетиками. В гидролизе полимерных соединений важную роль могут играть бактероиды.
Статистическая обработка полученных результатов исследуемых образцов с помощью построения кривой Rarefaction (генетическое расстояние 0,03, соответствующее рангу «вид») показывает, что достигнутая глубина секвенирования недостаточна для полной характеристики бактериальных сообществ (рис.7). По количеству выявленных филотипов и рассчетным коэффициентам видового богатства бактериальное сообщество прибрежных осадков оз. Сульфатное является более разнообразным, чем бактериальное сообщество осадков оз. Соленое, отобранных с глубинной части (табл.5).
Рис.7. Оценка микробного разнообразия сообществ донных отложений озер.
Таблица 5. Показатели видового разнообразия и богатства для бактериальных сообществ грунтов солоноватых озер Забайкалья (генетическое расстояние 0,03).
Объект/ проба Кол-во Кол-во Коэфф-т Коэфф-т валидных филотипов АСЕ Chao послед. (ОТЕ) Оз. Соленое/ колонка, 2821 553 979 глубинные осадки Оз. Сульфатное/ 8093 1716 2862 прибрежные осадки ЗАКЛЮЧЕНИЕ Впервые для оценки микробного разнообразия солоноватых щелочных озер Забайкалья был применен комплекс культуральных и молекулярно-генетических методов, позволивший охарактеризовать культивируемое и некультивируемое сообщество различных экотопов.
Среди бактерий, обитающих в воде и отложениях озер, представляющих сапротрофный компонент микробных сообществ этих экотопов, и доминировавших в момент отбора проб, нами были изолированы представители фил Firmicutes (кл. Bacilli - B. simplex, B.
safensis, B. aurantiacus, Jeоtgalibacillus campisalis, Sporosarcina aquamarina, Paenibacillus glucanolyticus, Marinibacillus campisalis), Actinobacteria (кл.
Actinobacteria - Micrococcus endophiticus, Rothia nasimurium, Citricoccus zhacaensis, Rhodococcus cercidiphylli), Bacteroidetes (кл. Sphingobacteria «Belliella buryatiensis sp.nov» ), кл. -proteobacteria (Paracoccus alcaliphilus, Loktanella vestfoldensis, Rhodobacter ovatus) и кл. -proteobacteria (Pseudomonas peli, Halomonas ventosae). В основном, их ближайшие гомологи выделены из соленых (морских) и щелочных сред. Анализ собственных и литературных данных позволяет оценить % состав культивируемого бактериального сообщества следующим образом: 57,8%:
протеобактерии (-26,6%, - 28,9%, - 2,2%), 22,2% - Firmicutes, 11,1% составляют Actinobacteria и 8,9% Bacteroidetes. Эти же филы составляли большинство и при оценке сообществ разными молекулярными методами.
Применение метода пиросеквенирования позволило дать более полную характеристику состава бактериальных сообществ донных осадков, выявить общие и отличительные черты. Различия в составе микробных сообществ различных экотопов изученных экосистем определяются условиями среды обитания. На основании количественных характеристик доминирующих в бактериальных сообществах филотипов, можно предполагать, что при условиях жесткого селективного давления в оз.
Соленое (высокая щелочность, повышенное содержание хлоридов, отсутствие кислорода и света) в большем количестве развиваются анаэробные, алкали- и галофильные и хемосинтезирующие организмы.
При снижении селективного давления в оз. Сульфатное (более низком содержании солей углекислоты и хлоридов, доступности света и кислорода, но при этом высоком содержании сульфатов) в продукционном звене увеличивается доля цианобактерий, в деструкционном звене увеличивается доля сульфатредуцирующих бактерий. При этом бактериальное сообщество оз. Сульфатное оказывается более разнообразным и имеющим большее количество филотипов с неясным таксономическим положением.
Анализ полученных данных демонстрирует, что выделенные нами в культуру бактерии слабо представлены в исследованных сообществах.
Выявление большого количества бактерий, имеющих наибольшее сходство с некультивируемыми формами и неясным таксономическим положением, свидетельствует как о слабой изученности подобных экосистем, так и об эндемичности обитающих бактерий.
ВЫВОДЫ В период проведенных исследований минерализация озер 1.
варьировала от 2,04 до 16,96 г/л, рН 8,9-10,7. Эти условия благоприятствуют развитию разнообразного микробного сообщества.
Численность культивируемых деструкторов достигала 1млрд.кл./см3.
Выделены, охарактеризованы и идентифицированы 31 культура 2.
органотрофных бактерий, доминировавшие в бактериальном сообществе солоноватых озер Забайкалья и относящиеся к филам Bacteroidetes (6), Proteobacteria (10), Firmicutes (10), Actinobacteria (5).
Выделены и описаны аэробные органотрофные алкалифильные и 3.
галотолерантные бактерии, принадлежащие к новому виду рода Belliella, для которого предлагается название «Belliella buryatiensis sp.nov».
Методом пиросеквенирования определены составы бактериальных 4.
сообществ осадков двух солоноватых озер Забайкалья. В оз. Соленое доминировали бактерии филы Proteobacteria (34,8%), субдоминировали Chloroflexi (18,7%), Firmicutes (16,3%) и Bacteroidetes (10,9%). В оз. Сульфатное более 50% сообщества составляли представители субдоминировали Proteobacteria, Bacteroidetes (11,1%).
В условиях анаэробиоза и карбонатно-хлоридного засоления в 5.
бактериальном сообществе в большей степени присутствуют анаэробные и алкали- и галофильные организмы. В условиях сульфатного засоления увеличивается доля сульфатредуцирующих бактерий и общее разнообразие филотипов.
В составе бактериальных сообществ солоноватых озер значимая 6.
роль принадлежит бактериям серного цикла. Их таксономическое разнообразие зависит от конкретных условий в донных осадках.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации Статьи в рецензируемых журналах:
Егорова Д.В., Дамбаев В.Б., Жавсан Ч. Физико-химические параметры 1.
солоноватых озер Монголии // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 2: Химия. Вып. 3, Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2010. – С.22-24.
Захарюк А.Г., Егорова Д.В., Намсараев Б.Б. Распространение и 2.
морфология бактерий-деструкторов в содовом озере Зун-Торей (Забайкалье) // Вестник Бурятского государственного университета.
Серия 2: Биология. Вып. 4, Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2010. – С.91-93.
Егорова Д.В., Козырева Л.П. Деструкция органических веществ в 3.
донных осадках содово-соленых озер Забайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 2: Биология. Вып.
4, Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2011. – С.158-162.
Захарюк А.Г., Козырева Л.П., Егорова Д.В., Намсараев Б.Б. Физико 4.
химическая и микробиологическая характеристика песчаных матов содового озера Зун-Торей (Забайкалье). // Вестник Московского государственного областного университета, №1, 2010 г. – С.104-107.
Статьи в нерецензируемых журналах:
Егорова Д.В., Ананьина Л.Н., Козырева Л.П., Захарюк А.Г., 5.
Плотникова Е.Г. Физико-химические свойства и микробное разнообразие озера Соленое (Республика Бурятия). // Вестник Пермского университета. Серия: Биология. Вып.1, Пермь: Изд-во ПГУ, 2011. – С.55-60.
Тезисы:
6. Егорова Д.В., Козырева Л.П., Ананьина Л.Н. Разнообразие доминирующих культивируемых бактерий содовых озер Бурятии. // Материалы 2-ой междунар. Науч. конф. «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии», Улан-Удэ, Изд-во БНЦ СО РАН, 2011. С.168-170.
7. Егорова Д.В., Ананьина Л.Н. Оценка микробного разнообразия озера Зун-Торей (Забайкальский край). // Материалы междунар. конф.
«Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний», Улан-Удэ - Улаанбаатар, Изд-во БГУ, 2011. С.77-79.
8. Захарюк А.Г., Егорова Д.В. Бактерии-деструкторы органического вещества в щелочных озерах Бурятии и Забайкальского края // Материалы 6-ой молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2010. С. 99-102.
9. Егорова Д.В., Козырева Л.П. Целлюлозоразлагающие бактерии содово-соленых озер Забайкалья и Монголии. // Материалы Всерос.
конф. с междунар. участием «Современные проблемы микробиологии Центральной Азии», Улан-Удэ, Изд-во БГУ, 2010 г. С.25-30.
10. Егорова Д.В. Филогенетическое разнообразие микробных сообществ в озере Соленое, Республика Бурятия // Материалы Региональной научно-практической конференции «Структура, функционирование биосистем и экологическая безопасность», Улан-Удэ, Изд-во Бурятского госуниверситета, 2012. Ч.2. С.174-178.
11. Егорова Д.В., Козырева Л.П. Таксономическое разнообразие бактериального сообщества иловых отложений оз. Соленое (Бурятия) // Материалы 8-ой молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2012. С. 99-102.