Нематоды подсемейства ostertagiinae lopez-neyra,
На правах рукописи
АКСЁНОВ Антон Павлович НЕМАТОДЫ ПОДСЕМЕЙСТВА OSTERTAGIINAE LOPEZ-NEYRA, 1947:
СИСТЕМАТИКА И ФИЛОГЕНИЯ Специальность: 03.02.11 – паразитология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013 2
Работа выполнена в Центре паразитологии ФГБУН «Институт проблем экологии и эволюции им А.Н. Северцова РАН».
Научный консультант: доктор биологических наук Спиридонов Сергей Эдуардович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Бенедиктов Игорь Иванович, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им К.И. Скрябина», ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии кандидат биологических наук, доцент Соколов Сергей Геннадиевич, ФГБУН «Институт проблем экологии и эволюции им А.Н. Северцова РАН», старший научный сотрудник Центра паразитологии
Ведущая организация: ФГУО ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.
Скрябина»
Защита диссертации состоится «29» мая 2013 г. в 1400 часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д.006.011.01, созданного на базе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им К.И. Скрябина» Россельхозакадемии Адрес: 117218, Москва, ул. Б. Черемушкинская, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС
Автореферат разослан «_» апреля 2013 г.
Ученый секретарь совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, доктор биологических наук, профессор Бережко Вера Кузьминична ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы: Нематоды подсемейства Ostertagiinae – это представители многочисленной группы паразитических стронгилидных нематод, произошедшей от свободноживущих форм семейства Rhabditidae, существующего в настоящее время (Sudhaus, Fitch, 2001). Изучение этого таксона нематод позволит внести вклад в исследования по возникновению и эволюции паразитизма. Нематоды этой группы паразитируют у различных млекопитающих, в том числе у жвачных животных. Они зарегистрированы в большинстве географических зон. При высоких показателях зараженности паразитирование остертагиин оказывает отрицательное воздействие на жизнедеятельность домашних животных, что указывает на социально экономическую важность изучения этих паразитов (Fox, 1997). Наибольшее внимание исследователей привлекают представители родов Ostertagia Ransom, 1907;
Marshallagia (Orloff, 1933), Travassos, 1937;
Teladorsagia Andreeva et Satubaldin, 1954;
Orloffia Drozdz, 1965 паразитирующие у домашних и диких жвачных. В США ущерб, причиняемый скотоводству этими нематодами, превышает $ 2 000 000 000 в год (Zarlenga et al., 2001). Кроме этого, нематоды этого подсемейства иногда паразитируют у человека. В России и сопредельных государствах обнаруживали виды Ostertagia ostertagi Stiles, 1892 и Teladorsagia circumcincta Stadelman, 1894 (Асадов, 1960).
Относительно подробные данные по фауне нематод подсемейства Ostertagiinae имеются лишь для некоторых регионов и небольшого числа видов жвачных животных (крупный рогатый скот, овцы, благородные олени, лоси). Со времени опубликования этих работ (Асадов, 1960;
Прядко, 1976;
Говорка и др., 1988) численное соотношение разных видов жвачных во многих регионах изменилось, что должно было повлиять и на состав фауны паразитов.
В последние годы в связи с сокращением поголовья домашних жвачных снизилась интенсивность обмена паразитами между домашними и дикими жвачными, что привело к изменению состава фауны паразитов.
Интродуцирование новых для данных географических регионов видов жвачных сопровождается проникновением новых для этих территорий паразитов (Говорка и др., 1988).
Наряду с практической значимостью, изучение этих нематод методами молекулярной филогении представляет собой актуальную фундаментальную задачу (Корсуненко, 2010). Так, Чилтон с соавторами (Chilton et al., 2006) провели анализ отряда Strongylida Railliet et Henry, 1913 на основе данных о строении участков 18S и 28S рибосомальной ДНК. Однако эти авторы отмечают, что остается ряд неразрешенных вопросов, в частности, касающихся подотряда Trichostrongylina, и требующих проверки с использованием данных о строении более вариабельных участков рибосомальной ДНК, таких, как ITS-1 и ITS-2. Кроме того, в настоящее время нет основанных на современных данных филогенетических деревьев, отражающих взаимоотношения в подсемействе Ostertagiinae (Chilton et al., 2006).
Ряд вопросов таксономии остертагиин на уровне родов и видов разработан недостаточно. Кроме того, известно, что для самцов некоторых родов этого подсемейства характерен диморфизм – то есть существование мажорной и минорной форм одного и того же вида (Drozdz, 1965, 1995), однако попытки проверить это экспериментально были предприняты лишь для пяти из восемнадцати видов (Drozdz, 1965, 1995;
Stevenson et al., 1996;
Dallas et al., а, б;
Кузнецов, 2009). Поэтому необходимо получение новых данных для решения этой задачи.
ДНК-исследования остертагиин (Zarlenga et al., 1998;
Dallas et al., 2000;
Chilton et al., 2001;
Santin-Duran et al., 2002) позволили прояснить ряд общих вопросов филогении и частные вопросы систематики на родовом и видовом уровнях, в том числе подтвердить конспецифичность предполагаемых мажорных и минорных морфов для некоторых видов. Наряду с этим имеются виды, для которых эти вопросы так и остались неразрешёнными. Исследования рибосомальной и митохондриальной ДНК позволят разобраться в этой проблеме.
Некоторые виды остертагиин (Ostertagia antipini Matschulski, 1950, Mazamastrongylus dagestanica (Altaev, 1953) Jansen, 1986) широко распространены главным образом в России. Быть может, именно поэтому данные о строении ДНК этих видов не учтены в фундаментальных исследованиях по филогении стронгилид (Chilton et al., 2006).
Для большинства видов остертагиин имеются лишь данные о строении коротких фрагментов рибосомальной ДНК (ITS-1 и ITS-2) длиной порядка 240– 260 пар нуклеотидов (п.н.) (Zarlenga et al., 1998;
Dallas et al., 2000;
Santin-Duran et al., 2002).
Цель исследования:
Провести молекулярно-таксономическое изучение нематод подсемейства Ostertagiinae и провести анализ филогенетических взаимоотношений нематод этого подсемейства и родственных групп стронгилид.
Задачи исследований:
1. Провести морфологическое и молекулярно-таксономическое изучение остертагиин от разных хозяев.
2. Отработать методы выделения ДНК из массового материала и единичных особей, провести подбор праймеров и соответствующих программ проведения ПЦР.
3. Провести филогенетический анализ совокупности молекулярных и морфологических данных по нематодам подсемейства Ostertagiinae и родственным формам. Определить уровень внутривидовых и межвидовых нуклеотидных различий у остертагиин.
Положения, выносимые на защиту:
Использование в филогенетическом анализе полной 1.
последовательности рибосомальных спейсеров (ITS1+5.8S+ITS2) существенно повышает количество выявляемых нуклеотидных различий между видами остертагиин и повышает уровень статистической поддержки отдельных ветвей в филогенетических деревьях.
2. Реконструкция филогении Ostertagiinae, основывающаяся на полном фрагменте рибосомальных спейсеров (ITS1+5.8S+ITS2), не подтверждает монофилию этого подсемейства. Его представители распадаются на две группы (Ostertagia, Marshallagia, Orloffia, Teladorsagia) и (Spiculopteragia, Mazamastrongylus, Skrjabinagia, Graphidium) не показывающие тесного родства в пределах Trichostrongylidae.
3. Анализ нуклеотидных последовательностей рибосомальных спейсеров (ITS1+5.8S+ITS2) нематод Haemonchus contortus выявил новые, ранее не отмеченные, гаплотипы, а также гаплотипы, описанные для этих нематод из различных регионов мира;
позволил получить новые данные для выявления внутривидовых группировок и установления их взаимоотношений.
Научная новизна:
1. Впервые проведено исследование молекулярными методами трихостронгилид жвачных собранных в Якутии и на полуострове Ямал и получены данные по строению ITS региона pДНК для двух видов трихостронгилид из Центральной России.
2. Получены молекулярные данные, характеризующие внутривидовой полиморфизм ITS-последовательностей трихостронгилид, обнаруженных на территории России и Монголии.
3. Впервые в сканирующем электронном микроскопе изучено два вида трихостронгилид.
4. В результате проведения филогенетического анализа определены взаимоотношения между родами подсемейства Ostertagiinae, выяснен уровень нуклеотидных различий между таксонами разного ранга.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Теоретическая значимость исследования определяется важностью исследуемой группы (остертагиин и в целом стронгилид), как одной из наиболее успешных в эволюционном отношении групп паразитических нематод позвоночных. Остертагиины России и прилегающих территорий достаточно хорошо исследованы традиционными методами, однако их изученность молекулярно-генетическими методами все еще недостаточна для проведения полноценного анализа состава фауны и филогении этой группы.
Использование комплекса морфологических и молекулярных признаков для реконструкции эволюционной истории трихостронгилид необходимо для построения естественной системы этих организмов, многие из которых являются возбудителями опасных заболеваний домашних и диких животных, чем определяется и практическая значимость проведенной работы.
Результаты работы могут быть использованы для видовой диагностики стронгилид, а также при разработке ветеринарных программ в различных учреждениях РАН и РАСХН соответвующего профиля (Центр паразитологии ИПЭЭ РАН, ВИГИС им. К.И.Скрябина, ветеринарные академии, институты, факультеты).
Личное участие автора в получении результатов. Диссертантом самостоятельно получено 30 нуклеотидных последовательностей для 18 видов нематод (в основном Ostertagiinae, но также и родственных им форм семейства Trichostrongylidae). Также диссертантом самостоятельно получено электроннограмм в СЭМ. Диссертантом единолично проведен анализ нуклеотидных данных, построены филогенетические деревья, проведено депонирование полученных последовательностей в международной базе данных. Также им самостоятельно проведен анализ имеющихся литературных данных (125 источников отечественной и зарубежной литературы), на основании которых составлен соответствующий обзор. Сбор материала по нематодам-остертагиинам и их первичное определение проводилось под руководством и при участии к.б.н. Д.Н. Кузнецова.
Апробация работы: Результаты исследования были представлены на научных конференциях «Теория и практика борьбы с инвазионными болезнями» (г. Москва, 2008;
2010 г.г.);
на научно-практической конференции «Беккеровские чтения» (г. Волгоград, 2010г.);
на международной научной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии» (г.
Москва,2010г.);
на межрегиональной научной конференции «Паразитологические исследования в Сибири и на Дальнем Востоке» (г.
Новосибирск, 2009г.);
на симпозиуме Российского общества нематодологов с международным участием «Нематоды естественных и трансформированных экосистем» (г. Петрозаводск, 2011 г.);
на международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии» (г. Москва, 2012 г.).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на страницах компьютерного набора текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводов и списка литературы.
Список литературы включает 127 источников, в том числе 78 зарубежных.
Текст иллюстрирован 16 таблицам и 45 рисунками.
Благодарности: Автор выражает глубочайшую благодарность научному руководителю С.Э. Спиридонову, а также Д.Н. Кузнецову, Е.С.
Ивановой, Е.А. Гузеевой, С.В. Малышевой и всем остальным сотрудникам Центра Паразитологии ИПЭЭ им А.Н Северцова. Особую благодарность автор выражает сотрудникам кафедры паразитологии ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им К.И. Скрябина» Н.В. Есауловой и Д.Н Шемякову, а также Мари-Клод Дюре-Дессе (Национальный музей естественной истории, Париж, Франция) Огромную благодарность автор выражает А.Д.
Решетникову, О.Д. Апсолиховой, О.В. Воробьевой, М.А Самсоновой, О.А.
Краснобаевой, А.В. Владимировой, П.Ю. Аксёнову, И.Е Аксёновой.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В данной главе анализируются основные этапы развития систематики и таксономии нематод семейства Trichostrongylidae. Детально рассмотрено развитие систематики нематод подсемейства Ostertagiinae Lopez-Neyra, 1947.
Рассмотрены также экологические особенности нематод данного подсемейства, их жизненные циклы и гостальная специфичность. Отдельно в данной главе проведен анализ применения методов молекулярной таксономии и филогении в изучении трихостронгилид, а также представлены основные результаты использования этих методов. Рассматриваются такие проблемы «молекулярного этапа» изучения трихостронгилид, как проблема полиморфизма и наличия различных гаплотипов в пределах одного вида трихостронгилид, возможности использования молекулярных данных для выявления популяционной структуры трихостронигид и реконструкции эволюционной истории этих нематод.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Изучение таксономического состава нематод В данном разделе представлены данные о местах сбора материала, который был подвергнут исследованию в рамках данной работы. Приводятся описания этапа гельминтологических вскрытий хозяев и особенности отбора материала. Также в виде таблицы приведены номера последовательностей в GenBank NCBI, полученных другими исследователями и использованными в нашей работе.
2.2. Изучение тонкой морфологии поверхности тела нематод В данном разделе детально описан процесс подготовки образцов нематод к исследованию в сканирующем электронном микроскопе.
2.3. Молекулярные методы В данном разделе дано подробное описание всех основных этапов подготовки и изучения материала «молекулярными» методами. В разделе 2.3. дается описание трех методов выделения ДНК, использованных нами в работе (выделение проводилось на колонках фирмы «Promega» (Wizard® SV Genomic DNA Purification System, USA), выделение стандартным методом с использованием протеиназы К и модифицированный протеиназный метод Холтермана и соавторов (Holterman et al., 2006) с применением меркаптоэтанола.
В разделах 2.3.2. и 2.3.3. приведены протоколы проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также визуализации результатов ПЦР. Поскольку в нашей работе мы использовали метод векторного клонирования, приводится использованный нами протокол клонирования в pGEM®-T векторе.
В разделе 2.3.4 описан процесс подготовки проб к секвенированию:
очистка в геле, выделение ПЦР-продукта из блоков геля на колонках «Promega» (Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System, USA) и преципитация этанолом в присутствии ацетата аммония. Метод векторного клонирования описан в разделе 2.3.5.
Отдельно в данной главе описан этап первичной обработки хроматограмм, полученных после секвенирования в ЦКП «Геном» («Генотех»).
Подробно описаны основные этапы филогенетического анализа, начиная с построения первичных выравниваний в программе «Clustal X» V.1. (Thompson, Gibson, 2000), и вплоть до получения кладограмм с помощью программ PAUP* 4.0b10 (Swofford, 1998), MEGA version 5 (Tamura et al., 2011) и Mr. Bayes v3.2.1 (Ronquist et al., 2012).
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Таксономический состав нематод от разных хозяев В данном разделе приводятся данные, полученные при первичном сборе материала от различных хозяев: северных оленей из двух районов Якутии и полуострова Ямал, домашних коз из Кировской области и Восточной Монголии.
3.2. Результаты исследования морфологии остертагиин и некоторых других трихостронгилоидей В данном разделе диссертации приводятся новые морфологические данные, полученные в основном, с помощью сканирующей электронной микроскопии для различных представителей надсемейства Trichostrongyloidea.
Необходимость такого исследования была связана с малой изученностью тонкой морфологии поверхности тела трихостронгилоидей в СЭМ и нашей попыткой объединения молекулярных и морфологических данных в рамках единого анализа. Изучение трихостронгилоидей не относящихся к подсемейству Ostertagiinae было связано с необходимостью получения данных для так называемых «внешних групп сравнения» при проведении филогенетического анализа по всей совокупности признаков. Нами была использована классификация, предложенная Дюре-Дессе с соавторами (Durette Desset et al., 1999) с некоторыми изменениями. Кроме того, в нашей работе был учтён феномен полиморфизма (существование мажорных и минорных морф одного и того же вида), характерный для подсемейства Ostertagiinae и других родственных подсемейств (Drozdz, 1965, 1995).
3.2.1. Ostertagia ostertagi (= O. ostertagi) f. major Stiles, Ширина рёбер синлофа не более 0,2–0,6 мкм. Расстояние между продольными гребнями синлофа составляет примерно 5–6 мкм. На латеральных поверхностях тела расстояние между рёбрами уменьшается до 3–4 мкм.
Поверхность между рёбрами представлена поперечной кольчатостью. Ширина колец составляет чуть менее 1 мкм. Вместе с рёбрами синлофа, поперечная кольчатость представляет характерную картину поверхности кутикулы этих нематод.
3.2.2. Ostertagia lyrata (= O. ostertagi f. minor) Sjoberg, Ширина рёбер синлофа составляет 1,5 мкм, достигая в некоторых местах 2 мкм. Расстояние между рёбрами синлофа составляет обычно около 5–6 мкм, но в некоторых областях тела (латеральные поверхности) ширина составляет не более 3–4 мкм. Поверхность тела между рёбрами синлофа занята элементами поперечной кольчатости с шириной кольца около 1 мкм. Кроме этого, на поверхности тела O. lyrata можно различить экскреторное отверстие диаметром 2 мкм, а также выступающие на латеральных сторонах тела заострённые дейриды. В некоторых местах на поверхности туловища можно наблюдать нерегулярность в организации продольных кутикулярных гребней. Так, одно из рёбер синлофа, доходя от головного конца до уровня экскреторной поры, исчезает. В то же время, на уровне дейрид появляются новые рёбра синлофа.
3.2.3. Ostertagia gruehneri (= O. gruehneri f. major) Skrjabin, Поверхность кутикулы покрыта продольными рёбрами синлофа (их количество достигает 32–36) и поперечной кольчатостью. Расстояние между рёбрами синлофа несколько разнится у различных особей, обычно составляя около 5–6 мкм. Дейриды O. gruehneri конические, с притупленным концом и несколько расширенным основанием. Они располагаются непосредственно на поверхности кутикулы, а не с углублением основания в ямку в кутикуле.
Дейрид разрывает ход одного из рёбер синлофа, а именно того ребра, которое находится точно на боковой поверхности тела и сближено с соседними на 2– мкм.
3.2.4. Ostertagia arctica (= O. gruehneri f. minor) Mitzkewitsh, Ротовое отверстие расположено терминально и ведет в небольшую невооруженную ротовую капсулу. Поверхность кутикулы несёт продольные рёбра синлофа количество, которых составляет от 32 до 36 штук. Расстояние между рёбрами синлофа составляет порядка 5–6 мкм. Хорошо различима поперечная кольчатость, бороздки которой не доходят до продольных гребней синлофа и оканчиваются на расстоянии 0,1–0,15 мкм от ребра синлофа.
Дейриды O. arctica близки по форме к коническим, с несколько расширенной нижней частью. Эта часть полностью занимает расстояние между двумя рёбрами синлофа. Основание дейриды прерывает ход одного из рёбер синлофа.
3.2.5. Ostertagia antipini Matschulski, Ротовое отверстие вытянуто в дорсо-вентральном направлении, имеет форму овала размером приблизительно 10 x 8 мкм. Вокруг ротового отверстия располагается валик гладкой кутикулы, имеющей шестигранную форму. По краям этого валика видны шесть щелевидных образований, вероятно представляющие собой сенсиллы губного круга, поскольку у латеральных щелевидных образований можно также различить дополнительные отверстия, по-видимому, являющиеся амфидами. Поверхность тела покрыта продольными рёбрами синлофа, расстояние между которыми разнится от 4–6 мкм в дорсальной и вентральной частях туловища, до 2–4 мкм на латеральных поверхностях. Дейриды имеют правильную коническую форму с длиной около 15 мкм. Они располагаются непосредственно на поверхности кутикулы, не образуя ямку, где бы покоилось их основание. При этом находящиеся на латеральной поверхности дейриды прерывают ход одного из рёбер синлофа.
3.2.6. Marshallagia mongolica Schumakovith, Головной конец без головной капсулы. Поверхность кутикулы покрыта продольными рёбрами синлофа, в количестве около 30–40 штук, их ширина составляет от 0,5–0,6 мкм. Расстояние между рёбрами колеблется и составляет от 5–6 мкм на дорсальной и вентральной сторонах туловища до 2,5–3 мкм на его латеральной поверхности. Как и для остальных остертагиин, для Marshallagia mongolica характерно исчезновение и появление гребней синлофа в средней части туловища. Дейриды крючковидной формы, хорошо развиты и направлены в сторону хвостового конца.
3.2.7. Teladorsagia circumcincta (= T. circumcincta f. major) (Stadelmann, 1894) Ransom, Вокруг округлого ротового отверстия различимы шесть щелевидных образований, по всей видимости, представляющие собой сенсиллы губного круга. Рёбра синлофа отстоят друг от друга на расстоянии около 4–5 мкм, за исключением латеральной стороны тела, где по среднебоковой линии проходит одно из рёбер синлофа, отстоящее от соседних ребер на расстояние в 2–3 мкм.
Дейриды имеют неправильно-коническую, слегка расширенную в средней части форму. Основание дейриды несколько сужено по сравнению с её средней частью и раздвигает два ряда ребер синлофа, не нарушая их ход.
3.2.8. Orloffia bisonis (= Orloffia bisonis f. major) Chapin, На расстоянии 50–60 мкм от головной оконечности тела на поверхности начинают появляться рёбра синлофа, ширина которых составляет 0,3–0,6 мкм.
Шейный отдел тела несёт не менее 20–30 рёбер синлофа. Дейриды представляют собой слегка вытянутые, округлые, папиллообразные образования, появляющиеся непосредственно на поверхности кутикулы без ямки.
3.2.9. Orloffia kasakhstanica (= Orloffia bisonis f. minor) Dikov et Nekipelova, Первые рёбра синлофа появляются на расстоянии 60–70 мкм от переднего конца тела. В середине туловища можно различить около 30 рёбер синлофа по всей окружности тела. Ширина колец кутикулы в средней части тела составляет около 1 мкм. Дейриды крючковидной формы, гребни синлофа огибают их с двух сторон. Между этими гребнями с каудальной стороны располагается ещё один промежуточный гребень, а со стороны головного конца-два промежуточных гребня.
Расстояние между гребнями синлофа составляет 7–8 мкм.
3.2.10. Mazamastrongylus dagestanica (Altaev, 1953) Jansen, Начальное количество гребней синлофа составляет 12, затем их число быстро нарастает, преимущественно в дорсальном и вентральном полях.
Поверхность туловища в средней его части несёт не менее 50–60 продольных рёбер синлофа, расстояние между которыми составляет 6–8 мкм. Ширина колец кутикулы не превышает 0,6–0,8 мкм. Ширина собственно рёбер синлофа составляет приблизительно такую же величину (0,6–0,8 мкм). Дейриды представляют собой папилообразные структуры диаметром 1,0–1,2 мкм, выступают из хорошо выраженной ямки, окруженной утолщенным кутикулярным ободком.
3.2.11. Graphidium strigosum Railliet et Henry, Вокруг ротового отверстия располагается шестиугольное кутикулярное кольцо. Кроме этого, вокруг ротовой полости находится шесть щелевидных образований, по-видимому, являющиеся сенсиллами губного круга, поскольку у латеральных образований находятся структуры, которые можно идентифицировать как амфиды. На расстоянии около 90–100 мкм от головного конца начинают появляться рёбра синлофа. Шейный отдел тела несёт около 15– 30 рёбер. Эти рёбра представляют собой хорошо заметные выступы кутикулы шириной приблизительно 1 мкм. Хорошо заметно исчезновение и появление этих рёбер в районе дейрид, а также на хвостовом и шейном отделе туловища.
Расстояние между продольными гребнями колеблется от 6–10 мкм в шейном отделе туловища и до 7,5–15 мкм на хвостовом конце. Дейриды по форме близки к коническим, с несколько расширенной нижней частью, которая полностью занимает расстояние между двумя гребнями синлофа. Основание дейриды, погруженное в ямку и окружённое хорошо выраженным кутикулярным ободком, прерывает ход одного из рёбер синлофа. Длина дейриды от вершины до основания составляет приблизительно 3 мкм.
3.2.12. Haemonchus contortus (Rudolphi, 1803) Cobb, Ротовое отверстие крупное, округлой формы, диаметром приблизительно 5 мкм, расположено терминально. В ротовом отверстии хорошо заметен треугольный зуб. Ротовое отверстие окружено губами, за которыми располагаются шесть щелевидных образований (сенсиллы губного круга). На расстоянии около 200 мкм от ротового отверстия находится экскреторная пора.
Она представляет собой отверстие диаметром приблизительно 2–2,5 мкм, прерывающее ход одного из гребней синлофа. Продольные гребни представляют собой хорошо выраженные кутикулярные валики шириной около 1,5 мкм. Их количество в средней части туловища составляет 30 штук. Как и для остертагиин, для вида H. contortus характерно исчезновение и появление гребней синлофа на некоторых участках туловища. Расстояние между гребнями колеблется от 8 до 15 мкм, увеличиваясь на дорсальной и вентральной поверхностях туловища и уменьшаясь на латеральной. Дейриды крючковидной формы, направлены остриями каудально. Расстояние от верхушки дейриды до её основания составляет приблизительно 25 мкм. Основание дейриды шириной 12– мкм. Дейриды располагаются непосредственно на поверхности кутикулы открыто, без какой либо ямки, и занимают расстояние между двумя рёбрами синлофа.
3.2.13. Trichostrongylus probolurus (Railliet, 1896) Looss, Ротовое отверстие треугольной формы, окружённое тремя губами. Вокруг ротового отверстия хорошо различимы шесть щелевидных образований, вероятно представляющие собой сенсиллы губного круга. Для этого вида, также как и для вида Trichostrongylus colubriformis, характерно отсутствие продольных гребней кутикулы (синлофа), поэтому рисунок кутикулы представлен только поперечной кольчатостью. Ширина колец приблизительно 2 мкм.
3.2.14. Trichostrongylus colubriformis Giles, Ротовое отверстие с тремя губами. Головная капсула отсутствует. Для этого вида, как и в целом для рода Trichostrongylus, характерно отсутствие продольных гребней синлофа. Поэтому рисунок кутикулы представлен только поперечной кольчатостью. Ширина колец составляет приблизительно 2 мкм.
3.2.15. Cooperia punctata (Linstow, 1906) Ransom, Исследование в СЭМ позволило выявить некоторые ранее не отмеченные особенности строения этих нематод. Ротовое отверстие треугольное, с выступающими вперед кутикулярными выступами на интеррадиусах. Около ротового отверстия располагаются шесть щелевидных образований, по видимому, представляющих собой сенсиллы губного круга. Расстояние от края ротового отверстия до края головной везикулы составляет приблизительно 6– 6,5 мкм. Ширина колец кутикулы колеблется от 1 до 1,8 мкм. Расстояние между продольными гребнями синлофа 12–17 мкм на дорсальной и вентральной поверхностях и уменьшается до 8 мкм в средней части туловища. На латеральной поверхности кутикулы хорошо различима срединная боковая линия, представляющая собой выступ шириной около 0,8 мкм.
3.2.16. Nematodirus helvetianus May, Вокруг широкоовального ротового отверстия располагается так называемая «corona radiata». За этим образованием можно различить шесть щелевидных структур, являющихся, по-видимому, сенсиллами губного круга, поскольку у латеральных щелевидных образований можно также различить дополнительные щелевидные отверстия, вероятно являющиеся амфидами.
Поверхность кутикулы частично покрыта продольными рёбрами синлофа.
Ширина ребра составляет около 0,5 мкм, а расстояние между рёбрами 10– мкм. У самцов поверхность задней части туловища не имеет продольных гребней на дорсальной стороне. Кроме продольных элементов можно наблюдать также элементы поперечной кольчатости.
3.3. Результаты исследования участков рибосомальной и митохондриальной ДНК нематод подсемейства Ostertagiinae и других родственных подсемейств 3.3.1. Результаты исследования ITS-участка рибосомальной ДНК у различных нематод подсемейства Ostertagiinae Основой проведенного молекулярно-таксономического анализа стали полученные нами последовательности ITS-участка рибосомальной ДНК различных остертагиин и родственных им нематод. Эти последовательности были депонированы в ГенБанке (Таблица 1).
Результаты филогенетического анализа, проведенного четырьмя различными методами представлены на рис.1. Топология филогенетических деревьев полученных этими разными методами, основанными на принципе максимальной экономии (парсимонии - MP), оценки нуклеотидных «дистанций» между отдельными формами («связывание ближайшего соседа» NJ) и использования моделей эволюции (метод максимального правдоподобия, Байесов анализ - BA) были в основном сходными. Лишь некоторые узлы кладограмм не поддерживались или поддерживалась слабо в том или ином виде анализа. При проведении данного анализа нами были сделаны попытки использования в качестве внешней группы сравнения последовательностей различных нематод, а именно представителей родов Chabertia Railliet et Henry, 1909 (Chabertiidae;
Strongyloidea);
Necator Stiles, 1903 (Ancylostomatidae;
Ancylostomatoidea);
Ancylostoma (Dubini, 1843) Creplin, 1845 (Ancylostomatidae;
Ancylostomatoidea). Сравнение полученных деревьев показало, что выбор внешней группы сравнения среди трёх упомянутых форм не оказывает существенного влияния на форму кладограммы. В дальнейшем, в качестве группы сравнения использовалась последовательность для нематод Chabertia. Значительная часть узлов данной кладограммы имеет высокие показатели bootstrap-поддержки, так что можно говорить, что определённые филогенетические связи на базальном уровне филогении трихостронгилид оказываются разрешёнными.
К единой группе по этим методам относились роды Ostertagia Ransom, 1907;
Marshallagia Orloff, 1933;
Orloffia Drozdz, 1965;
Teladorsagia Andreeva et Satubaldin, 1954. Все эти четыре рода объединяются в нашей кладограмме с достаточно высоким уровнем bootstrap-поддержки или, для Байесова анализа, обратной вероятности (MP-91%, NJ-96%, BA-95%), а каждый из этих родов по отдельности обычно имеет максимальное значение bootstrap-поддержки (100%).
Лишь в анализе методом максимального правдоподобия (ML) филогенетическое единство этих остертагиин не получает достоверной поддержки.
Таблица Номера нуклеотидных последовательностей домена ITS rDNA, депонированных в NCBI GenBank Образец Номер Nematodirus helvetianus JQ Marshallagia marshalli JQ Marshallagia occidentalis JQ Marshallagia mongolica клон 1 JQ Marshallagia mongolica клон 2 JQ Mecistocirrus digitatus JQ Ostertagia gruehneri JQ Trichostrongylus axei JQ Teladorsagia circumcincta, JQ Кировская область Teladorsagia circumcincta, JQ Mомский район Teladorsagia trifurcata JQ Trichostrongylus probolurus клон 1 JQ Trichostrongylus probolurus клон 2 JQ Mazamastrongylus dagestanica JQ Ostertagia antipini JQ Orloffia bisonis JQ Orloffia kasakhstanica JQ Другая группа из трех родов остертагиин, а именно Spiculopteragia Orloff, 1933, Skrjabinagia (Kassimov, 1942), а также Mazamastrongylus dagestanica, во всех видах проведенного анализа объединялись между собой с высоким уровнем поддержки (100/100/90/99) никогда не показывая при этом филогенетической связи с остальными номинальными остертагиинами. К этой же эволюционной линии тяготеет и последовательность, полученная нами для нематод рода Graphidium Railliet et Henry, 1909 от кроликов.
Заметим также, что на представленной кладограмме, объединяющей результаты анализа по четырем независимым методам, надежно (со стопроцентной поддержкой) объединяются изученные нами представители подсемейств Trichostrongylinae и Haemonchinae. Поскольку результаты филогенетического анализа методом максимального правдоподобия отличаются от результатов, полученных другими тремя методами, эти данные заслуживают отдельного анализа. Можно видеть (Рис. 1), что этим методом также поддерживается единство нескольких основных группы в пределах остертагиин (Marschallagia+Orloffia), (Teladorsagia) и (Ostertagia), однако, низкую поддержку получает единство остертагиин. Также не наблюдается и каких-либо связей между и (Spiculopteragia Graphidium +Skrjabinagia+Mazamastrongylus).
Рис.1. Филогенетические отношения между представителями подсемейства Ostertagiinae, представителями надсемейства Trichostrongyloidea и другими стронгилидами по результатам анализа четырьмя разными методами ITS-участка рибосомальной ДНК. Рядом с узлами кладограммы даны значения статистической поддержки для всех четырёх методов в формате MP/NJ/ML/BA.
Примечания: Обозначения для проб Teladorsagia circumcincta: К – Кировская область;
М – Момский район;
comb-нуклеотидная последовательность получена путем комбинирования данных по Spiculopteragia asymmetrica из ГенБанка (номер AF 480617 и AF 480615), «-» в значении статистической поддержки означает, что поддержка данного узла кладограммы в этом виде анализа отсутствовала или была незначительной.
3.3.2. Результаты исследования COI участка митохондриальной ДНК у различных нематод подсемейства Ostertagiinae Нами были получены нуклеотидные последовательности домена цитохромоксидазы I митохондриальной ДНК для 10 видов остертагиин. Эти последовательности были депонированы в ГенБанке (Таблица 2).
Результаты филогенетического анализа домена COI митохондриальной ДНК методами максимальной экономии (MP), минимальной эволюции (ME), присоединения ближайшего соседа (NJ), максимального правдоподобия (ML) представлены на Рис. 2. При проведении данного анализа нами были использованы в качестве внешней группы сравнения нематоды из родов Chabertia Railliet et Henry, 1909 и Ancylostoma (Dubini, 1843) Creplin, 1845.
Таблица Номера нуклеотидных последовательностей домена COI mtDNA, депонированных в NCBI GenBank Образец Номер Ostertagia ostertagi клон 1 JX Ostertagia ostertagi клон 2 JX Ostertagia lyrata JX Ostertagia gruehneri JX Teladorsagia circumcincta, JX Kировская обл.
Teladorsagia circumcincta, JX Mомский район Teladorsagia trifurcata JX Marshallagia occidentalis JX Mecistocirrus digitatus JX Trichostrongylus probolurus JX Trichostrongylus colubriformis JX Trichostrongylus axei JX Вторая ветвь объединяет, также с высоким уровнем поддержки (100%), последовательности, полученные от нематод вида T. circumcincta из Кировской области и последовательность, полученную от этого же вида и депонированную в ГенБанке под номером U 57036. В остальном представленная кладограмма соответствует классическим представлениям о систематике трихостронгилид.
Вместе объединяются исследованные представители подсемейств Trichostrongylinae и Haemonchinae.
Рис.2. Филогенетические отношения между представителями подсемейства Ostertagiinae, представителями надсемейства Trichostrongyloidea и другими стронгилидами по результатам анализа четырьмя разными методами домена COI митохондриальной ДНК. Рядом с узлами кладограммы даны значения статистической поддержки для всех 4-х методов в формате MP/ME/NJ/ML.
Примечание: К – Кировская область;
М – Момский район;
clone 1 и clone 2 различные клоны Ostertagia ostertagi, полученные методом векторного клонирования.
3.3.3. Результаты исследования ITS участка рибосомальной ДНК у различных гаплотипов нематоды Haemonchus contortus В ходе нашего исследования оказалось необходимым изучить последовательности рибосомальной ДНК у нематод других подсемейств, родственных подсемейству Ostertagiinae. При этом мы столкнулись с определенными проблемами при изучении рибосомальных последовательностей широко распространенного вида H. contortus. Попытка прямого секвенирования продукта полимеразной цепной реакции с использованием гомогената нескольких особей H. contortus из одного хозяина дала в результате нечитаемые хроматограммы с наложением нескольких пиков почти по каждой из позиций. Было сделано предположение, что причиной неудачи является полиморфизм по данному участку ДНК. После этого было проведено клонирование ПЦР-продуктов с прочтением нуклеотидных последовательностей от каждого из клонов. Были получены данные для пяти клонов из первого гомогената (клоны 1–5). Ни одна пара из этих пяти клонов не оказалась идентичной, отличаясь друг от друга на 2–11 пар оснований, что составляет порядка 0,3–1,4 % от общего числа сравниваемых оснований.
Обнаруженный высокий уровень полиморфизма в выборке особей H.
contortus, использованных для получения данного гомогената, побудил нас исследовать полиморфизм на уровне одной особи этих нематод. С этой целью был подготовлен гомогенат единственного образца этих нематод, а полученные ПЦР-продукты клонированы. Для семи клонов (клоны 6–12) были получены нуклеотидные последовательности ITS-участка. Сравнение полученных последовательностей с таковыми из первого гомогената показало, что большая часть клонов полученных от единственной особи не были выявлены ранее при изучении гомогената от нескольких особей, хотя отличие между некоторыми из этих последовательностей составляло лишь несколько (1-2) оснований.
Полученные последовательности были депонированы в Генбанке NCBI (Таблица 3). При использовании опции BLAST в NCBI GenBank (Altschul et al., 1990) были выявлены многочисленные схожие последовательности, депонированные для H. contortus различными авторами.
Таблица Номера нуклеотидных последовательностей различных гаплотипов нематоды Haemonchus contortus, депонированых в NCBI GenBank Образец Сиквенс H. contortus клон 4 JN H. contortus клон 1 JN H. contortus клон 10 JN H. contortus клон 7 JN H. contortus клон 8 JN H. contortus клон 9 JN H. contortus клон 11 JN Полученные нами последовательности отдельных клонов рибосомальной ДНК H. contortus и найденные в ГенБанке NCBI, аналогичные последовательности для этой же нематоды были использованы для проведения филогенетического анализа. Анализ этой выборки проводился разными методами филогенетического анализа (дистанционный метод, метод максимального правдоподобия, основанный на поиске адекватной модели эволюции), которые дали весьма сходные результаты. Высоким уровнем поддержки во всех видах анализа пользовалась группа, состоящая из клонов 1 и 3, полученных из первого гомогената, и последовательности EU 086379, полученной от H. contortus, паразитировавших в жирафах зоопарка Флориды.
Постоянно присутствующую, хотя и слабо поддерживаемую, группу образовывали несколько клонов полученных нами от одной особи Haemonchus contortus, а также другая последовательность от гемонхов из зоопарка Флориды и последовательность HQ 844231 Haemonchus contortus из Китая.
Для детального анализа нуклеотидных различий был использован подход, предложенный Гассером с соавторами (Gasser et al., 1998). Этими авторами было проведено сравнение нуклеотидных различий между отдельными клонами гемонхов в «привязке» к определенным позициям последовательности ITS-2 rDNA. Было выявлено несколько характерных гаплотипов, и для каждого из них в форме таблицы были указаны изменения по каждой из вариабельных позиций. Это подход с построением таблицы был взят за основу и дополнен полученными данными. Наряду с мутациями, выявленными Гассером и др.(Gasser et al., 1998), в монгольском материале нами были обнаружены ранее не отмеченные гаплотипы.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ В двух первых разделах этой главы (4.1. и 4.2.) анализируются полученные при выполнении нашей работы данные по таксономическому составу нематод из сычуга и кишечника северного оленя и домашних коз.
В разделе 4.3. рассматриваются результаты, полученные при исследовании тонкой морфологии поверхности нематод подсемейства Ostertagiinae и некоторых других трихостронгилидных нематод.
В разделе 4.4. предложен анализ филогенетических отношений нематод подсемейства Ostertagiinae по результатам анализа ITS-участка рибосомальной ДНК. Основным методом при этом было «наложение» морфологических признаков, как полученных в процессе нашей работы, так и известных ранее, на кладограмму построенную по результатам молекулярно-филогенетического анализа. При этом основной целью был поиск синапоморфий (признаков, объединяющих между собой несколько таксонов), и аутапоморфий – признаков, характеризующих уникальность какого-то терминального таксона (Павлинов, Любарский, 2011). В базальной части этого филогенетического древа представлены предковые состояния признаков, как о них можно судить по строению ближайших свободноживущих и почвенных родственных форм.
На Рис. 3 можно видеть, что для некоторых групп, характеризующихся высоким уровнем bootstrap-поддержки в большинстве или во всех методах анализа, обнаруживаются надежные синапоморфии. Так, для поддержки единой группы из трех родов подсемейства Haemonchinae имеется, по крайней мере, три синапоморфии (бурса с формулой 2-1-2, слияние лучей 5 и 6, увеличенная стома). Немалым оказывается и число синапоморфий для трех видов рода Trichostrongylus Looss, 1905 (представлены на нашей схеме одинарной ветвью, как и остальные роды, для которых исследовано несколько видов).
Синапоморфией для всех Trichostrongylidae может стать лишь признак миниатюризации стомы. Более сложным представляется вопрос о синапоморфиях, характеризующих срединные узлы нашего филогенетического дерева. Нематоды подсемейства Ostertagiinae характеризуются расщеплением дистальной части спикулы с образованием нескольких отростков сложной формы и в разной степени изогнутых.
Нематоды рода Nematodirus Ransom, 1907, которые в соответствии с современными таксономическими представлениями относятся к семейству Molineidae Durette-Desset et Chabaud, 1977, занимают в наших филограммах базальное положение по отношению к Trichostrongylidae. Спикулы этих нематод дистально объединяются, образуя общий нерасщепленный ланцетовидный конец. Отдельные спикулы с одинарной оконечностью характерны для энтомопатогенных Heterorhabditidae, а также для почвенных Rhabditidae Oerley, 1880, которых рассматривают в качестве формы, близкой к предковой для всех Strongyloidea (Blaxter et al., 1998). В таком случае правильным было бы считать именно такое состояние предковым, а усложнение строения спикулы (расщепления, изгибы) рассматривать как вторичное изменение. При этом оказывается, однако, что наложение признака «расщепление дистальной части спикулы» на полученное нами филогенетическое древо выявляет независимое его появление в рамках изучаемой группы. Другим примечательным случаем параллельного развития является вторичное восстановление рулька в двух линиях трихостронгилид, а именно у Ostertagiinae и Graphidium. Привлеченные нами для анализа морфологические данные не позволяют выявить синапоморфии для имеющей всегда высокую поддержку группы Spiculopteragia+Skrjabinagia+ Mazamastongylus. Для единой группы, объединяющей эти три рода с родом Graphidium, единственной синапоморфией служит признак явного сближения (наклона друг к другу) оконечностей бурсальных лучей 2 и 3. Дюрре-Дессе с соавторами (Durette-Desset et al., 1999) рассматривают этот признак как, несомненно, важный и используют его при проведении филогенетического анализа всей группы по морфологическим признакам. Наиболее ярким противоречием между полученными нами молекулярными данными и устоявшимися представлениями о составе подсемейства Ostertagiinae стало разделение исследованных родов, номинально относящихся к этому подсемейству, на две линии. Одна из них представляла формы, близкие типовому роду, другая (в составе Spiculopteragia, Skrjabinagia, Mazamastongylus) никогда не показывала связи с этой основной группой.
Нанесение на полученные филогенетические деревья морфологических признаков выявило лишь несколько особенностей строения упомянутых нематод, которые могли бы поддержать такое неожиданное разделение.
Безусловно, к таким признакам можно отнести синапоморфию наличия раздвоенного полового конуса (непарной преклоакальной папиллы) у Ostertagia, Marschallagia, Orloffia и Teladorsagia, а также признак «сближение оконечностей бурсальных лучей r2 и r3» для Spiculopteragia, Mazamastrongylus и Skrjabinagia. Неплохой синапоморфией для первой группы было бы восстановление (реституция) рулька, но он отмечен и для Graphidium. Другим ярким параллелизмом между двумя сравниваемыми группами оказывается расщепление дистальной оконечности спикулы на несколько отростков.
В разделе 4.5. обсуждаются результаты исследования COI участка митохондриальной ДНК нематод подсемейства Ostertagiinae и других трихостронгилид.
В отдельном разделе данной главы (4.6.) анализируются полученные нами данные по полиморфизму ITS-участка рибосомальной ДНК нематоды H.
contortus.
Исследования по трихостронгилидам диких животных показали, что основной разброс изменчивости нуклеотидных признаков наблюдался не между различными популяциями одного вида, а в пределах каждой из популяций (Blouin et al., 1992, 1995). При этом исследования по трихостронгилидам одомашненных жвачных показали отсутствие у них, в отличие от этих нематод из диких животных, какой-либо существенной географической структурированности в распределении гаплотипов. К примеру, 2–3% всей выявленной изменчивости митохондриальной ДНК у O. ostertagi в Австралии наблюдается между особями из различных австралийских популяций, тогда как различия между этими остертагиями США и Австралии составляют лишь около 4% (Constantine, 2002).
Известно, что ITS rDNA вместе со всей остальной рибосомальной последовательностью (т.е. вместе со спейсерами), транскрибируется как единая молекула, и лишь затем, в результате сплайсинга, эти ITS-участки удаляются.
Однако, вторичная структура формирующейся РНК важна для дальнейшего процессинга образующейся молекулы (Hillis, Dixon, 1991). Именно поэтому на ITS-последовательности также распространяются определенные селективные ограничения (Schlotterer et al., 1994). Вторичная структура транскрипта определяет и неслучайный характер мутационного процесса в ITS-участке:
замены оснований по некоторым позициям коррелируют. При этом нейтральные, с точки зрения отбора, варианты появляются и распространяются в популяции быстрее, нежели процесс «дирижируемой эволюции» (Hillis, Dixon, 1991) успевает их гомогенизировать. Именно совокупность всех этих факторов приводит к таким удивительным картинам разнообразия различающихся в ITS-участке гаплотипов, что мы наблюдаем у H. contortus. К нескольким уже выявленным гаплотипам у этой нематоды (Gasser et al., 1998) нами добавлено еще почти столько же.
Рис.3.Наложение морфологических признаков стронгилид на консенсусное филогенетическое дерево, построенное по результатам филогенетического анализа последовательностей ITS-1+ 5.8S + ITS-2 rDNA.
Примечание (по данным Durette-Desset et al., 1999): 1 – тип бурсы 2-2-1;
– пузыревидное кутикулярное покрытие на головном конце (cephalic bulb);
3 – слияние спикул в «ланцет»;
4 – луч бурсы 2 меньше луча 3;
5 – миниатюризация стомы;
6 – концы лучей бурсы 2 и 3 сближены;
7 – раздвоение преклоакальной папиллы (половой конус);
8 – веерообразная мембрана на спикулах;
9 – тип бурсы 2-1-2;
10 – лучи бурсы 5 и 6 слиты или парралельны;
11 – укрупнение стомы;
12 –тип бурсы 1-2-2;
13 – тип бурсы 1-3-1;
14 – дистанция между лучами бурсы 2 и 3 больше, чем между 3 и 4;
15 – отсутствие проконуса;
16 – имеется рулёк;
17 – расщепление дистального конца спикул (от 2 до 3 отдельных отростков, но не гребни и не «веер»);
18 – нерасщеплённость дистального конца спикул.
Представляется удивительным тот факт, что при значительном разнообразии гаплотипов у H. contortus среди депонированных последовательностей обнаруживаются и весьма близкие к тем, что получены нами. Так два наших клона полностью совпадают по нуклеотидному составу с гаплотипом, выявленным в Китае (HQ 844231). Примечательно, что гемонхи, от которых был получен этот гаплотип ITS-участка, были обнаружены при вскрытии козы в провинции Внутренняя Монголия, т.е. на сравнительно небольшом расстоянии от точки сбора нашего материала.
ВЫВОДЫ 1. Применение для решения вопросов таксономии трихостронгилоидей совокупности молекулярных и морфологических признаков, в том числе полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа, позволяет повысить достоверность реконструкции филогенетических отношений этих нематод, и приблизиться к построению естественной системы этого таксона, отражающей эволюционную историю данной группы паразитических нематод.
Использование полной последовательности 2. ITS-участка рибосомальной ДНК (ITS1+5.8S+ITS2) дает дополнительные молекулярно таксономические признаки (нуклеотидные различия) для дифференциации видов трихостронгилид и повышает статистическую поддержку, а значит и надежность выделения основных эволюционных линий в пределах этого таксона.
3. Для большей части изученных родов остертагиин и других трихостронгилид наблюдается четкая граница между уровнем межродовых нуклеотидных различий и различиями между видами, входящими в эти роды. В то же время такого надежного разрыва в уровне нуклеотидной изменчивости между видами и между отдельными образцами, относящимися к одному виду (межпопуляционные различия), не выявлено. Существуют виды (например, Teladorsagia circumcincta), у которых различия по последовательностям ITS rDNA и COI mtDNA между отдельными популяциями (от разных хозяев и из разных регионов) превышают уровень межвидовых различий.
4. Для отдельных представителей подсемейства Ostertagiinae и некоторых видов семейства Trichostrongylidae свойственен значительный полиморфизм в последовательностях ITS-участка рибосомальной ДНК. У H. contortus геном одной особи может содержать не менее пяти гаплотипов, различающихся по последовательности этого домена. Меньшее разнообразие гаплотипов было обнаружено и у M. mongolica. При этом характер полиморфизма у этих нематод существенно отличается: у гемонхов он обеспечивается изменчивостью на уровне отдельных нуклеотидов (замены, делеции), тогда как у остертагий полиморфизм образуется за счет сравнительно небольшого количества довольно крупных вставок (от 90 до 500 пар нуклеотидов).
5. Филогенетический анализ взаимоотношений Trichostrongylidae и некоторых родственных форм, использованных в качестве внешних групп показал, что исследованные нами роды подсемейства Ostertagiinae разделяются в полученных нами филограммах на две отдельные эволюционные линии:
собственно остертагиин в составе родов Ostertagia, Marshallagia, Teladorsagia и Orloffia и представителей родов Mazamastrongylus, Spiculopteragia и Skrjabinagia, не показавших при различных методах анализа явного родства с первой группой. Таким образом, результаты анализа по данному домену могут рассматриваться как указание на полифилетический характер самого таксона Ostertagiinae (в понимании Дюре-Дессет и Шабо(1999)).
6. Наложение морфологических признаков, традиционно используемых в систематике и таксономии трихостронгилид, на филогенетические деревья, построенные на основании анализа молекулярных данных, показывает, что для большей части выявленных эволюционных линий могут быть найдены синапоморфные признаки, в том числе и те, что были предложены в качестве наиболее существенных в последних ревизиях группы (Durette-Desset et al.,1999;
Anderson et al., 2009). В то же время не для всех терминальных таксонов (родов) в полученных нами филогенетических деревьях могут быть найдены надежные аутапоморфии.
7. Изучение тонкой морфологии поверхности остертагиин и родственных им форм в сканирующем электронном микроскопе позволило выявить дополнительные морфологические признаки. Особенности организации поверхности кутикулы (простая кольчатость без синлофа) оказываются в наших филограммах надежной аутапоморфией для рода Trichostrongylus.
Особенности строения головного конца также могут быть поставлены в соответствие основным эволюционным линиям: так треугольное ротовое отверстие с тремя губами у Trichostrongylus и наличие пузыревидных кутикулярных образований головы (cephalic vesicle) вкупе с треугольным ротовым отверстием у Cooperia, а также большое шестиугольное ротовое отверстие для Haemonchus, являются аутапоморфными признаками этих родов.
8. В целом использование для филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей по таким изменчивым (быстро эволюционирующим) последовательностям как ITS rDNA и COI mtDNA позволяет получить дополнительные данные для решения вопросов систематики Ostertagiinae и Trichostrongylidae на уровне видов и родов. Эти же данные оказываются информативными для выявления структуры вида трихостронгилид (полиморфзм, внутривидовые группировки, географическая распространенность отдельных гаплотипов), но не позволяют определить внутренние узлы филогении группы с достаточным уровнем статистической поддержки.
9. Для определения большинства видов остертагиин достаточно применения прямого секвенирования ITS-участка рибосомальной ДНК, что представляется достаточно дешевой и нетрудоемкой альтернативой или дополнением к морфологическому определению. В то же время присущий некоторым видам трихостронгилид полиморфизм в нуклеотидных последовательностях вынуждает использовать более трудоемкие и дорогостоящие методы (клонирование).
СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях перечня ВАК Кузнецов Д.Н., Данзан Г., Хрусталев А.В., Батчимег М., Уржинбямба Б. О., Аксёнов А.П., Есаулова Н.В. О видовом составе нематод сычуга и тонкого кишечника коз Восточной Монголии // Российский паразитологический журнал. М., 2008. №.2. С. 15-19.
Аксёнов А.П., Кузнецов Д.Н., Решетников А.Д. О видовом составе нематод сычуга и тонкого кишечника северных оленей // Российский паразитологический журнал. М., 2011. №.1. С.6-10.
Аксенов А. П., Спиридонов С.Э. Разнообразие гаплотипов ITS rDNA у нематод Haemonchus contortus (Trichostrongyloidea, Rhabditida) от одного хозяина // Известия РАН: серия биологическая. М., 2013. № 1. С.1-10.
Публикации в других изданиях:
Аксёнов А.П., Кузнецов Д.Н., Спиридонов С.Э. Филогенетические отношения нематод подсемейства Ostertagiinae (Rhabditidae,Strongyloidea) по результатам анализа ITS-участка рибосомальной ДНК (ITS-1+5.8S+ITS-2) // Труды ЦП ИПЭЭ РАН «Морфология, систематика и экология паразитов» М.
2011. Том 47. С. 12-26.
Публикации в сборниках и материалах конференций:
Аксёнов А.П., Кузнецов Д.Н. Нематоды сычуга и тонкого кишечника северных оленей Ямало-Ненецкого Автономного округа // Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока «Паразитологические исследования Сибири и на Дальнем Востоке». г.
Новосибирск, 15-20 сентября 2009 г., С. 12-14.
Аксёнов А.П. Использование последовательностей участка ITS-1 +5. S+ITS-2 рибосомальной ДНК в систематике нематод подсемейства Ostertagiinae (Trichostrongylidae;
Strongylida) // Материалы межрегиональной научной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии».
г.Москва, 30 ноября-3 декабря 2010 г., С. 23-27.
Кузнецов Д.Н., Аксёнов А.П., Масленникова О.В., Масленникова Т.В., Шемяков Д.Н. О видовом составе и соотношении полов в популяциях нематод сычуга и тонкого кишечника коз // Материалы научной конференции « Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». г. Москва, 27-29 мая 2008г. С.
244-247.
Аксёнов А.П., Кузнецов Д.Н., Решетников А.Д. Нематоды подсемейства Ostertagiinae Lopez-Neyra, 1947 у северных оленей тундровой зоны Якутии // Материалы научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». г. Москва, 18-20 мая 2010г. С. 11-15.
Кузнецов Д.Н., Аксёнов А.П. О видовом составе нематод северных оленей // Сборник научных трудов по материалам конференции «Первые международные Беккеровские чтения». г. Волгоград, 27-29 мая 2010г., С. 418 420.
Спиридонов С.Э., Аксёнов А.П. Полиморфизм ITS-участка рибосомальной ДНК паразитических нематод: последствия и возможности применения // Сборник научных статей по материалам IX симпозиума Российского общества нематодологов с международным участием «Нематоды естественных и трансформированных экосистем». г. Петрозаводск, 27 июня- июля 2011г., С. 94-95.
Спиридонов С.Э., Аксенов А.П. Анализ филогенетичеких отношений нематод подсемейства Ostertagiinae Lopez-Neyra, 1947 проведённый на основании строения COI участка митохондриальной ДНК // Материалы международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии». г. Москва, 30 октября-1 ноября 2012 г., С. 6-10.