Клинико – лабораторные аспекты сальмонеллёза у взрослых
На правах рукописи
НАЗМУТДИНОВА РИТА ГАЛИЕВНА КЛИНИКО – ЛАБОРАТОРНЫЕ АСПЕКТЫ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА У ВЗРОСЛЫХ 14.01.09 - инфекционные болезни 03.02.03 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук
Москва – 2011
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении выс шего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Фе дерации Научные руководители:
Мурзабаева Расима Тимеряровна Доктор медицинских наук Мавзютов Айрат Радикович Доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Грачёва Нина Михайловна Доктор медицинских наук, профессор Пашков Евгений Петрович Доктор медицинских наук, профессор Ведущая организация : ГБОУ ВПО «Московский государственный медико стоматологический университет» Минздравсоцразвития РФ
Защита состоится «28» октября 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного сове та Д 208.114.01 Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека по адресу: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреж дения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Фе деральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека по адресу: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а.
Автореферат разослан «24» сентября 2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Александр Васильевич Горелов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы По данным ВОЗ, ежегодно регистрируется до 275 млн. диарейных заболеваний среди детей и взрослых, занимая второе место по частоте после острых респираторных вирусных инфекций, в Российской Федерации (РФ) - около 1 млн. случаев острых ки шечных инфекций (ОКИ). При этом показатель заболеваемости в 2007-2008 гг. соста вил 509,8–512,3 на 100 тыс. населения и не имеет тенденции к снижению. Сальмонел лез в структуре кишечных инфекций составляет 6,96% и 6,97% в 2007, 2008 гг., в его этиологии доминируют Salmonella Enteritidis [Рожнова С.Ш., 2009;
Шаханина И.Л., 2005;
Brien S.J., 2003].
Особую озабоченность вызывает низкая эффективность профилактических мер при данном заболевании, это связывают с видовым разнообразием сальмонелл, их жиз неспособностью и значительной генетической пластичностью возбудителя, что суще ственно затрудняет лабораторную диагностику и борьбу с ними. Сохраняется актуаль ность госпитального сальмонеллеза [Акимкин В.Г., 1998;
Трунилина Р.А., 2006;
Дёмин И.А., 2006], обусловленного антибиотикорезистентными штаммами бактерий [Милю тина Л.Н., 2008], наличием R-плазмид [Рожнова С.Ш., 2000;
Воробьёв А.А., 2000;
Вар тересян И.И., 2002]. Однако, в последние годы учёные все чаще высказывают предпо ложения о существовании генетических механизмов изменения патогенности сальмо нелл, которые связывают с циркуляцией между клиническими штаммами энтеробакте рий мобильных генетических элементов, в том числе «островов» патогенности, отве чающих за синтез различных факторов патогенности, что, в свою очередь, даёт микро бам селективное преимущество и конкурентоспособность [Бондаренко В.М., 2001;
Бу харин О.В., 2000;
Домарадский И.В., 1997;
Рожнова С.Ш., 2000;
Hacker J.,2000;
Kaper J.B., 1999;
Wood M.W., 1998].
Появились новые данные, указывающие на немаловажную роль липополисаха ридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий, включая Salmonella spp., в патогенезе и мо дификации иммунного ответа при вызываемых ими заболеваниях [Бондаренко В.М., 2002;
Рябиченко Е.В., 2005;
Яковлев М.Ю., 2003;
Лиходед В.Г., 1996;
Конев Ю.В., 2009].
Вышеизложенное послужило основанием для проведения соответствующих ис следований.
Цель работы – установить наличие и характер взаимосвязей между частотой встречаемости фрагментов генов «островов» патогенности энтеробактерий, антибиоти корезистентностью выделенных штаммов сальмонелл и клиникой заболевания у взрос лых, определить липополисахарид-эндотоксинемию в динамике болезни для разработ ки дополнительных критериев оценки тяжести, прогноза и рационального подхода к терапии сальмонеллеза.
Задачи исследования 1. Установить клинико-лабораторные особенности сальмонеллеза с учётом сте пени тяжести заболевания.
2. Определить концентрацию липополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови боль ных сальмонеллёзом в двух возрастных группах и установить взаимосвязи между уров нем ЛПС и показателями периферической крови в динамике болезни.
3. Молекулярно-генетическая детекция фрагментов генов «островов» патогенно сти, ассоциируемых с патогенностью E. coli, у клинических штаммов сальмонелл (ге ны, кодирующие -гемолизины – hly (hlyA и hlyB) и адгезины – sfa (sfaA и sfaG)) и ха рактеристика взаимосвязей между частотой их обнаружения и особенностями клиниче ского течения сальмонеллёза.
4. Установить взаимосвязи между фрагментами генов «островов» патогенности, кодирующими -гемолизины – hly (hlyA и hlyB) и адгезины – sfa (sfaA и sfaG), и анти биотикорезистентностью выделенных культур. Выявить влияние фактора полирези стентности к антибактериальным препаратам на тяжесть течения сальмонеллёза.
5. Установить характер взаимосвязей между молекулярно-генетическими и фе нотипическими особенностями клинических штаммов S. Enteritidis и клинико лабораторными показателями сальмонеллеза в двух группах сравнения (первая – гемо лизины и вторая - адгезины).
Основные положения, выносимые на защиту 1. Липополисахарид-эндотоксинемия, нарастающая в динамике болезни, определя ет клинико-лабораторные особенности сальмонеллеза в зависимости от возраста больных.
2. Клинические штаммы сальмонелл в 97,3%, в том числе S. Enteritidis в 97,1% случаев, обнаруживают фрагменты генов «островов» патогенности (ФГОП), ас социируемые с патогенностью E. coli, кодирующие -гемолизины - hly (hlyA и hlyB) и адгезины - sfa (sfaA и sfaG).
3. Наличие у клинических штаммов сальмонелл генетических детерминант (hly, sfa), ассоциируемых с патогенностью E. сoli, коррелирует со степенью тяжести сальмонеллеза и антибиотикорезистентностью возбудителя.
Научная новизна исследования Впервые установлены клинические особенности сальмонеллёза у взрослых, обу словленные наличием у 97,1% штаммов S. Enteritidis различных сочетаний фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП), ассоциируемых с патогенностью E. сoli, опре деляющих способность синтезировать фимбрии типа S (sfaG и sfaA) и -гемолизины (hlyA и hlyB). Выявлены корреляционные связи между фрагментами генов «островов» патогенности (ФГОП), степенью тяжести заболевания и антибиотикорезистентностью культур.
Впервые при сальмонеллёзе показана корреляция между молекулярно генетическими характеристиками возбудителей и клинико-лабораторными показателя ми в группах сравнения, разделённых по признаку содержания генов -гемолизинов и адгезинов у выделенных штаммов сальмонелл.
Впервые была определена концентрация липополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови у больных сальмонеллёзом в двух возрастных группах и установлены взаимосвя зи между уровнем ЛПС – эндотоксинемии и показателями периферической крови в ди намике болезни.
Практическая значимость работы Показано, что фрагменты генов «островов» патогенности: sfaG, sfaA, hlyA, hlyB, ассоциируемые с патогенностью E. coli, могут выступать в качестве маркеров патоген ности клинических штаммов сальмонелл. Наличие указанных детерминант у возбуди телей коррелирует с рядом особенностей течения заболевания, клинико-лабораторными показателями, антибиотикорезистентностью сальмонелл, степенью тяжести, прогнозом заболевания, и их определение может применяться при лабораторной диагностике сальмонеллёза и выборе рационального лечения.
Указанные генетические маркеры могут использоваться при оценке роли возбу дителя в эпидемическом процессе, а в сочетании с результатами определения антибио тикорезистентности сальмонелл позволяют повысить эффективность этиотропной те рапии.
Выявленная в ходе исследования ЛПС-эндотоксинемия, нарастающая в динами ке болезни, определяет тактику ведения больных сальмонеллёзом - включение в схемы лечения средств, снижающих уровень интоксикации (сорбенты, дезинтоксикационная терапия).
Апробация работы Основные положения диссертации доложены на Российской научно – практиче ской конференции «Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и экспери менте» (Махачкала, 2008);
Российской научно – практической конференции «Актуаль ные вопросы клинической медицины: инфекционных и неинфекционных болезней в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2009);
I, II, III Всероссийском Ежегодном Кон грессе по инфекционным болезням (Москва, 2009, 2010, 2011);
Российской научно – практической конференции «Национальные лабораторные дни» (Москва, 2010);
Рес публиканской научно - практической конференции, посвящённой 100-летию муници пального учреждения инфекционной клинической больницы №4 г. Уфы (Уфа, 2010).
Работа апробирована на межкафедральном заседании сотрудников кафедры инфекци онных болезней с курсами дерматовенерологиии и косметологии ИПО, лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Баш кирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.
Внедрение результатов работы в практику Материалы диссертации опубликованы в печати. Данные, полученные в резуль тате проведённых исследований, дополняют знания о возбудителях сальмонеллёза и о патогенезе вызываемого ими заболевания. Результаты исследований внедрены в работу КИБ №4 г. Уфы, используются в педагогическом процессе кафедр инфекционных бо лезней с курсами дерматовенерологиии и косметологии ИПО, лабораторной диагно стики ИПО и фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкир ский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.
Публикации По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 - в журналах, ре комендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и ме тоды исследования», трёх глав собственных результатов, обсуждения, заключения, вы водов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 164 стра ницах машинописного текста, содержит 40 таблиц, 8 рисунков. Список литературы включает 216 источников: 105 – отечественных и 111 – зарубежных авторов.
Материалы и методы исследований Работа основана на анализе клинического наблюдения и лабораторного обследо вания 112 взрослых больных сальмонеллёзом гастроинтестинальной формы, находив шихся на стационарном лечении в городской клинической инфекционной больнице № г. Уфы и г. Октябрьского в 2007-2008 гг.
Критерием включения в исследование были больные, от которых выделены кли нические штаммы S. Enteritidis. Критериями исключения из исследования были паци енты, у которых выявлялись микробные ассоциации сальмонелл с условно-патогенной флорой, шигеллами, ротовирусами и др.
Изучение клинических симптомов и лабораторных данных проводилось с учё том степени тяжести заболевания. Больные сальмонеллёзом по полу были представле ны 64 (61%) женщинами и 41 (39%) мужчиной разных возрастов. Большее количество пациентов было в возрасте от 20 до 29 лет – 36 (34,3%).
Группу контроля составили 33 практически здоровых человека, сопоставимых по возрасту (p 0,684) и полу (p 0,158) с пациентами основной группы.
Помимо общеклинических методов обследования, у 17 больных сальмонеллё зом, была определена концентрация липополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови по концентрации ЛПС хромогенным методом по конечной точке с применением ЛАЛ – реактива (Hbt LAL, Голландия) в динамике: на 1-2, 3-4 и 10-11 дни болезни.
Сбор коллекции клинических штаммов сальмонелл проводили бактериологиче ским методом с использованием питательных сред отечественного производства. Био химическую идентификацию культур осуществляли при использовании сред Гисса и систем для ускоренной идентификации (СИБ, ПБДЭ и др.) отечественного («Диагно стические системы», Россия) и импортного («Chemapol», Чехия) производства. В слу чае низкой или атипичной биохимической активности выделенных культур их иденти фикацию проводили с использованием видоспецифических бактериофагов.
Определение чувствительности клинических штаммов сальмонелл к ампицил лину, карбенициллину, гентамицину, амикацину, доксициклину, левомицетину, ци профлоксацину, цефазолину, цефотаксиму, цефтриаксону, цефалексину и сальмонел лёзному и интести - фагам осуществляли общепринятым дискодиффузионным мето дом. Оценку резистентности к антибиотикам проводили в соответствии со значениями задержки зоны роста [Скала Л.З., 2004].
Тотальную бактериальную ДНК выделяли из суточной агаровой культуры с ис пользованием стандартных наборов «ДНК-сорбА» («Интерлабсервис», Россия). ПЦР проводилась в амплификаторе МС–16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Для вы полнения работы использовали праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе «ост ровов» патогенности у E. coli, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfa A и sfa G) и -гемолизины (hlyA и hlyB) отечественного производ ства («Синтол», Россия). Продукты амплификации (20 мкл) анализировали электрофо ретически в 1,5% горизонтальных агаровых гелях в постоянном электрическом поле (10В/см). ДНК окрашивали бромидом этидия и визуализировали при освещении ульт рафиолетовыми лучами (304 нм) на трансиллюминаторе «Флуоскоп–2» («Биоком», Россия). Документирование результатов реакции осуществляли фотографированием на цифровую видеокамеру. В качестве маркеров использовали ДНК фага, рестрициро ванную Вst E2 (М 1), и 123 п.н. – лестница «Promega» (М 2).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась в соответствии с технологией современного компьютерного анализа на IBM – современном персо нальном компьютере с использованием приложений Microsoft Exсell пакета Office XP и Statistica (Stat Soft) версии 6.0 [Реброва О.Ю., 2002;
Зайцев В.И, 2006;
Гареев Е.М., 2009]. При проведении анализа определялись: среднее значение признака (М), стан дартное отклонение признака (S), стандартная ошибка среднего (m), медиана (Ме), верхний (Q1), нижний квартили (Q3), для оценки силы влияния факторов (2) проводил ся частотный дисперсионный анализ. Для оценки различий количественных признаков при распределении отличном от нормального применяли критерий Манна-Уитни (U), Вилкоксона (W), при множественных сравнениях – с соответствующими поправками;
при оценке различий качественных признаков – непараметрические критерии – 2 Пир сона, Фишера (F). Для оценки взаимосвязей между признаками определялись коэффи циенты ранговой корреляции Спирмена (rs), линейной корреляции Пирсона (r), канони ческой корреляции (r*). Статистические гипотезы считались подтвержденными при уровне значимости р0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Клинико-лабораторная характеристика больных сальмонеллёзом Среди пациентов, госпитализированных в инфекционный стационар с диагнозом «острая кишечная инфекция», в 37,1% случаев подтверждался сальмонеллёз. Из них под нашим наблюдением находилось 105 больных с гастроинтестинальной формой сальмонеллёза в возрасте от 18 до 70 лет, от которых были выделены S. Enteritidis в мо нокультуре. Клинически преобладал гастроэнтеритический вариант заболевания (83%).
Женщины составили 61% (64), мужчины - 39% (41). Преобладающая часть пациентов была в возрасте от 18 до 40 лет – 70 (66,7%). Средний возраст женщин и мужчин соста вил 35,1±2,28 и 34,9±2,85 лет (p0,05), соответственно. У больных сальмонеллёзом среди сопутствующих заболеваний чаще регистрировались болезни органов пищеваре ния – у 35 (33,3%), каждый пятый ранее перенёс аппендэктомию – 21 (20%).
У 24 (22,9%) пациентов диагностирована лёгкая форма, у 63 (60%) - среднетя жёлая и у 18 (17,1%) – тяжёлая форма болезни. Достоверных различий по тяжести те чения заболевания среди женщин и мужчин не выявлено (2=2,44, 0,295).
У больных тяжёлой формой сальмонеллёза отмечались слабость (100%), голов ные боли (83,3%), головокружение (50%) и отсутствие аппетита (94,4%). Температура тела на высоте подъема достигала 39,00С и выше (94,4%) и сохранялась до 7 дней и дольше – у 55,6% пациентов. На тошноту жаловались 44,4% пациентов, рвота была многократной (до 10 раз) у 72,2% и более - у 11,1% больных. У трети (33,2%) пациен тов рвотный симптомокомплекс сохранялся до 7 дней и более. Боли в животе отмеча лись у всех больных с тяжёлой формой заболевания, из них у 94,4% сохранялись свыше 3 дней. Жидкий стул имел место в 100% случаев, носил преимущественно водянистый характер (88,9%). В кале определялись патологические примеси в виде зелени (50%), слизи (55,6%), прожилок крови (22,2%). При тяжёлых формах чаще диагностировался гастроэнтероколитический вариант сальмонеллёза (44,4%), осложнения развивались в (72,7%) случаях из 11 (инфекционно–токсический шок - 1 случай, гиповолемический шок – 3, аппендицит - 1, желудочное кровотечение – 1 и обострение хронической пато логии органов пищеварения - 2 случая). При среднетяжёлой форме болезни осложнения выявлены у 3 (27,3%) пациентов: у 1 – аппендицит и у 2 – обострение хронической па тологии органов пищеварения. При лёгкой форме сальмонеллеза осложнения не на блюдались. Летальных случаев среди анализированных больных не было.
В острый период болезни в периферической крови выявлена тенденция к повы шению уровня гемоглобина, что в среднем составило 140±6,61 г/л при тяжёлой, 132,6±2,38 г /л – при среднетяжёлой и 129,7±2,80 г/л - при лёгкой форме сальмонеллеза;
также количества эритроцитов - 4,6±0,24x1012/л;
4,3±0,16х1012/л и 4,17±0,07х1012/л, со ответственно. В лейкоформуле выявлено нарастание показателей нейтрофилов, что в среднем составило 81,3±4,85% при тяжелой, 71,3±4,25% - при среднетяжелой, 67,5±4,02% - при легкой форме болезни, что может отражать активацию клеточного звена иммунитета. При всех вариантах течения сальмонеллеза определялась тенденция к снижению показателей тромбоцитов: до 192,5±11,1х109/л - при тяжелой;
до 198,5±7,78х109/л - при среднетяжёлой и до 195,0±10,4х109/л - при лёгкой форме заболе вания, что согласуется с данными других авторов [Каган Ю.Д., 1992] и, по-видимому, указывает на выраженность токсикоза. У 33,3% больных с тяжёлой и у 22,2% со сред нетяжёлой формой сальмонеллёза в моче выявлялся белок, тогда как при легкой форме болезни протеинурии не было. При тяжёлом течении заболевания отмечалась выра женная гипостенурия, её значения в отдельных случаях достигали 1004, при выписке из стационара в среднем составили - 1010±1,27. Выявленное снижение удельной плотно сти мочи указывало на поражение почек, что могло быть следствием токсического дей ствия ЛПС на эндотелий почечных сосудов [Харланова Н.Г., 2004].
Определение липополисахарида в сыворотке крови у больных сальмонел лёзом среднетяжёлой формы в динамике болезни Концентрация липополисахарида (ЛПС) определялась в сыворотке крови в ди намике на 1-2, 3-4, 10-11 дни болезни у 17 больных сальмонеллёзом среднетяжёлой формы, которые составили основную группу, и 33 практически здоровых лиц из груп пы контроля. Основная группа была разделена по возрасту на две группы сравнения. В первую группу вошли больные от 18 до 50 лет (n=9), во вторую – от 50 лет и старше (n=8). В крови лиц из группы контроля средняя концентрация ЛПС составила (Me, Q25 Q75) 0,22 (0-0,60) Ед/мл (табл. 1).
Таблица 1 – Концентрация липополисахарида в сыворотке крови у больных сальмонел лёзом среднетяжёлой формы в динамике болезни (Me, Q25-Q75) Группы Концентрация липополисахарида (ЕД/мл), Темп роста (дни болезни) уровня ЛПС в динамике 1 сыворотка 2 сыворотка 3 сыворотка (в 3 и 1 сы (1–2 день) (3-4 день) (10-11день) воротках) I группа (n=9) 1,70 (0,59 - 1,50 (0,76 - 2,36)* 3,03 (1,63 - 1, 2,36)* 3,60)* группа 0,71 (0,38 - 1,50 (0,29 - 2,28) II 1,90 (0,78 - 2, (n=8) 1,08)* 3,47)*, ** Контрольная 0,22 (0 - 0,60) группа (n=33) Примечание: * - различия достоверны при сравнении с контролем (р0,001) по методу Крускала-Уоллиса, с последующим множественным сравнением по (U) Критерию Манна-Уитни c поправкой Данна, ** - различия достоверны (р0,01) при сравнении с показателем при поступлении по критерию Фридмана с последующим критерием мно жественного сравнения (W) Вилкоксона с поправкой Бонферони.
Средние показатели ЛПС в обеих возрастных группах во все периоды болезни были достоверно выше, чем в контроле (р0,001), кроме 2-й сыворотки в группе боль ных старшего возраста. Концентрация ЛПС в группах сравнения нарастала в динамике болезни. Так, в соответствующие сроки в I группе показатели составили 1,70 (0,59 2,36)*;
1,50 (0,76-2,36)*;
3,03 (1,63-3,60)* Ед/мл, темп увеличения уровня ЛПС на фоне лечения (в 3 по сравнению с 1 сывороткой) составил 1,8 раза. Во II группе показатель ЛПС достоверно возрос с 0,71 (0,38-1,08)*до 1,90 (0,78-3,47)*, ** Ед/мл (p0,01), темп роста составил 2,7 раза, что в 1,5 раза больше, чем в первой группе. Большее повыше ние концентрации ЛПС (в 2,7 раза) у лиц старшего возраста в динамике болезни может отражать, в силу инволюционных процессов, недостаточность и быстрое истощение систем, связывающих и нейтрализующих эндотоксин грамотрицательных бактерий в организме [Конев Ю.В., 2009].
Сопоставление клинико-лабораторных данных в группах сравнения выявило различия. Температура до 390С и выше была у всех 9 больных первой группы против из 8 – во второй группе, температура до 380С свыше 3 дней, была только у больных II группы – у 4 из 8. Среди больных II группы частота рвоты была больше – у 5 из 8 про тив 3 из 9 пациентов I группы, продолжительная диарея также чаще встречалась среди больных старшей возрастной группы – у 7 из 8 против 3 из 9 пациентов первой группы.
Результаты исследования крови у пациентов в группах сравнения выявили более высокие показатели сегментоядерных нейтрофилов в крови больных первой группы (Me, Q25-Q75) – 51,0 (44,0 - 62,0)% против 49,5 (40,0 – 65,5)%, (р0,001) в острый период болезни, что может указывать на более выраженную ответную реакцию иммунной сис темы у лиц молодого возраста. Показатели тромбоцитов в острый период болезни сни жались в обеих группах, но больше во второй (Me, Q25-Q75) - 121,0 (106,5 – 137,0)х109/л против 152,0 (137,0 – 165,0)х109/л - в первой (р0,043) и в стадии выздоровления оста вались низкими – во второй группе - 158,5 (130,5 – 191,0)х109/л, по сравнению с первой - 235,0 (191,0 – 254,0)х109/л (р0,009), что могло быть также связано с ограниченными резервами эндотоксинсвязывающих систем организма у пожилых людей и большим разрушением клеток крови, участвующих в связывании эндотоксина [Конев Ю.В., 2009;
Яковлев М.Ю., 2003].
Сравнительный анализ показателей периферической крови больных основной группы (n=17) и группы контроля (n=33) выявил статистически значимые различия до и после лечения. Так, в острый период в основной группе пациентов были достоверно выше, чем в контроле количество лейкоцитов (p0,026), палочкоядерных нейтрофилов (p0,001), СОЭ (p0,001), эритроцитов (p0,018), достоверно ниже – показатели эози нофилов (p0,013), лимфоцитов (p0,001) и тромбоцитов (p0,001). В стадии выздо ровления отмечено достоверное увеличение количества моноцитов (p0,001), высокий уровень СОЭ (p0,001) и снижение сегментоядерных нейтрофилов (p0,002), сохраня лась тромбоцитопения (p0,046) в крови больных основной группы в сравнении со здо ровыми лицами из группы контроля. Выявленные изменения в гемограммах у пациен тов сальмонеллёзом могут указывать на наличие воспалительного процесса в организме и выраженность эндотоксинемии (в частности тромбоцитопения), оказывающей дозо зависимое влияние на клетки миелоидного ряда и иммунной системы (активирующее – при малых дозах и подавляющее – при больших дозах ЛПС) [Dinarello C.A., 2007;
Silvester H. et al., 1990;
Платонов А.Е., 1999;
Мешков М.В., 2005].
С целью выявления ЛПС–опосредованных изменений в организме и определе ния взаимосвязей между концентрацией ЛПС в сыворотке крови и показателями пери ферической крови у больных сальмонеллёзом проводился статистический анализ, кото рый выявил при поступлении в стационар статистически значимую, прямую, средней силы корреляционную связь (по коэффициенту Пирсона) между уровнем ЛПС и моно цитов (r=0,65;
р0,005). При выписке больных определилась достоверная прямая кор реляционная зависимость средней силы между уровнем ЛПС и показателями эозино филов (r=0,51;
р0,037). В остальных случаях имела место незначимая корреляция средней силы - между уровнем ЛПС и лейкоцитов (r=0,41;
р0,104), обратная зависи мость между уровнем ЛПС и показателями моноцитов (r=-0,30;
р0,236). Изменения картины периферической крови в разные периоды болезни, по-видимому, объясняются дозозависимым влиянием ЛПС (активизирующим или подавляющим) на клетки крови [Dinarello C.A., 2007;
Яковлев М.Ю., 2003].
Молекулярно–генетическая оценка клинических штаммов сальмонелл, выделенных от взрослых больных гастроинтестинальной формой сальмонеллёза Исследование клинических штаммов сальмонелл на наличие ДНК–фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП), специфичных известным генам кластеров па тогенности E. coli, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfaA и sfaG) и –гемолизин (hlyA и hlyB), выявило присутствие генетических детер минант у 109 (97,3%) из 112 клинических штаммов сальмонелл (табл. 2).
Таблица 2 - Частота встречаемости фрагментов генов «островов» патогенности у кли нических штаммов сальмонелл, выделенных от больных сальмонеллёзом (абс., %) № Штаммы сальмо- hlyA Итого ге hlyB sfaG sfaA п нелл нов n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) 1. S. Enteritidis 50 54 57 29 (n=102) (92,6%) (90%) (96,6%) (100%) (94,1%) 2. S. Typhimurium 3 4 1 0 (n=5) (5,6%) (6,7%) (1,7%) (4,0%) 3. S.редких групп 1 2 1 0 (n=2) (1,8%) (3,3%) (1,7%) (1,9%) Всего: 109 54 60 59 29 (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) Непосредственно в исследование были включены только S. Enteritidis (105 шт.).
У 102 (97,1%) из них выявлены искомые гены, в отдельности и в различных комбина циях по 2, 3 и 4, общим числом 190. Причём у 40 (39,2%) штаммов выявлено по одному гену: sfaA – у 2, sfaG – 18, hlyA – 7, hlyB – 13;
у 40 (39,2%) - шесть сочетаний по 2 гена:
hlyA+sfaA – у 2, hlyB+sfaA – 9, hlyB+sfaG – 8, hlyA+sfaG – 11, hlyA+hlyB – 8, sfaA+sfaG – 2;
у 18 (17,6%) штаммов – по три: hlyA+sfaA+sfaG – у 6, hlyA+hlyB+sfaA – 4, hlyA+hlyB+sfaB – 8. И четыре (3,9%) штамма несли одновременно все четыре иско мых гена.
Проведённый анализ частоты встречаемости ФГОП у клинических штаммов сальмонелл показал, что от лиц 20–29 лет, которые количественно преобладали, было выделено большее количество возбудителей - 36 (35,3%), которые одновременно несли искомые ФГОП числом 61 (32,1%), что больше, чем в других возрастных группах.
От пациентов, в зависимости от пола, чаще выделялись сальмонеллы, несущие генетические детерминанты sfaG в отдельности (n=18), которые определялись одинако во часто у микробов, выделенных от мужчин и женщин – по 9 (50%).
Нами был проведён анализ влияния каждой генетической детерминанты (hlyA, hlyB, sfaA, SfaG) в отдельности, в сочетании с другими генами и всей совокупности ге нов данной генетической детерминанты на тяжесть течения сальмонеллёза. Частотный дисперсионный анализ показал, что наибольшее влияние на тяжесть болезни оказывало наличие генетической детерминанты hlyB как в отдельности (2 =36%, F=10,2, р0,003), так и его комбинации с другими генами (2 =24%, F=18,9, р0,001) и всей совокупности генов в целом (2 =25%, F=26,7, р0,001). В то время как другие генетические детерми нанты только в сочетании с другими генами и всей совокупности генов в целом отра жали степень тяжести сальмонеллёза: hlyA (2=23%, F=18,9;
р0,001 и 2 =16%, F=14,0;
р0,001);
sfaA (2 =28%, F=14,9;
р0,001 и 2=31%, F=18,7;
р0,001);
sfaG (2=18%, F=12,8;
р0,001 и 2=10%, F=9,3;
р0,001).
Для оценки влияния отдельных групп генетических детерминант (гемолизины и адгезины) на тяжесть течения болезни, клинические штаммы сальмонелл были разде лены на две группы. В первую группу вошли культуры, несущие генетические детер минанты -гемолизинов А и В в отдельности и в различных комбинациях с другими генами, общим числом n=104, во вторую – бактерии, содержащие гены адгезинов A и G в отдельности и в различных сочетаниях, всего n=86 генетических детерминант. Наи большее влияние ФГОП на тяжесть заболевания выявлено в первой группе (гемолизи нов) во всех случаях, как в отдельности (2 =20, F=7,0;
р0,002), так и в случае сочета ния генетических детерминант гемолизинов с другими генами (2 =24, F=38,3;
р0,001) и всей совокупности генов в целом (2 =20, F=39,7;
р0,001). Во второй группе (адгези нов), наибольшее влияние выявлено в случае сочетания генов адгезинов с другими ге нами (2 =22, F=27,1;
р0,001) и совокупности генов в целом (2 =15, F=23,3;
р0,001).
Для оценки влияния количества фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП) в геноме клетки возбудителя на тяжесть течения сальмонеллёза был проведен частотный дисперсионный анализ (табл. 3).
Таблица 3 - Зависимость тяжести течения сальмонеллёза от количества фрагментов ге нов «островов» патогенности Количество Легкая Среднетяжёлая Тяжёлая Итого F фрагментов ге- абс. абс. абс. абс.
% % % % нов «островов» (%) (%) (%) (%) (%) патогенности 1 фрагмент ге- 15 62,5 20 33,3 5 28 40 39,2 11 7,2* нов «островов» (37,5) (50) (12,5) (100,0) патогенности (100%) 2 фрагмента ге- 7 29,2 25 41,7 8 44 40 39,2 19 13, нов «островов» (17,5) (62,5) (20,0) (100,0) * патогенности (100%) 3-4 фрагмента 2 8,3 15 25 5 28 22 21,6 29 12, генов «остро- (9,0) (68,0) (23,0) (100,0) * вов» патогенно сти (100%) Всего 24 100 60 100 18 100 102 Примечание: 2 - сила влияния фактора, F – критерий Фишера, * - уровень значимости (p0,001).
Изучение влияния количества генетических детерминант на тяжесть заболева ния показало, что штаммы, выделенные от больных с лёгкой формой сальмонеллёза, несли преимущественно один из фрагментов генов «островов» патогенности. Тогда как штаммы, выделенные от больных с тяжёлым течением болезни, отличались наличием одновременно сразу нескольких искомых генетических детерминант, которые оказыва ли статистически значимое влияние на тяжесть течения сальмонеллёза. Сила влияния составила 11% при наличии одного ФГОП (2=11;
p0,001), 19% - при двух ФГОП (2=19;
p0,001) и 29% при наличии 3-4 ФГОП (2=29;
p0,001). Взаимосвязь между признаками оказалась средней силы во всех трёх группах (r*=0,33;
r*=0,44;
r*=0,54).
Антибиотикорезистентность клинических штаммов S. Enteritidis и фраг менты генов «островов» патогенности Учитывая то, что патогенность определяется совокупным эффектом различных свойств возбудителя, правомерными являются представления об адаптивной пере стройке метаболизма бактерий при изменившихся условиях их существования [Гаши мова Д.Т., 1998;
Петровская В.Г., 1994]. Это может происходить в результате межвидо вого генетического обмена в микробных сообществах, в результате которого утрачива ются или приобретаются свойства, обеспечивающие микроорганизмам селективные преимущества. Наглядно это видно на примере формирования устойчивости к дейст вию противомикробных препаратов, в первую очередь, антибиотиков [Рожнова С.Ш., 2000]. Информация, касающаяся типов лекарственной устойчивости микроорганизмов, выявления у них новых детерминант резистентности (R – плазмид), важна не только для выработки рациональной стратегии и тактики применения антимикробных препа ратов, но может быть использована в качестве своеобразных эпидемиологических мар кёров возбудителей [Рожнова С.Ш., 2000;
Вартересян И.И., 2002, Воробьёв А.А., 2000].
Использование таких маркёров позволило доказать, что в течение 14 лет наблюдений (с 1994 по 2008 гг.) среди S. Enteritidis появились штаммы, устойчивые к 6 препаратам и более, т.е. полирезистентные, которые составили треть всех изученных культур. Пока зано, что сальмонеллёз, вызванный такими штаммами, отличается тяжёлым течением, в частности у детей старшего возраста, поражением толстой кишки, вплоть до геморра гического колита [Милютина Л.Н., 2008].
Проведенные нами исследования показали, что чувствительность клинических штаммов сальмонелл к 13 наиболее широко используемым антибактериальным препа ратам (ампициллин, гентамицин, доксициклин, цефазолин, амикацин, ципрофлоксацин, цефотаксим, цефтриаксон, цефалексин, левомицетин, карбенициллин и интести - и сальмонеллёзный бактериофаги) варьирует. Установлено, что 68 (66,7%) микробов бы ли резистентны к антибактериальным препаратам (АБП), из них 35 (51,5%) - к 1-3 пре паратам, 27 (39,7%) - к 4-5, 6 (8,8%) - к 6 и более АБП одновременно. Наиболее часто устойчивость возбудителей имела место к ампициллину (52%), доксициклину (40,2%), левомицетину (34,3%), цефазолину (30,4%) и карбенициллину (28,4%). Меньшая рези стентность сальмонелл определялась к цефалексину (10%), амикацину (8,8%), гентами цину (6,8%), цефтриаксону (3,9%), цефотаксиму (2,9%), ципрофлоксацину (2,9%) и бактериофагам (1,0%).
Наибольшая устойчивость клинических штаммов S. Enteritidis выявлена к 5 ан тибиотикам: ампициллину, доксициклину, цефазолину, левомицетину и карбеницилли ну. При этом у микробов, проявивших наибольшую резистентность к ним, чаще других определялись следующие сочетания генетической детерминанты hlyA: hlyA+hlyB;
hlyA+sfaG;
hlyA+hlyB+sfaG;
hlyА+sfaA+sfaG. Причём, при наличии сочетания детер минант hlyA+hlyB выявлено сильное влияние, статистически значимое (2=27, F=3,2, р0,025) на устойчивость микробов к 5 вышеперечисленным антибиотикам и связь ме жду ними оказалась средней силы, тогда как в остальных случаях влияние было слабее и незначимое.
Увеличение количества фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП) в геноме клинических штаммов сальмонелл оказывало статистически значимое влияние средней силы на резистентность к цефазолину (2 =11%, F=5,4;
p0,006) и слабое - к ампициллину (2=4%, F=3,51;
p0,032), в то же время на устойчивость к доксициклину (2=4%, F=2,26;
p0,109), левомицетину (2=4%, F=2,13;
p0,124) и карбенициллину (2=5%, F=2,39;
p0,098) – оно было слабым и незначимым. Коэффициент канониче ской корреляции выявил связь средней силы (r*=0,33) между количеством генетиче ских детерминант и резистентностью к цефазолину, а к ампициллину, доксициклину, левомицетину и карбенициллину – очень слабую (r*=0,2;
0,2;
0,2;
0,22;
соответствен но).
Также установлено, что с увеличением количества ФГОП достоверно уменьша ется количество чувствительных к АБП штаммов (2=9%, F=4,84, p0,009), выявлена связь средней силы между изучаемыми признаками (r*= 0,31).
Анализ связей между фактором резистентности к АБП сальмонелл и степенью тяжести заболевания показал, что устойчивые к АБП микробы чаще встречались при тяжёлых формах сальмонеллёза - 13 (72,2%) против 5 (27,8%) - при лёгких формах. Та ким образом, можно предположить, что устойчивость к антибактериальным препаратам оказывает влияние на степень тяжести заболевания, что согласуется с мнением других авторов, рассматривающих лекарственную резистентность к АБП у сальмонелл в каче стве эпидемически значимого маркёра их патогенности [Милютина Л.Н., 1998;
Рожно ва С.Ш., 1999;
Бухарин О.В., 2000].
В ходе исследования нами выявлены достоверные различия в группах микроор ганизмов с различной устойчивостью к АБП (1 группа – к 1-3 АБП, 2 - к 4 АБП и более) (x2=7,145;
df=2;
p0,028).
Сравнение двух групп микроорганизмов с различной резистентностью к АБП, выявило, что в группе микроорганизмов, устойчивых к 1-3 антибактериальным препа ратам (n=35), сила влияния данного признака на степень тяжести сальмонеллёза была слабой, но статистически значимой (2=6%, F=3,37, p0,038, r*=0,24). Среди полирези стентных микроорганизмов (n=33), устойчивых к 4 АБП и более, выявлено сильное влияние, статистически значимое между анализируемыми признаками (2=32%, F=22,8, p0,001) и установлена корреляционная связь средней силы (r*=0,57).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что полирезистентные к АБП сальмо неллы, а именно S. Enteritidis, оказывают более выраженное влияние на тяжесть тече ния заболевания, что согласуется с данными других исследователей [Милютина Л.Н., 2008].
С «островами» патогенности связывают различные функции микробов: патоген ность, адаптация, симбиоз, деградация биополимеров, метаболизм, лекарственная ус тойчивость, секреторная функция [Бондаренко В.М., 2001;
Kaper J.B., 1999]. В этой связи можно предположить, что выявленные нами фрагменты генов «островов» пато генности (ФГОП) имеют отношение к формированию устойчивости к ряду антибиоти ков, в частности, генетические детерминанты -гемолизинов (hlyA+hlyB) - к формиро ванию устойчивости к ампициллину, цефазолину, доксициклину, левомицетину, карбе нициллину.
Связь между фенотипическими и генотипическими характеристиками культур и клиническими проявлениями сальмонеллёза в двух группах сравнения Для выяснения патогенетической роли генетических детерминант (hlyA, hlyB и sfaA, sfaG) в развитии клинических проявлений сальмонеллёза были выделены две группы пациентов. В первую группу вошли больные, от которых были изолированы сальмонеллы, несущие генетические детерминанты -гемолизинов (n=28) и во вторую группу - пациенты, от которых были выделены штаммы бактерий, несущие гены адге зинов (n=22). Установлено, что сравниваемые группы были сопоставимы по возрасту (2=4,117;
df=5;
р0,324), полу (р0,828), срокам лечения (р0,762) и по локализации поражения отделов желудочно-кишечного тракта (2=0,055;
df=1;
р0,615).
В клинических проявлениях сальмонеллёза в сравниваемых группах были выяв лены отличия. В первой группе больных заболевание начиналось остро, с выраженных проявлений интоксикации. Температура тела (38,10 - 390С) была у 36,4% человек про тив 23,5% в группе сравнения (р0,366). Их беспокоила тошнота – 39,3% против 3,6%, (p0,049), рвота – у 53,6% против 41% (p0,366), которая продолжалась в течение дней - у 73,3% пациентов против 22,2%. У 89,3% больных 1 группы наблюдался жид кий стул, что достоверно чаще, чем во второй группе – 77,3% (p0,006). У половины пациентов первой группы стул был до 10 раз за сутки и диарея проходила быстрее, в течение 7 дней.
Установлено, что секреция гемолизина у адгезированных штаммов эшерихий вызывает выделение медиаторов из полиморфноядерных лейкоцитов, участвующих в индукции воспаления, сопровождающегося, как правило, увеличением сосудистой про ницаемости [Бондаренко В.М., 1988]. Непосредственные диареегенные механизмы ге молизинов не до конца ясны. Но показано наличие у -гемолитических E. coli, выде ленных при диарее, в 0,6% присутствие гена hly и в 1,1% - сочетание генов hly и cnf (кодирующий цитотоксический некротизирующий фактор 1).
Инфекционно – воспалительный тип диареи был воспроизведен на модели изо лированной петли кишечника кролика при инфицировании штаммами бактерий, со держащими ген hly, и продемонстрировано, что гемолизин способен провоцировать диарею, по мнению авторов, через образование каналов в мембране энтероцитов. Кана лы нарушают ионное равновесие в клетке, увеличивается внутриклеточный Ca2+, обра зуются метаболиты арахидоновой кислоты, которые нарушают секрецию ионов и фор мируют воспалительную реакцию [Elliott S.J. et al., 1998]. Есть исследования, в которых показано тесное сцепление hly-генов с детерминантами, контролирующими синтез маннозорезистентных адгезинов [Бондаренко В.М., 1988]. Можно предположить, что у исследованных нами пациентов, от которых были изолированы сальмонеллы, несущие фрагменты генов «островов» патогенности, кодирующие гемолизины (hly), наблюдался воспалительный тип диареи.
В отличие от первой группы, клиника заболевания у больных второй группы от личалась более выраженным поражением желудочно-кишечного тракта, что и опреде ляло степень тяжести сальмонеллеза. В этой группе было больше пациентов с тяжелым течением болезни – 27,3% против 10,7% в 1 группе (р0,166). Больных чаще беспокои ли боли в животе - в 68,2% случаев против 50% (р0,203), и у большего количества па циентов (66,7% против 26,7%) была продолжительная рвота до 7 дней (p0,007).
Обильная диарея, до 20 раз в сутки и более, встречалась чаще у этой группы больных – у 27,3% против 11,1% (p0,168), стул был и более продолжительным, более 7 дней, - у половины (50%) пациентов против 28,6% в первой группе (p0,140). Из патологических примесей в кале чаще обнаруживалась слизь - в 40,9% случаев против 25% в группе сравнения (p0,269), примесь зелени - в 36,4% случаев против 10,7% (p0,034), а при месь крови в кале выявлялась только у больных 2 группы - в 18,2% случаев.
Во второй группе чаще встречались осложнения заболевания (3-13,6%) в виде инфекционно–токсического и гиповолемического шока, чем в первой (1-3,6%) (p0,005). Можно предположить, что в организме больных второй группы, от которых были изолированы сальмонеллы, несущие генетические детерминанты, кодирующие адгезины, развивается более выраженный воспалительный процесс. Полученные ре зультаты согласуются с исследованиями, где показано, что штаммы, экспрессирующие S фимбрии, высоковирулентны в моделях на животных [Finlay B.B., 1997].
Исследования периферической крови в динамике болезни в группах сравнения показали, что количество лейкоцитов у больных 2 группы при поступлении в стационар было больше, чем у больных 1 группы (p0,05), в динамике болезни показатели лейко цитов во второй группе пациентов статистически достоверно снизились по сравнению с острым периодом (р0,034). Это отчасти подтверждает предположение о том, что в ор ганизме пациентов 2 группы развивается более выраженный воспалительный процесс, о чём свидетельствуют и описанные выше симптомы болезни (продолжительная рвота, выраженная затяжная диарея) и воспалительные изменения в испражнениях (чаще вы являлись патологические примеси в кале в виде слизи, зелени и прожилок крови).
У больных первой группы показатели гемоглобина в динамике болезни досто верно снизились (р0,023). Полученные результаты согласуются с мнением исследова телей, которые показали, что гемолизины, вызывая гемолиз эритроцитов, обеспечивают возбудителю доступ к свободному железу Fe3+ [Cavalieri S.G., 1984]. Показатели тром боцитов в крови пациентов обеих групп в период выздоровления, после снижения в разгар болезни, достоверно возросли, но больше в 1 группе (р0,001), чем во (р0,045).
В первой группе больных, чаще, чем во второй, встречались изменения в анали зах мочи, а именно, снижение удельной плотности до 1009±1,26 к выписке из стацио нара против 1015±0,94 в острый период болезни, чаще определялся белок в моче. По лученные данные согласуются с мнением других авторов о том, что гемолизины при нимают участие во внекишечных поражениях, в том числе в поражении почек и ниж них отделов мочевыводящей системы [Cavalieri S.J., 1984].
Анализ влияния генетических детерминант hly и sfa в двух группах сравнения ( - гемолизины и 2 - адгезины) на фактор полирезистентности практически не выявил взаимосвязей между изучаемыми признаками (r*=0,10;
p0,05 и r*=0,26;
p0,05, соот ветственно). Но в первой группе (гемолизинов) количество полирезистентных (устой чивых к 4 АБП и более) штаммов достоверно значительно больше, чем во второй груп пе (адгезинов) – 11 (39,3%) против 3 (13,6%), (р 0,05).
Проведенное исследование позволяет предположить, что фрагменты генов «ост ровов» патогенности hly и sfa, кодирующие -гемолизины и адгезины, обнаруженные у клинических штаммов сальмонелл, влияют на формирование таких основных симпто мов болезни, как интоксикация, лихорадка, тошнота, рвота, боли в животе, диарея, па тологические примеси в кале и устойчивости к антибиотикам.
Таким образом, изучение связей между фенотипическими и генотипическими характеристиками культур в двух группах сравнения и клиникой сальмонеллёза выяви ло статистически значимые различия по некоторым позициям. Наличие у сальмонелл генов -гемолизинов (первая группа) и множественной устойчивости к антибактери альным препаратам определили особенности клиники и тяжесть заболевания, которые проявились выраженной интоксикацией, высокой лихорадкой, частой регистрацией тошноты, жидким стулом, изменениями в анализах крови - большей тромбоцитопенией в острый период болезни и снижением показателей гемоглобина в период выздоровле ния. В то же время, наличие генов адгезинов у возбудителей от больных второй группы определило более выраженное поражение желудочно-кишечного тракта с частыми бо лями в животе, с продолжительной рвотой и диареей, с патологическими примесями в стуле, а в анализах крови - более высокие цифры лейкоцитоза. В этой группе пациентов достоверно чаще регистрировались осложнения в виде инфекционно – токсического и гиповолемического шока (р0,05).
Полученные результаты способствуют расширению знаний о патогенезе саль монеллёзной инфекции, позволяют установить значение факторов патогенности ( гемолизинов, адгезинов, ЛПС – эндотоксинемии и антибиотикорезистентности) для оценки степени тяжести, прогнозирования особенностей течения болезни и повышения эффективности терапии гастроинтестинальной формы сальмонеллёза.
ВЫВОДЫ 1. Установлена взаимосвязь между выявленными фрагментами генов «островов» патогенности (hlyA, hlyB, sfaA и sfaG), ассоциируемых с патогенностью E. coli, у кли нических штаммов сальмонелл, с особенностями и тяжестью течения болезни, анти биотикорезистентностью возбудителя, определена липополисахарид-эндотоксинемия в динамике, что в совокупности может быть использовано в качестве критериев оценки тяжести и прогноза заболевания.
2. Среди пациентов, госпитализированных в инфекционный стационар с диагно зом «острая кишечная инфекция», в 37,1% случаев подтверждался сальмонеллез. Забо левание чаще регистрировалось у лиц молодого возраста – до 40 лет (66,7%), женского пола (61%). Клинически заболевание протекало в гастроинтестинальной форме с пре обладанием гастроэнтеритического варианта сальмонеллеза (83%), среднетяжёлой формы (60%). Специфические осложнения развивались в 10,8% случаев.
3. Уровни липополисахаридов в крови больных сальмонеллёзом среднетяжёлой формы в двух возрастных группах (от 18 до 50 лет и от 50 лет и старше) повышаются в динамике болезни – в 1,8 и 2,7 раза (в третьей по сравнению с первой сывороткой), со ответственно, что отражает особенности клинического течения заболевания, коррели рует c показателями периферической крови в виде сегментоядерного нейтрофилеза (р0,001) в острый период болезни в первой группе и более выраженной тромбоцито пении (р0,043) во второй группе пациентов.
4. Клинические штаммы S. Enteritidis в 97,1% случаев содержали фрагменты ге нов «островов» патогенности (hlyA, hlyB, sfaA и sfaG), ассоциируемые с патогенностью E. coli. Генетические детерминанты «островов» патогенности встречались в отдельно сти и различных комбинациях по 2, 3 и 4, общим числом 190. Увеличение их количест ва в геноме у клинических штаммов сальмонелл, а также наличие генетической детер минанты hlyB и генов группы гемолизинов, как в отдельности, так и в сочетании с дру гими генетическими детерминантами, коррелируют с тяжестью заболевания.
5. 66,7% клинических штаммов сальмонелл резистентны, из которых 48,5% - по лирезистентны к 13 антибактериальным препаратам. Множественная устойчивость возбудителей к антибактериальным препаратам оказывает достоверно сильное влияние на степень тяжести сальмонеллёза (2=32%, р0,001), а наличие у них сочетания гене тических детерминант hlyA+hlyB - статистически значимое сильное влияние на рези стентность к ампициллину, доксициклину, цефазолину, левомицетину и карбеницилли ну (2=27%, F=3,2, p0,024, r*=0,52). Увеличение количества различных фрагментов генов «островов» патогенности в геноме S. Enteritidis коррелирует с резистентностью к цефазолину (p0,006), ампициллину (p0,032) и уменьшением количества чувствительных к антибактери альным препаратам сальмонелл (p0,009).
6. Наличие у клинических штаммов сальмонелл фрагментов генов «островов» патогенности, кодирующих -гемолизины (hlyА и hlyB), сочетается с полирезистентно стью к антибактериальным препаратам (p0,05), выраженностью у пациентов синдрома интоксикации, тромбоцитопенией в острой стадии болезни (p0,001) и снижением уровня гемоглобина крови в реконвалесцентном периоде (p0,023), тогда как наличие фрагментов генов «островов» патогенности адгезинов (sfaA и sfaG) - с более тяжелым кишечным синдромом, лейкоцитозом в начале заболевания (p0,034) и более частыми осложнениями в виде инфекционно-токсического и гиповолемического шока (p0,05).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для оценки патогенного потенциала сальмонелл, тяжести, особенностей тече ния и прогноза заболевания, помимо общепринятых методов исследования, целесооб разно определение фрагментов генов «островов» патогенности - hlyA, hlyB, sfaA и sfaG молекулярно – генетическим методом ПЦР.
2. Выявленное влияние увеличения количества фрагментов генов «островов» па тогенности в геноме S. Enteritidis и фактора полирезистентности к антибиотикам на степень тяжести сальмонеллеза определяют тактику лечения (необходимость назначе ния антибиотиков широкого спектра действия и проведения интенсивной дезинтокси кационной терапии).
3. Учитывая полученные нами данные о нарастающей в динамике болезни липо полисахарид - эндотоксинемии, необходимо включать в схемы лечения больных саль монеллезом средства, снижающие уровень интоксикации (сорбенты, дезинтоксикаци онная терапия).
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Особенности современного сальмонеллеза / Р.Г. Назмутдинова, Р.Т. Мурзабаева, Д.А. Валишин [и др.] // Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и эксперименте: сборник научных трудов 13 Российской научно–практической конференции. – Махачкала, 2008. - С. 85-88.
2. Мурзабаева, Р.Т. Генетические маркеры патогенности возбудителя и клиниче ские проявления сальмонеллеза / Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова., А.Р. Мав зютов // Инфекционные болезни. - 2009. - Т. 7, прил. 1: Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - С. 147-148.
3. Мурзабаева, Р.Т Генетические маркеры патогенности и их взаимосвязь с анти биотикорезистентностью выделенных сальмонелл у взрослых / Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова, А.Р. Мавзютов // Инфекционные болезни. - 2009. - Т. 7, прил.
1: Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болез ням. - С. 148.
4. Генетические маркеры патогенности и влияние биологических свойств возбуди теля на клинические проявления сальмонеллеза у взрослых / Р.Г. Назмутдинова, Р.Т. Мурзабаева, А.Р. Мавзютов [и др.] // Актуальные вопросы клинической ме дицины: инфекционных и неинфекционных болезней в клинике и эксперименте:
сборник научных трудов 14 Российской научно-практической конференции. – Махачкала, 2009. - Т. 1. - С. 123-127.
5. Сравнительная характеристика острых кишечных инфекций различной этиоло гии / Д.А. Валишин, Р.Т. Мурзабаева, А.П. Мамон, Н.В. Антонова, Д.Н. Дубров ская, Р.Г. Назмутдинова // Актуальные вопросы клинической медицины: инфек ционных и неинфекционных болезней в клинике и эксперименте: сборник науч ных трудов 14 Российской научно-практической конференции. – Махачкала, 2009. - Т. 1. - С. 114-118.
6. Мавзютов, А.Р. Генетические механизмы биоразнообразия Salmonella Enteritidis и клинические особенности сальмонеллёза / А.Р. Мавзютов, Р.Т. Мурзабаева, Р.Г.
Назмутдинова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2010. - № 5. – С. 70-73.
7. Генетические маркёры патогенности Salmonella spp. и антибиотикорезистент ность / И.А. Мирсаяпова, Р.Г. Назмутдинова, А.Р. Мавзютов, Р.Т. Мурзабаева // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2010. - Т. 12, № 2, прил. 1. - С. 39.
8. Клинико-генетические параллели при сальмонеллезе у взрослых / Р.Т. Мурзабае ва, А.Р. Мавзютов, Р.Г. Назмутдинова, И.А. Мирсаяпова // Инфекционные болез ни. - 2010. – Т. 8, прил. 1: Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – С. 214.
9. Генетические маркеры патогенности Salmonella spp. и клинические особенности сальмонеллеза у взрослых / А.Р. Мавзютов, Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова, И.А. Мирсаяпова // Инфекционные болезни. - 2010. – Т. 8, прил. 1: Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – С. 182 183.
10. Мурзабаева, Р.Т. Клинико-патогенетическое значение определения липополиса харид-эндотоксинемии при сальмонеллезе / Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова, А.Р. Мавзютов // Инфекционные болезни. - 2011. - Т. 9, прил. 1: Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – С. 254 255.
11. Характер изменений уровня липополисахарид-связывающего белка при различ ных инфекционных процессах и дисбиозах / А.Р. Мавзютов, Г.А. Мавзютова, К.М. Бондаренко, С.Е. Сендерович, Р.Г. Назмутдинова [и др.] // Журнал микро биологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2011. - № 2. – С. 66–72.
12. Назмутдинова, Р.Г. Взаимосвязь генетических маркеров патогенности S. Enteriti dis c антибиотикорезистентностью культур и особенностями течения заболевания / Р.Г. Назмутдинова, Р.Т. Мурзабаева, А.Р. Мавзютов // Медицинский вестник Башкортостана. – 2011. - № 5. – С. 15-17.