Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому с6
На правах рукописи
ШЕИН Сергей Александрович Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому С6 03.01.04 – Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии имени В.П.
Сербского» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Чехонин Владимир Павлович доктор медицинских наук, Гурина Ольга Ивановна
Официальные оппоненты:
Барышников Анатолий Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, директор Ипатова Ольга Михайловна, доктор биологических наук, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав.
отделом Ведущее учреждение:
ФГБУН «Научно-исследовательский институт физико химической медицины Федерального медико биологического агентства»
Защита состоится « 13 » декабря 2012 г. в 1100 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.010.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр.8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН Автореферат разослан «_» ноября 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Карпова Е.А.
кандидат химических наук Актуальность Мультиформная глиобластома – наиболее агрессивная из первичных злокачествен ных опухолей головного мозга, средняя выживаемость, при которой составляет около года после постановки диагноза [Norden A.D. et al., 2009]. На сегодняшний день не суще ствует эффективных методов лечения данного заболевания. В связи с чем, активно идет поиск и изучение опухоль-ассоциированных антигенов. Прогрессирование солидных опу холей во многом зависит от степени васкуляризации и ангиогенеза в малигнизированной ткани [Folkman J., 2006, Jain R.K. et al., 2007]. Из целого спектра проангиогенных факто ров наиболее важным является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), который играет ключевую роль в физиологическом и патологическом ангиогенезе [Ferrara N. et al., 2003, Ferrara N., 2004]. Кроме того, повышенный уровень экспрессии VEGF выявлен в различ ных типах опухолей, в частности в глиомах III-IV степени злокачественности [Schmidt N.O. et al, 1999, Samoto K. et al., 1995, Plate K.H.,.1999], поэтому этот фактор может рас сматриваться как перспективная молекулярная мишень, для транспорта контейнерных си стем в опухоли мозга. Кроме того, подавление функций VEGF приводит к регрессии нео пластических сосудов [Jain R.K., 2001, Jain R.K., 2005] и может сдерживать рост опухоли [Borgstrom P. et al., 1999, Kim K.J. et al., 1993].
Тем не менее, на сегодняшний день существуют противоречивые данные относи тельно эффективности применения бевацизумаба при опухолях мозга, и целесообразность такого подхода остается спорной [Norden A.D. et al., 2009, Miletic H. et al., 2009, Bergers G., Hanahan D., 2008, Keunen O. et al., 2011, Chi A.S. et al., 2009, Lakka S.S., Rao J.S., 2008].
Так продемонстрирована значительная активация инвазии и инфильтрации опухолевых клеток в паренхиму мозга при антиангиогенной терапии [Lucio-Eterovic A.K. et al, 2009, Paez-Ribes M. et al., 2009, Ebos J.M. et al., 2009, Sakariassen P.O. et al., 2006, Keunen O. et al., 2011, Bikfalvi A. et al., 2011]. Стоит отметить, что большинство исследований противо опухолевых эффектов бевацизумаба проводили на подкожных моделях, в то время как ра бот на интракраниальных моделях недостаточно. В связи с чем, есть очевидная необходи мость изучить целесообразность антиангиогенной терапии на ортотопической (т.е. интра краниальной) аллогенной модели высокоагрессивной глиомы C6 и продолжить разработ ку новых подходов направленного транспорта лекарств в опухолевую ткань. Один, из ко торых основывается на поиске привлекательной опухоль ассоциированной мишени и со здании высокоселективной наноконтейнерной системы векторного типа, для доставки в опухоли мозга терапевтических и диагностических агентов.
Несмотря на то, что значительная часть злокачественных новообразований в высо кой степени экспрессирует VEGF и этот белок является перспективной мишенью для ад ресной доставки контейнерных систем или наночастиц [Yoncheva K., Momekov G., 2011], возможность применения анти-VEGF антител в качестве молекулярного вектора изучена недостаточно. В 2010 г было показано, что бевацизумаб повышает клеточный захват и се лективное накопление катионизированных липосом в культуре in vitro [Kuesters G.M., Campbell R.B., 2010]. Такой подход особенно перспективен для высокоселективной до ставки контейнерных систем, с диагностическими и терапевтическими агентами, в очаги неконтролируемого ангиогенеза, в том числе в опухоли головного мозга через патологи чески измененный гемато-энцефалический барьер [Caraglia M. et al. 2012, Chekhonin V.P.
et al., 2012]. Однако, вопрос о возможности применения VEGF в качестве мишени и мо ноклональных анти-VEGF антител в роли вектора для направленного транспорта нано размерных систем в опухоли мозга in vivo остается открытым. Таким образом, создание селективных векторных систем для адресной доставки на основе анти VEGF антител яв ляется актуальной задачей современной биохимии и нейроонкологии.
Цель работы: изучить перспективы применения и разработать высокоселективную наноконтейнерную систему на основе моноклональных анти-VEGF антител для направ ленного транспорта диагностических и терапевтических агентов в глиомы in vivo.
Задачи:
1. Изучить перспективу применения антигена VEGF, в качестве молекулярной ми шени, и моноклональных анти-VEGF антител, в качестве вектора, для направленного транспорта наноразмерных систем в опухоли мозга.
2. Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к рекомби нантному VEGF. Провести иммунохимическую характеристику полученных антител.
3. Оценить эффективность терапии моноклональными антителами к VEGF на ин тракраниальной аллогенной модели С6 глиомы.
4. Исследовать накопление векторных наночастиц оксида железа на основе мо ноклональных анти-VEGF антител в глиоме методом МРТ при системном введении.
5. Оценить селективность накопления векторных липосомальных систем на основе моноклональных анти-VEGF антител в опухолевых клетках при системном введении.
Научная новизна:
1. Показано, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела при внутри венном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 накапливаются в опухолевой ткани.
2. Впервые in vivo на интракраниальной модели глиомы показано, что полученные анти-VEGF антитела, конъюгированные с липосомами и магнитными наночастицами зна чительно повышают уровень их накопления в опухолевой ткани.
3. Показано, что анти-VEGF антитела могут использоваться в качестве высокосе лективного вектора для направленной доставки наноразмерных систем в злокачественные новообразования центральной нервной системы.
4. Впервые in vivo на интракраниальной модели глиомы показано, что липосомы конъюгированные с моноклональными анти-VEGF антителами при системном введении селективно накапливаются и захватываются опухолевыми клетками.
Практическая значимость.
Разработана векторная липосомальная контейнерная система на основе монокло нальных анти-VEGF антител, которая способна селективно доставлять в глиомы диагно стические и лекарственные препараты. Полученные результаты вносят реальный вклад в исследования направленной доставки контейнерных систем в клетки мишени, что позво лит значительно повысить эффективность диагностики и терапии онкологических заболе ваний, в том числе высокоагрессивных новообразований головного мозга.
Апробация диссертационной работы Основные положения диссертационной работы были представлены на межлабора торных конференциях ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского», Москва, 2010-2012;
Меж дународной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых уче ных, Москва, 2011-2012.
Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научно практической конференции коллектива сотрудников кафедры и Отдела медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета ГБОУ ВПО Российского Нацио нального Исследовательского Медицинского Университета имени Н.И. Пирогова Мин здравсоцразвития России и сотрудников Отдела фундаментальной и прикладной нейро биологии ФГБУ ГНЦ Социальной и Судебной Психиатрии имени В.П. Сербского 28 июня 2012 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них четыре – статьи в журналах рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, вы водов и библиографического указателя. Работа изложена на 124 машинописных страни цах, содержит 4 таблицы и 43 рисунка. Список литературы включает 6 отечественных и 221 иностранных источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы.
Получение моноклональных анти-VEGF антител. Рекомбинантный VEGF- для иммунизации был получен и любезно предоставлен для исследований А.В. Леопольд [Леопольд А.В. и др., 2011]. Самок мышей линии Balb/C подкожно иммунизировали ре комбинантным очищенным препаратом VEGF-164 крысы (25 мкг) с полным адъювантом Фрейнда («Difco laboratories», США). Иммунизация состояла из трех циклов: три подкож ных иммунизации и заключительное бустерное введение препарата (100 мкг).
Получение гибридом проводили по методике Khler G. и Milstein C. в нашей моди фикации [Чехонин В.П. и др., 2001]. Слияние спленоцитов иммунизированной мыши с клетками миеломной культуры Sp2/0-Ag14 осуществляли с помощью раствора полиэти ленгликоль/диметилсульфоксид. Скрининг гибридных клеток продуцирующих анти VEGF антитела проводили параллельно несколькими методами трехкратно: твердофаз ным иммуноферментным анализом (ELISA), иммуноцитохимическим анализом (ИЦХ), иммуногистохимическим анализом (ИГХ) и иммуноблотингом. Для положительного кон троля использовали коммерческие анти-VEGF антитела (10 мкг/мл, ab1316 «Abcam», США). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические иммуногло булины мыши в эквивалентной концентрации. Первичные антитела проявляли козьими антителами к F(ab)2 фрагментам иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с перок сидазой хрена и предабсорбированными сывороткой крысы (А3682, «Sigma», США). Им мунофлуоресцентный анализ проводили с козьими антимышиными антителами конъюги рованными с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США) в разведении 1:1000, ядра клеток до крашивали DAPI («Invitrogen», США). Моноклональные антитела выделяли из асцита ме тодом аффинной хроматографии на протеин A-агарозе («Invitrogen», США). Для получе ния первично меченных флуорохромом моноклональных анти-VEGF антител и неспеци фических IgG использовали набор Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit («Invitrogen», США).
Константа аффинности. Аффинность полученных моноклональных антител к VEGF определяли методом ИФА, путем расчета константы гетерофазного равновесия об разования комплексов антиген-антитело [Beatty J.D. et al., 1987].
Wound-healing тест. Исследование биологической активности анти-VEGF антител in vitro проводили на клетках культуры C6. Для этого нарушали клеточный монослой и добавляли анти-VEGF антитела (2 мкг/мл), в качестве контроля вносили неспецифические IgG (2 мкг/мл). Через 9 ч регистрировали степень восстановления монослоя в месте по вреждения. Площадь свободной области определяли в программе «Leica LAS AF» и рас считывали процент оставшейся свободной области через 9 ч относительно первоначаль ной. Расчеты, построение диаграмм и статистический анализ проводили в программе «Microsoft Excel 2010».
Антиангиогенная терапия С6 глиомы. Интракраниальную опухоль моделирова ли на беспородных крысах с помощью внутримозговой стереотаксической имплантации клеток глиомы С6 [Чехонин В.П. и др., 2007]. Антиангиогенную терапию проводили очи щенными моноклональными антителами на модели интракраниальной глиомы C6. Пер вый этап эксперимента проводили на 9 животных с введением: анти-VEGF антител (n=4), неспецифических IgG (n=2) и PBS (n=3). Все препараты антител вводили в бедренную ве ну на 5, 12 и 19 сутки после имплантации глиомы в концентрации 3 мг/кг. Второй этап проводили на 14 животных с введением: анти-VEGF антител (n=4), препарата бевацизу маб («Hoffmann-La Roche», Швейцария) (n=4), неспецифических IgG (n=3) и раствор PBS (n=3). Все препараты вводили в бедренную вену по следующей схеме: на 2, 9 и 16 сутки после имплантации в концентрации 10 мг/кг. Анализ выживания проводили по методу Каплана-Мейера, обрабатывали результаты в программе «Statistics 7.0».
Магнитно резонансная томография. Исследование накопления магнитных нано частиц, которые были получены и любезно предоставлены для исследований М.А. Абаку мовым [Абакумов М.А. и др., 2011, Абакумов М.А. и др., 2012] проводили на томографе Clinscan 7Т («Bruker», Германия) с постоянным магнитным полем 7 Тл. Для визуализации глиомы животным вводили внутривенно раствор наночастиц, конъюгированных с антите лами к VEGF, а также с антителами к Сх43. Введнная доза наночастиц, в пересчте на концентрацию железа, составляла 10 мг/кг. МРТ-сканирование проводили в режиме SWI (табл. 1).
Таблица 1. Параметры режима SWI, используемого для диагностики глиомы С6 с помощью магнитных наночастиц.
Время Параметры Время Кол-во Толщина Параметры Время иссле повтора Тип поля сним эхо повторов среза матрицы дования импульса ка 320* 33 мс 19 мс 0,5 мм 45*32 мм 1 3D 2: пикселей Синтез липосом. В качестве контейнерной системы были использованы липосо мы, которые готовили по следующей схеме: смешивали 3,75 мл пальмитоилолеилфосфа тидилхолина (РС, 10 мг/мл), 10 мг холестерина, 210 мкл 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3 фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевой соли (DSPE ПЭГ2000, 50 мг/мл), 40 мкл 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N [малеимид(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевой соли (DSPE-ПЭГ-малеимида, 10 мг/мл) и 37 мкл диметилдиоктодециламония бромида (DDAB, 10 мг/мл) в смеси хлороформа и метанола (3:1 по объему) [Perrie Y. et al., 2001, Shi N., Pardridge W.M., 2000]. Все липиды были приобретены в фирме «Avanti Polar Lipids», США. Полученную смесь помещали в роторный испаритель и сушили в течение 2 часов в атмосфере аргона при температуре 40 С и скорости вращения ротора 180 об/мин. Сухой остаток растворяли в 1 мл циклогек сана, замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение 5 часов. После лиофи лизации к липидной пленке добавляли 2 мл PBS и образующуюся эмульсию обрабатывали ультразвуком, после чего подвергали 5 циклам замораживания (в жидком азоте) – размо раживания (водяная баня, 40 С) и последовательно экструдировали через поликарбонат ные мембраны с размерами пор 400 и 200 нм («Avanti Polar Lipids, Inc», США). В качестве флуоресцентной метки добавляли 0,1% (1,1’-октадецил 3,3,3’,3 Dil тетраметилиндокарбоцианин перхлорат).
Конъюгация антител с липосомами. Раствор антител (4 мг в 1 мл 0,1 М боратно го буфера, содержащего 5 мМ ЭДТА) в течение часа инкубировали с 10-кратным моляр ным избытком 2-иминотиолана (реагент Траута, 40 мкг). Активированные антитела сме шивали со свежеприготовленными липосомами в соотношении: 4 мг антител на мкмоль РС (PBS, рН 7.4), полученную смесь инкубировали в течение ночи при 4оС. Им мунолипосомы отделяли от остальных компонентов реакционной смеси и несвязанных моноклональных антител с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке с сефарозой CL-4B, уравновешенной PBS буфером (0,5 мл/мин). Полученные векторные липосомы концентрировали на фильтрах с пределом пропускания 30 кДа («Millipore», США) при 1000 g до 4 мл.
Оценка накопления липосом in vitro. Эксперимент по захвату липосом in vitro проводили на фиксированных клетках глиомы C6 и глиобластомы U-87 MG человека. Го товили последовательные разведения анти-VEGF иммунолипосом (1:50-400) в полной ро стовой среде RPMI-1640 и вносили к клеткам. В качестве контроля использовали немоди фицированные липосомы и липосомы конъюгированные с неспецифическими IgG. Клетки инкубировали в течение 2-3 часов при 37°С, после чего трехкратно отмывали PBS без де тергентов.
Оценка накопления липосом in vivo. Исследование проводили на крысах с интра краниальной глиомой C6. Липосомы синтезировали за 3 дня до введения (50 мкмоль РС, 25 мкмоль холестерина на 6 животных). Перед введением препараты нормировали по по глощению флуорохрома Dil на спектрофотометре U-2800 («Hitachi», Япония) на длине волны 550 нм. Иммунохимическую активность подтверждали в ELISA. На 20 сутки разви тия опухоли векторные липосомы вводили в бедренную вену в объеме 500 мкл (на одно животное: 5 мкмоль пальмитоилолеилфосфатидилхолина, 2,5 мкмоль холестерина и 2, нмоль антител). Первой группе вводили липосомы конъюгированные с анти-VEGF анти телами (n=3), второй – липосомы конъюгированные с неспецифическими IgG (n=2) и ли посомы без векторных групп (n=2). Через двое суток проводили перфузию внутренних органов и извлекали головной мозг, который в течение суток выдерживали в 4% растворе параформальдегида. Срезы мозга докрашивали кроличьими поликлональными анти-GFAP антителами (1:400 в PBS без детергента). Визуализацию накопления проводили на инвер тированном флуоресцентном микроскопе DMI 6000 («Leica», Германия) и лазерном кон фокальном сканирующем микроскопе A1R MP («Nikon», Япония).
Результаты и обсуждения.
Иммуноблотинг Для подтверждения иммунохимической специфичности полученных антител по отношению к антигену VEGF, был проведен иммуноблотинг.
Рис. 1. Результаты иммуноблотинга антител к VEGF с рекомбинантным и на тивным антигеном. А – проявление очищенным препаратом полученных моноклональ ных анти-VEGF антител. Б – проявление коммерческими антителами к VEGF ab («Abcam», США). 1 – очищенный препарат рекомбинантного thioredoxin/VEGF-164 кДа. 2 – лизат клеток E. coli без генетической конструкции с последовательностью VEGF.
3 – лизат клеток С6 глиомы крысы. 4 – лизат нормальных астроцитов крысы.
Референсные антитела интенсивно проявляли рекомбинантный VEGF 37 кДа (Б-1, рис. 1), в то время как нативный антиген распознавали значительно слабее: мономер VEGF ~24 кДа (Б-3, рис. 1) и димер VEGF ~48 кДа (Б-4, рис. 1). Полученные монокло нальные антитела, в данной постановке эксперимента, практически не проявляли бэнд ре комбинантного VEGF 37 кДа (А-1, рис. 1), но распознавали нативный мономер VEGF ~ кДа (А-3, рис. 1) и выраженно визуализировали нативный димер VEGF ~48 кДа (А-3 и А 4, рис. 1). Результаты сравнительного анализа свидетельствуют о том, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела более аффинно связывают нативный димер VEGF.
В то же время, коммерческие антитела в большей степени проявляли иммунохимическую активность с рекомбинантным VEGF.
Рис. 2. Результаты иммуноблотинга антител к VEGF с рекомбинантным антиге ном. 1 – маркер молекулярной массы. 2, 3 – очищенный рекомбинантный thioredoxin/VEGF 164 37 кДа, предварительно нагретый до 95°С. и – очищенный рекомбинантный thioredoxin/VEGF-164 37 кДа, внесенный в гель без нагревания. 2, 5 – проявление очищенным препаратом полученных моноклональных анти VEGF антител. 3, 4 – проявление коммерчески ми антителами к VEGF («Sigma», США).
Дальнейшая иммунохимическая характеристика включала идентификацию связы вания антител с рекомбинантным антигеном. Коммерческие антитела («Sigma», США) распознавали рекомбинантный VEGF с молекулярной массой 37 кДа, и в тоже время, про являли бэнды с большей молекулярной массой ~75 и 80 кДа (4, рис. 2). Что свидетель ствует о присутствие в белковом препарате димерных форм рекомбинантного VEGF, ко торые связаны ковалентно через дисульфидный мостик. Анализируемые антитела визуа лизировали высокомолекулярные димеры VEGF ~75 и 80 кДа (5, рис. 2) и мономер VEGF 37 кДа (2, рис. 2).
Серия иммуноблотингов позволила провести иммунохимическую идентификацию моноклональных антител. Эти результаты позволяют предполагать, что полученные нами моноклональные антитела к VEGF специфично распознают как рекомбинантный, так и нативный VEGF, но преимущественно взаимодействуют с нативным димером VEGF.
Константа аффинности антител Константа диссоциации составила 6,99 ± 0,7810-9 M и константа аффинности – 1,37±0,15108 M-1. Однако, следует учитывать ряд важных факторов. Во-первых, аффин ность определялась к рекомбинантному антигену VEGF. Во-вторых, вследствие возмож ных конформационных изменений, при сорбции VEGF на поверхности полистирола, а также поверхностных эффектов, константа гетерофазного равновесия может отличаться от константы равновесия в растворе с нативным VEGF. Кроме того, очищенные монокло нальные антитела к VEGF содержат примесь эндогенных мышиных иммуноглобулинов G, что также искажает расчетную константу аффинности на 5-10%.
По результатам изотипирования, полученные моноклональные иммуноглобулины принадлежат к классу G2a.
Иммуноцитохимический анализ Рис. 3. Иммунофлуоресцентный анализ моноклональных антител к VEGF на фиксированных клетках С6 глиомы крысы. A, B – визуализация полученными мо ноклональными анти-VEGF антителами. С – отрицательный контроль, неспецифические иммуноглобулины мыши. D – коммерческие антитела к VEGF ab1316 («Abcam», США).
Анти-VEGF антитела проявляли антимышиными иммуноглобулинами конъюгированны ми с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).
В иммуноцитохимическом анализе на клетках культуры C6 глиомы крысы полу ченные антитела к VEGF ярко окрашивали цитоплазму практически всех клеток (A и B рис. 3). При этом наиболее интенсивно визуализировалась зона эндоплазмы (околоядер ное пространство). Полученные результаты соответствуют общепринятым данным, по скольку VEGF секретируемый белок, его синтез происходит в эндоплазматическом рети кулуме, откуда в секреторных везикулах экспортные белки транспортируются в направле нии цитоплазматической мембраны. Коммерческие антитела к VEGF идентично окраши вали клетки: ярко визуализировали околоядерное пространство и слабее область экто плазмы (D, рис. 3). В отрицательном контроле специфической флуоресценции не наблю далось (C, рис. 3).
Рис. 4. Иммунофлуоресцентный анализ моноклональных антител к VEGF на фиксированных клетках культуры HUVEC человека. A, B – визуализация получен ными моноклональными анти-VEGF антителами. С, D – коммерческие антитела к VEGF ab1316 («Abcam», США). Анти-VEGF антитела проявляли антимышиными иммуноглобу линами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).
Сравнительный анализ полученных (A и B, рис. 4) и референсных антител (C и D, рис. 4) на клетках культуры человеческих эндотелиоцитов HUVEC показал полную иден тичность субклеточной локализации. Анти-VEGF антитела интенсивно окрашивали ком партменты ЭПР в зоне перинуклеарного пространства, в то время как по периферии цито плазмы визуализировались гранулярные структуры, выстраивающиеся вдоль тяжей цито скелета. На представленных микрофотографиях хорошо видно, что для клеток HUVEC характерна своя уникальная картина окрашивания, которую воспроизвели полученные нами антитела.
По результатам комплексного иммуноцитохимического анализа и сопоставления иммунофлуоресцентной картины можно сделать вывод, что полученные антитела специ фично визуализируют цитоплазматический пул нативного VEGF на клеточных препара тах. Это подтверждает наши выводы, сделанные на основании анализа результатов имму ноблот анализа, о том, что полученные антитела с большей аффинностью связывают на тивный димер VEGF. Это особенно важно для направленной терапии, поскольку антитела будут селективно распознавать и связывать биологически активный VEGF. Кроме того, было убедительно продемонстрировано, что VEGF экспрессируется глиомными клетками.
Иммуногистохимический анализ глиомы C6 крысы.
Рис. 5. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мозга крысы с глиомой С6 моноклональными анти-VEGF антителами. A – визуализация глиомных клеток и VEGF-позитивных астроцитов в периопухолевом пространстве. B – визуализация клеток опухолевой ткани. С – визуализация VEGF-позитивных реактивных астроцитов. D – отри цательный контроль, неспецифические иммуноглобулины. Анти-VEGF антитела проявля ли антимышиными иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).
На следующем этапе был проведен иммуногистохимический анализ глиомных кле ток C6 в процессе интракраниального развития опухоли. Полученные моноклональные антитела интенсивно окрашивали глиомные клетки (A и B, рис. 5). Локализация флуорес ценции, соответствующая иммунофлуоресцентному окрашиванию анти-VEGF антитела ми, строго совпадала с опухолевым очагом, в то время как интактная ткань оставалась темной. Что свидетельствует о высоком уровне экспрессии VEGF глиомными клетками, не только в культуре in vitro, но и в процессе роста и развития опухоли in vivo.
На границе глиомы и паренхимы нервной ткани, в зоне астроглиоза, присутствуют ярко окрашенные клетки звездчатой морфологии – VEGF-позитивные реактивные астро циты (С, рис. 5). Феномен реактивного астроглиоза при повреждениях нервной ткани хо рошо известен [Salhia B. et al., 2000]. В отрицательном контроле, при окрашивании неспе цифическими мышиными иммуноглобулинами, ни в опухолевой, ни в нормальной ткани флуоресценции не наблюдалось (D, рис. 5).
Результатам проведенного иммуногистохимического анализа позволяют сделать следующие выводы. Полученные моноклональные анти-VEGF антитела иммунохимиче ски специфичны к VEGF, селективно визуализируя на срезах мозга VEGF-позитивные структуры. Выраженно окрашивается опухолевая ткань и отдельные реактивные астроци ты в перитуморальном пространстве, а также микрососуды в паренхиме нервной ткани.
Представленные результаты соответствуют существующим данным иммуногистохимиче ского окрашивания нервной ткани антителами к VEGF [Ogunshola O.O. et al., 2000]. Стоит отметить, что большинство глиомных клеток были VEGF-позитивны. Это свидетельствует в пользу того, что VEGF является опухоль ассоциированным белком, синтез которого зна чительно повышается в малигнизированной ткани.
Исследование биологической активности антител in vitro Хорошо известно, что антитела к VEGF предотвращают активацию рецепторов VEGFR и трансдукцию сигнала [Wedam S.B. et al., 2000], ингибируя пролиферацию и ми грацию клеток. В связи с чем, целью нашего эксперимента было изучение влияния анти тел к VEGF на рост клеток глиомы C6 in vitro.
Моноклональные антитела к VEGF в концентрации 2 мкг/мл замедляли восстанов ления монослоя клеток глиомы С6. В контроле с неспецифическими иммуноглобулинами в эквивалентной концентрации зона повреждения монослоя заполнялась мигрирующими клетками.
60 Неспец иммуно 2 мкг/м % Анти-VE 20 37 антител Рис. 6. Площадь повреждения монослоя клеток С6 глиомы в процентах через 9 ча сов. По оси ординат процент оставшейся площади повреждения относительно первона чальной площади повреждения. Синий столбец – неспецифические иммуноглобулины Площадь повреждения монослоя через мкг/мл, через 9 ч сохраняется только 37±2,9% свободной площади, повреждение практи 9 часов чески зарастает (n=3, S=2,9). Красный столбец – моноклональные анти-VEGF антитела мкг/мл, через 9 ч сохраняется 68±7,5% свободной площади, ингибирование восстановле ния монослоя в 1,8 раз (n=3, S=7,5, p0,05).
В случае анти-VEGF антител монослой восстанавливался медленно, через 9 ч ин кубации среднее значение площади, свободной от клеток глиомы, составило 68±7,5% от первоначальной площади (рис. 6). Тогда как с неспецифическими IgG площадь поврежде ния восстанавливалась и заполнялась клетками значительно быстрее: через 9 ч оставалось лишь 37±2,9% свободной площади. Таким образом, достоверно показано (p0,05), что мо ноклональные анти-VEGF антитела ингибируют восстановление клеточного монослоя in vitro.
Оценка накопления меченных антител в опухоли in vivo На следующем этапе важно было исследовать возможность использования полу ченных антител в направленной терапии опухолей мозга или адресной доставке лекарств.
Для этого моноклональные антитела к VEGF, конъюгированные с флуорохромом, внутри венно вводили крысам с имплантированной глиомой С6.
Рис. 7. Флуоресцентный анализ накопления меченных Alexa Fluor 488 антител при внутривенном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 через 24 ч. A, B – моноклональные анти-VEGF антитела, визуализация накопления в опухолевой ткани.
C – моноклональные анти-VEGF антитела, паренхима нервной ткани D– неспецифические иммуноглобулины, опухолевая ткань.
Через 24 ч после введения препарата, в опухоли было обнаружено накопление мо ноклональных анти-VEGF антител (A и B, рис. 7). Визуализировались группы клеток в различных регионах опухоли, как в центре, так и по периферии. В паренхиме нервной ткани специфической флуоресценции не наблюдалось (C, рис. 7), что в первую очередь объясняется интактным гемато-энцефалическим барьером (ГЭБ), не пропускающим высо комолекулярные соединения из кровотока в мозг. При внутривенном введении меченных неспецифических иммуноглобулинов накопление в опухоли отсутствовало (D, рис. 7). Что подтверждает именно специфическое накопление моноклональных анти-VEGF антител в ткани с высокой концентрацией VEGF за счет селективного взаимодействия с антигеном, а не пассивную диффузию из плазмы в межклеточное пространство опухоли. Полученные данные дают основания сделать вывод о том, что при нарушении целостности гемато энцефалического барьера, вследствие патологических процессов, анти-VEGF антитела мо гут быть использованы в качестве вектора для направленного транспорта в VEGF позитивные клетки.
Антиангиогенная терапия Мы показали, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела распознают нативный димер VEGF, визуализируют в ИГХ опухолевые ткань, ингибируют рост клеток С6 in vitro и накапливаются в глиоме при системном введении. В связи с чем, была сфор мулирована задача: изучить эффективность анти-VEGF монотерапии на ортотопической аллогенной модели высокоагрессивной глиомы C6.
Рис. 8. Анализ выживаемости контрольных (IgG, PBS) и опытных групп (ан ти-VEGF антитела, авастин) животных с глиомой С6 по методу Каплана-Мейера.
Однако, антиангиогенная терапия, как моноклональными антителами, полученны ми нами, так и коммерческим бевацизумабом, не продлевала жизнь крысам с глиомой C (рис. 8). Достоверных различий по выживаемости между опытными и контрольными группами не обнаружено, все животные погибали между 22 и 28 сутками. Более того, мо ноклональные анти-VEGF антитела не влияли на объем и рост интракраниальной опухо ли. Увеличение терапевтической дозы антител в 3,3 раза (с 3 до 10 мг/кг) и раннее начало лечения также не дали никакого эффекта. В связи с вышеизложенным можно предполо жить, что анти-VEGF монотерапия не эффективна при ортотопической глиоме C6. Инте ресно, что в последнее время количество публикаций, в которых отмечается низкая эф фективность антиангиогенной терапии опухолей мозга, значительно возросло. Так на ин тракраниальной ксеногенной модели глиобластомы бевацизумаб практически не влиял на скорость роста глиомы [Keunen O. et al., 2011]. Не смотря на успехи применения бева цизумаба при колоректальном раке и раке молочной железы, в случае глиом III-IV степе ни злокачаственности анти-VEGF терапия остается малоэффективным инструментом.
Векторные наночастицы для МРТ-визуализации Установлено, что многие солидные опухоли, в том числе опухоли мозга, гиперэкс прессируют VEGF [Schmidt N.O. et al, 1999, Samoto K. et al., 1995, Plate K.H.,.1999]. Нами было показано, что клетки глиомы in vitro в культуре и при интракраниальном развитии in vivo характеризуются повышенным уровнем синтеза данного фактора. VEGF является секретируемым белком и его концентрация велика в межклеточном пространстве, кроме того, часть изоформ закреплена на мембране клеток и в межклеточном матриксе [Ferrara N., 2004]. В связи с чем, есть основания полагать, что VEGF может использоваться как мишень в молекулярной визуализации патологической ткани. Целью эксперимента было продемонстрировать специфическое накопление векторных магнитных наночастиц (90± нм) на основе моноклональных анти-VEGF антител в опухолевой ткани методом МР то мографии.
Рис. 9. МРТ-визуализация накопления векторных наночастиц в мозге крыс с интракраниальной глиомой С6. A, C – до введения препаратов наночастиц. B, D – через 24 ч после введения магнитных наночастиц 10 мг/кг по железу. B – наночастицы конъ югированные с неспецифическими иммуноглобулинами. D – наночастицы конъюгирован ные с моноклональными анти-VEGF антителами, накопление детектируется в очаге глио мы.
Через 24 часа, после введения наночастиц на основе моноклональных анти-VEGF антител, детектируется селективное накопление анти-VEGF наночастиц в опухолевой ткани (D, рис. 9). При в/в введении препаратов конъюгированных с неспецифическими иммуноглобулинами изменений в накоплении и интенсивности сигнала не наблюдалось (A и B, рис. 9), что объясняется отсутствием векторной специфичности у вводимого пре парата.
Таким образом, было показано, что моноклональные антитела к VEGF позволяют селективно направлять в клетки мишени наноразмерные структуры, повышая уровень их накопления и тропность к опухолевой ткани. Применение контрастных направленных си стем позволит проводить молекулярную визуализацию и неинвазивную диагностику со лидных опухолей на ранних стадиях.
Накопление липосом in vitro Одним из принципиально новых направлений повышения эффективности лечения опухолей мозга может оказаться адресная высокоселективная доставка наноразмерных контейнерных систем векторного типа на основе моноклональных антител [Yoncheva K., Momekov G., 2011, Kuesters G.M., Campbell R.B., 2010, Caraglia M. et al. 2012, Chekhonin V.P. et al., 2012]. Мы показали, что VEGF является опухолеспецифичной и гиперэкспрес сируемой молекулярной мишенью, а моноклональные анти-VEGF антитела – потенциаль ным вектором для направленной доставки. Поэтому, следующей задачей была разработка контейнерной селективной транспортной системы на основе моноклональных анти-VEGF антител, способной доставлять вещества различной природы в опухоли мозга.
В качестве контейнера были использованы stealth-липосомы, модифицированные полиэтилен гликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 2000 Да. Такое внешнее покрытие липосом, состоящее из ПЭГ, продлевает время циркуляции липосом в кровотоке, замедляя системную элиминацию и захват фагоцитирующими клетками. Конъюгацию между липо сомами и анти-VEGF антителами осуществляли через малеимидную группу липидов и сульфгидрильную группу активированного белка.
Рис. 10. Флуоресцентный анализ накопления липосом на фиксированных клетках С6 глиомы. A, B – визуализация клеток после инкубации с анти-VEGF иммуно липосомами (красный). С – ПЭГилированные липосомы, без конъюгации с антителами. D – липосомы конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами. Ядра докраше ны DAPI (синий).
Анти-VEGF иммунолипосомы связывали цитоплазматический пул VEGF и визуа лизировали практически все клетки на фиксированном препарате C6 глиомы (A и B, рис.
10). В то время как, после инкубации ПЭГилированных липосом с клетками окрашивания не наблюдалось (C, рис. 10). В случае липосом конъюгированных с неспецифическими антителами флуоресцентный сигнал детектировался (D, рис. 10), однако значительно бо лее слабый по сравнению с анти-VEGF липосомами. Более выраженное накопление анти VEGF иммунолипосом (A и B, рис. 10), относительно липосом с неспецифическими IgG (D, рис. 10), свидетельствует о селективном накоплении векторной системы, за счет взаи модействия векторной группы липосом (моноклональные анти-VEGF антитела) с антиге ном.
Накопление векторных липосом в опухоли in vivo Для исследования селективности накопления векторных липосом в условиях in vivo крысам с С глиомой в бедренную вену вво дили препараты липосом (210± нм) в объеме 500 мкл, нормиро ванные по липидам, белку и флуоресцентной метке (на одно животное по липидному составу ~5 мкмоль фосфатидилхолина и 2,5 мкмоль холестерина).
Рис. 11. Флуоресцент ный анализ накопления липо сом в опухолевой ткани при внутривенном введении кры сам с интракраниальной глио мой С6 через 48 ч. A – ПЭГили рованные липосомы. B – ПЭГи лированные липосомы конъюги рованные с неспецифическими иммуноглобулинами. C – селек тивное накопление ПЭГилиро ванных липосом конъюгирован ных с моноклональными анти VEGF антителами в глиоме. Яд ра докрашены DAPI (синий).
Сравнительный флуоресцентный анализ срезов мозга выявил значительные отли чия в накоплении липосомальных препаратов разной конструкции (рис. 11). Так, ПЭГили рованные липосомы, без модификации векторной молекулой, практически не накаплива лись в опухолевой ткани (A, рис. 11). Накопление липосом с неспецифическими имму ноглобулинами детектировалось в большей степени, наиболее яркие области, представ ляющие из себя вытянутые структуры, локализованные преимущественно в центральной части опухоли (B, рис. 11). Подобная визуализация, по-видимому, ассоциирована с накоп лением иммунолипосом в патологических сосудах, вследствие нарушения их перфузии и застоя плазмы. А благодаря высокой проницаемости опухолевых сосудов и нарушения целостности ГЭБ происходит диффузия липосом из кровотока в межклеточное простран ство глиомы. На представленной микрофотографии хорошо видно, что основное накопле ние метки сконцентрировано вокруг отдельных очагов с интенсивной флуоресценцией (B, рис. 11).
Накопление анти-VEGF липосом (C, рис. 11), у всех 3 животных, многократно пре восходило аналогичное в контрольных группах (A и B, рис. 11). Стоит отметить, что ин тенсивно визуализировалась вся опухолевая ткань, как в центральной зоне, таки по пери ферии. Сопоставление уровня и картины флуоресценции трех проанализированных пре паратов подтверждает селективность и специфичность разработанной липосомальной си стемы на основе анти-VEGF антител. По-видимому, проникновение анти-VEGF липосом происходило из патологических сосудов, подобно липосомам с неспецифическими имму ноглобулинами: хорошо заметны яркие области, с высокой концентрацией липосом (C, рис. 11). Таким образом, циркулируя в кровотоке, иммунолипосомы через патологические сосуды проникают в интерстициальное пространство. Однако, векторные анти-VEGF ли посомы селективно накапливаются в области локализации антигена по градиенту VEGF.
Видно более равномерное распределение флуоресцентной метки и накопление по всему объему глиомы, что подтверждает направленный транспорт из кровотока в малигнизиро ванную ткань за счет векторной специфичности.
Рис. 12. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия накопления им мунолипосом в опухолевой ткани при внутривенном введении крысам с интра краниальной глиомой С6 через 48 ч. A – селективный захват анти-VEGF липосом опу холевыми клетками. B – накопление неспецифических иммунолипосом в микрососудах.
Ядра докрашены DAPI (синий).
Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия позволила на клеточном уровне локализовать накопление липосом в глиоме. Хорошо видно, что анти-VEGF липосомы ак тивно захватываются и интернализуются практически всеми опухолевыми клетками (A, рис. 12). Подтверждая вывод о селективности векторной системы и ее эффективном накоплении в опухолевой ткани. При этом, выделяются отдельные клетки накопившие значительно больше флуоресцентной метки. В то время как IgG-липосомы визуализиро вали микрососуды (B, рис. 12), незначительно захватываясь глиомными клетками.
Рис. 13. Флуоресцентный анализ накопления липосом в перитуморальном пространстве. Для визуализации астроцитов срезы докрашены поликлональными анти GFAP антителами. A, B – селективное накопление анти-VEGF липосом в глиомных клет ках на границе опухоли и паренхимы мозга. C – ПЭГилированные липосомы. D – липосо мы конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами. Анти-GFAP антитела проявляли антикроличьими иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).
Иммунохимическая визуализация реактивных астроцитов (зеленый цвет) позволи ла достоверно разграничить перитуморальное пространство от глиомы, и утверждать о высокой селективности векторных иммунолипосом по отношению к опухолевой ткани.
Так ПЭГилированные липосомы практически не визуализировали опухолевые клетки (C, рис. 13), как и неспецифические иммунолипосомы, которые накапливались преимуще ственно в сосудах (D, рис. 13). В то время как, селективное накопление векторных анти VEGF липосом выраженно окрашивало опухолевую ткань, совпадая с границей астрогли ального вала (A и B, рис. 13). Это свидетельствует о специфичности нашей контейнерной системы по отношению к глиоме и высокой степени ее захвата VEGF-позитивными опу холевыми клетками. Однако, часть реактивных астроцитов также секретирует VEGF, ко торый регулирует репаративный ангиогенез. Интересно, что анти-VEGF липосомы захва тываются и отдельными астроцитами (А, рис. 14) в перитуморальном пространстве.
Рис. 14. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия захвата анти VEGF иммунолипосом мигрирующими опухолевыми клетками и реактивными аст роцитами в перитуморальном пространстве. Для визуализации астроцитов проводили иммунофлуоресцентное окрашивание анти-GFAP антителами. А – захват векторных липо сом астроцитами и опухолевыми клетками в перитуморальном пространстве. В – захват векторных липосом глиомной клеткой. Анти-GFAP антитела проявляли антикроличьими иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).
Сканирование перитуморального пространства подтвердило выраженное накопле ние иммунолипосом в мигрирующих глиомных клетках (А, рис. 14), а также в астроцитах, что свидетельствует об эффективной антиген-направленной доставке и создании высокой концентрации векторизованной системы в данной области опухоли. Возможно, такой подход окажется эффективным в отношении инвазивной популяции клеток, в том числе при терапии резистентных опухолевых фенотипов. Хорошо видно, что интернализованная флуоресцентная метка визуализируется в виде относительно крупной зернистости, кото рая вероятно является скоплением липосом в эндосомах (B, рис. 14).
Заключение.
Таким образом, на основании результатов флуоресцентного анализа и оценки накопления липосом можно сделать важные выводы. При системном введении векторные липосомы на основе моноклональных анти-VEGF антител селективно накапливаются в опухолевой ткани. Известно, что вследствие патологического строения сосудистой сети, высокого внутричерепного давления и развития отека, транспорт терапевтических агентов в опухоли мозга затруднен. Нами было показано, что иммунолипосомальные контейнер ные системы, способны проникать из системного кровотока через измененный патологи ческим процессом ГЭБ в глиомную ткань. При таком подходе, высокая проницаемость сосудов и отсутствие полноценного гистогематического барьера, характерных для опухо лей, способствуют накоплению липосом, в то время как в нормальной ткани, с интактным ГЭБ, подобного не происходит.
Сравнительный анализ показал значительные различия в накоплении ПЭГилиро ванных липосом с неспецифическими и анти-VEGF антителами. В первом случае, визуа лизация опухолевых клеток обнаруживается вблизи отдельных очагов накопления, в то время как в большей части опухолевой ткани окрашивались только микрососуды. Что, свидетельствует о пассивной диффузии и неспецифической адгезии липосом. В то время как анти-VEGF липосомы накапливаются и распределяются по всем участкам опухоли, активно захватываясь и интернализуясь глиомными клетками. В перитуморальном про странстве визуализируются мигрирующие глиомные клетки и астроциты.
Разработанная нами липосомальная система на основе моноклональных антител к VEGF обладает селективностью по отношению к VEGF-позитивным клеткам и эффектив но накапливается в патологической ткани при системном введении. Пролонгированная циркуляция контейнерной системы в кровотоке (за счет ПЭГилирования) и тропность к опухолевой ткани (за счет векторных антител) может обеспечить высокоэффективную направленную доставку лекарств в опухоли ЦНС. Подобный подход, основанный на вы сокоселективной доставке наноразмерных контейнерных систем, может существенно по высить эффективность терапии солидных опухолей, в том числе высокоагрессивных и ре зистентных глиом. Кроме того, результаты данной работы подтверждают, что VEGF явля ется перспективной опухолеспецифичной мишенью, а моноклональные анти-VEGF анти тела – селективным молекулярным вектором для направленной доставки наноконтейнеров и наночастиц в опухоли мозга in vivo.
Выводы.
1. Модифицированный способ иммунизации мышей рекомбинантным препаратом VEGF-164 позволил получить В-лимфоциты селезенки, способные при слиянии с клетка ми миеломной культуры Sp2/0-Ag14 образовывать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные анти-VEGF антитела изотипа G2a, характеризующиеся константой аф финности – 1,37±0,15108 M-1. Полученные моноклональные анти-VEGF антитела спо собны специфично распознавать рекомбинантный и нативный VEGF в иммуноблот анали зе, а также визуализировать VEGF-позитивные клетки.
2. Препарат моноклональных анти-VEGF антител, меченных флуорохромом Alexa Fluor 488 и введенных внутривенно, способен захватываются клетками интракраниальной глиомы и накапливаться в опухолевой ткани, визуализируясь в иммунофлуоресцентном анализе.
3. Терапия препаратом моноклональных анти-VEGF антител крыс с ортотопиче ской глиомой C6 в концентрации 3 и 10 мг/кг при внутривенном введении не оказывает влияния на выживаемость экспериментальных животных и объем опухоли.
4. Конъюгация моноклональных анти-VEGF антител с магнитными наночастицами оксида железа (гидродинамический диаметр 90±5 нм), и холестерин- фосфатидилхолино выми липосомами (210±10 нм) объективно повышает уровень их накопления в опухоле вой ткани при внутривенном введении и качество визуализации глиом методами МРТ ис следования в режиме SWI и флуоресцентного анализа.
5. Внутривенное введение крысам с интракраниальной глиомой С6 ПЭГилирован ных липосом, конъюгированных с моноклональными анти-VEGF антителами (2,58±0, нмоль антител), приводит к их специфичному захвату клетками глиомы и реактивными астроцитами, а также позволяет визуализировать накопление в опухолевой ткани.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Леопольд А.В., Баклаушев В.П., Корчагина А.А., Шеин С.А., Гриненко Н.Ф., Павлов К.А., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Лиганд-рецепторный анализ в оценке функцио нальной активности рекомбинантных VEGF и экстраклеточного фрагмента VEGFR-1 че ловека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т.152(12). С. 647 651.
2. Шеин С.А., Гурина О.И., Леопольд А.В., Баклаушев В.П., Корчагина А.А., Гри ненко Н.Ф., Иванова Н.В., Волгина Н.Е., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Получение мо ноклональных антител к рекомбинантному фактору роста эндотелия сосудов. // Клеточ ные технологии в биологии и медицине. 2012. (1) С. 24-28.
3. Чехонин В.П., Шеин С.А., Корчагина А.А., Гурина О.И. Роль VEGF в развитии неопластического ангиогенеза. // Вестник РАМН. 2012. (2) С. 23-34.
4. Абакумов М.А., Шеин С.А., Вишвасрао Х., Нуколова Н.В., Сокольски-Папков М., Cандалова Т.О., Губский И.Л., Гриненко Н.Ф., Кабанов А.В., Чехонин В.П. Визуали зация экспериментальной глиомы С6 методом МРТ с помощью магнитных наночастиц, конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012 Т.154(8) С. 242-246.
5. Шеин С.А., Леопольд А.В. Получение моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов. // Материалы VI Международной (XV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2011 г. Вестник РГМУ. 2011. спец. выпуск (1). С. 230.
6. Шеин С.А. Получение моноклональных антител к фактору роста эндотелия со судов. // Материалы VII Международной (XVI Всероссийской) Пироговской научной ме дицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2012 г. Вестник РГМУ.
2012. спец. выпуск (1). С. 214.