Выделение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и изучение возможности их использования в промышленности и сельском хозяйстве
На правах рукописи
ДУНАЙЦЕВ Игорь Анатольевич ВЫДЕЛЕНИЕ ФОСФАТСОЛЮБИЛИЗИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ И СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Оболенск – 2010
Работа выполнена в 1997 – 2010 гг. в отделе биологических технологий Государственного Научного Центра Прикладной Микробиологии и Биотехнологии, п. Оболенск Московской области Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич кандидат биологических наук Бикетов Сергей Федорович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Степанов Алексей Вячеславович доктор биологических наук Коломбет Любовь Васильевна
Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов
Защита состоится « » 2010 года в часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Государственном Научном Центре Прикладной Микробиологии и Биотехнологии, Оболенск Московской области, ГНЦ ПМБ.
Факс: (4967) E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного Научного Центра Прикладной Микробиологии и Биотехнологии.
Автореферат разослан « » 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н.К. Фурсова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Фосфор (Р) является критически важным элементом для жизнедеятельности человека, широко используется в разнообразных отраслях промышленности и для обеспечения продуктивности в сельском хозяйстве. Его получают из водонерастворимого сырья в химической фосфорной индустрии. Доказанных мировых запасов фосфатов существует примерно на 60- лет, отмечается постоянный рост спроса на сырье. Переработка сырья и производство фосфорсодержащих химических веществ и удобрений с использованием сильных кислот – энергоемкий и дорогой процесс, создающий к тому же десятки миллионов тонн отходов бедных фосфатных руд, отходов фосфогипса и шламов. Культурные растения ассимилируют только 10-25 % от вносимого с минеральными удобрениями фосфора. Как следствие, происходит эвтрефикация водоемов и переосаждение фосфора в почвах. Из-за высокой стоимости многие развивающиеся страны практически не используют химические фосфорные удобрения. В связи с этим встает вопрос о разработке более дешевых и эффективных фосфорных удобрений и способов их применения.
Альтернативой для существующих химических методов извлечения фосфора может служить процесс прямого микробиологического высвобождения (солюбилизации) фосфатов из нерастворимого сырья. Процесс основан на использовании метаболической активности фосфатсолюбилизирующих (ФС) культур. Они встречаются в природе в различных экологических нишах и способны медленно переводить нерастворимые фосфаты из фосфатсодержащих рудных материалов в растворимую форму в ходе своей жизнедеятельности. Прямая микробная мобилизация фосфатов может служить основой для использования в агротехнологиях в виде биофосфорных удобрений. Кроме того, эту микробиологическую активность можно было бы применить для более эффективного использования исчерпаемого сырья с извлечением остаточного фосфора из бедных руд, из вторичных продуктов переработки сырья, тем самым снизив экологическую нагрузку на окружающую среду. Однако, широкое применение ФС свойств микроорганизмов в сельском хозяйстве и, в особенности, в промышленности затруднено в силу ряда причин: недостаточно изучена биохимия процессов микробной ФС, нет полного представления о биоразнообразии фосфатсолюбилизирующих микроораганизмов (ФСМ) и экологических нишах их обитания, нет данных о влиянии состава фосфатных руд на ФСМ. В целом проблема имеет междисциплинарный характер, и ее решение требует комплексного подхода с привлечением знаний в различных областях, Таким образом, представляется актуальным вопрос о разработке новых технологий и препаратов, базирующихся на ФС свойствах микроорганизмов. для чего требуется отобрать наиболее активные по фосфатсолюбилизации культуры, и исследовать микробную ФС в новом поколении биологических удобрений, а также в процессах утилизации отходов фосфатной индустрии и извлечении остаточного фосфора.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлись выделение активных ФСМ из различных экологических ниш и изучение возможности их использования для разработки биофосфорных удобрений и в процессах высвобождения фосфора из фосфатсодержащих бедных руд и отходов.
Задачи исследования включали:
1. Поиск и выделение активных ФС культур в широком спектре экологических ниш;
2. Характеризацию ФС изолятов, включая исследование ФС в модельных средах, ключевых метаболитов, биодоступности различного фосфатного сырья;
3. Изучение возможности применения выделенных ФСМ для создания технологии микробных фосфорных удобрений и ее экономическая оценка;
4. Исследование перспективы использования ФСМ для прямого извлечения фосфатов из фосфатсодержащих отходов, бедных руд.
Научная новизна результатов исследований. Впервые для поиска, выделения и оценки распространенности ФСМ был предложена и использована панель скрининга разнообразных экологических ниш и показано, что активные ФСМ эффективно выделяются не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород. Полученные результаты позволяют более глубоко понять процессы микробной ФС: выявлено значительное влияние компонентов питательной среды на состав метаболитов, обеспечивающих растворение фосфатов, с использованием широкого круга микроорганизмов детально изучен механизм высвобождения фосфатов с помощью группы глюконовых кислот, позволяющий наиболее эффективно использовать для этой цели углеродный субстрат. Изучена доступность спектра фосфорных руд отечественных и мировых месторождений воздействию отобранных наиболее активных микроорганизмов. Выявлено несколько групп фосфатного сырья, наиболее доступных микробной фосфатсолюбилизации. Впервые показана возможность микробиологического высвобождения фосфатов низкой концентрации из фосфорсодержащих материалов: фосфогипса и рудных отходов.
Практическая значимость. Разработаны микробиологические и биотехнологические основы для использования процессов прямой микробной фосфатсолюбилизации в промышленности, сельском хозяйстве и природоохранных технологиях. Выделены культуры, способные к прямой микробной фосфатсолюбилизации из нерастворимого рудного сырья. Отобраны для практического использования наиболее перспективные штаммы, не уступающие или превосходящие по ряду свойств и ФС активности лучшие мировые аналоги. Разработаны лабораторные методики приготовления фосфорных удобрений с использованием фосфат-солюбилизирующих микроорганизмов, выделения и селекции фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, лабораторные Регламенты производства фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и производства комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами. В Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск Московской обл.) депонированы два штамма ФСМ. Показано повышение урожайности зерновых и декоративных растений при использовании экспериментальных образцов биофосфорных удобрений. Отобраны наиболее биологически доступные группы фосфатного сырья, выбраны наилучшие по биодоступности отечественные фосфатные руды. Разработаны формоустойчивые волокнистые носители, позволяющие эффективно соиммобилизовать биомассу и сырье в процессе непрерывной обработки руд. Предложена технология использования ФС культур и ФС процессов для извлечения фосфатов из бедных руд и для утилизации фосфатсодержащих отходов промышленности (фосфогипса).
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦПМБ 16 июля 2010 года. Материалы диссертации доложены и представлены на 12 международных и российских научных конференциях: 8-м Европейском конгрессе по биотехнологии (17- августа 1997 г., Budapest, Hungary);
Международном конгрессе «Вода: экология и технология» (25-30 мая 1998 г., Москва, Россия);
Международном семинаре «Evaluation of sponsored biological studies in Russia for new millennium» (02- сентября 1999 г. Новосибирск, Россия);
Международной научной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (22-25 мая 2000 г., Оболенск, Россия);
Международном Форуме «Биотехнология и современность» (17-18 июня 2003 г., Санкт-Петербург, Россия);
Канадско-Российском Коллоквиуме по биологическим наукам (15-17 Сентября 2004 г., Москва);
34-м Международном Семинаре Япония/Россия «Biotechnologies in Russia/CIS» (17 Июня 2005 г., Tokyo, Japan);
3-м Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (14-18 марта 2005 г., Москва, Россия);
3-м Международном Симпозиуме «Phosphate Dynamics in Soil-Plant Continuum» (14-19 мая 2006 г., Uberlandia, Brazil);
10-й Международной Конференции «Soil-Water Systems Consoil-2008» (03-06 июня 2008 г., Milano, Italy);
Юбилейном Международном Симпозиуме МОББ «Биоценотическая регуляция. Основы современных фитосанитарных технологий» (21-25 мая 2007 г., Санкт-Петербург, Россия);
2-м Международном Экологическом Форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (01-04 июля 2008 г., Санкт-Петербург, Россия).
Публикации. Основное содержание работы
отражено в 17 научных публикациях, включая 7 статей и патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, раздела материалов и методов, результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 170 работ, из них 121 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 56 рисунками и 34 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
.
1. Обзор литературы.
В главе дан обзор литературы по текущему состоянию и проблемам фосфорных ресурсов и индустрии переработки фосфатного сырья, использованию микроорганизмов в обработке руд и решении экологических проблем их добычи и переработки. Рассмотрены механизмы микробного высвобождения фосфатов из нерастворимого сырья, подходы к выделению фосфатсолюбилизирующих культур и использованию микроорганизмов для улучшения фосфорного питания растений.
2. Материалы и методы.
Объектами исследований служили коллекционные штаммы микроорганизмов, а также изоляты ФСМ, выделенные в ходе экспедиционных работ.
Для оценки фосфатсолюбилизирующей активности и исследования процессов метаболизма ФСМ применяли методы на основе использования минеральных питательных сред, в которых в качестве единственного источника фосфора содержались нерастворимые фосфорсодержащие руды или трикальцийфосфат.
Кроме этого, в работе использовали общепринятые микробиологические, биохимические, газохроматографические, аналитические, биотехнологические, агротехнические методы.
3. Результаты и обсуждение.
Использование фосфатсолюбилизирующего штамма Burkholderia cepacia E- Штамм Burkholderia cepacia E-37, являющийся одним из самых активных ФС штаммов, описанных в научной литературе, был предоставлен для исследований д ром R.D. Rogers (INL, Айдахо, США). Изучен механизм высвобождения фосфатов из модельного фосфорсодержащего сырья трикальцийфосфата (ТКФ) под воздействием этого штамма, технологические особенности этого микроорганизма и возможность использования его в качестве основы для биофосфорного удобрения.
Для изучения механизма высвобождения фосфатов под действием Е-37 было исследовано влияние концентрации источника углерода (глюкозы), посевной дозы и растворимых фосфатов на динамику этого процесса. Как видно из рисунка 1, повышение концентрации глюкозы увеличивает растворимость фосфора за счет образования кислых продуктов (рисунок 1б).
700 6, 5, Р, мкг/мл рН 300 4, 3, 0 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 60 t, ч 1 2 t, ч 1 2 а б Рис. 1. Влияние концентрации глюкозы на динамику изменения концентрации фосфора в растворе (а) и рН (б) для штамма B. cepacia Е-37 (посевная доза 5,0*107 КОЕ/мл): 1- 0,15% глюкозы;
2 – 0,3% глюкозы;
3 – 0,6% глюкозы.
При этом величина перешедшего в раствор фосфора и время достижения максимума увеличивается прямо пропорционально концентрации глюкозы (рисунок 1а). До сих пор в литературе не описаны микроорганизмы, высвобождающие большее количество фосфора на единицу углеродного субстрата.
На рисунке 2 представлено влияние посевной дозы на время достижения 7, 6, Р, мгк/мл 400 5, рН 4, 3, 0 0 20 40 60 0 10 20 30 40 50 1 2 1 2 3 t, ч t, ч а б Рис. 2. Влияние посевной дозы на динамику перехода фосфора в растворимое состояние и величину рН для штамма B. cepacia Е-37: 1 – 4,0*107 КОЕ/мл;
2 – 12,9*107 КОЕ/мл;
3 – 3,8*108 КОЕ/мл.
максимальной растворимости фосфатов для штамма Е-37 при одинаковой концентрации глюкозы (0,6%). Повышение посевной дозы не увеличивает концентрацию растворенного фосфора (рисунок 2а), но снижает время достижения максимума концентрации растворенного фосфора за счет ускорения образования кислых продуктов (рисунок 2б).
На рисунке 3 представлено влияние растворимого фосфата (КН2РО4, КФ) на динамику высвобождения фосфора из Са3(РО4)2, размножение клеток и продукцию кислых метаболитов под действием E-37 в жидкой минимальной среде.
Г, MMС P, мг/л;
MMС.
1400 ГК, MMС 1200 P, мг/л;
КГК, MMС MMС+10мМ КФ.
8 Г, MMС+10мМ 1000 P, мг/л;
C, мг/мл КФ MMС+20мМ КФ.
ГК, MMС+10мМ 800 6 КФ КОЕx106;
кл/мл;
KГК, MMС 600 MMС+10мМ КФ 4 Г, MMС+20мМ КОЕx106;
400 кл/мл;
MMС+10м КФ ГК, MMС+20мМ М КФ.
КОЕx106;
кл/мл;
КФ 200 MMС+20мМ КФ. KГК, MMС+20мМ КФ 0 0 20 40 0 5 10 15 t, ч t, ч а б Рис. 3. Влияние растворимого фосфата а) на динамику высвобождения фосфора из Са3(РО4)2 и размножение клеток;
б) на потребление глюкозы и продукцию кислых метаболитов под действием B. cepacia E-37 в МСС среде (1% глюкозы) при концентрации КФ: 0мМ, 10мМ и 20мМ КН2РО4.
В отсутствии КФ количество перешедшего в раствор фосфора почти стехиометрически соответствует сумме глюконовой и кетоглюконовой кислот, образующихся из глюкозы под действием ферментных систем Е-37. Присутствие изначально растворенного фосфора в среде приводило к снижению максимального количества фосфора, высвобождаемого под действием E-37. При этом отмечалось снижение концентрации кетоглюконата в после 4-х часов культивирования, обусловленное, скорее всего, его потреблением в процессе размножения клеток.
Подтверждением этого вывода могут служить данные по КОЕ (рисунок 3а): в присутствии КФ к 4-м часам роста КОЕ возрастает в 4 раза, тогда как в отсутствие КФ, размножение клеток начинается только через 20 часов культивирования после достижения максимальной концентрации фосфора в растворе.
Таким образом, на примере наиболее известного по ФС эффективности штамма Е-37 показано, что для него солюбилизация фосфатов сопряжена со стехиометрическим окислением глюкозы до глюконовых кислот. На первой фазе выращивания идет окисление глюкозы до глюконовой и кетоглюконовой кислот, которые вызывают растворение фосфатов. После исчерпания глюкозы в среде начинается размножение клеток.. В отсутствие растворимых фосфатов для таких микроорганизмов глюкоза, по-видимому, является ингибитором размножения.
Поскольку на другие цели субстрат в начальной фазе культивирования практически не расходуется, а лишь стехиометрически переходит в другие формы, процесс солюбилизации фосфора для такого штамма, как Е-37, наиболее эффективен в расчете на единицу углеводного субстрата,.
Технологические особенности штамма B. cерасiа Е-37 исследовали в условиях периодического и проточного культивирования. Для выращивания культуры E- использовали богатую питательную среду (на основе гидролизата рыбокостной муки (ГРМ) с содержанием аминного азота в среде 100 мг%) и минеральные обогащенные среды с различными источниками углерода (глюкоза, ацетат). В качестве микроэлементов добавляли Fe, Cu, Mn, Zn. Для оптимизации состава среды, выяснения оптимальных физико-химических условий роста культуру выращивали в качалочных колбах. На основании измерения максимальной удельной скорости роста мах установлено, что оптимальными являются температура роста (28±2) °С и pH (6±1). Культура хорошо росла в богатых средах:
показывая высокую скорость роста и выход биомассы. На минеральных средах рост был значительно слабее. Ацетат не утилизировался. Добавка ГРМ (5mg%) существенно не влияла на результат роста.
С культурой B. cepacia E-37 проведено 12 циклов культивирования, в том числе 8 процессов в лабораторных ферментерах (15л), 4 процесса в пилотных ферментерах (100-130л). Масштабный переход не оказал влияния на основные показатели процесса (выход биомассы ОПкон, время культивирования, максимальная удельная скорость роста мах), что говорит о пригодности продуцента и процесса для промышленной разработки. Все процессы вели в управляемом режиме с контролем и поддержанием параметров То, рН, рО2, уровня пенообразования, в регулярно отбираемых пробах определяли ОП590, чистоту популяции на отсутствие пмф, титр КОЕ.
Таблица 1. Основные параметры культивирования штамма Е-37 в периодическом режиме на лабораторном и пилотном уровне.
№ Основные показатели Среда выращивания Примечания ГРМ среда Полусинт.
среда 1 Основной источник “С” Глюкоза Глюкоза Naм 100мг% 2 Основной источник “N” ГРМ NH4Cl 1 – 2 % всего 3 Среднее время роста, ч 12–15 14– 4 рН, ед рН 6,0±0,2 6,0±0, 5 Диапазон рО2,% 10-100 10- Температура, 0С 6 28±0,2 28±0, 7 Выход БМ по ОПкон 27,3±4,7 14,7±3, по сухому весу, г асв/л 8.3±1,4 5.1±1, КОЕ, млрд./мл 20,5±8,2 12,6±5, 8 Макс. удельная скорость до 0.58 до 0, роста, мах, ч- Как видно из данных таблицы 1 по глубинному выращиванию штамма Е-37, он показал хорошие результаты на обеих средах и дальнейшее использование данных в экономических расчетах себестоимости биомассы привели к необходимости исследовать возможность интенсивного культивирования штамма Е-37 в проточном режиме.
Культивирование в проточном режиме проводили в биореакторе вместимостью 1л с контролем и поддержанием параметров То, рН, рО2, скорости подачи стерильной среды (протока D, ч-1), уровня пенообразования. В регулярно отбираемых пробах выходного потока КЖ определяли ОП590, чистоту популяции на отсутствие пмф и КОЕ.
20, Производительность процесса 19, Оптическая плотоность исследовали в диапазоне протока 18, среды 0,1 – 0,4 ч-1, добиваясь после 17, 16, смены каждого режима протока 15, стабилизированной величины ОП на 14, 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0, выходе КЖ из аппарата.
Скорость протока Использовали 2% концентрацию Рис. 4. Зависимость концентрации биомассы (ОП590) на выходе от скорости глюкозы. Как видно из рисунка 4, протока среды при культивировании B.
максимальные значения ОП cepacia E-37.
достигаются при величине протока 0,15 – 0,3 ч-1.
Влияние исходной концентрации источника углерода на продуктивность (ОПвых) проточного процесса культивирования Е-37 определяли при величине ч- протока 0,1 и диапазоне Оптическая плотность концентраций глюкозы 1 – 3 %. Как видно из рисунка 5, практически нет различий по выходу биомассы между концентрациями 2% и 3%, то есть субстрат сжигается неэффективно.
1 2 Концентрация глюкозы,% При росте концентрации субстрата Рис. 5. Влияние концентрации входного вдвое (с 1% до 2%) наблюдается субстрата проточного культивирования штамма Е-37 на выходную ОП прибавка биомассы (ОП) всего на культуральной жидкости.
6%, что показывает неэффективность такого повышения концентрации субстрата. Поэтому была выбрана рабочая концентрация глюкозы 1%.
На основании данных оптимизации процессов как периодического, так и непрерывного культивирования для B. cepacia E-37 была проведена экономическая оценка себестоимости процесса и разработки масштабной технологии получения биоудобрения на основе этого ФСМ. В расчетах использовались оптовые цены 2010 года на компоненты сред из различных источников. Стоимость сухой биомассы культуры (по сырью) составила более 3100 руб. или более 103 $, что делает потенциальный биофосфорный препарат (куда добавятся и другие сырьевые компоненты) чрезвычайно дорогим. Это связано с использованием дорогостоящего компонента: вклад ГРМ в себестоимость составляет 85% от всех сырьевых затрат.
Поэтому выращивание штамма Е-37 на богатой среде, содержащей ГРМ и глюкозу не перспективно. На полусинтетической среде стоимость 1кг сухой биомассы культуры составила около 49$ как при периодическом, так и при непрерывном культивировании, что является гораздо более приемлемым результатом для разработки препарата на ее основе.
На следующем этапе из биомассы B. cepacia Е-37 были приготовлены и испытаны экспериментальные образцы гранул экспериментального биофосфорного удобрения, включавшего сухую биомассу штамма Е-37 или ассоциации микроорганизмов, фосфоритную руду, глюкозу и стеарат натрия для ее инкапсуляции, а также полимерную добавку в качестве связующего вещества при формировании гранул (таблица 2). Ассоциация микроорганизмов включала, кроме B. cepacia Е-37 еще два ФС штамма Pseudomonas sp. АD, выделенный из фосфатной руды, и Lactobacillus salivaris. Использовалась фосфоритная мука, приготовленная из фосфоритов Егорьевского месторождения. Контрольный препарат гранул не содержал микроорганизмов и был приготовлен на основе одной фосфоритной муки Мелкоделяночные испытания вариантов биофосфорных удобрений проводились в открытом грунте в п. Оболенск (Серпуховский район Таблица 2. Состав гранул биофосфорных удобрений.
Концентрации компонентов, % Гранулы Глю- Стеарат Высушенная Фосфорит- Связующая Р2О биомасса ная руда добавка коза натрия Без микробов 0 99 0 0 1 14. 4.88 70.81 14.65 7.32 2.34 10. В. сepacia E- Ассоциация 4.88 70.81 14.65 7.32 2.34 10. микроорг-мов Московской области) в летний период. Результаты биометрических измерений (рисунок 6) показали, что, применение биогранул способствовало более интенсивному росту и развитию растений по 4, сравнению с контрольным вариантом без Средний сырой вес на делянку, кг внесения P2O5 и практически не уступало по 3, эффективности варианту с внесением 2, двойного суперфосфата (ДСФ). По степени кустистости растений биогранулы также не 1, уступали ДСФ. Применение гранул фосфорной руды без микроорганизмов 0, 1 2 3 4 (вариант 3) оказалось малоэффективным, на Вариант уровне контроля без внесения P2O5. Рис. 6. Средний вес растений ячменя на делянку, варианты: 1 – Таким образом, изучена ФС без добавления фосфатов;
2 – ДСФ;
3 – гранулированная руда;
активность и подтверждена возможность – биогранулы с E-37;
5 – гранулы применения ФСМ B. cepacia Е-37 в на основе ассоциации ФСМ.
качестве основы для биологических удобрений. В то же время, высокая себестоимость получения биомассы штамма, особенности ФС процесса культуры, заключающиеся в быстром пиковом высвобождении фосфора в среду без удержания растворенных фосфатов на стационарном уровне – настоятельно требуют поиска новых высокоэффективных по ФС культур, способных расти в минеральных средах и лучшим по технолого-экономическим характеристикам.
Выделение и свойства фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов Для выделения новых наиболее активных ФСМ были спланированы и проведены 7 экспедиций в различные регионы РФ и СНГ с целью максимально охватить предполагаемый спектр экологических ниш (известных в литературе и новых). Панель для скрининга экологических ниш (всего 100) включала двухуровневое сочетание: района поиска (всего 10 районов в группе) и типа пробы для селекции ФСМ (всего 10 типов образцов в группе). В ходе экспедиций собрано и обработано 640 образцов ризосферных почв, минеральных пород, растительных тканей, скальных и донных отложений.
В процессе оценки ФС активности выделяемых из объектов окружающей среды изолятов оказалось, что общепринятый полуколичественный метод селекции и оценки ФС активности по соотношению диаметра зоны растворения с диаметром колонии (Dз/dк) на МСС агаре с трикальцийфосфатом дает неоднозначные результаты. На примере четырех ФС культур было показано, что параметр Dз/dк Отбор Контроль Выделение Технологич.
Персп Образец из изолятов на ФС в МСС исследован ектив ЧК на целевых ные МСС с различн. ия ФСМ МСС ФСМ Первичная экониш Испыта гало + углеводами селекция в ния по МСС и с области Отбор Выделение Технологич.
разл. примене изолятов на НИР по доминиру углеводами ния пМСС области ющих ЧК рНmin гало - Хранение применения в рНmin и рНmin активных МСС ФСМ Рис. 7. Рабочая схема выделения и селекции активных ФСМ значительно варьирует в зависимости от концентрации источников углерода и азота в среде, их соотношения, дозировки культуры и не имеет однозначных корреляций с изученными факторами.
В результате, была выработана развернутая схема выделения и селекции чистых культур (ЧК) фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, которая позволила, за счет количественного контроля активности ФС изолята в жидкой среде, не терять при отборе активные ФС культуры. Схема представлена на рисунке 7.
Результаты селекции показали, что среди отобранных изолятов, растворяющих не менее 25% ТКФ в жидкой среде, более половины плохо или совсем не формируют зоны растворения на агаре с ТКФ (таблица 3).
Таблица 3. Распределение ФСМ, отобранных из образцов 7 экспедиций, по формированию зон просветления на МСС агаре.
Размер зон на Всего ФСМ доля % агаре с ТКФ - 97 21, + 150 33, ++ 106 23, +++ 64 14, ++++ 25 5, +++++ 10 2, Всего 452 100, В ходе выделения ФСМ было отмечено, что они часто встречаются на поверхности разрушающихся минеральных пород, а эффективность обнаружения ФСМ для эрозионных пород была в 2,1-4,8 раз выше, чем для аналогичных цельных пород (рисунок 8). Из разрушенных гранитов “рапакиви” (Карелия) были выделены несколько самых активных ФСМ (Pseudomonas sp. Krl-181a и др.).
Наличие ФСМ в биоценозе разрушаемых минералов хорошо объясняется способностью таких культур извлекать труднодоступные питательные компоненты из эрозионной породы. Электронная микроскопия минерала после недельного воздействия двух ФСМ (Acinetobacter sp. Kav-305 и Pseudomonas sp. Krl-181a) в МСС среде на кристалл рапакиви – показала наличие повреждений поверхности кристаллов, что показало возможность участия культур такого типа в разрущении минеральных пород.
Данные по эффективности 3, выделения (ЭВИ) изолятов ФСМ за Хортица все Хортица эроз.
пробы гранит весь период показали, что имеется 2, несколько групп - “районов поиска”, Карелия граниты 7 экспед.
рапакиви Карелия эроз. эрроз. породы которые сравнимы или значительно породы 1, 7 экспед.
Карелия превосходят (0,65-1,16) Карелия цельные цельные цельные породы граниты породы общеизвестные (поле, лесной массив).
0,0 Среди них выделяются районы с Рис. 8. Эффективность выделения ФСМ недостатком питательных из цельных и эрозионных пород для отдельных и всех экспедиций компонентов: места подземных выбросов (минеральные источники, вулканы), пещеры, ущелья, скалы. К «богатым» по ФСМ группам проб из экониш, дефицитным по питательным вешествам, можно отнести эрозионные породы, наросты или корни растений со скал, которые сравнимы или превосходят (0,69 0,90) общеизвестный тип проб «ризосферная зона растений».
исследование динамики фосфатсолюбилизации в жидкой среде проявило различный характер высвобождения фосфатов, что, по-видимому, обусловлено особенностями метаболизма (рисунок 9). В частности, для штамма Е-37 характерно наличие острого максимума, что свидетельствует о быстром возврате фосфора в нерастворимое состояние. У Р, мкг/мл других микроорганизмов наблюдали наличие «плато». Такие культуры способны длительное время 0 5 10 15 20 25 30 поддерживать определенную t, час 1 2 3 4 концентрацию фосфатов в растворе, Рис. 9. Динамика высвобождения обеспечивая тем самым их дальнейшее растворенного фосфора: 1- P.
поглощение растениями. Именно этот fluorescens P469;
2 –Bас. subtilis ИПМ 215;
3 - T. longibrahiatum №29;
4 –T.
тип культур можно считать asperellum штамм №16;
5 – B. cepacia E перспективными для создания 37.
биофосфорных удобрений.
Для наиболее активных выделенных ФС изолятов, которые полностью высвобождали фосфаты из ТКФ, мог наблюдаться различный характер выхода растворенного фосфора на максимум (рисунок 10). У некоторых культур отмечался лаг-период до 2 суток, когда требовался промежуточный синтез ферментов и метаболитов, обеспечивающих растворение фосфатов. Другие культуры могли сразу показывать максимум скорости растворения. Для таких активных культур наблюдался интенсивный синтез кислот глюконовой группы при трансформации глюкозы, типичная картина процесса представлена для культуры Kav-282 на Hor 12gl рис. 11. глюкоза практически полностью 1200 Hor 16gl P, мкг/мл Kav 282gl превращается в кислоты. При этом Kav 92gl Kav 179gl глюконовая кислота довольно быстро Lhv159gl окисляется в кетоглюконовую, которая является значительно более сильной t,h 0 50 100 150 кислотой. Из сравнения рисунков 10 и Рис. 10. Кривые накопления фосфора видно, что динамика накопления в растворе под действием наиболее фосфора в растворе практически активных изолятов (2% глюкозы).
совпадает с накоплением кетоглюконовой кислоты.
Для такого рода штаммов, как и ранее для B. cepacia E-37, показано, что добавление в среду растворенных фосфатов снижает ФС способность микроорганизмов, если она глюкоза обусловлена продуктами C, мг/мл глюконат первичного окисления глюкозы – кетоглюконат глюконовой и кетоглюконовыми кислотами. Если ФС способность t, h 0 10 20 30 40 микроорганизмов (как для B.
subtilis ИПМ-215) обусловлена Рис. 11. Динамика окисления глюкозы в глюконовую и кетоглюконовую кислоты продуктами более глубокой под действием изолята Kav-282 (1% переработки субстрата, то глюкозы) растворенные фосфаты могут не оказывать отрицательного влияния на ФС.
Результаты определения эффективности расходования углеродного субстрата для высвобождения фосфатов (ФСЭ) у штаммов P. fluorescens Р-469 и изолята Kav 282, как и для В. cepacia E-37, показали, что наиболее высокие значения ФСЭ демонстрируют штаммы, у которых глюкоза расходуется только на образование кислых продуктов, обеспечивающих растворение фосфатов. Повышение в среде содержания источника азота (хлорид аммония) при ФС процессе изменяет соотношение кислот, образующихся при прямом окислении глюкозы, что влияет на ФС эффективность.
Важной характеристикой ФС продуцентов с точки зрения создания перспективных биотехнологий является их способность эффективно растворять конкретное природное фосфатсодержащее сырье. На рисунке 12 представлены Ковдорский апатит данные по максимальному Фосфорит со дна 400 Я понского моря количеству высвобожденного Фосфорит шельфа Н амибии Фосфорит, М арокко фосфора из 5 разных видов Е горьевский фосфатных руд за 7 суток в фосфор ит 100 Фосфорит Каратау, Казахстан присутствии 4 различных Kav 305 Krl 181 B.sub tilis Ps. Fluor Ф С ш таммы ФСМ. Из представленных 215 данных следует, что фосфатные Рис. 12. Результаты солюбилизации руды по биодоступности 5 видов фосфатного сырья с использованием ФС культур Ps. fluorescens 469, различаются более, чем в Bac. subtilis 215, Acinetobacter sp.305 и раз. Кроме этого, очевидны Pseudomonas sp. также различия в ФС активности разных штаммов по отношению к одному и тому же сырью. Это необходимо учитывать при разработке препаратов и технологий для любого вида регионального сырья. Исследование групп фосфорного сырья (по 2-3 руды в группе) показало, что наибольшей биодоступностью обладают океанские фосфориты шельфого залегания, желваковые, зернистые и, в меньшей степени, ракушечные фосфориты, а апатиты малодоступны (рисунок 13).
ШЛФ Яп море АПТ Кировск ШЛФ Намибия АПТ Ковдор ШЛФ Чили АПТ Новополтав ЗРН Иордания МЗР Каратау Р, ppm Р, ppm МЗР Китай ЗРН Мрк 300 Хурибга РКШ Кабала ЖЛВ Вятка РКШ Кингисепп 200 ЖЛВ Егорьевск КНТ Озерск ЖЛВ Чилисай КНТ Обладжан 0 сут 0 2 4 6 8 сут 0 2 4 6 8 Рис 13. Высвобождение фосфора штаммом Acinetobacter sp.305 из океанических шельфовых (ШЛФ), желваковых (ЖЛВ) и зернистых (ЗРН) фосфоритов, микрозернистых (МЗР), ракушечных (РКШ), континентальных метасоматических (КНТ) фосфоритов и группы апатитов (АПТ) В коллекции культур ФСМ, отобранных в результате экспедиционной деятельности, присутствуют микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам. Около четверти принадлежат к грамположительным бациллам и коккам, более 20 процентов - это дрожжевые культуры, остальные ФСМ относятся к различным группам грамотрицательных бактерий. Более пятидесяти перспективных ФС культур прошли биохимическую идентификацию.
На основе совокупности полученных о ФС изоляте данных, включая глубину, скорость и характер ФС, эффективность ФС, степень высвобождения фосфатов, способность к растворению биологически слабо доступного сырья (апатитов), технологичность культуры при выращивании и переработке, другим дополнительным свойствам и с помощью экспертных оценок, были отобраны для испытаний в качестве биологической основы биоудобрения ФС штаммы Acinetobacter sp. Kav-305 и Pseudomonas sp. Krl-181a, а для использования в биореакторе по обработке фосфатсодержащих отходов был селекционирован консорциум ФСМ из Bacillus megaterium Lhv-71b, Acinetobacter sp. Kav-282 и дрожжевого изолята Yarrowia sp. Lhv-11b..
Использование процессов микробной фосфатсолюбилизации Исследования по влиянию различных физико-химических факторов на процесс роста и выход биомассы при выращивании выбранного активного ФС штамма Pseudomonas sp. Krl-181a проводили в режиме глубинного периодического культивирования в минеральной среде с использованием термостатируемых качалок. В качестве источника углерода использовали сахарозу, которая не уступала глюкозе по 0, Y, макс ч- 0, скорости роста и выходу биомассы, Эк. Коэф. Y Ск роста 0, но более доступна по цене, что 0, существенно для разработки недорогого препарата. На рисунке 0 2 4 Сахароза, % 14 представлена зависимость Рис. 14. Влияние содержания сахарозы на основных ростовых показателей от основные показатели роста культуры Pseudomonas sp. Krl-181, макс. удельную содержания источника углерода.
скорость роста мах и экономический Штамм отличает высокий коэффициент Y показатель скорости роста уже при низких концентрациях субстрата (оптимум при концентрации субстрата более 0,2%). Также были оптимизированы другие показатели: рН 5,5-7,0, температура роста 28-32 оС. Внесение в среду факторов роста (дрожжевой экстракт до 0,4%) практически не увеличивало скорость роста (0,48 ч-1), но существенно удорожало среду. В оптимизированных условиях проведены циклы культивирования в лабораторных ферментерах и получены следующие результаты (таблица 4).
Таблица 4. Основные параметры культивирования Pseudomonas sp. Krl-181 в периодическом режиме в лабораторном ферментере (10л).
№ Основные показатели Среда выращивания Примечания БС среда Синт. среда 1 Основн. источник “С” Сахароза Сахароза Naм 100мг% 2 Основн. источник “N” ГРМ NH4Cl 1 – 3 % всего 3 Среднее время роста, ч 10–13 14– 4 Рабочая рН, ед рН 6,0±0,5 6,0±0, 5 Диапазон рО2,% 10-100 10- Температура роста, 0С 6 28±0,2 28±0, 7 Выход БМ по ОПкон 28,3±6,4 13,7±1, по сухому весу, г асв/л 7.1±2,3 4.9±0, 8 Макс. удельная скорость до 0.56 до 0, роста, мах, ч- Результаты свидетельствуют об эффективном росте культуры на богатых и минеральных средах. Поскольку первая имеет несколько лучшие результаты по длительности процесса и выходу биомассы, но чрезвычайно дорога по себестоимости, в дальнейших работах по изготовлению биомассы и расчетах экономических параметров была использована минеральная среда. Экономические расчеты себестоимости получения биомассы штамма Krl-181а по сырью благодаря недорогим средам и высоким показателям роста дали величину 12,3 $/кг асв, что существенно лучше, чем у известного в литературе штамма Е-37 и является перспективным для разработки недорогих препаратов биоудобрений.
Таблица 5. Описание вегетационного опыта по оценке ФС свойств штаммов Kav-305 и Krl-181a на декоративных растениях Tagetes patula Источник фосфора Форма №№ БМ штамма 1 порошок нет нет 3 порошок нет фосфорит 5 гранулы нет нет 7 гранулы нет фосфорит 9 порошок нет Kav- 11 порошок фосфорит Kav- 13 гранулы нет Kav- 15 гранулы фосфорит Kav- 17 порошок нет Krl-181a 19 порошок фосфорит Krl-181a 21 гранулы нет Krl-181a 23 гранулы фосфорит Krl-181a В вегетационном опыте на декоративных растениях Tagetes patula были испытаны два перспективных ФС штамма Acinetobacter sp. Kav-305 и 4, 4, Pseudomonas sp. Krl-181a. В качестве 3, источника фосфора использовали 3, Сухой Вес, г 2, Егорьевский фосфорит (фосмука), 2, биомасса штаммов находилась в виде 1, 1, лиофилизированного порошка или в 0, составе биогранул. И в свободном 0, 1 9 17 3 11 19 5 13 21 7 15 виде, и в составе гранул оба штамма варианты Рис. 15. Сухой вес растений бархатцев, давали достоверный прирост урожая сформированный по подгруппам (рисунок 15). Одновременно, (триады) с контрольными вариантами.
отмечали прирост содержания фосфора в цветочной части растений, наиболее требовательных к его наличию.
Представленные данные позволяют отнести ФСМ штаммы Acinetobacter sp. Kav 305 и Pseudomonas sp. Krl-181a к перспективным в качестве компонента биоудобрения.
В дальнейших экспериментах на примере нескольких ФС изолятов изучали возможность высвобождения микроорганизмами фосфатов из низкосортных российских руд и фосфатсодержащих отходов производства минеральных фосфорных удобрений. При этом можно было ожидать остановки процесса вследствие накопления ингибирующих метаболитов и растворимых компонентов руд в периодическом режиме процесса. Для проверки возможности непрерывного цикла высвобождения фосфатов был испытан отъемно-доливной процесс фосфатсолюбилизации с использованием 5 разных руд и штамма Kav-305 (рисунок 16). В этих условиях со всеми видами руд и полной сменой среды количество высвобожденного фосфора увеличилось почти вдвое. Таким слив и долив свежих сред Фосфорит, образом, была продемонстрирована Кингисепп Фосфорит, Р, ppm возможность микробиологического Егорьевск 200 Фосфорит высвобождения фосфатов в Марокко, БуКраа Апатит непрерывном процессе. 100 Селигдар Фосфорит Каратау В процессе дальнейших 0 2 4 6 8 10 сут исследований возникла Рис. 16. Отъемно-доливная обработка технологическая проблема, различных Р-руд штаммом Kav-305 для связанная с тем, что медленный высвобождения фосфатов процесс ФС фосфорсодержащего сырья требует использования аппаратов с длительным временем удержания в объеме реактора. Такой процесс обычно реализуется в колонных системах, в которых быстро происходит заиливание верхних слоев руды. Вместе с этим, необходима иммобилизация ФС ассоциации для долговременной эксплуатации системы.
Для решения этой проблемы в целях одновременной соиммобилизации руды и биомассы ФСМ культур было предложено использовать проницаемые формоустойчивые волокнистые носители биомассы в виде цилиндрических патронов (ВФПН). Этот тип носителей превосходит известные материалы по удельной сорбционной емкости в 2,5-4 раза и показывает в биопроцессах хорошие эксплуатационные характеристики. Например, для нестационарного процесса очистки вод от нефтепродуктов в режиме переключения от режима поддержания непосредственно на рабочий проток применение ВФПН в сравнении с известным носителем керамзитом показало его существенные Рисунок 17. Эффективность биологической преимущества (рисунок 17).
очистки стоков, загрязнённых НП, при переключении "режим поддержания / На основе ВФПН была рабочий режим" создана колонная установка, где были соиммобилизованы фосфорсодержащиее сырье и биомасса ФС культур. В качестве биокомпонента использовали неантагонистический консорциум ФСМ, включая Bacillus megaterium Lhv-71b, Acinetobacter sp. Kav-282 и дрожжевой изолят Yarrowia sp. Lhv-11b.
б б 90 Вынос, мг/кг отходов*сут Вынос, мг/кг отхдов*сут 20 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 Скорость протока, л/сут Скорость протока, л/сут а б Рис.18. Мобилизация фосфора (за сутки) из фосфорфосодержащего сырья: а) фосфогипса, б) низкосортной руды.
В режиме непрерывного протока более 3 месяцев отмечено стабильное высвобождение растворимых фосфатов при всех скоростях протока (рисунок 18), что подтвердило возможность использования процесса микробной фосфатсолюбилизации для рекуперации фосфатов из различного фосфатсодержащего сырья.
ВЫВОДЫ.
1. Изучено распространение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов в природных экологических нишах и выявлены новые ниши, сравнимые или превосходящие известные на сегодня по эффективности выделения целевых культур. Установлено, что активные ФСМ могут эффективно выделяться не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород.
2. В дополнение к методу зон просветления на плотных средах с нерастворимым фосфатом для выделения активных ФСМ предложен комплексный метод, включающий дополнительное использование жидких селективных сред.
3. Детально исследованы ФС свойства штамма B. cepacia E-37, оптимизирована технология получения его биомассы, сделана экономическая оценка ее приготовления, показана его эффективность в составе опытного биоудобрения в полевых вегетационных экспериментах на ячмене. Отмечено, что технология приготовления его биомассы достаточно дорога и не дает устойчивых результатов.
4. Выделены и охарактеризованы штаммы, которые по своим ФС и технолого экономическим свойствам превосходят один из лучших мировых аналогов B.
cepacia E-37 и перспективны для создания ФС препаратов и технологий.
5. Получены новые данные о существенном влиянии содержания источников питания, растворенных фосфатов, дозы ФСМ на эффективность протекания ФС.
6. Выявлены группы фосфатсодержащих руд, наиболее доступных воздействию микроорганизмов при использовании в ФС процессах.
7. В лабораторных вегетационных и мелкоделяночных испытаниях опытных образцов фосфорного биоудобрения подтверждена их эффективность:
достоверно повышалась урожайность растений и содержание в них фосфора.
8. Разработана технология непрерывного высвобождения фосфатов из низкосортных фосфорсодержащих материалов на основе использования ФСМ.
Эффективный непрерывный процесс высвобождения фосфатов был реализован за счет подбора носителей и соиммобилизации в них рудного сырья и ассоциации ФСМ.
Список условных сокращений асв абсолютно сухой вес биомассы, мг асв/мл, г асв/л БМ биомасса ВФПН волокнистые фильтрующие полимерные носители биомассы ГРМ гидролизат рыбокостной муки ДСФ двойной суперфосфат КЖ культуральная жидкость микроорганизмов КОЕ колониеобразующая единица КФ калия фосфат однозамещенный МСС минимальная солевая селективная среда ОП оптическая плотность суспензии, измеряемая спектрофотометрически пмф Посторонняя микрофлора ТКФ трикальцийфосфат, нерастворимый фосфат ФС фосфатсолюбилизация, фосфатсолюбилизирующий фосфатсолюбилизирующий микроорганизм ФСМ эффективность фосфатсолюбилизации ФСЭ ЧК чистая культура ЭВИ эффективность выделения изолятов ФСМ рН показатель рН рО2 парциальное давление растворенного кислорода в среде Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Makarevich A.V., Pinchuk L.S., Dunaitsev I.A. Perfection of polymeric microorganism carriers for water purification systems. // Proceedings of 8th European Congress on Biotechnology. – Budapest, 1997. - P. 306.
2. Макаревич А.В., Пинчук Л.С., Дунайцев И.А. Новые полимерные носители микроорганизмов в фильтрах биологической очистки сточных вод. // Доклады АН Беларуси. – 1997. - т.41. - №1. - C. 114-118.
3. Дунайцев И.А., Кондрашенко В.М. Разработка технологии и установок биологической очистки сильнозагрязненных стоков, воздушных выбросов с использованием нового поколения полимерных носителей биомассы. // Материалы Конф. “Наука и техника – городу”. – Москва, 1998. - С.195.
4. Jigletsova S.K., Dunaitsev I.A., Kondrashenko V.M. Development of the technology of deep purification of phosphate-polluted sewage water. // Int.
Congress “Water: ecology and technology”. - Moscow, 1998. - P. 261.
5. Dunaitsev I.A., Makarevich A.V., Pinchuk L.S. The development and selection of carriers of immobilized microorganisms in engineering systems of the intensive biological oxidation of hydrocarbon contamination. // Proceedings of Int. Workshop "Evaluation of sponsored biological studies in Russia for new millennium". Novosibirsk, 1999. - v.1. - P. 60-74.
6. Патент BY №2753 C1. Носитель биомассы фильтров для биологической очистки сточных вод. / Макаревич А.В., Дунайцев И.А., Пинчук Л.С. // Опубл. Афiцыйны бюл. Дзяржавн. Ведамства Рэспублiкы Беларусь. – 1999. №1. - C. 110.
7. Дунайцев И.А., Макаревич А.В., Пинчук Л.С., Кондрашенко В.М. Разработка технологий и установок биологической очистки сильнозагрязненных стоков, воздуха с использованием селективных носителей биомассы. // Материалы Конф. «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии»:
- Оболенск, 1999. - С. 170.
8. Левчук В.П., Лунева Н.И., Иванов С.А., Дунайцев И.А., Перелыгин В.В.
Использование микроорганизмов для мобилизации фосфатов из фосфатсодержащих руд. // Материалы Межд. Конф. «Проблемы биологической и экологической безопасности». - Оболенск, 2000. - С. 405-406.
9. Makarevich A.V., Dunaitsev I.A., Pinchuk L.S. Aerobic treatment of industrial wastewaters by biofilters with fibrous polymeric biomass carrier. // Bioprocess Engineering. – 2000. - V. 22. - P. 0121-0126.
10. Ноздрин В.Н., Дунайцев И.А., Перелыгин В.В. и др. Разработка микробиологических методов утилизации фосфорных соединений из различных источников. // Отчет о НИР (заключительный): ГНЦ Прикладной Микробиологии. - Оболенск, 2001.- кн.6, инв. 5920. - C. 25-40 и C. 75-77.
11. Дунайцев И.А. Иммобилизация клеток как инструмент интенсификации биологических процессов. // Сб. трудов Межд. Форума «Биотехнология и современность». - С.-Пб., 2003. - C. 25-26.
12. Dunaitsev I.A. Fibrous formstable biomass carriers to be used for biopurification needs. // Proceedings of Canadian Biological Science Colloquium, ISTC. – Moscow, 2004. - P.112.
13. Dunaytsev I.A., Zhigletsova S.K., Klykova M.V., Kondrashenko T.N., Aitov R.S., Boyko A.S., Aripovskiy A.V. Screening phosphate solubilizing microorganisms and quantative evaluation of their efficacy. // Proceedings of 3rd Int. Symp. “Phosphate Dynamics in Soil-Plant Continuum”. - Uberlandia, Brazil, 2006. - P. 240-241.
14. Дунайцев И.А., Старшов А.А., Перелыгин В.В., Клыкова М.В., Кондрашенко Т.Н. Эффективность экспериментальных образцов микробиологических фосфорных удобрений на ячмене. // Агро XXI. – 2008. - №1-3. - С. 35-36.
15. Dunaytsev I.A., Zhigletsova S.K., Aitov R.S., Klykova M.V., Kondrashenko T.N., Starshov A.A., Boyko A.S. Utilization of phosphate containing wastes by direct microbial phosphates mobilization. // Proceedings of ISTC workshop at the Int.
Conf. on Soil Contamination “ConSoil-2008”. - Milano, ISTC/ConSoil, 2008. - P.
84-88.
16. Жиглецова С.К., Дунайцев И.А., Бесаева С.Г. Возможности применения микроорганизмов для решения задач экологической и продовольственной безопасности. // Агрохимия. – 2010. - №6. - С. 83-96.
17. Dunaytsev I.A. Compact biosystems with immobilization and fibrous formstable biomass carriers to be used for biopurification needs and air decontamination. // Osteuropa workshop auf dem 22 Kasseler Abfal- und bioenergieforum. – UniKasselTransfer. – 2010. - P. 10-11.
Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям д.м.н., профессору И.А. Дятлову и к.б.н. Бикетову С.Ф., чей богатый опыт, внимание и поддержка помогали в проведении данной работы и в завершении труда, а также к.х.н. С.К. Жиглецовой, к.б.н. В.В. Перелыгину за большую помощь в организации экспедиционного поиска, экспериментальных исследований и в обобщении результатов. Автор считает своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем соавторам и сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.