Влияние серотонина на свойства возбудителя чумы, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток
На правах рукописи
КЛЮЕВА Светлана Николаевна ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИНА НА СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ АПОПТОЗ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК 03.00.07 – микробиология 14.00.36 – аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Саратов - 2008
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный консультант:
доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Щуковская Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна
Ведущая организация: ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Защита состоится «_»_2009 г. в _ часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.078.01 при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».
Автореферат разослан «»2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Существование на территории России и многих стран мира природных очагов чумы, а также угроза применения возбудителя чумы в качестве агента биотерроризма диктуют необходимость углубленных исследований иммунопатогенеза чумной инфекции с целью создания современных, надежных средств и методов е диагностики, лечения и профилактики [Онищенко Г.Г. и др., 2004, 2006;
Clarke R.A., 1999, Richard J.L., Grimes D.E., 2008].
В последние годы интенсифицировались исследования по изучению триггерных молекулярных механизмов взаимодействия патогена с организмом хозяина, в том числе возможности использования микроорганизмами эндогенных биологически активных веществ макроорганизма для ускорения собственного развития на начальных этапах инфекционного процесса.
Формируется новое междисциплинарное направление – микробная эндокринология, изучающее фундаментальные и прикладные аспекты нейроэндокринной регуляции взаимодействия про- и эукариот [Олескин А.В. и др., 2000;
Стадников А.А. и др., 2002;
Lyte M., 2004;
Voigt W. et al., 2006].
Получены свидетельства наличия на клеточной поверхности прокариот рецепторных структур, связывающих биогенные амины – нейрогормоны [Freestone P.P. et al., 2007]. Выявлен стимулирующий эффект стрессорных гормонов на рост патогенных штаммов Escherichia coli и синтез адгезина К99, шига-подобных токсинов I и II, показана зависимость транскрипции генов, кодирующих секрецию III типа и синтез флагелл у энтерогеморрагических и энтеротоксигенных E. coli от адреналина и норадреналина [Lyte M. et al.,1997;
O’Donnell P.M. et al., 2006]. Катехоламины, в частности норадреналин, способны влиять на процесс захвата E. coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis ионов железа из трансферрина и лактоферрина [Freestone P.P.et al., 2002, 2003;
Anderson M.T., Armstrong S.A., 2006;
O’Donnell P.M. et al., 2006], на интенсивность процесса образования биопленок бактериями [Lyte M.
et al., 2003]. Обнаружено существование перекрестной связи между luxS/AI- бактериальной (кворум сенсинг) и адренергической QS (адреналин/норадреналин) системой организма хозяина [Sperandio V. et al., 2003;
Clarke M.B et al., 2006].
В этой связи, большой интерес представляет серотонин (5 окситриптамин), который принадлежит к группе биогенных аминов: азотистых оснований, возникающих в организме при декарбоксилировании аминокислот и обладающих чрезвычайно сильной активностью, благодаря высокой способности их к конформационным изменениям, к соединению с макромолекулами, к переносу электронов и протонов [Белжеларская С.Н., Саттон Ф., 2003].
Биогенный амин серотонин является нейромедиатором, медиатором воспаления и аллергических реакций, обладает выраженным иммуномодулирующим действием, является одним из компонентов сосудисто тромбоцитарного гемостаза, способен комплексировать с ДНК про- и эукариот, с нуклеозидами и нуклеотидами, ингибировать процессы перекисного окисления липидов в клеточных мембранах, непосредственно взаимодействуя с перекисными радикалами [Ноздрачев А.Д., Пушкарев Ю.П., 1980;
Бурлакова Е.Б. и др., 1992;
Щуковская Т.Н. и др., 1999, 2008;
Helene C. et al., 1971].
Известно, что серотонин ускоряет рост культур E. coli, Rhоdospirillum rubrum, Streptococcus faecalis, Candida guilliermondii, вызывая сокращение лаг фазы, стимулирует формирование биопленки у E. coli и плодовых тел у миксобактерий [Страховская М.Г., Иванова Э.В., Фрайкин Г.Я., 1993;
Олескин А.В. и др., 1998].
На данный момент отсутствуют сведения о потенциальном влиянии серотонина, высвобождаемого тромбоцитами и клетками нейроэндокринного микроокружения в месте проникновения чумного микроба в организм хозяина, на размножение клеток Y. pestis, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), культурально-морфологические характеристики чумного микроба, профиль синтезируемых им белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена). Отсутствует также какая-либо информация о возможности применения серотонина в схеме лабораторной диагностики чумы для повышения эффективности выделения возбудителя чумы из исследуемого материала, как контаминированного, так и не контаминированного сопутствующей микрофлорой.
Интегральным показателем, характеризующим изменения эукариотических клеток под воздействием инфекционного агента является соотношение количества клеток на разных стадиях клеточного цикла, включая стадию их запрограммированной гибели (апоптоз). Механизмы индукции апоптоза представителями рода Yersinia находятся на стадии исследования [Fields K., Straley S., 1999;
Weinrauch Y. et al., 2002;
Zhang Y., Bliska J.D., 2003].
Не изучен механизм модулирующего действия биогенных аминов, в том числе серотонина, на развитие апоптоза под влиянием патогенных иерсиний, а также пролиферацию иммунокомпетентных клеток в условиях иммунобиологической перестройки, вакцинированного против чумы макроорганизма.
Цель исследования – изучить влияние серотонина на рост, электрофоретический профиль белков, экспрессию поверхностных антигенов чумного микроба, а также индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток.
Основные задачи исследования 1. Изучить влияние серотонина на скорость роста, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), морфометрические характеристики Y. pestis EV НИИЭГ (pFra+, pCad+, pPst+) и его изогенных штаммов Y. pestis КМ218 (pFra-, pCad-, pPst-), Y. pestis КМ216 (pFra-, pCad-, pPst+) в условиях культивирования на плотных и жидких питательных средах.
2. Оценить возможность применения серотонина для повышения эффективности выделения возбудителя чумы бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой.
3. Изучить влияние серотонина на экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба ФI, активатора плазминогена) и электрофоретический профиль белков Y. pestis с различным плазмидным составом в условиях культивирования на питательных средах.
4. Провести сравнительный анализ влияния серотонина на развитие индуцированного Y. pestis и другими представителями рода Yersinia (Y.pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) апоптоза лейкоцитов крови человека в модельной системе in vitro.
5. С применением проточной цитофлуориметрии изучить in vivo влияние серотонина на процессы апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов биомодели (мыши BALB/c, нелинейные белые мыши) в условиях иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, а также различными препаратами капсульного антигена чумного микроба ФI.
Научная новизна Впервые установлено, что серотонин стимулирует накопление биомассы Y. pestis EV НИИЭГ и бесплазмидного штамма Y. pestis КМ218 на ранних стадиях развития культур, индуцирует по данным проточной цитофлуориметрии увеличение числа клеток с интенсивной ДНК– флуоресценцией для Y. pestis EV НИИЭГ в 2 раза, для Y. pestis КМ218 – в 1, раза.
Получены новые сведения о влиянии серотонина на выделение чумного микроба из исследуемого материала, контаминированного посторонней микрофлорой. Показана эффективность применения серотонина на начальном этапе бактериологического исследования на чуму. С применением серотонина разработан способ выделения Y. pestis бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включая объекты внешней среды, позволяющий сократить до 24 ч сроки биологического накопления возбудителя чумы и увеличить число колониеобразующих единиц (КОЕ) чумного микроба. Новизна исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (варианты)» (положительное решение о выдаче патента от 16.10.2008 г. по заявке №2007142840/13(046910), приоритет от 19.11.2007 г.).
Показано влияние серотонина на экспрессию видоспецифических антигенов чумного микроба (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), детектируемых с помощью коммерческих препаратов иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных. Обнаружено увеличение процентного содержания клеток с повышенной интенсивностью свечения.
Впервые выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез чумным микробом полипептида с молекулярной массой 22 кДа, участвующего в формировании поверхностного заряда клеток и проявлении адгезивных свойств, в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 С в течение 24 ч.
Впервые in vitro и in vivo с применением проточно цитофлуориметрического метода цитологического анализа установлено непосредственное участие серотонина в механизмах модуляции индуцированного Y. pestis и капсульным антигеном чумного микроба (Ф1) апоптоза, изменений состояния ядерного хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов биомодели. Серотонин в концентрации 10 -5 моль (М) в первые 6 ч замедляет in vitro развитие индуцированного Y. pestis апоптоза лейкоцитов крови интактных биомоделей, что создает благоприятные условия для роста и размножения чумного микроба в организме хозяина и связано с влиянием антигенов, синтезируемых при 37 С, в первую очередь капсульного антигена (Ф1). В иммунном организме модулирующее действие серотонина проявляется лишь через 24 ч и имеет противоположную направленность.
Впервые получены новые данные о влиянии биогенного амина серотонина на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y.
enterocolitica). Серотонин оказывает модулирующее действие на распределение лейкоцитов по клеточному циклу, изменяя соотношение в крови клеток, находящихся на стадиях апоптоза и пролиферации. Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.
Практическая значимость Результаты исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Организация работы и обеззараживание материала, содержащего возбудитель чумы при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии», которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 6 от 12.12.2008 г.) и утверждены директором ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Разработанный нами «Способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (варианты)» (положительное решение на выдачу патента от 16 октября 2008 г. по заявке № 2007142840/13(046910), приоритет от 19.11.2007 г.) внедрен в работу специализированной лаборатории препаратов против чумы и др. ООИ ГИСК им. Л.А. Тарасевича (акт внедрения патента в НД утвержден директором ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича академиком Н.В. Медуницыным от 26.11.2008 г.).
Основные положения, выносимые на защиту 1. Биогенный амин серотонин в концентрации 10 -5 М оказывает стимулирующее влияние на рост чумного микроба на стандартно используемых для его культивирования жидких и плотных питательных средах [бульон и агар Хоттингера рН 7,2;
агар Хоттингера рН 7,2, содержащий лизированную кровь (1%) и генцианвиолет (1:100000-1:200000)], индуцирует по данным проточной цитофлуориметрии увеличение числа клеток с интенсивной ДНК– флуоресценцией.
2. С применением серотонина разработан способ выделения Y. pestis бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включая объекты внешней среды, который позволяет увеличить число КОЕ чумного микроба в 1,5–5,5 раза и значительно сократить (до 24 ч) сроки биологического накопления возбудителя чумы из нативного материала.
3. Выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида с молекулярной массой 22 кДа клетками вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, бесплазмидного штамма Y. pestis КМ218, моноплазмидного штамма Y. pestis КМ216 в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 С в течение 24 ч.
4. В модельной системе in vitro серотонин в концентрации 10-5 М оказывает модулирующее действие на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.
5. Установлено, что примирование серотонином биомоделей (мыши BALB/c, беспородные белые мыши) до иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, различными препаратами капсульного антигена чумного микроба (ФI) влияет на характер развития процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина, лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов, интенсивность и направленность которых зависят от вида иммунизирующего препарата.
Апробация работы Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на:
Международных конференциях «Saratov Fall Meeting: Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine IY» (Саратов, 2002-2003);
Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология XXI век» (Саратов, 2004);
на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007);
на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах участниках СНГ» (Саратов, 2007);
IX Межгосударственной научно практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества независимых государств» (Волгоград, 2008);
научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2003-2008).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 работ, их них статей в рекомендованных ВАК изданиях – 4, в зарубежной печати – 2.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 147 отечественных и 150 зарубежных источников.
Объем диссертации составляет 159 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 11 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы В работе использовали: 1) штамм Y. pestis EV НИИЭГ (pFra+, pCad+, pPst+), его изогенные производные – штаммы Y. pestis КМ216 (pFra-, pCad-, pPst+), Y. pestis КМ218 (pFra-, pCad-, pPst-);
2) вирулентный штамм Y. pestis (Pgm+, pFra+, pCad+, pPst+);
3) другие виды иерсиний: штаммы Y.pseudotuberculosis I серовар, Y. pseudotuberculosis IV серовар, Y. enterocolitica 383 (pCad-) 09 серовар, Y. enterocolitica КМ-33 (201) (pCad+) 09 серовар, Y.enterocolitica 134 03 серовар 4) S. aureus 209-П, E. coli 25922 АТСС;
5) углеводсодержащий препарат капсульного антигена чумного микроба (ФI) и чистый белок ФI. Все указанные штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб». Препараты капсульного антигена любезно предоставлены доктором биологических наук Тараненко Т.М.
(лаборатория биохимии РосНИПЧИ «Микроб»).
Серотонин-креатинин сульфат («Merck», Germany) применяли в виде свежеприготовленного водного раствора, стерилизованного фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Конечное разведение серотонин-креатинин сульфат соответствовало 3,510-4 М или 110-5 М в пересчете на серотонин основание.
В экспериментах использованы 180 клинически здоровых нелинейных белых мышей, мышей инбредной линии BALB/c массой (18±2) г, полученные из «Сектора по разведению экспериментальных животных» лаборатории биомоделей РосНИПЧИ «Микроб».
Микробиологические методы Штамм Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенные производные выращивали на агаре и бульоне Хоттингера рН 7,2 при температуре 28 С и 37 С, штаммы Y.
pseudotuberculosis - при 28 С и 37 С, Y. enterocolitica - при 37 С в течение 48 ч, E.coli - на агаре Хоттингера рН 7,2 при 37 С в течение 24 ч, S. aureus - на агаре Хоттингера рН 7,4 при 37 С в течение 24 ч. Из полученных культур готовили соответствующие взвеси в стерильном 0,9 % растворе натрия хлорида рН 7,2 по стандартному образцу мутности ОСО-42-28-85П 10 единиц, эквивалентному 1109 м.к./мл. Методом серийных разведений доводили концентрацию клеток до 103 м.к./мл. Для получения смешанной взвеси клеток Y. pestis EV, S.аureus, E. сoli по 500 мкл взвеси каждого штамма вносили в одну пробирку. Навески природной почвы массой 1 г инфицировали 105 и 104 м.к Y. pestis EV, затем суспензировали в 10 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида.
Серотонином обрабатывали как непосредственно исследуемый материал перед посевом, так и готовые агаровые пластины.
Морфометрический анализ колоний и клеток чумного микроба проводили с применением аппаратно-программного комплекса «Мекос-Ц» (Мекос ДММ, версия 2.1.0.0.) и биологического микроскопа Olimpus CX 31 с видеокамерой JVC.
Электрофоретическое разделение белков цельно-клеточных лизатов исследуемых культур проводили в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) по методу U. K. Laemmli (1970).
Для регистрации относительного содержания ДНК в микробных клетках и анализа распределений бактерий по клеточному циклу (ДНК-гистограмм) применяли цитохимический метод, основанный на специфической окраске ДНК смесью митрамицина и этидиум бромида [Steen H.B., Boye E., 1981] предварительно обеззараженных и фиксированных (70±1) этанолом бактериальных клеток. Измерения флуоресценции проводили на цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия), оснащенном 2048-канальным амплитудным анализатором импульсов Orto Instruments 2102 (Westwood, Mass USA) для автоматической сортировки клеток и построения гистограмм.
Для проточно-цитофлуориметрического анализа экспрессии поверхностных антигенов Y. pestis использовали коммерческий препарат иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных производства РосНИПЧИ «Микроб», прошедший контроль на активность и специфичность в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Измерения проводили на цитофлуориметре ICP-22 PHYWE. Экспрессию специфических поверхностных антигенов чумного микроба оценивали количественно путем измерения в потоке интенсивности иммунофлуоресценции большой статистической выборки отдельных клеток и автоматической сортировки их по данному показателю.
Иммуносерологические методы Антитела к капсульному антигену Ф1 чумного микроба в сыворотке крови определяли микрометодом в системе реакций РНГА и РТНГА с применением диагностикума чумного эритроцитарного антигенного производства НИИМ МО РФ (г. Киров). ТИФА применяли для выявления капсульного антигена Ф1 чумного микроба с использованием тест-системы иммуноферментной моноклональной.
Иммуноблоттинг после электрофоретического разделения белков цельно клеточных лизатов исследуемых культур в полиакриламидном геле (SDS PAGE) проводили согласно H. Towbin с соавторами (1979).
Иммунологические методы Иммунизацию биомодельных животных осуществляли подкожно двухсуточной агаровой культурой вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ в дозе 105 м.к. или капсульным антигеном чумного микроба ФI в дозе 100 мкг в объеме 0,2 мл. Серотонин (10-5 М) вводили за 30 мин до иммунизации однократно, подкожно в область спины в объеме 0,5 мл.
Определение апоптотических и пролиферирующих эукариотических клеток проводили с применением проточной цитофлуориметрии. Окраску ДНК митрамицином (Serva, Германия), бромидом этидия (Serva, Германия) проводили по методу В. Barlogie et al. (1976). Морфологическое подтверждение апоптоза лейкоцитов проводили в препаратах, окрашенных по Романовскому Гимзе, с применением аппаратно-программного комплекса «Мекос-Ц» (Мекос ДММ, версия 2.1.0.0.).
Проточно-цитофлуориметрический мониторинг состояния ядерного хроматина и лизосомального аппарата клеток иммунной системы проводили с использованием цитохимического метода, основанного на применении красителя акридинового оранжевого (АО) [Melamed M.R., 1972]. По интенсивности зеленой флуоресценции ядерного хроматина и красной флуоресценции лизосомальных гранул на гистограммах идентифицировали активированные клетки, которые подсчитывали в процентах по отношению к общему числу исследованных клеток.
LD50 заражающего штамма Y. pestis 231 определяли по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина, А.А. Воробьева (1962).
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Exсel», гистограмм и фотографий - «Corel PHOTO PAINT 11», «Adobe Photoshop».
Фотографии получали при помощи цифровой фотокамеры Canon Power Shot A 70, Canon Power Shot A 410 и программно-аппаратного комплекса Мекос-Ц (программа Мекос-ДММ, версия 2.1.0.0.).
Результаты исследований и их обсуждение Нами проведено исследование влияния серотонина на динамику роста, морфометрические показатели Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом на плотных и жидких питательных средах в условиях культивирования при 28 С и 37 С.
Добавление серотонина в различных концентрациях в жидкую среду культивирования (бульон Хоттингера рН 7,2) оказывало непосредственное влияние на количественные показатели интенсивности роста чумного микроба.
Выявлена зависимость роста Y. pestis EV при 28 С от концентрации добавленного в среду культивирования серотонина. Наличие экзогенного серотонина в жидкой среде культивирования в концентрации 10-5 М, 10-4 М, 10- М более чем в 2 раза увеличивало количество микробных клеток на начальном этапе выращивания. Низкие концентрации серотонина (10 -8 М, 10-7 М, 10-6 М) в аналогичных условиях не обладали стимулирующим действием и оказывали противоположный эффект на рост чумного микроба (рисунок 1).
EV - штамм Y. pestis EV;
EV +С – штамм Y. pestis EV в среде с добавлением серотонина.
Рисунок 1. Влияние различных концентраций серотонина на рост Y. pestis EV НИИЭГ в бульоне Хоттингера рН 7,2 при 28 С.
Для дальнейших исследований была выбрана концентрация серотонина - 10 М, обладающая стимулирующим действием на рост чумного микроба и соответствующая физиологическим концентрациям серотонина, освобождающимся при разрушении и агрегации тромбоцитов в очаге воспаления, что соответствует обычно 10-6 - 10-5 М [Tamir H. et al., 1983;
Gershon M.D., Tamir H., 1984].
Нами установлено, что выращивание Y. pestis EV в бульоне Хоттингера рН 7,2 в присутствии 10-5 М серотонина как при 28 С, так и при 37 оС обеспечивало более интенсивное, по сравнению с контролем, накопление клеточной биомассы Y. pestis EV в течение 23-24 ч. В более поздние сроки наблюдения (28 ч, 47 ч, 51 ч) ростостимулирующий эффект серотонина проявлялся только в условиях инкубирования посевов при 37 C.
При культивировании штамма Y. pestis EV с полным набором плазмид и изогенного бесплазмидного штамма Y. pestis КМ218 в бульоне Хоттингера при температуре 28 С наличие экзогенного серотонина в концентрации 10 -5 М приводило к увеличению количества микробных клеток на начальном этапе выращивания для обоих штаммов, что свидетельствовало о независимости стимулирующего действия серотонина от плазмидного состава клеток чумного микроба.
В ходе проведенных нами исследований показано, что биогенный амин серотонин в концентрации 10-5 М оказывает стимулирующие действие на рост чумного микроба в условиях культивирования на плотных питательных средах, применяемых при стандартном бактериологическом методе исследования на чуму (агар Хоттингера рН 7,2, агар Хоттингера рН 7,2 с лизированной кровью и генцианвиолетом).
Обработка серотонином как непосредственно самого исследуемого материала перед посевом (бактериальной взвеси), так и готовых агаровых пластин приводила к достоверному увеличению числа колониеобразующих единиц (КОЕ), не оказывая при этом значимого влияния на тинкториальные, культурально-морфологические свойства и морфометрические показатели чумного микроба. При добавлении серотонина во взвесь клеток Y. pestis EV или на поверхность агара число КОЕ через 24-48 ч возрастало в 2 раза (p0,05) по сравнению с контрольными посевами (таблица 1).
Аналогичные результаты получены нами при изучении влияния серотонина на рост чумного микроба в смешанной культуре.
Ростостимулирующий эффект серотонина проявлялся одинаково как при нанесении раствора серотонина на поверхность агара, так и при внесении его в смешанную взвесь клеток Y. pestis EV, S. аureus, E. сoli за 30 мин до посева на плотную питательную среду. Серотонин в концентрации 10-5 М оказывал также стимулирующее действие и на рост E. сoli, что согласуется с данными А.В.
Олескина с соавторами (1998), однако сам эффект выражен намного слабее по сравнению с его действием на чумной микроб (уровень стимуляции роста по сравнению с контролем – 25 % у E. сoli, против – 120 % у Y. pestis;
число КОЕ в контроле принято за 100 %).
При исследовании контаминированного сопутствующей микрофлорой материала, в первую очередь объектов внешней среды и, особенно, при малом содержании в нем чумного микроба, наблюдается, как правило, поздняя визуализация колоний Y. pestis (через 48-96 ч). На примере искусственно инфицированной Y. pestis природной почвы, нами установлено, что обработка серотонином перед посевом либо исследуемого материала, либо агаровых пластин позволяет значительно сократить (до 24 ч) сроки биологического накопления возбудителя чумы и увеличить в 3–5 раз число колониеобразующих единиц чумного микроба.
С применением серотонина нами разработан способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (положительное решение о выдаче патента на изобретение от 16 декабря 2008 г.
по заявке № 2007142840, приоритет от 19.11.2007 г.), который не требует больших материальных затрат и дорогостоящего оборудования, легко воспроизводим и может быть реализован как в стационарных, так и полевых условиях.
Таблица 1 - Влияние серотонина на количество КОЕ Y. pestis, выращенных на агаре Хоттингера рН 7,2 с лизированной кровью (1 %) и генцианвиолетом (1:100000) при 28 оС КОЕ Исследуемый Способ обработки Вид материал серотонином микроорганизмов через 24 ч через 48 ч n M±m M±m Внесение Y. pestis EV НИИЭГ 44 ± 1,8* 85 ± 1,8* Монокультура во взвесь Контроль Y. pestis EV НИИЭГ 20 ± 1,2 38 ± 1, (без серотонина) Внесение E. coli 25922 АТСС 62 ± 2,5* 88 ± 4, Монокультура во взвесь Контроль E. coli 25922 АТСС 50 ± 2,0 83 ± 4, (без серотонина) Внесение нет роста нет роста St. aureus 209-П Монокультура во взвесь Контроль нет роста нет роста St. aureus 209-П (без серотонина) Y. pestis EV НИИЭГ 12 ± 2,4* 32 ± 3,6* Смешанная Внесение культура во взвесь нет роста нет роста St. aureus 209-П E. coli 25922 АТСС 16 ± 2,7 29 ± 3, Y. pestis EV НИИЭГ 6 ± 1,5 15 ± 1, Смешанная Контроль культура (без серотонина) нет роста нет роста St. aureus 209-П E. coli 25922 АТСС 13 ± 2,3 22 ± 2, Внесение в Y. pestis EV НИИЭГ 6 ± 0,5* 55 ± 6,1* Почва почвенную (105 м.к. суспензию Y. pestis на Нанесение на Y. pestis EV НИИЭГ 7 ± 0,8* 37 ± 2,1* 1 г почвы) поверхность агаровых пластин Контроль Y. pestis EV НИИЭГ нет роста 10 ± 1, (без серотонина) Внесение в Y. pestis EV НИИЭГ 2 ± 0,8* 20 ± 1,5* Почва почвенную (104 м.к. суспензию Y. pestis на Нанесение на Y. pestis EV НИИЭГ 3 ± 0,6* 18 ± 2,3* 1 г почвы) поверхность агаровых пластин Контроль Y. pestis EV НИИЭГ нет роста 6 ± 0, (без серотонина) Примечание - * достоверность различий опытных проб с серотонином от проб без серотонина (p0,05).
Нами обнаружено, что обработка взвеси клеток Y. pestis EV серотонином в конечной концентрации 10-5 М в течение 30 мин при комнатной температуре приводит к достоверному двукратному увеличению доли клеток с повышенным содержанием ДНК, регистрируемой методом проточной цитометрии (рисунок 2). Ранее А.В. Олескиным с соавторами (1998) было отмечено, что ростостимулирующий эффект серотонина на E. coli, Rsp. rubrum не зависел от того, добавляли ли серотонин однократно в момент посева культуры или вносили многократно. По-видимому, биогенный амин серотонин действует на определенный «пусковой механизм», инициируемый на ранней стадии развития культуры.
Количество клеток Содержание ДНК на клетку в условных единицах (каналах) А - распределение клеток Y. pestis EV без обработки бактериальной взвеси серотонином;
Б - распределение клеток Y. pestis EV с обработкой бактериальной взвеси серотонином.
Рисунок 2. Влияние серотонина в концентрации 10-5 М на характер распределения Y. pestis EV НИИЭГ по клеточному циклу.
Проведенный нами впервые проточно-цитофлуориметрический мониторинг относительного содержания ДНК в клетках Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом в условиях культивирования при 37 С на питательных средах в присутствии серотонина также показал наличие активирующего воздействия серотонина на генетический аппарат клеток чумного микроба.
С применением проточно-цитофлуориметрического анализа нами в условиях культивирования при 37 С установлена возможность влияния серотонина на экспрессию видоспецифических антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена) клетками штамма Y.pestis EV НИИЭГ и Y. pestis КМ216 (pPst+), детектируемых с помощью коммерческого препарата иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных, в сторону ее усиления.
Обнаружено увеличение процентного содержания клеток с повышенной интенсивностью свечения.
При сравнительном изучении влияния серотонина в SDS-PAGE на электрофоретический профиль белков цельно-клеточных лизатов штаммов чумного микроба с различным плазмидным составом было обнаружено, что все культуры, независимо от того, содержат ли они одну (Y. pestis КМ216), три (Y.pestis EV), или ни одной (Y. pestis КМ218) плазмиды, синтезируют полипептид молекулярной массы 22 кДа, что согласуется с литературными данными [Заднова С.П., 1998].
Обнаружено, что культивирование Y. pestis на агаре Хоттингера рН 7,2, обработанном 10-5 М серотонина, приводило почти к исчезновению на тестируемых протеинограммах мажорного белка с молекулярной массой кДа, выявляемого в лизатах культур Y. pestis EV, Y. pestis КМ218 и Y. pestis КМ216, выращенных на этой же среде, но без серотонина (рисунок 3).
М - маркеры (белки с известной молекулярной массой);
1 - бактерии выращены на агаре Хоттингера;
2 - бактерии выращены на агаре Хоттингера с серотонином;
3 - бактерии выращены на агаре Хоттингера с лизированной кровью;
4 - бактерии выращены на агаре Хоттингера с лизированной кровью и серотонином.
Рисунок 3. Электрофореграмма цельно-клеточных лизатов клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при 28 С в течение 24 ч.
Выявленный нами ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида с молекулярной массой 22 кДа имеет, по-видимому, немаловажное значение для адаптации и реализации патогенного потенциала чумного микроба на начальных этапах инфекционного процесса.
Не исключено также, что данный эффект может быть реализован в условиях биопленки Y. pestis в блохах, так как клетки чумного микроба, выделенные из биопленки, обладают повышенной резистентностью к фагоцитозу полиморфноядерными лейкоцитами крови человека именно на стадии захвата, а внеклеточный матрикс, образующий оболочку биопленки Y.pestis, включает форменные элементы поглощенной блохой крови, в состав которых входят тромбоциты, депонирующие серотонин. Вследствие разрушения и агрегации тромбоцитов происходит высвобождение серотонина, способного к реализации своего модулирующего действия. В пользу высказанного предположения свидетельствует также факт отсутствия продукции чумным микробом при нахождении в блохе таких антифагоцитарных факторов, как капсульный антиген Ф1 и секретируемые белки Yop [Jarret C.O. et al., 2004].
Нами впервые с применением проточной цитофлуориметрии в модельной системе in vitro получены новые данные о влиянии биогенного амина серотонина на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y.enterocolitica).
Установлено, что серотонин замедляет in vitro развитие раннего (через ч) и стимулирует проявление позднего (через 24 ч) апоптоза лейкоцитов крови человека в ответ на клетки вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенные при 28 С. Серотонин в 2 раза снижал интенсивность раннего апоптоза лейкоцитов крови человека в ответ на клетки Y. pseudotuberculosis I серовара, независимо от температуры их выращивания, и не оказывал достоверного воздействия на развитие раннего и позднего апоптоза, индуцированного Y. pseudotuberculosis IV серовара. Под влиянием серотонина зарегистрировано более чем двукратное увеличение интенсивности развития позднего апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного клетками штамма Y. enterocolitica 383 09 серовара, лишенного плазмиды кальцийзависимости (рисунок 4).
В нашей работе, как и в исследованиях других авторов [Шмелькова Т.П.
и др., 2007], наблюдалось развитие позднего апоптоза лейкоцитов крови человека под действием Y. pestis и Y. pseudotuberculosis I серовара, относящихся к одной эволюционной линии и вызывающих заболевания, часто сопровождающиеся острым течением инфекции [Гаева А.В., 2002].
Физиологические концентрации серотонина, освобождающиеся при разрушении и агрегации тромбоцитов в очаге воспаления могут быть достаточны для оказания модулирующего действия на развитие апоптоза эукариотических клеток, запускаемого патогенными иерсиниями.
Как показали результаты нашего исследования, серотонин в концентрации 10-5 М оказывает в условиях in vitro различной степени влияние на апоптоз лейкоцитов, индуцируемый в крови человека представителями рода Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.
Контроль Y.enterocolitica 383 + С Y.enterocolitica 1 Ось абсцисс - относительное содержание ДНК на клетку в условных единицах интенсивности флуоресценции;
ось ординат - количество лейкоцитов.
1- гиподиплоидные клетки (менее 2С ДНК);
2 - диплоидные клетки (2С ДНК);
3- пролиферирующие клетки (более 2С ДНК). Срок инкубации 24 ч при 37 С.
Рисунок 4. Влияние серотонина на индуцируемый Y. enterocolitica апоптоз лейкоцитов крови человека Механизм модулирующего действия биогенного амина серотонина на развитие апоптоза под влиянием патогенных иерсиний может быть связан с одной стороны, с изменением экспрессии поверхностных антигенов под влиянием серотонина, что было показано нами на примере чумного микроба, а с другой – с интенсивностью выработки цитокинов лейкоцитами, изменением экспрессии молекул, участвующих в связывании лигандов TLR (таких как CD14) и опосредующих эффекторные функции клеток (молекул адгезии, рецепторов хемокинов, костимуляторных молекул) [Хорева М.В., 2006].
Полученные новые сведения, несомненно, имеют важное значение для понимания патогенеза вызываемых Yersinia spp. инфекций и могут быть использованы при разработке новых подходов в их комплексной терапии.
Нами также, впервые in vitro и in vivo с применением проточно цитофлуориметрического метода цитологического анализа установлено непосредственное участие серотонина в механизмах модуляции апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, изменений состояния ядерного хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных клеток в динамике формирования иммунного ответа биомодельных животных в условиях иммунизации вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ и капсульным антигеном чумного микроба (Ф1), а также индуцированного in vitro Y. pestis апоптоза лейкоцитов крови.
Показано, что серотонин в концентрации 10-5 М в первые 6 ч замедляет in vitro развитие индуцированного Y. pestis апоптоза лейкоцитов крови интактных биомоделей, что создает благоприятные условия для роста и размножения чумного микроба в организме хозяина и связано с влиянием антигенов, синтезируемых при 37 С, в первую очередь капсульного антигена (Ф1). В иммунном организме модулирующее действие серотонина проявлялось лишь через 24 ч и имело противоположную направленность.
Иммунизация мышей BALB/c вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ индуцировала в течение первой недели активацию ядерного хроматина лейкоцитов крови. Доля клеток с активированным ядерным хроматином достоверно повышалась в крови на 1-е и 7-е сутки иммуногенеза.
Одновременно регистрировалось увеличение относительного содержания клеток с активированным лизосомальным аппаратом с 19 % до 72 % на 1-е сутки и до 77,4 % – на 7-е сутки (p0,05). К 21-м суткам данные показатели были несколько меньше исходных значений.
Примирование серотонином приводило к увеличению в крови более чем в 2 раза доли клеток с активированным ядерным хроматином на 1-е сутки и заметному снижению ее на 7-е и 21-е сутки с момента вакцинации. Напротив, среди перитонеальных клеток, полученных путем промывания средой брюшной полости мышей BALB/c на 21-е сутки с момента вакцинации Y. pestis EV НИИЭГ на фоне примирования серотонином, в 1,85 раза увеличивалась доля клеток с активированным хроматином (p0,05).
Введение серотонина перед иммунизацией вакцинным штаммом чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ приводило к снижению степени реактивности лизосомального аппарата клеток иммунофагоцитарной системы, что проявлялось значительным уменьшением в крови и перитонеальной полости доли клеток с интенсивной красной флуоресценцией лизосомальных гранул в течение всего периода наблюдения.
Примирование серотонином биомодельных животных за 30 минут до их иммунизации Y. pestis EV сопровождалось достоверным повышением пролиферативной активности лейкоцитов крови и спленоцитов на ранней стадии вакцинального процесса (1-е сутки). Следует отметить, что в центральном органе иммунной системы тимусе доля пролиферирующих тимоцитов под воздействием серотонина снижалась на 7-е сутки иммуногенеза на фоне повышенного количества гиподиплоидных клеток ( 2С ДНК). По видимому, под влиянием серотонина происходит повышение интенсивности отрицательной клональной селекции Т-клеток в ответ на иммунизацию Y. pestis EV, что согласуется с данными Л.С. Елисеевой (1984) о выраженном модулирующем действии серотонина на Т-клеточное звено иммунитета и изменение соотношения Т- и В-лимфоцитов в сторону увеличения последних.
Как показали результаты наших исследований, иммунизация на фоне примирования серотонином приводила к четырехкратному увеличению титров сывороточных антител к капсульному антигену чумного микроба ФI, выявляемых в системе реакций РНГА – РТНГА.
На фоне примирования серотонином, иммунизация углеводсодержащим препаратом капсульного антигена Ф1 нелинейных белых мышей сопровождалась достоверным повышением в крови доли клеток с активированным хроматином при одновременном уменьшении ее в перитонеальной полости. Напротив, при иммунизации примированных серотонином в концентрации 10–5 М белых мышей белковым препаратом Ф наблюдалась тенденция к уменьшению доли лейкоцитов крови с активированным хроматином без достоверных изменений состояния перитонеальных клеток по исследуемому показателю.
Независимо от препарата капсульного антигена чумного микроба подкожное введение 10–5 М серотонина за 30 мин до иммунизации индуцировало снижение относительного содержания лейкоцитов крови с активированным лизосомальным аппаратом.
Следует отметить, что в условиях повышенной реактивности клеток иммунной системы на углеводсодержащий препарат капсульного антигена чумного микроба, интенсивно воздействующий на метаболизм макрофагов и более протективный для мышей [Ермакова Г.В., 1990], обладающий достоверно более высоким эффектом стимуляции колониеобразующей функции стволовых клеток [Щуковская Т.Н. и др., 1999], модулирующее действие серотонина было наиболее выраженным.
Таким образом, полученные в результате проведенных исследований новые сведения о влиянии серотонина на рост Y. pestis, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), электрофоретический профиль белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба ФI, активатора плазминогена), а также индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток организма хозяина, свидетельствуют о реальной возможности использования возбудителем чумы биогенного амина серотонина, являющегося компонентом микроокружения в месте входных ворот чумной инфекции, для создания условий, направленных на ускорение адаптации его к внутренней среде организма хозяина и способности противостоять системе антиинфекционной защиты макроорганизма.
ВЫВОДЫ 1. Биогенный амин серотонин в концентрации 10 -5 М оказывает стимулирующее влияние на рост чумного микроба на стандартно используемых для его культивирования жидких и плотных питательных средах (бульон и агар Хоттингера рН 7,2;
агар Хоттингера рН 7,2 с лизированной кровью и генцианвиолетом), не оказывая при этом значимого влияния на тинкториальные, культурально-морфологические свойства и морфометрические показатели чумного микроба.
2. С применением серотонина разработан способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включая объекты внешней среды, который позволяет увеличить число колониеобразующих единиц (КОЕ) чумного микроба в 1,5–5,5 раза и значительно сократить (до 24 ч) сроки биологического накопления возбудителя чумы из нативного материала.
3. Биогенный амин серотонин в концентрации 10-5 М индуцирует по данным проточной цитофлуориметрии увеличение числа клеток с интенсивной ДНК-флуоресценцией, оказывает влияние на экспрессию видоспецифических антигенов чумного микроба (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), детектируемых с помощью коммерческих препаратов иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных, в сторону ее усиления.
4. Выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида с молекулярной массой 22 кДа клетками Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных Y. pestis КМ218, Y. pestis КМ216 в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 С в течение 24 ч.
5. Серотонин в концентрации 10-5 М оказывает различной степени влияние на индуцируемый Yersinia spp. апоптоз лейкоцитов крови in vitro.
Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.
Cеротонин ингибирует развитие раннего (через 6 ч) апоптоза лейкоцитов крови человека под действием близкородственных бактерий Y. pestis и Y.pseudotuberculosis I серовара.
6. Установлено, что примирование серотонином биомоделей (мыши BALB/c, нелинейные белые мыши) до иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, различными препаратами капсульного антигена чумного микроба (ФI) влияет на характер развития процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина, лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов, интенсивность и направленность которых зависят от вида иммунизирующего препарата.
7. Полученные новые сведения о влиянии серотонина на рост Y. pestis, перераспределение по клеточному циклу, электрофоретический профиль белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток организма хозяина, свидетельствуют о реальной возможности использования возбудителем чумы биогенного амина серотонина, являющегося компонентом микроокружения в месте входных ворот чумной инфекции, для создания условий, направленных на ускорение адаптации его к внутренней среде организма хозяина и способности противостоять системе антиинфекционной защиты макроорганизма.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Корсуков В.Н., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Клюева С.Н., Попов Ю.А. Действие серотонина на размножение и содержание ДНК бактерий Yersinia pestis // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - 2002. Вып. 5.- С. 58 - 60.
2. Korsukov V.N., Schukovskaya T.N., Klueva S.N., Kravtsov A.L., Polunina T.A., Popov Yu.A. The application of the flow cytometry for determination of the action of serotonin on the antigenic composition and amount of DNA of plague microbe, cultured at 37 C // Proc. SPIE. - 2002. - V. 5068 - P. 61 - 67.
3. Клюева С.Н., Корсуков В.Н., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Попов Ю.А. Модуляция серотонином свойств клеточной поверхности и содержания ДНК в клетках Yersinia pestis с различным плазмидным составом // Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ Микробиологии МОРФ. - Киров, 2003. - С.83.
4. Klueva S.N., Korsukov V.N., Schukovskaya T.N., Kravtsov A.L. Effect of serotonin on the expression of antigens and DNA levels in Yersinia pestis cells with different plasmid content // Proc. SPIE. - 2003. - V. 5474. - P. 361 - 368.
5. Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Кутырев В.В. Проточная цитометрия как новая технология современной клинической микробиологии // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всерос.
науч.- практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 125 - 126.
6. Киреев М.Н., Тараненко Т.М., Храмченкова Т.А., Кравцов А.Л., Гусева Н.П.. Полунина Т.А.. Подборонова Н.А., Клюева С.Н.. Шмелькова Т.П.
Структурно-функциональные свойства препаратов капсульного антигена Ф1 в процессе хранения // Биотехнология. - 2005. - № 5. - С. 41 - 43.
7. Киреев М.Н., Кравцов А.Л., Тараненко Т.М., Храмченкова Т.А., Клюева С.Н., Гусева Н.П., Шмелькова Т.П. Сравнительная оценка методом проточной цитофлуориметрии степени активации клеток иммунофагоцитарной системы у мышей, иммунизированных различными препаратами капсульного антигена чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып.
2 (94). - С. 61 - 64.
8. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Задумина С.Ю., Бугоркова С.А., Клюева С.Н., Щуковская Т. Н. Азурофильная дегрануляция нейтрофилов крови in vitro у лиц, привитых живой чумной вакциной // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации:
Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 71 - 72.
9. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Лоцманова Е.Ю., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Феномен внеклеточной бактерицидности нейтрофилов и механизмы защиты бактерий от действия лейкоцитарной эластазы // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. - № 1. - С. 49 - 52.
10. Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н.
Экспериментальная система для изучения антифагоцитарных свойств возбудителей особо опасных инфекций // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. науч.-практ.
конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 232 - 234.
11. Щуковская Т.Н., Клюева С.Н., Кравцов А.Л., Козлова Е.А. Влияние биогенного амина серотонина на индуцированный иерсиниями in vitro апоптоз лейкоцитов крови человека // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. науч.-практ. конф.
государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 322 - 324.
12. Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Лоцманова Е.Ю., Кутырев В.В. Роль апоптоза в иммунопатогенезе особо опасных инфекций // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации: Матер. IX съезда Всерос.
науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2007. - Т. 1. - С. 118 -119.
13. Клюева С.Н., Кравцов А.Л., Тараненко Т.М., Щуковская Т.Н. Влияние серотонина на функциональную активность иммунокомпетентных клеток биомоделей, иммунизированных Yersinia pestis EV НИИЭГ или капсульным антигеном чумного микроба // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества независимых государств: Матер. IX Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С.
93 - 95.
14. Щуковская Т.Н., Клюева С.Н., Кравцов А.Л., Волох О.А., Алешина Ю.А., Кутырев В.В. «Влияние биогенного амина серотонина на рост и профиль белков чумного микроба в условиях культивирования на плотных питательных средах» // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - Вып.2 (96). - С. 35 - 39.
15. Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н.
Изучение взаимодействия чумного микроба с клетками крови в модельных системах in vitro // Методические документы и отчеты по санитарно эпидемиологической охране территории Российской Федерации - Саратов, 2008. - С. 43.