Особенности изменения метаболических процессов в крови, пече ни и миокарде на разных стадиях острого экспериментального панкреатита и их коррекция
На правах рукописи
ШИМУНОВ Герман Яковлевич Особенности изменения метаболических процессов в крови, пече ни и миокарде на разных стадиях острого экспериментального панкреатита и их коррекция 03.00.04-биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук
Ростов-на-Дону 2006
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении выс шего профессионального образования «Ростовский государственный меди цинский университет Федерального агентства по здравоохранению и соци альному развитию» Доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
Микашинович Зоя Ивановна доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Внуков Валерий Валентинович доктор медицинских наук, профессор Терентьев Владимир Петрович
Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии
Защита состоится «03» 11 2006 г. В 12 час. на заседании диссертационно го совета Д 208.082.01 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицин ском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета
Автореферат разослан «01» 10 2006 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, профессор Н.Я. Корганов
Общая характеристика работы
.
Актуальность темы.
В последнее десятилетие отмечен неуклонный рост частоты заболеваний поджелудочной железы (ПЖ) во всех индустриально развитых странах. По данным статистики на 10000 населения Земли 1 человек страдает патологией ПЖ (Н.Б. Губергриц, Л.А. Штода, К.Ю. Линевская и др., 1999;
Н.А. Яицкий, В.М. Седов, Р.А. Сопия, 2003).
Ведущая роль в структуре заболеваний ПЖ принадлежит панкреатитам.
На протяжении жизни одного врачебного поколения острый панкреатит (ОП) из заболевания казуистически редкого стал едва ли не самой частой формой «острого живота», уступая лишь аппендициту и холециститу (В.М. Лащев кер, 1982). Хронический панкреатит по данным разных авторов занимает до 9% от всех заболеваний пищеварительной системы у человека.
В современной панкреатологии проблема диагностики острого панкреатита одна из наиболее сложных и актуальных. Панкреанекроз, имевший в начале про шлого века славу одной из наиболее внушительных катастроф в брюшной полос ти, до настоящего времени остаётся заболеванием с непрогнозируемым исходом (С.А. Шалимов, М.Е. Нечитайло, А.И. Панков, 1992;
B.C. Савельев, В.А. Кубыш кин, 1993). В последнее время отмечается неуклонное возрастание частоты острого панкреатита в структуре хирургической патологии органов брюшной полости (В.И. Филин, А.Л. Костюченко, 1994;
Н.Б. Губергриц, Т.Н. Христич, 2000). Благо даря современным методам диагностики, лечения и профилактики, летальность при ОП в последние годы снизилась до 6 - 21%, однако, при деструктивных фор мах ОП эта цифра стабильно составляет 50 - 85% (Б.И. Альперович и др.,1991;
Б.С.
Граков и др., 1992;
И.Ф. Сырбу и др., 1993;
В.И. Филин, А.Л. Костюченко, 1994;
Н.Б. Губергриц, Т.Н. Христич, 2000). А если учесть, что по современным данным на долю деструктивных панкреатитов приходится примерно 20% от всех случаев ОП (С.З. Бурневич, Б.Р. Гельфанд, Б.Б. Орлов, Е.Ц. Цыденжапов, 2000), то эта цифра становится весьма ощутимой. Среди выживших больных у 73% возникает стойкая утрата трудоспособности, что придаёт данной проблеме неоспоримую социальную значимость, поскольку пик заболеваемости приходится на людей в возрасте 30 — 50 лет, то есть находящихся в активном трудоспособном возрасте (С.А. Шалимов, А.П. Радзиховский, М.Е. Нечитайло, 1990;
Н.А. Яицкий, В.М. Се дов, Р.А. Сопия, 2003).
Несмотря на существенные успехи в разработке факторов патогенеза ОП, многие вопросы остаются спорными, в том числе оценка роли биохимиче ских механизмов развития данного заболевания. Известно, что в периоды обострения воспалительного процесса в поджелудочной железе происходит активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), хотя до конца не ясна причина повышения интенсивности ПОЛ и его место в структуре факторов, повреждающих панкреациты (А.А. Гольдберг, 1987;
О.Б. Любицкий, Б.В.
Давыдов, И.В. Ельцинский и др., 1998;
Д.Б. Демин, 2000). Большинство учё ных считает, что причиной интенсификации ПОЛ при данной патологии яв ляются активированные фагоциты, продуцирующие активные формы кисло рода(К. Kusterer, 1995;
Е. Folch, D. Closa, N. Prats et al., 1998;
B. Poch, F.
Gansauge, B. Rau et al., 1999). До настоящего времени уделялось мало внима ния влиянию N0', вырабатываемого фагоцитами, на метаболизм в ткани ПЖ при панкреатитах. Учитывая широкий спектр биологических эффектов N0', таких как регуляция сосудистого тонуса, адгезия и агрегация тромбоцитов, передача межнейронального сигнала, проапоптогенное и бактерицидное дей ствие (И.Ю. Малышев, 1997;
А.Ф. Ванин, 2000;
К.Г. Гуревич, 2000;
С.Я.
Проскуряков, СИ. Бикетов, 2000) данные исследования могут оказаться по лезными для понимания патогенеза изучаемого заболевания. Обсуждается роль протеолитических ферментов, липазы, фосфолипазы, а также ряда дру гих факторов в активации ПОЛ (Л.А. Локшина, 1979;
А.А. Андреев, 1999;
А.В. Охлобыстин, 1999;
Н.Б. Губергриц, Г.М. Лукашевич, Ю.А. Загоренко и др., 2000;
B.C. Тарасенко и др. 2000;
Э.В. Луцевич, 2001).
Особый интерес представляет функциональное состояние различных ор ганов и систем при панкреатитах. Выявлена взаимосвязь патологии печени, почек, миокарда, лёгких и других органов с воспалением ПЖ (Г.П. Гидирим, 1980;
В.И. Ковальчук, 1982;
В.М. Лащевкер, 1990;
С.А. Шалимов, А.П. Рад зиховский, М.Е. Ничитайло, 1990;
И.П. Верещагин, 1996;
И.А. Криворучко, 1996;
Т. Arita, N. Matsunaga, К. Tanako et al., 1999;
K.J. Mortele, P.J. Mergo, H.M Taylor, 2000). Во всех этих работах недостаточно внимания уделяется молекулярным аспектам и патогенетической взаимосвязи между патологией ПЖ и поражением других органов.
В связи с тем, что в последнее время начинают широко применять и рек ламировать употребление препаратов цинка в больших дозировках при раз личных заболеваниях, мы поставили перед собой цель оценить влияние вы соких терапевтических доз сульфата цинка на крыс с острым эксперимен тальным панкреатитом. Обмен цинка при панкреатитах и влияние цинксодер жащих препаратов на течение данного заболевания остаётся малоизученным.
Исходя из того, что цинк используется в биосинтезе инсулина, входит в состав карбоангидразы, тканевой коллагеназы, лейцинаминопептидазы, карбоксипеп тидаз, супероксиддисмутазы, а также участвует в синтезе гема, который входит в структуру гемоглобина, цитохромов, каталазы, миелопероксидазы, №Г синтазы (Е.В. Печенникова, 1997;
А.В. Кудрин, 1998;
К.Г. Гуревич, 2002;
Л.В.
Авдеева, С.А. Воробьёва, 2003;
Л.Е. Андрианова, С.Н. Силуянова, 2003;
В.А.
Голенченко 2003), исследования связанные с данным микроэлементом при воспалительном процессе в ПЖ представляются своевременными и необходи мыми для повышения эффективности патогенетической терапии.
Наряду с медикаментозным лечением, нельзя игнорировать и физические методы терапии. Одним из прогрессивных и наиболее интересных в научном плане физиотерапевтических приборов на данный момент является СКЭНАР — самоконтролирующий энергонейроадаптивный регулятор, оказывающий импульсное электротерапевтическое воздействие на организм через нервные окончания кожных покровов. Нам представляется важным проверить эффек тивность СКЭНАР-терапии на модели острого экспериментального панкреа тита (ОЭП), так как его действие направлено на нормализацию нарушенных функций и оптимизацию гомеостаза. При этом известно, что эффективность методов лечения зависит не только от патогенеза заболевания, но и индиви дуальных особенностей организма.
Цель исследования:
На основании исследования основных биохимических параметров, харак теризующих функциональное состояние клеток крови, печени и миокарда, выяснить степень их вовлечения в патологический процесс на разных стади ях ОЭП и определить возможность коррекции метаболических сдвигов цин ксодержащими препаратами, а также оценить эффективность СКЭНАР терапии при ОП.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Отработать удобную и эффективную модель экспериментального острого панкреатита на крысах и определить выраженность дест руктивных процессов в ПЖ по показателям активностей фермен тов-маркёров цитолиза и морфологическим изменениям.
2. На основании исследования газотранспортной функции эритроци тов, направленности гликолитических процессов в эритроцитах и исследуемых органах оценить степень тканевой гипоксии.
3. Исследовать уровень активности ферментов антиоксидантной защиты в эритроцитах, печени и миокарде крыс при экспериментальном ОП.
4. Оценить метаболическую активность лейкоцитов по данным ак тивности миелопероксидазы и продукции NO'.
5. Выяснить эффективность корригирующего влияния цинксодержа щих препаратов и СКЭНАРа на анализируемые метаболические сдвиги.
Научная новизна.
Установлена связь между ОП, функциональным состоянием клеток кро ви, печени и миокарда, показана роль продукции оксида азота лейкоцитами в патогенезе ОП. Впервые разработана схема коррекции выявленных метабо лических нарушений с помощью СКЭНАРа и цинк-содержащих препаратов.
Выявлены сроки вовлечения миокарда, печени и эритроцитов в патологиче ский процесс у лабораторных животных. Показано изменение антиоксидант ного спектра при ОП в эритроцитах, печени и миокарде. Установлено нали чие тканевой гипоксии и компенсаторных процессов у лабораторных живот ных в динамике заболевания. Исследована активность КФК-МВ у экспери ментальных животных с травматической моделью ОП.
Научно-теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные данные могут быть использованы в своевременной профи лактике печёночных и, что особенно важно, сердечных осложнений. На ос новании выявленных молекулярных изменений в различных органах и крови уточнена патогенетическая картина формирования экспериментального пан креатита. Выявленные закономерности ранних метаболических сдвигов по зволяют отобрать наиболее чувствительные параметры для своевременного прогнозирования тяжести процесса и формирования патогенетически обос нованной программы лечения.
Апробация работы и публикации.
Основные положения диссертации представлены на Четвёртой конферен ции гастроэнтерологов южного федерального округа (Кисловодск, 2004), IV Научной сессии РостГМУ (Ростов-на-Дону, 2004), Одиннадцатой российской гастроэнтерологической неделе (симпозиум РОЭПС) (Москва, 2005), конфе ренции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005), доложены на 58-й Итоговой научной конферен ции студентов, молодых ученых и специалистов РостГМУ (2004), 59-й Ито говой научной конференции студентов, молодых ученых и специалистов Ро стГМУ (2005), Четвёртой межвузовской международной научно практической конференции студентов, молодых учёных и специалистов «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2005), Пя той межвузовской международной научно-практической конференции сту дентов, молодых учёных и специалистов «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2006).
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 в центральной пе чати. Оформлена заявка на изобретение «Способ моделирования острого некротического панкреатита» № 2005116418/14(018744). Получено решение о выдаче патента на изобретение (06. 05. 2006).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. При ОЭП в 1 - 3 сутки наблюдаются депрессия биоантиоксидантных ферментов и снижение уровня восстановленного глутатиона в миокар де и эритроцитах крыс, достигающие наибольшей выраженности к ме сячному сроку.
2. В печени крыс с ОП выявлено достоверное увеличение активности ка талазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы и концентрации восстановленного глутатиона, что указывает на активацию антиокси дантной защиты клетки.
3. Увеличение синтеза оксида азота фагоцитами и усиление миелоперок сидазной активности плазмы в динамике ОЭП свидетельствует об ак тивации антибактериальной функции лейкоцитов.
4. Дозировки сульфата цинка, превышающие физиологические концен трации, неблагоприятно влияют на антиоксидантный статус эритроци тов и функциональное состояние миокарда при ОЭП.
5. После воздействия аппаратом СКЭНАР регистрируется уменьшение выраженности тканевой гипоксии крыс с ОП, а также снижается вы раженность деструктивных процессов в тканях миокарда и печени.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страни цах машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами и 28 рисунками.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава № 1), общей ха рактеристики материала и методов исследования (глава № 2), изложения по лученных результатов (главы № 3, № 4, № 5, № 6, № 7), обсуждения полу ченных результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографи ческого списка, включающего 281 источник, в том числе 130 отечественных и 151 зарубежных.
Содержание работы.
Материалы и методы исследования.
Эксперимент проводили на белых беспородных крысах обоего пола с со блюдением правил, предусмотренных Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов. Крысы находились в стандартных условиях с есте ственной сменой освещения и соблюдением общевиварийного рациона. У всех животных был свободный доступ к пище и воде.
Для моделирования ОП животным экспериментальной группы под эфир ным наркозом проводили срединную лапаротомию, выделяли ПЖ и вводили в её толщу 0,2 мл 1% раствора тритона-Х-100 по принципу метода, предло женного Э.С. Гульянц с соавторами (авторское свидетельство № 1327152 от 01. 04. 1987 г.;
Ю.А. Калмыкова, 1991). Операционную рану затем зашивали послойно наглухо. Контрольная группа состояла из двух подгрупп: интакт ные и животные, которым была сделана только лапаротомия - ложно опери рованные крысы (ЛО). Определение показателей проводили на первые, тре тьи, десятые сутки и через месяц.
Изменения в ткани ПЖ, трактуемые как ОП, подтверждены гистологиче ским исследованием, проведённым на базе морфологического центра Рост ГМУ. Для гистологического исследования кусочки ПЖ экспериментальных крыс фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы окрашивались гематоксилином-эозином. Забор материала проводился через 3, 10 и 30 суток после введения тритона-Х-100 в ткань ПЖ.
Для определения влияния сульфата цинка на метаболические процессы в крови крыс ежедневно с момента моделирования ОП поили водным раство ром сульфата цинка;
сульфат цинка очень легко растворим в воде, после приёма внутрь цинк хорошо абсорбируется в тонкой кишке (до 60% всасыва ется в 12-перстной кишке и около 20% - в тощей и подвздошной) (М.Д.
Машковский, 2002;
«Лекарственные препараты в России: Справочник Ви даль», 2003). Каждая крыса из группы коррекции получала 1 мг препарата в сутки, что в перерасчёте на человека массой 70 кг составляет 300 мг.
С целью исследования влияния СКЭНАР-терапии на метаболические сдвиги у лабораторных животных с ОП сконструирована специальная клетка (профессор, д.м.н. А.В. Тараканов), благодаря которой можно воз действовать импульсными токами данного аппарата (ОКБ «Ритм» СКЭНАР 97.4 PDS) на внутреннюю поверхность лапок крыс, подбирая необходимую энергию воздействия, не вызывающую болевого шока у животных при частоте 60 Гц. СКЭНАР-терапия проводилась ежедневно (однократно - 15 минут) на протяжении 10 дней, начиная с 1-го дня после введения тритона-Х-100 в ПЖ крыс.
В указанные сроки после моделирования ОП производили декапитацию лабораторных животных с целью получения крови. Гепаринизированную кровь разделяли на плазму, эритроциты и лейкоциты.
Для исследования биохимических показателей в органах экспериментальных животных сразу после декапитации производили вскрытие брюшной полости и грудной клетки, извлекали печень и миокард для приготовления гомогенатов, предварительно отмыв органы физиологическим раствором от крови. Перед го могенизированием органы крыс сразу же помещались на лёд и стандартизова лись по весу. Гомогенаты тканей готовили с холодным физиологическим рас твором в соотношении 1:10, после чего производилось центрифугирование ( минут со скоростью 1500 оборотов в минуту) для осаждения грубых частиц тка ней и получения рабочих супернатантов. Для решения планируемых задач ис следования использованы следующие методы:
1. Оценка состояния газотранспортной функции эритроцитов и выражен ности гипоксии:
• определение 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) по методу Dyse, Bessman в модификации И.С. Лугановой, М.Н. Блинова, 1975 г.;
• определение молочной кислоты по методу Баркер и Саммерсон в описании МИ. Прохоровой и З.Н. Тупиковой, 1965 г.
2. Определение активности ферментов антиоксидантной защиты:
• супероксиддисмутазы (СОД) по методу Н.Р. Mistra и J. Fridovich, 1972 г. в модификации, проведенной на кафедре общей и клиниче ской биохимии № 1 РостГМУ;
• каталазы по методу Королюк и др., 1988 г.;
• глутатионпероксидазы (ГПО) по методу В.М. Моина, 1986 г.;
• глутатионредуктазы (ГР) по методу Л.Б. Юсуповой, 1989 г.;
• определение концентрации восстановленного глутатиона (Г-SH) ме тодом G.L. Ellman, 1959 г.
3. Определение активности маркёров цитолиза:
• -амилазы в плазме крови лабораторных животных амилокластиче ским методом со стойким крахмальным субстратом по Каравею с использованием стандартного набора реактивов «КлиниТест-Альфа амилаза».
• активности МВ-фракции креатинфосфокиназы (КФК-МВ) в плазме крови энзиматическим кинетическим иммунологическим методом с использованием стандартного набора реактивов «Ольвекс Диагно стикум».
4 Анализ молекулярных механизмов фагоцитоза:
• активность миелопероксидазы по методу Klebanoff, описанному М.Г. Шафран, С.Н. Лызловой, 1975 г.;
• продукции NO-радикала (NO') мононуклеарными клетками крови методом Ю.В. Шебзухова и соавт., 1998 г.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась соглас но общепринятым методам с определением средней арифметической, ошиб ки средней. Статистическую обработку данных проводили методом вариаци онной статистики на компьютере IBM, совместимом с использованием спе циального программного обеспечения (диалоговая статистическая система STADIA 6.0) (А.П. Кулайчев, 1996). Достоверность различий между иссле дуемыми группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента после про верки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие величине ошибки достоверности p0,05.
Результаты и их обсуждение.
Метаболические изменения в миокарде при остром панкреатите Клинические наблюдения и лабораторные данные говорят о том, что при ОП нарушается сердечная деятельность. Но поражения происходят на раз личном уровне - у одних больных всё ограничивается функциональной не достаточностью с изменениями только на ЭКГ, у других же пациентов в про цессе ОП на поздних этапах его течения возникают осложнения в виде тяжё лых органических поражений миокарда. Вопрос о причинах нарушения сер дечной деятельности и способах её предотвращения при ОП остаётся откры тым. Важными на наш взгляд являются вопросы профилактики органических поражений миокарда у больных с ОП на ранних этапах заболевания.
По результатам наших исследований уровень активности антиоксидант ных ферментов в миокардиоцитах крыс с ОП достоверно снижается, начиная уже с 1 — 3-х суток после моделирования данного заболевания. И по мере увеличения сроков продолжает снижаться. Через месяц у крыс с ОП актив ность каталазы снижается на 82.14% (p0.05) по сравнению с ЛО животны ми. Активность СОД и ГР через месяц снижается на 78.31% (p0.05) и 67.77% (p0.05) соответственно. Наряду с этим, активность ГПО в миокар диоцитах возрастает. Такие изменения в системе глутатионовых ферментов приводят к уменьшению содержания восстановленного глутатиона в миокар де крыс с ОП, уровень которого уже через сутки после моделирования ЭОП падает на 16.38% (p0.05) по отношению к ЛО и остаётся пониженным до месячного срока. Учитывая современные представления о вкладе восстанов ленного глутатиона в детоксикационную функцию организма и роль эндо генной интоксикации в патогенезе острого панкреатита, данные изменения могут привести к серьёзным последствиям и нарушению функции миокарда при данной патологии. Важно отметить, что снижение Г-SH может привести к угнетению активности КФК-МВ, поскольку активность КФК зависит от присутствия свободных сульфгидрильных групп (Дж. Уилкинсон, 1968).
Метаболические изменения в печени при остром панкреатите По сравнению с миокардиоцитами гепатоциты находятся в более выгод ном положении - они имеют наиболее развитую систему детоксикации и ан тиоксидантной защиты. Но, с другой стороны, кровь от ПЖ оттекает в систе му воротной вены и, таким образом, через печень проходят огромные коли чества токсинов и поражающих агентов при ОП. Активные ферменты ПЖ и образующиеся токсины в процессе ОП проходят через печень, попадая в ней через портальную и лимфатическую системы, а также через жёлчные пути, оказывая влияние на микроструктуру и функцию этого органа.
Изменения активности каталазы и СОД у крыс опытной группы по отно шению к ЛО однонаправлены вплоть до месячного срока. Активность СОД к 3-м суткам достоверно повышается на 46.72% (p0.05), а активность каталазы достоверно стимулируется уже к 1-м суткам на 45.41% (p0.05) и к 3-м суткам на 78.17% (p0.05). К 10-м суткам активность этих ферментов приближается к показателям у интактных крыс. К месячному же сроку активность каталазы остается практически такой же, а активность СОД достоверно падает ниже уровня данного фермента у интактных животных на 18.76% (p0.05).
Наиболее выраженные сдвиги в системе глутатионовых ферментов и со держании восстановленного глутатиона в печени крыс происходят на ранних сроках развития ОП, особенно на 3-й сутки после моделирования ОП. Со держание Г-SH к данному сроку возрастает на 33.06% (p0.05) по отноше нию к ЛО крысам. Активность ГР возрастает к 3-им суткам на 23.03% (p0.05). Активность ГПО печени экспериментальных крыс с ОП по отноше нию к ЛО остаётся достоверно сниженным вплоть до 10-х суток: на 48.30% (p0.05) к 1-м суткам, на 53.59% (p0.05) к третьим суткам и на 35.37% (p0.05) к 10-тидневному сроку. Через месяц после моделирования ОП все вышеперечисленные показатели возвращаются к исходным величинам, полу чаемым у контрольной группы.
Метаболические изменения в крови при остром панкреатите Особенностью гликолиза в эритроцитах является наличие шунта, приво дящего к образованию 2,3-ДФГ - аллостерического регулятора сродства ге моглобина к кислороду.
Содержание 2,3-ДФГ и молочной кислоты в эритроцитах ЛО крыс по сравнению с интактными крысами достоверно не различается. Уровень 2,3 ДФГ в эритроцитах крыс с ОП остаётся повышенным на протяжении всего эксперимента с максимумом на 3-й сутки: в 1-е сутки содержание 2,3-ДФГ достоверно возрастает на 26.35% (p0.05), к 3-м суткам - на 96.55% (p0.05), к 10-м и 30-м суткам - соответственно на 59.09% (p0.05) и 43.74% (p0.05).
При этом содержание лактата на ранних сроках эксперимента у крыс с ОП остаётся приближенным к показателям контрольной группы и, начиная с 10-х суток, достоверно возрастает: через 10 дней на 54.74% (p0.05) и через месяц на 94.56% (p0.05). Нужно отметить, что повышение содержания лактата в эритроцитах экспериментальных животных с ОП происходит на фоне сниже ния уровня 2,3-ДФГ, хотя его содержание остаётся достоверно повышенным по сравнению с ЛО животными.
Полученные данные показывают, что в ответ на развившуюся гипоксию возникает компенсаторная реакция со стороны клеток красной крови в виде повышения синтеза 2,3-ДФГ, играющего адаптационную роль, уменьшая сродство гемоглобина к кислороду, что облегчает переход кислорода в клет ки тканей.
Таким образом, полученный материал свидетельствует о развитии ком пенсаторно-приспособительной реакции у крыс с экспериментальным ОП.
Интересно отметить, что в эритроцитах, для которых бескислородное окисление глюкозы - единственный способ получения энергии, активизиру ется анаэробный гликолиз, о чём можно судить по содержанию молочной кислоты в этих клетках. Если клетки начинают усиленно продуцировать лак тат, это является свидетельством, что они испытывают кислородное голода ние. Аналогичная же динамика лактата в случае с эритроцитами на наш взгляд отражает активацию гликолиза для усиленного синтеза 2,3-ДФГ, не обходимого для снижения гипоксии, и активизации пентозофосфатного шун та с целью защиты собственной мембраны и гемового железа от активных форм кислорода. Таким образом, реакция эритроцитов на развитие ОП в виде усиленного образования лактата можно расценивать как интенсификацию метаболических процессов в этих клетках, а также как отражение генерали зованной гипоксии в организме.
Антиоксидантная система эритроцитов крыс с ОП страдает, начиная уже с первых-третьих суток эксперимента. Наблюдается депрессия биоантиокси дантов - каталазы и СОД - на протяжении всего эксперимента с максимумом, приходящимся на 10 - 30-е сутки. Эритроциты содержат богатые запасы глу татиона, причём 95% приходится на восстановленную форму. В норме прак тически весь глутатион ассоциирован с форменными элементами крови, а в плазме отсутствует. Из клеток эритроидного ряда самый высокий уровень Г SH отмечается в ретикулоцитах (М.В. Кения и соавт., 1993;
Д.В. Черданцев, Ю.С. Винник, 2002). При ОЭП нарушается метаболизм глутатионовых фер ментов и падает концентрация самого Г-SH. Активность эритроцитарной ГР остаётся достоверно сниженной по отношению к ЛО: на 21.88% (p0.05) к 1 м суткам, нa 21.20%( p0.05) к 3-м суткам, на 19.29 (p0.05) через 10 дней и на 36.57% (p0.05) через месяц. Сродство к перекиси водорода у ГПО намно го выше, чем у каталазы. Учитывая тот факт, что место действия ГПО — ци топлазма, в физиологических условиях основная масса перекиси водорода, образующейся в процессе жизнедеятельности эритроцитов, разрушается ГПО, а при патологическом возрастании концентрации перекиси водорода её начинает активно разрушать каталаза (Л.Ф. Панченко и соавт., 1981;
К. Kothe et al., 1975). Активность эритроцитарной ГПО у экспериментальных крыс с ОП по сравнению с ЛО на протяжении всего эксперимента остаётся досто верно сниженной: на 7.98% (p0.05), 10.31% (p0.05), 11.11% (p0.05) и 8.45% (p0.05) соответственно через 1, 3, 10 и 30 суток. Причём наиболее выраженное снижение соответствует 10-м суткам.
Известно, что в периоды обострения воспалительного процесса в подже лудочной железе происходит активация ПОЛ, хотя до конца не ясна причина повышения интенсивности ПОЛ и его место в структуре факторов, повреж дающих панкреациты и другие клетки организма (А.А. Гольдберг, 1987;
О.Б.
Любицкий, Б.В. Давыдов, И.В. Ельшанский и др., 1998;
Д.Б. Демин, 2000).
Большинство учёных считает, что причиной интенсификации ПОЛ при дан ной патологии являются активированные фагоциты, продуцирующие актив ные формы кислорода (К. Kusterer, 1995;
Е. Folch, D. Closa, N. Prats et al., 1998;
В. Poch, F. Gansauge, B. Rau et al., 1999). До настоящего времени уделя лось мало внимания фагоцитарному NO' в патогенезе ОП. Острое воспаление ПЖ - это процесс, в который вовлекается практически весь организм. Из вестно, что цитокины и другие медиаторы воспаления стимулируют продук цию NO' макрофагами, моноцитами, гладкомышечными клетками.
Усиленная выработка NO' активными фагоцитирующими клетками у крыс с ОЭП наблюдалась на протяжении всего экспериментального периода с максимумом, приходящимся на 1 месяц: в 1-е сутки продукция NO' возраста ет на 31.73% (p0.05), к 3-м суткам - на 23.91% (p0.05), через 10 дней - на 29.80% (p0.05) и через месяц - на 56.43% (p0.05). Образовавшийся NO' в условиях оксидативного стресса, имеющего место при ОП, с наибольшей скоростью реагирует с супероксидным анионом и переходными металлами:
гемовыми комплексами железа и меди, железосерными структурами. Реакция NO' с супероксидом протекает с большой скоростью, при этом образуется пероксинитрит - высокореакционное вещество. Учитывая повышенную ак тивность фагоцитирующих клеток при ОЭП через 10 суток и 1 месяц после моделирования заболевания, а также депрессию основных антиоксидантных ферментов эритроцитов, можно предположить формирование всех вышепе речисленных факторов агрессии (взаимодействие NO' и супероксидного аниона с образованием пероксинитрита и вытекающими из этого последст виями, образование метгемоглобина).
По нашим данным лейкоциты при ОЭП усиливают свою активность не только в отношении синтеза NO' (активация макрофагальной NO'-синтазы), но также и МПО, при участии которой катализируется реакция с образовани ем гипохлорит-ионов, обладающих бактерицидным действием. Исходя из того, что в нашем случае ОЭП был условно асептическим, повышение актив ности МПО у животных с ОП говорит в пользу мнения некоторых авторов, которые считают, что даже в случае асептического ОП возникает интоксика ция условно-патогенной микрофлорой или продуктами их жизнедеятельно сти (B.C. Тарасенко, В.И. Никитенко, В.А. Кубышкин, 2000;
L. Gianotti, M.
Braga, J.W. Alexander, 1995). Активность МПО достоверно повышается на 10-е сутки в плазме животных с ОЭП по отношению к ЛО на 36.36% (p0.05) и через месяц на 70.56% (p0.05).
В плазме крови животных с ОЭП определяются такие маркеры цитолиза, как -амилаза и КФК-МВ. Исследование на -амилазу является стандартным и общепринятым при ОП. В наших исследованиях активность -амилазы плазмы крови крыс с ОЭП по отношению с ЛО животными достоверно по вышается на 47.68% (p0.05) к 1-м суткам, на 67.20 % (p0.05) к 3-им суткам и на 36.69% (p0.05) через 10 дней. К месячному сроку активность -амилазы снижается, хотя остаётся повышенной по отношению к контрольной группе на 20.95% (р0.05), что свидетельствует об усилении повреждения ткани ПЖ и потери ею большого процента своей функциональной активности. Дейст вительно, на снимках гистологических препаратов ПЖ крыс с ОП месячного срока видно замещение очагов некроза грануляционной тканью.
Определение активности КФК-МВ в плазме крови экспериментальных животных позволило составить нам более достоверную картину о состоянии миокарда при данной патологии. Активность данного фермента достоверно повышается на 10-е сутки после моделирования ОП на 46.67% (p0.05) по сравнению с ЛО животными. Максимальное повышение активности КФК МВ в плазме крови крыс с ОП наблюдается к месячному сроку и составляет 106.25% (p0.05) по сравнению к ЛО крысам. На 1-е и 3-й сутки от начала эксперимента у крыс с ОП также наблюдается тенденция к повышению дан ного фермента в плазме крови по отношению к ЛО на 15.21% (0.05р0.1) и 16.39 (р0.05) соответственно. Полученные данные (в том числе и получен ная информация об антиоксидантной обеспеченности миокардиоцитов на разных стадиях ОЭП), свидетельствуют о том, что миокард вовлекается в патологический процесс, начиная уже с 1-х суток после моделирования ОП.
Влияние сульфата цинка на метаболические процессы в крови при остром панкреатите В рамках данной работы проводилась коррекция ОЭП крыс сульфатом цинка и СКЭНАРом. Исследования проводились на 10-е сутки после моде лирования заболевания, поскольку на данном этапе эксперимента выявлены наиболее значимые изменения определяемых показателей у крыс с ОЭП по сравнению с ЛО животными.
Цинк (Zn) относится к группе незаменимых микроэлементов наряду с же лезом (Fe), йодом (I), медью (Сu), марганцем (Мn), кобальтом (Со), молибде ном (Мо), селеном (Se), хромом (Сr) и фтором (F). Его регулярное поступление с пищей или водой в организм абсолютно необходимо для нормальной жизнедея тельности. По современным представлениям цинк входит в состав более металлоферментов, витаминов, гормонов и других биологически активных ве ществ, что говорит о его участии практически во всех видах обмена веществ в организме млекопитающих. В дозировке до нескольких мг цинк входит во многие витаминные, минеральные и смешанные комплексы. В последнее вре мя стали появляться лекарственные средства, представляющие собой моно препараты цинка в виде его солей (чаще сульфат или окись) в высоких дози ровках (в среднем 150 мг), которые рекомендуют принимать по 2-3 раза в день, в том числе и при патологии желудочно-кишечного тракта, включая патологию ПЖ. Такое количество цинка, несопоставимо с физиологической потребностью человеческого организма;
в норме человеку требуется потреблять с пищей около 15 мг цинка в сутки, из которых примерно 10 мг выводится из организма) (М.Д.
Машковский, 2002;
Е.В. Печенникова, В.В. Вашкова, Е.А. Можаев, 1997;
К.Г.
Гуревич, 2002;
Е.В. Ших, 2004). В данной работе представлены результаты ис следования влияние доз сульфата цинка, превышающих физиологические по требности, на метаболические процессы в крови у крыс с ОЭП.
У крыс с ОП, получавших сульфат цинка уровень 2,3-ДФГ возрос на 37.87% (р0.05) по сравнению с животными, не получавших данный препарат.
Эти сдвиги происходят на фоне повышенного содержания молочной кислоты в эритроцитах: у крыс с ОП, получавших сульфат цинка содержание лактата практически не отличается от такового у крыс, не получавших препарат. Дан ные сдвиги говорят в пользу прогрессирующей гипоксии животных с ОЭП.
Цинк считается микроэлементом с антиоксидантными свойствами (входит в состав СОД, участвует в синтезе каталазы) (Е.В. Печенникова, 1997, Куд рин А.В., 1998;
К.Г. Гуревич, 2002). Высокие терапевтические дозы цинка угнетают активность эритроцитарной СОД у крыс в наших исследованиях.
Соответственно у пролеченных крыс отмечается возрастание активности ка талазы - на 35.82% (p0.05) по сравнению с экспериментальными крысами, не получавшими препарат.
Содержание Г-SH, а также активность зависимых от него ферментов у крыс, получавших сульфат цинка, по сравнению с больными животными, не получав шими данный препарат, достоверно не изменялись, оставаясь сниженными.
Активность -амилазы в плазме крови у крыс с ОП, получавших сульфат цинка на 42.2 % (p0.05) превышает таковую у нелеченых крыс.
Активность КФК-МВ в плазме крови крыс с ОП повышается после приё ма сульфата цинка на 34.26% (p0.05).
У крыс, пролеченных сульфатом цинка, активность МПО снижается на 55.36% (р0.05) по сравнения с экспериментальными животными, не полу чавшими этот препарат. Изменения в продукции NO' лейкоцитами крыс с ОП, получавших сульфат цинка, происходят аналогично МПО. У крыс, про леченных сульфатом цинка, отмечается снижение синтеза NO' по отношению к крысам, не получавшим данный препарат, на 56.72% (p0.05).
Влияние СКЭНАРа на метаболические процессы в крови при остром пан креатите СКЭНАР - аббревиатура способа воздействия на организм человека и на звание прибора (самоконтролируемая энергонейроадаптивная регуляция;
самоконтролирующий энергонейроадаптивный регулятор). СКЭНАР осуще ствляет воздействие на участки кожи электрическим током и в этом смысле является методом электролечения. В 1991 г. комитет по новой медицинской технике Минздрава СССР рекомендовал прибор СКЭНАР и СКЭНАР-терапию к широкому применению в качестве нового уникального высокоэффективного метода импульсной электротерапии, нормализующего физиологические систе мы организма;
восстанавливающего утраченные функции, активизирующего резервы организма, проводящего реставрационные работы в организме.
Содержание 2,3-ДФГ в эритроцитах крыс с ОП, подвергшихся воздейст вию СКЭНАРа на 10-е сутки после моделирования данного заболевания, дос товерно снижается на 35.86% (p0.05) по сравнению с экспериментальными крысами, не пролеченными этим аппаратом.
Аналогичная тенденция наблюдается в изменении содержания эритроци тарного лактата, которое достоверно снижается на 33.99% (p0.05) у проле ченных крыс по сравнению с животными, не получавшими лечения СКЭНА Ром. Полученные данные свидетельствуют в пользу уменьшения кислород ного голодания экспериментальных животных с ОП.
После воздействия СКЭНАРом на крыс с ОП, у этих животных по отно шению к не пролеченным экспериментальным крысам, активность СОД и каталазы повышалась на 34.10% (p0.05) и 45.42% (p0.05) соответственно, активность глутатионовых ферментов достоверно не изменялась и содержа ние Г-SH возрастало на 35.69% (p0.05), что свидетельствует о восстановле ние активности антиоксидантных ферментов в эритроцитах эксперименталь ных крыс с ОП.
После воздействия на экспериментальных крыс с ОП СКЭНАРом актив ность -амилазы в их плазме возросла на 23.02% (p0.05), активность КФК МВ снизилась на 20.07% (p0.05) и активность МПО снизилась на 11.60% (р0.05). Воздействие СКЭНАРа на лабораторных животных с ОП не вызва ло достоверных изменений в продукции NO' фагоцитами по сравнению с не пролеченными экспериментальными животными.
Выводы.
1. В сердечной мышце уже с 1-х суток ЭОП наблюдаются депрессия био антиоксидантных ферментов и снижение уровня восстановленного глу татиона, достигающие наибольшей выраженности к месячному сроку.
2. Накопление в сердечной мышце молочной кислоты, начиная с десятых суток, а также увеличение активности КФК-МВ в плазме крови экспери ментальных животных указывает на развитие тканевой гипоксии и син дрома цитолиза.
3. В печени крыс с ОП выявлено достоверное увеличение активности ката лазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы и концентрации вос становленного глутатиона с первых суток эксперимента, что указывает на сдвиги метаболизма компенсаторной направленности.
4. В эритроцитах уже с первых-третьих суток развития ОЭП происходит депрессия всех исследуемых биоантиоксидантных ферментов и сниже ние содержания восстановленного глутатиона. Накопление в этот период эритроцитами 2,3-дифосфоглицериновой кислоты на фоне увеличиваю щегося содержания лактата в миокарде и печени отражает включение модуляционного механизма компенсации развивающейся тканевой ги поксии у крыс с острым панкреатитом. Через месяц после начала моде лирования содержание лактата в органах сохраняется высоким на фоне снижения уровня эритроцитарного 2,3-дифосфоглицерата по сравнению с контролем, что отражает нарушение компенсаторных механизмов.
5. Увеличение синтеза оксида азота фагоцитами и усиление активности миелопероксидазы в плазме крови свидетельствует о генерализованной активизации лейкоцитов.
6. Сульфат цинка, угнетая повышенную продукцию N0' и активность МПО, направленно корригирует функциональную активность фагоцитов крови при экспериментальном панкреатите.
7. СКЭНАР-терапия уменьшает выраженность тканевой гипоксии крыс с ОП, об этом свидетельствуют данные газотранспортной функции и акти оксидантный статус эритроцитов. Снижение активности КФК-МВ в плазме крови пролеченных животных отражает уменьшение деструктив ных процессов в ткани миокарда.
Практические рекомендации.
1. На основании данных о депрессии глутатион зависимого звена АОЗ при ОЭП целесообразно рассмотреть вопрос о включении в комплексную терапию лекарственных средств, содержащих тиоловую группу.
2. Использование СКЭНАР-терапии в сочетании с применением терапев тических дозировок сульфата цинка способствует снижению выраженно сти тканевой гипоксии и клеточной деструкции при остром панкреатите.
3. Определение КФК-МВ необходимо включить в лабораторную диагно стику обследуемых больных с панкреатитами для своевременного выяв ления повреждения миокарда.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Шимунов Г.Я., Летуновский А.В., Ветрова Е.В., Положишникова А.А.
Состояние газотранспортной функции крови и выраженность гипоксии при остром экспериментальном панкреатите // IV научная сессия Рост ГМУ. - Ростов-на-Дону, 2004. - С. 136 - 137.
2. Шимунов Г.Я., Летуновский А.В., Положишникова А.А., Павлова Е.Б., Аргун Н.А. Состояние газотранспортной функции крови и антиокси дантной защиты при остром экспериментальном панкреатите // Труды III-й межвузовской международной конференции «Обмен веществ при адаптации и повреждении». - Ростов-на-Дону, 2004. - С. 12-14.
3. Шимунов Г.Я., Пыльцин С, Ильин А., Баринова В. Состояние антиоксидантной системы при остром экспериментальном панкреатите // 58-я итоговая научная конференция молодых учёных РостГМУ. - Ростов-на-Дону, 2004. - С. 128.
4. Шимунов Г.Я., Положишникова А, Пыльцин С, Ильин А., Ломбе Д.
Оценка выраженности тканевой гипоксии при остром эксперименталь ном панкреатите // 58-я итоговая научная конференция молодых учёт ных РостГМУ. - Ростов-на-Дону, 2004. - С. 129.
5. Шимунов Г.Я., Микашинович З.И. Влияние сульфата цинка на антиок сидантную систему крыс с острым экспериментальным панкреатитом // Известия ВУЗов. Сев.-Кавк. регион. Естественные науки. — 2005. Спецвыпуск «Гастроэнтерология Юга России». - С. 100 - 101.
6. Шимунов Г.Я., Летуновский А.В., Василенко B.C., Опруженков А.В.
Острый панкреатит: новый взгляд на старую проблему // Труды IV-й межвузовской международной конференции «Обмен веществ при адап тации и повреждении». - Ростов-на-Дону, 2005. - С. 168-173.
7. Shimunov G.J., Letunovski A.V., Shapovalov A.S., Kuznetcov D.V. NO production in rat's macrophages with an acute experimental pancreatitis // The materials of the IV international conference between highest educational es tablishments: «Peculiarities of metabolism at adaptation and alteration». Rostov-on-Don, 2005. - P. 190.
8. Шимунов Г.Я., Микашинович З.И. Состояние антиоксидантной системы миокарда при остром экспериментальном панкреатите // 4-я националь ная научно-практическая конференция с международным участием «Ак тивные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье чело века». - Смоленск, 2005. - С. 199 - 201.
9. Шимунов Г.Я., Шаповалов А., Кузнецов Д., Василенко В. Макрофагаль ная продукция оксида азота при остром экспериментальном панкреатите // 59-я итоговая научная конференция молодых учёных Рост-ГМУ. - Рос тов-на-Дону, 2005. - С. 72.
10. Шимунов Г.Я., Микашинович З.И. Антиоксидантный статус эритроцитов при остром экспериментальном панкреатите // Российский журнал гастро энтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2005. - Т. XV, № 5.-С. 66.
11. Шимунов Г.Я. Поджелудочная железа (исторический очерк) // Вестник Гиппократа.-2006.-№ 1 (9).-С. 9-14.
12. Шимунов Г.Я. Патогенез острого панкреатита // Вестник Гиппократа. 2006.-№1(9).-С.64-70.
Выражаем глубокую благодарность профессору А.В. Тараканову за предоставление аппара та СКЭНАР и возможность проведения экспериментальных исследований.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2,3-ДФГ — 2,3-дифосфоглицериновая кислота КФ — международная классификация ферментов КФК — креатинфосфокиназа;
КФК-АТФ: креатинфосфотрансфераза (КФ 2.7.3.2) КФК-МВ — МВ-фракция креатинфосфокиназы ЛО — ложно оперированные крысы ОП — острый панкреатит ОЭП — острый экспериментальный панкреатит ПЖ — поджелудочная железа ПОЛ — перекисное окисление липидов СКЭНАР — самоконтролирующий энергонейроадаптивный регулятор ГПО — глутатионпероксидаза (КФ 1.11.1.9) ГР — глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2) Г-SH — восстановленный глутатион МПО — миелопероксидаза (КФ 1.11.1.7) СОД — супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.1)