Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперименте
На правах рукописи
Шитов Леонид Николаевич Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперименте 03.02.03 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук
Москва – 2010 2
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный консультант:
Доктор медицинских наук, профессор Романов Виталий Александрович
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Митрохин Сергей Дмитриевич Доктор медицинских наук, профессор Царв Виктор Николаевич
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального об разования «Российский государственный медицинский университет Федераль ного агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится «_» _ 2010 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпиде миологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу:
125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский науч но-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габ ричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребите лей и благополучия человека.
Автореферат разослан «» 2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук О.Ю. Борисова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Препараты, обладающие цитостатическим действием, являются эффек тивными противоопухолевыми средствами;
кроме того, обладая иммуносупрес сивным эффектом, цитостатики находят широкое применение в терапии ауто иммунных заболеваний и в трансплантологии.
К наиболее опасным и часто встречающимся осложнениям, развиваю щимся на фоне иммуносупрессии, возникающей при цитостатической терапии, относятся инфекции (Балабанова Р.М., 2006;
Белов Б.С. и соавт., 2006;
Jallouli M., 2008), возбудителями которых являются, главным образом, условно патогенные представители микрофлоры организма (Соколов А.А., 2009;
Garbino J. et al., 2005;
Lee P.P.W., 2007). При этом в ряде исследований было показано, что при заболеваниях, требующих назначения цитостатиков, имеют место изменения в микробиоценозах пациентов, выражающиеся, главным обра зом, в избыточном росте условно-патогенных микроорганизмов (Привалова Т.Ю., 2006;
Гульнева М.Ю. и соавт., 2007, Stringer A.M. et al., 2009).
Одним из наименее изученных вопросов является прямое воздействие ци тостатиков на биологические свойства микроорганизмов и состояние микро флоры макроорганизма. Вместе с тем, препараты с цитостатическим механиз мом действия являются ДНК-тропными агентами, проявляют выраженные му тагенные свойства и, следовательно, потенциально способны вызвать измене ния свойств микроорганизмов. Отмечено, что биологические характеристики бактерий, выделенных на фоне введения рассматриваемых лекарственных средств, отличаются от аналогичных свойств бактерий, встречающихся у людей или лабораторных животных, не подвергавшихся воздействию препаратов с цитотоксическими свойствами (Бельский В.В. и соавт., 2008;
Гульнева М.Ю. и соавт., 2007). Публикации о прямом влиянии цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий единичны (Шаповал О.Г., 2008).
В соответствии с рассмотренными выше обстоятельствами, актуальным является исследование, позволяющее установить характер эффектов цитостати ков в отношении условно-патогенных бактерий микрофлоры организма в кон тексте возникновения инфекционных осложнений и микроэкологических нарушений при применении данных препаратов.
В реальной практике данные о состоянии и свойствах микрофлоры до назначения цитостатической терапии, как правило, отсутствуют, а учесть все факторы, влияющие на микрофлору организма больного, крайне затруднитель но, поэтому получение объективных данных в рамках клинического исследова ния представляется весьма сложным. Можно предположить, что в условиях живого организма воздействие цитостатиков на микрофлору может реализовы ваться не напрямую, а за счт влияния на различные системы макроорганизма, прежде всего, на иммунную систему. В соответствии с изложенным, обосно ванным подходом к достижению поставленной цели является исследование воздействия широко применяемых в медицине цитостатиков – метотрексата и циклофосфа мида – на условно-патогенные микроорганизмы в опытах как in vitro, так и in vivo, в сравнении с эффектами преднизолона – иммуносупрессивного препарата с нецитостатическим механизмом действия.
Цель исследования – оценка влияния цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперимен тах in vitro и in vivo.
Задачи исследования:
1. Оценить уровни колонизации толстой кишки стафилококками, энтеро кокками и энтеробактериями при курсовом введении белым мышам цитостати ков – метотрексата и циклофосфамида в сравнении с преднизолоном – иммуно депрессантом с нецитостатическим механизмом действия.
2. Изучить биологические свойства штаммов, выделенных у животных, получавших метотрексат, циклофосфамид и преднизолон.
3. Исследовать влияние различных концентраций метотрексата на разви тие популяции музейных штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemo lyticus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и Pseudomo nas aeruginosa в опытах in vitro.
4. Изучить биологические свойства условно-патогенных бактерий, под вергшихся воздействию различных концентраций метотрексата в опытах in vitro.
Научная новизна В экспериментальном исследовании, исключающем влияние комплекса дополнительных факторов, действующих на микрофлору пациента в клиниче ских условиях, получены новые данные о самостоятельной роли цитостатиков в изменении показателей кишечного микробиоценоза и свойств его представите лей.
Новые данные о влиянии курсового введения цитостатиков разных групп (метотрексата и циклофосфамида) и иммунодепрессанта с нецитостатическим механизмом действия (преднизолона) на уровни колонизации толстой кишки белых мышей стафилококками, энтерококками и энтеробактериями показыва ют, что все препараты повышают общее количество условно-патогенных мик роорганизмов, однако имеются некоторые различия в характере воздействия препаратов на популяционные уровни отдельных бактерий.
Впервые установлено, что цитостатики вызывают разнонаправленные из менения антибиотикорезистентности условно-патогенных бактерий, а также их адгезивности;
при этом выявлена прямая корреляция между показателями адге зии и популяциоными уровнями энтеробактерий в содержимом толстой кишки экспериментальных животных;
под влиянием метотрексата in vitro происходит замедление развития популяции условно-патогенных бактерий и изменение культуральных свойств золотистого стафилококка.
Практическая значимость работы Данные о способности цитостатиков вызывать микроэкологические нарушения и влиять на антибиотикорезистентность условно-патогенных бакте рий в эксперименте являются основой рекомендаций для совместной работы с клиницистами при проведении цитостатической терапии, в частности, при ле чении инфекционных осложнений, развившихся на е фоне.
Результаты выполненной работы необходимы для дальнейшего развития исследований, направленных на формирование концепции самостоятельной ро ли цитостатической терапии в изменении показателей микрофлоры и биологи ческих свойств е отдельных представителей.
Внедрение результатов исследования в практику Результаты работы внедрены в работу межкафедральной научно исследовательской лаборатории на базе кафедры микробиологии ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава, полученные данные используются при проведении занятий и чтении лекций для интернов, ординаторов, слушателей факультета последи пломного образования и студентов всех факультетов ГОУ ВПО ЯГМА Рос здрава.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Применение цитостатиков является самостоятельной причиной микро экологических нарушений и изменения биологических свойств условно патогенных бактерий in vivo;
сходные эффекты реализуются также при введе нии преднизолона – иммунодепрессанта с нецитостатическим механизмом дей ствия.
2. Введение циклофосфамида и метотрексата экспериментальным живот ным влияет на антибиотикорезистентность и адгезивные свойства условно патогенных бактерий микрофлоры кишечника.
3. Прямое воздействие метотрексата в опытах in vitro характеризуется из менениями антибиотикорезистентности, показателей адгезии, культуральных свойств и динамики развития популяции условно-патогенных бактерий.
Апробация работы Апробация диссертационной работы состоялась на межкафедральной научной конференции кафедр микробиологии с вирусологией и иммунологией, фармакологии и патологической анатомии с курсом судебной медицины Яро славской государственной медицинской академии, протокол № 1 от 5 мая года.
Основные положения работы были представлены на 57–60-й научных студенческих конференциях ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава (г. Ярославль, 2003– 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиоло гов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007), научно-практической конференции «Современные возможности клинической лабораторной диагно стики в клинико-диагностическом процессе» (г. Ярославль, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Москва, 2008), V съезде ревматологов России (г. Москва, 2009), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (г. Казань, 2009).
Публикации По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 3 – в других периодических изданиях, 6 – в материалах конференций, 6 – в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на русском языке на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Мате риалы методы исследования», четырх глав собственных исследований, обсуж дения полученных результатов и выводов. Указатель литературы включает источников: 103 отечественных и 108 иностранных. Диссертация иллюстриро вана 46 таблицами, 20 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Препараты. В работе использованы коммерческие препараты «Веро метотрексат», 1%-ный раствор натриевой соли метотрексата для инъекций (ЗАО «Верофарм», Москва);
«Циклофосфан», порошок для приготовления инъ екционных растворов (ОАО «Биохимик», Саранск);
«Преднизолон Никомед», раствор для внутривенного и внутримышечного введения («Nycomed», Ав стрия).
Штаммы микроорганизмов. Эксперименты in vitro выполнены на музей ных штаммах S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC 29212, P. aeruginosa ATCC 27853, S. haemolyticus 107, K. pneumoniae 119 (два послед них – из музея кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава).
Лабораторные животные. Исследование микрофлоры толстой кишки выполнено на 60 беспородных белых мышах обоих полов массой 30 ± 3 г. Кон трольные и опытные группы состояли из 15 животных. Все животные находи лись в стандартных условиях содержания и кормления.
Исследование микрофлоры толстой кишки экспериментальных живот ных. Препараты вводили внутрижелудочно с помощью атравматического зонда.
Схемы введения выбирали исходя из режимов дозирования, применяемых у че ловека, пересчт доз осуществляли в соответствии с действующими рекоменда циями («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению но вых фармакологических веществ», М.;
2000). Циклофосфамид (ЦФ) вводили в дозе 35,4 мг/кг ежедневно;
метотрексат (МТ) – 2,5 мг/кг в неделю за 2 прима с интервалом 24 часа;
преднизолон (ПЗ) – 2,5 мг/кг ежедневно. Продолжитель ность введения всех препаратов составляла 6 недель. Животным контрольной группы вводили стерильную дистиллированную воду.
Исследование содержания микроорганизмов с аэробным и факультатив но-анаэробным типом дыхания в фекалиях мышей выполняли через 2, 4 и недель после начала введения препаратов. Выделение, идентификацию и коли чественную оценку содержания микроорганизмов осуществляли общеприня тыми методами на основе изучения морфологических, тинкториальных, куль туральных и биохимических свойств. Культуры, выделенные на 6-й неделе ис следования, использовали для определения биологических свойств и антибио тикорезистентности. Исследовано 120 культур стафилококков, 130 культур эн терококков, 360 культур энтеробактерий.
Исследование влияния метотрексата на развитие популяции и биологи ческие свойства условно-патогенных бактерий. Для оценки влияния МТ на развитие популяции условно-патогенных бактерий стерильный раствор натрие вой соли МТ добавляли в МПБ в концентрациях 0,1;
1,0;
10;
100 и 1000 мг/л;
число параллельных образцов каждой из концентраций равнялось 7. Суспензию тест-культуры вносили в пробирки до концентрации 510 5 КОЕ/мл. Культиви рование осуществляли при 37°С в течение 18 часов;
концентрацию бактериаль ных клеток в суспензии оценивали фотометрическим методом на планшетном фотометре ЭФОС 9305 (светофильтр 450 нм). Интенсивность роста выражали в процентах от контроля, не содержащего препарат (100%). Для микроорганиз мов, интенсивность роста которых значимо менялась под воздействием препа рата, построены кинетические кривые роста.
Влияние МТ на рост условно-патогенных бактерий оценивали также с помощью диско-диффузионного метода и метода серийных разведений в ага ре. В диско-диффузионном методе использовали агар Мюллера-Хинтон и стан дартизированные бумажные диски, содержащие 50, 250, 750 и 1000 мкг натрие вой соли МТ. Тестирование осуществляли согласно методическим указаниям «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным пре паратам» (МУК 4.2. 1890-04). Для исследований методом серийных разведений на агаре готовили агар Мюллера-Хинтон и МПА с концентрациями натриевой соли МТ 100, 500 и 1000 мг/л. На поверхность агара наносили 0,1 мл бактери альной суспензии, содержащей 500-2000 клеток в 1 мл (одинаковое число кле ток наносили на чашки с разными концентрациями метотрексата). Осуществля ли инкубацию при 37°С в течение 48-72 часов. Отмечали наличие роста, срав нивали число колоний, выросших на образцах агара, содержащих различные концентрации МТ и не содержащих препарата (контроль);
изучали культураль ные и морфологические свойства.
С целью оценки влияния МТ на биологические свойства и антибиотико резистентность условно-патогенных бактерий осуществляли посев инокулюма, приготовленного аналогично вышеописанной методике, в пробирки с 5 мл МПБ, содержащего натриевую соль МТ в концентрациях 1, 10, 100 и 500 мг/л, а также с МПБ, не содержащим препарата (контроль). Культивирование осу ществляли в течение 5 суток при 37°С с периодическим встряхиванием. По окончании периода культивирования у бактерий определяли адгезивные свой ства, чувствительность к антибактериальным препаратам (АБП), некоторые факторы патогенности.
Адгезивные свойства микроорганизмов оценивали по методике, предло женной Брилис В.И. с соавт. (1986) с определением среднего показателя адге зии (СПА – среднее число микробных клеток, прилипших к поверхности одно го эритроцита), коэффициента участия эритроцитов в адгезивном процессе (К, % – процент эритроцитов, участвующих в адгезивном процессе), индекса адге зивности микроорганизма (ИАМ, вычисляемый по формуле ИАМ=(СПА·100)/К). Адгезивность считали нулевой при СПА от 0 до 1,0;
низ кой – при СПА от 1,01 до 2,0;
средней – от 2,01 до 4,0;
высокой – свыше 4,0.
Чувствительность условно-патогенных бактерий к АБП оценивали с по мощью диско-диффузионного метода и метода серийных разведений в бульоне.
У культур, выделенных от мышей контрольной и опытных групп, определяли чувствительность к основным клинически значимым АБП. Музейные штаммы, подвергшиеся воздействию различных концентраций метотрексата, тестирова ли на чувствительность к расширенному спектру АБП.
Активность плазмокоагулазы определяли по методике Трояшкина А.А. и Ивановой С.П. (1968), гемолитической и лецитиназной активности использова ли методики Чистовича Г.Н. (1961), а также упрощнную методику, описанную Ходаковой Н.Г. (2008).
Программное обеспечение. Хранение и обработку полученных данных осуществляли на IBM PC совместимом компьютере с помощью программ Mi crosoft Office Excel 2003, STATISTICA (StatSoft, Inc.) релиз 7.0, Primer of Bio statistics (Stanton A. Glantz, McGraw Hill) версия 4.03 в среде WINDOWS. Для графического оформления работы использованы программы Microsoft Office Excel 2003 и Adobe Photoshop CS2.
Статистическая обработка данных. Нормальность распределения дан ных оценивали по W-тесту Шапиро-Уилка;
при нормальном распределении выполняли дисперсионный анализ и множественные сравнения по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони;
в случае распределения, отличного от нормального, осуществляли непараметрический дисперсионный анализ по кри терию Крускалла-Уоллиса и множественные сравнения по критерию Данна.
При анализе качественных признаков применяли критерий 2. Для оценки тес ноты взаимосвязи между анализируемыми показателями вычисляли коэффици ент корреляции Пирсона (при нормальном распределении) или коэффициент ранговой корреляции Спирмена (при распределении, отличном от нормально го). При анализе повторных измерений применяли критерий Фридмана (рас пределение, отличное от нормального) и множественные сравнения по крите рию Ньюмена-Кейлса (Гланц С., 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Популяционные уровни некоторых условно-патогенных бактерий в составе микрофлоры толстой кишки белых мышей, получавших цито статики и преднизолон У всех животных, получавших исследуемые препараты, отмечались ста тистически достоверные изменения показателей микрофлоры, выраженность которых, как правило, возрастала по мере увеличения продолжительности вве дения препаратов (таблица 1).
Введение циклофосфамида вызывало статистически достоверное повы шение высеваемости стафилококков на 2-й и 4-й неделях (p0,05), а также лак тозонегативных энтеробактерий (ЛНЭБ) в течение всего срока наблюдения и кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью (КПСФА) на Таблица 1. Содержание некоторых микроорганизмов в фекалиях экспериментальных животных Общее число Содержание Стафилококки Энтерококки КП типичные КПСФА ЛНЭБ АФАМ ГМ Группа % от общего числа млн КОЕ/г АФАМ Показатели через 2 недели (медиана;
[25-й процентиль;
75-й процентиль]) 43,92 [18,65;
5,20 [2,14;
К1 1,23 [1,09;
1,41] 2,66 [2,34;
6,03] 2,27 [1,08;
5,27] 0,86 [0,69;
1,46] 7,10 [6,05;
8,10] 59,54] 21,76] 193,24 [123,54;
39,00 [30,31;
9,20 [2,45;
8,93 [4,48;
55,16 [17,04;
ЦФ 7,82 [4,38;
11,93] 4,07 [3,33;
6,00] 249,54]* 58,04]* 16,49] 10,45] 732,76]* 227,68 [201,71;
105,51 17,75 [6,62;
0,42 [0,22;
9,90 [0,32;
МТ 11,41 [5,26;
13,86] 5,73 [2,62;
6,90] 296,54]* [63,21;
156,47]* 40,13]* 0,61]* 15,18] 127,66 [110,31;
60,21 [50,24;
0,56 [0,11;
ПЗ 9,22 [6,41;
30,15] 1,57 [0,83;
2,62] 1,16 [0,18;
5,78] 6,90 [5,11;
8,10] 135,54]* 76,60]* 10,28] Показатели через 4 недели 44,76 [22,32;
6,60 [2,01;
К 1,14 [0,56;
2,01] 3,65 [3,13;
4,20] 2,39 [1,02;
7,00] 1,20 [0,76;
1,75] 5,56 [3,70;
6,42] 51,20] 18,28] 295,75 [178,30;
31,47 [16,93;
167,26 [72,80;
10,78 [6,30;
ЦФ 7,71 [5,90;
15,06]* 6,48 [4,49;
8,82] 7,10 [4,18;
8,17] 340,78]* 54,73] 339,19]* 905,32]* 53,71 [31,71;
0,61 [0,17;
МТ 7,93 [5,34;
10,34]* 6,18 [5,62;
8,25] 6,39 [2,41;
8,87] 1,06 [0,62;
2,12] 3,70 [2,86;
5,87] 67,33] 1,07]* 151,48 [119,23;
18,73 [9,95;
ПЗ 57,10 [7,21;
89,28]* 3,65 [1,86;
7,28] 6,67 [2,26;
9,91] 5,22 [2,41;
8,20] 5,90 [3,87;
7,45] 171,77]* 20,72]* Показатели через 6 недель 42,76 [18,31;
5,99 [2,05;
К 1,48 [0,79;
2,00] 1,34 [0,30;
5,92] 2,65 [1,67;
5,87] 1,37 [0,78;
1,61] 6,79 [3,33;
7,58] 50,14] 31,12] 1570,47 [1273,14;
68,37 [38,02;
822,27 [571,30;
574,67 [79,68;
ЦФ 0,67 [0,58;
0,71] 1,12 [1,02;
1,21] 6,21 [5,71;
6,90] 1831,76]* 146,58] 2156,31]* 4952,42]* 61,24 [49,11;
1,25 [0,98;
МТ 22,11 [9,56;
77,47]* 3,24 [0,20;
12,50] 0,18 [0,12;
0,25] 0,13 [0,12;
0,17] 5,71 [3,33;
6,90] 71,35] 2,02]* 306,08 [276,31;
190,88 [55,93;
3,95 [2,54;
ПЗ 1,69 [0,74;
3,75] 3,66 [3,33;
7,46] 25,31 [2,74;
56,50] 6,00 [4,07;
7,40] 382,83]* 220,15]* 16,01] * - статистически достоверные различия с контрольной группой, p0, – средний исходный уровень показателей для всех групп 4-й и 6-й неделях эксперимента (p0,05). В группе животных, получавших ПЗ, отмечено наиболее выраженное по сравнению с другими группами повышение высеваемости стафилококков на протяжении всего периода введения препарата (p0,05) и энтерококков на 4-й неделе. Введение МТ вызывало статистически достоверное снижение высеваемости типичных кишечных палочек (КП) на протяжении всего периода введения препарата (p0,05). На протяжении всего периода введения МТ отмечено достоверное повышение высеваемости стафи лококков, на 4-й неделе – энтерококков (p0,05).
Таким образом, введение экспериментальным животным МТ, ЦФ и ПЗ приводит к увеличению содержания условно-патогенных бактерий в фекалиях.
В ходе введения ЦФ и ПЗ наблюдается увеличение выраженности происходя щих изменений. Повышение общего числа условно-патогенных микроорганиз мов при использовании ЦФ происходит, преимущественно, за счт энтеробак терий, а при введении ПЗ, главным образом, за счт стафилококков. МТ вызы вает повышение общего числа условно-патогенных микроорганизмов с после дующим снижением их уровня при выраженном дисбалансе соотношения ана лизируемых показателей по сравнению с контрольной группой: повышение численности стафилококков и снижение – энтеробактерий.
2. Биологические свойства условно-патогенных бактерий, выделен ных из фекалий экспериментальных животных Плазмокоагулаза и лецитиназа не были выявлены ни у одной из исследо ванных культур.
Частоты встречаемости гемолитических условно-патогенных бактерий (УПБ) у опытных групп мышей преимущественно не претерпевали статистиче ски значимых изменений по сравнению с аналогичными показателями живот ных контрольной группы. Достоверные изменения отмечены только на фоне введения ПЗ: снижение частоты высеваемости -гемолитических стафилокок ков и повышение – -гемолитических ЛНЭБ.
Исследование адгезивных свойств микроорганизмов показало (таблица 2), что типичные КП, КПСФА и ЛНЭБ, выделенные у животных, получавших МТ, отличались более низкими показателями адгезии по сравнению со штам мами, изолированными у мышей контрольной группы (ИАМ у типичных КП;
СПА, К и ИАМ у КПСФА;
СПА у ЛНЭБ;
p0,05).
Штаммы ЛНЭБ, полученные от мышей, которым вводили ПЗ, характери зовались более высокими показателями адгезии (СПА, К;
p0,05). Установлена статистически значимая взаимосвязь между адгезивными свойствами исследо ванных представителей семейства Enterobacteriaceae и их количественным со держанием в фекалиях (СПА и lgКОЕ/г на 6-й неделе исследования;
коэффици ент ранговой корреляции Спирмена r = 0,73, p0,01).
Стафилококки, выделенные у животных, получавших ЦФ, отличались сниженными по сравнению с контрольной группой показателями адгезии (СПА и ИАМ, p0,05);
при исследовании адгезивных свойств стафилококков, полу ченных от мышей, которым вводили ПЗ, было отмечено уменьшение значения коэффициента участия эритроцитов в адгезивном процессе.
При оценке показателей адгезии энтерококков, выделенных у мышей, ко торым вводили ЦФ, установлено более высокое, по сравнению с контрольной группой, значение К (p0,05).
Таблица Адгезивные свойства микроорганизмов, выделенных у мышей контрольной и экспериментальных групп через 6 недель после начала введения препаратов Микро- Группа СПА К ИАМ организмы животных Стафилококки Контроль 2,36±0,73 72,51±9,63 3,22±0, ЦФ 1,83±0,61* 69,70±10,63 2,61±0,73* МТ 2,66±1,02 73,06±14,78 3,59±0, ПЗ 1,99±0,82 62,44±13,56* 3,14±0, Энтерококки Контроль 2,44±0,69 61,69±9,31 4,02±1, ЦФ 2,63±0,69 68,41±9,92* 3,89±1, МТ 2,43±0,49 65,49±6,68 3,74±0, ПЗ 2,38±0,50 63,86±9,26 3,73±0, Контроль 2,06±0,63 63,54±12,74 3,21±0, ЦФ 2,21±0,59 69,01±12,04 3,18±0, КП типичные МТ 1,74±0,59 66,92±11,07 2,55±0,63* ПЗ 2,13±0,88 66,31±14,50 3,10±0, Контроль 2,01±1,01 56,00±18,43 3,41±1, ЦФ 67,48±14,07* 3,63±1, 2,44±0, КПСФА МТ 1,18±0,36* 42,29±12,77* 2,81±0,53* ПЗ 1,93±0,81 63,73±13,83 2,95±0, Контроль 2,05±0,88 64,31±14,07 3,20±0, ЦФ 1,95±0,89 69,05±9,45 2,84±1, ЛНЭБ МТ 1,47±0,56* 53,22±17,53* 2,72±0, ПЗ 2,65±0,81* 75,89±14,82* 3,47±0, * - статистически достоверные различия с контрольной группой, p0, Для всех групп животных, получавших препараты, выявлены отличия в антибиотикорезистентности выделенных от них условно-патогенных бактерий по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы. В наиболь шей степени это касалось групп мышей, подвергавшихся воздействию ЦФ и ПЗ. Достоверно изменнные уровни чувствительности обнаружены в первую очередь у кишечных палочек. Для типичных КП показано повышение чувстви тельности к АБП;
в отношении КПСФА и ЛНЭБ отмечено как повышение, так и снижение чувствительности к АБП. В ряде случаев, несмотря на достоверно сниженные значения минимальных подавляющих концентраций (МПК50) анти биотиков у штаммов, изолированных от мышей, получавших МТ, ЦФ и ПЗ, среди этих культур бактерий обнаруживались резистентные штаммы, не выяв ленные у животных контрольной группы. Различия в антибиотикорезистентно сти стафилококков и энтерококков, выделенных от животных контрольной и опытных групп на фоне введения препаратов, носили менее выраженный ха рактер, чем у представителей семейства Enterobacteriaceae.
3. Влияние метотрексата на развитие популяции условно-патогенных бактерий in vitro В диапазоне концентраций МТ 0,1 – 1,0 мг/л не наблюдалось статистиче ски достоверного влияния на рост взятых для исследования штаммов УПБ;
при концентрациях 10 – 1000 мг/л метотрексат вызывал частичное угнетение роста всех взятых для исследования микроорганизмов, за исключением P. aeruginosa АТСС 27853. Достоверные различия с показателями роста контрольных образ цов приходились главным образом на концентрации препарата 1000 и 100 мг/л.
Аналогичные результаты были получены при исследовании штаммов, выде ленных у мышей (таблица 3).
Таблица Интенсивность роста УПБ в жидкой питательной среде в присутствии различ ных концентраций метотрексата (в % от контроля, не содержащего препарат) Концентрации метотрексата, мг/л Микроорганизмы 1000 100 10 1 0, Музейные штаммы S. aureus АТСС 25923 51,33±3,08* 66,81±4,08* 87,53±5,43* 99,76±6,21 99,88±4, 78,66±4,72* 98,73±5,34 99,25±4,88 99,62±6,18 99,77±6, S. haemolyticus E. faecalis АТСС 29212 46,25±2,82* 80,03±4,80* 89,55±5,55* 94,15±5,65 99,47±5, E. coli АТСС 25922 57,14±3,49* 88,07±5,42* 99,14±4,62 99,82±6,14 99,85±6, 63,76±3,91* 78,95±3,45* 96,73±5,94 99,14±7,51 99,71±9, K. pneumoniae P. aeruginosa АТСС 27853 99,81±6,17 99,75±5,48 99,85±4,95 99,90±4,53 99,95±6, Штаммы, выделенные у мышей 81,02±3,98* 91,31±3,94* 99,12±5,01 99,31±7,11 99,62±7, S. haemolyticus M 70,14±4,19* 87,52±4,78* 98,85±3,55 99,43±5,98 99,81±4, S. haemolyticus M 71,22±3,77* 89,91±2,98* 99,20±3,69 99,75±5,21 99,90±4, E. coli M 62,23±4,43* 84,27±4,12* 98,87±3,91 99,76±4,87 99,89±7, E. coli M 59,67±4,67* 89,12±6,76* 98,57±3,98 99,57±5,23 99,87±7, E. coli M 56,34±3,36* 89,72±3,57* 94,35±3,87 98,65±7,45 99,87±2, E. faecalis M 77,12±6,34* 91,45±3,34 98,67±7,01 99,15±4,92 99,81±8, E. faecalis M 60,34±5,34* 83,67±3,98* 96,98±4,76 98,81±3,48 99,52±4, E. faecium M * - достоверные различия с контрольным образцом, p0, Наиболее выраженное ингибирующее действие МТ оказывал в отноше нии роста E. faecalis АТСС 29212 и S. aureus АТСС 25923. При исследовании динамики развития популяции бактерий было отмечено, что ингибирующее действие имело место на всех фазах развития бактериальной популяции.
Наиболее ощутимые различия между контрольными и опытными образцами проявлялись в поздние сроки;
на ранних фазах различия были выражены в меньшей степени (рисунки 1-4).
контроль МТ 400 100 мг/л Dx МТ 1000 мг/л 0 10 20 30 40 время, ч Рисунок 1. Динамика развития популяции S. aureus АТСС 25923 в жидкой питательной среде в присутствии метотрексата (D – оптическая плотность бак териальной суспензии, МТ – метотрексат) контроль 400 МТ 100 мг/л МТ Dx 1000 мг/л 0 10 20 30 40 время, ч Рисунок 2. Динамика развития популяции E. coli АТСС 25922 в жидкой питательной среде в присутствии метотрексата (D – оптическая плотность бак териальной суспензии, МТ – метотрексат) контроль МТ 100 мг/л МТ 1000 мг/л Dx 0 10 20 30 40 время, ч Рисунок 3. Динамика развития популяции E. faecalis АТСС 29212 в жидкой питательной среде в присутствии метотрексата (D – оптическая плотность бак териальной суспензии, МТ – метотрексат) контроль 400 МТ 100 мг/л МТ 1000 мг/л Dx 0 10 20 30 40 время, ч Рисунок 4. Динамика развития популяции K. pneumoniae 119 в жидкой питательной среде в присутствии метотрексата (D – оптическая плотность бак териальной суспензии, МТ – метотрексат) При оценке чувствительности к метотрексату взятых для исследования штаммов УПБ диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон зона задержки роста была выявлена только у S. aureus АТСС 25923 и S. haemolyticus 107. Диско-диффузионный метод продемонстрировал лишь частичное угнете ние роста S. aureus АТСС 25923. При последующей оценке чувствительности к метотрексату стафилококков, выросших в зоне частичного угнетения роста, установлено, что их уровень чувствительности не отличался от исходного, т.е.
неполный характер угнетения роста бактерий в рассматриваемой зоне не был связан с селекцией мутантов, резистентных к МТ.
Также было осуществлено сравнение чувствительности к МТ штаммов стафилококков, выделенных у мышей контрольной группы и группы, получав шей МТ;
при этом достоверных различий не было выявлено. При содержании МТ в диске 250 мкг диаметр зоны частичной задержки роста (мм, M±SD) для стафилококков, выделенных у контрольной группы составил 19,93±5,85 мм, у стафилококков, изолированных от мышей, получавших МТ, – 21,36±6,64 мм (p0,05). Показано, что чувствительность разных штаммов к метотрексату ва рьирует в достаточно широких пределах: диаметры зон задержки роста штаммов стафилококков находились в пределах от 12 до 36 мм. Распределение значений данного показателя соответствует нормальному (p=0,0013 при ис пользовании W-теста Шапиро-Уилка).
Метод серийных разведений в агаре показал, что на среде, содержащей МТ в концентрациях 100 – 1000 мг/л, рост колоний S. aureus АТСС 25923 в зна чительной степени замедлялся;
колонии имели меньшие размеры и неправиль ную форму (рисунок 5). При последующем пересеве колоний неправильной формы на агар Мюллера-Хинтон, не содержащий МТ, культуральные свойства выросших колоний полностью соответствовали исходным характеристикам му зейного штамма.
А Б Рисунок 5. Колонии S. aureus АТСС 25923 на агаре Мюллера-Хинтон с содержанием метотрексата 500 мг/л (Б) и без добавления препарата (А) 4. Влияние метотрексата на биологические свойства условно патогенных бактерий in vitro У штаммов S. aureus АТСС 25923 и E. coli АТСС 25922 достоверных из менений показателей адгезии под влиянием МТ не было выявлено (таблица 4).
При исследовании адгезии E. faecalis АТСС 29212, культивированных в присутствии 100 и 500 мг/л МТ, было установлено статистически достоверное (p0,05) повышение коэффициента участия эритроцитов в адгезивном процес се. При этом достоверных различий величин СПА и ИАМ между контролем и энтерококками, выращенными в присутствии МТ, не обнаружено.
У штамма P. aeruginosa АТСС 27853, выращенных на МПБ с концентра цией МТ 100 и 500 мг/л наблюдалось статистически достоверное (p0,05) по вышение СПА и К, при концентрации 500 мг/л – достоверное повышение ИАМ.
Значения СПА и К, выявленные у P. aeruginosa АТСС 27853, подвергшихся действию 100 и 500 мг/л МТ достоверно (p0,05) отличались от аналогичных показателей, полученных при исследовании адгезии P. aeruginosa АТСС 27853, выращенных при 1 и 10 мг/л МТ. Значение ИАМ P. aeruginosa АТСС 27853, по лученное при культивировании в присутствии 100 мг/л, достоверно выше зна чений, наблюдаемых у бактерий, подвергшихся действию 1 и 10 мг/л МТ.
По результатам оценки адгезивных свойств K. pneumoniae 119 констати ровано статистически достоверное (p0,05) снижение СПА и К при воздействии 100 и 500 мг/л МТ.
Таким образом, имели место как повышение, так и снижение показателей адгезии взятых для исследования штаммов УПБ. При этом все выявленные из менения показателей адгезии приходятся на наиболее высокие концентрации МТ – 100 и 500 мг/л.
При концентрациях МТ 100 и 500 мг/л наблюдалось статистически зна чимое снижение титра плазмокоагулазы по сравнению с контролем;
по видимому, указанные изменения активности плазмокоагулазы в культуральной жидкости связаны со снижением интенсивности роста бактерий в среде культи вирования, содержащей МТ (коэффициент линейной корреляции между анали зируемыми показателями r = 0,95;
p=0,014).
У S. aureus АТСС 25923 наблюдалось статистически достоверное сниже ние титра гемолизинов в культуральной жидкости, которое, как и в случае с плазмокоагулазой, коррелировало со снижением интенсивности роста (коэффи циент линейной корреляции r = 0,94, p=0,018). Для P. aeruginosa АТСС достоверных изменений гемолитической активности не выявлено.
У всех взятых для исследования штаммов УПБ имели место изменения чувствительности к АБП при культивировании на МПБ, содержащем МТ (таб лицы 5-10). В целом, преобладали факты снижения чувствительности по срав нению с исходным уровнем. Изменения антибиотикорезистентности происхо дили преимущественно при концентрациях МТ в среде культивирования 10 и 100 мг/л в меньшей степени – при 1 и 500 мг/л. Среди взятых для исследования штаммов наибольшее число изменений в чувствительности к АБП выявлено у S. aureus АТСС 25923 и E. faecalis АТСС 29212.
Таблица Показатели адгезии условно-патогенных бактерий при воздействии различных концентраций метотрексата Концентрация МТ, СПА К ИАМ мг/л S. aureus АТСС 0 (контроль) 2,23±0,20 67,51±6,54 3,33±0, 2,35±0,49 61,04±7,17 3,88±0, 2,36±0,26 64,29±8,57 3,73±0, 2,37±0,78 66,00±12,12 3,69±1, 2,29±0,25 64,27±8,80 3,62±0, E. faecalis АТСС 2,31±0,22 69,33±5,57 3,32±0, 2,31±0,33 71,93±7,79 3,23±0, 2,39±0,35 77,22±2,44 3,10±0, 2,75±0,35 79,20±5,57* 3,48±0, 2,59±0,62 78,90±5,18* 3,29±0, E. coli АТСС 2,58±0,23 61,75±5,68 4,21±0, 2,50±0,21 59,88±6,79 4,23±0, 2,41±0,23 59,50±5,10 4,08±0, 2,70±0,16 60,50±6,70 4,51±0, 2,57±0,19 62,00±4,96 4,17±0, K. pneumoniae 1,61±0,20 79,26±4,94 2,05±0, 1,57±0,23 78,42±4,69 1,98±0, 1,70±0,11 75,89±2,07 2,24±0, 1,26±0,14* 63,99±9,95* 2,03±0, 1,32±0,05* 62,45±7,44* 2,15±0, P. aeruginosa АТСС 1,30±0,11 66,91±2,38 1,94±0, 1,32±0,16 71,65±7,76 1,86±0, 1,22±0,10 67,57±3,37 1,81±0, 1,82±0,26* 80,45±5,69* 2,26±0, 2,07±0,29* 79,30±2,48* 2,61±0,33* * - статистически достоверные различия с контролем, p0, В ряде случаев изменения чувствительности имели однонаправленный характер на всм диапазоне концентраций МТ, при этом для некоторых штам мов величина сдвигов показателей антибиотикорезистентности возрастала по мере увеличения концентрации МТ;
следует отметить, что кривая «концентра ция МТ – диаметр зоны задержки роста» для всех подобных ситуаций имеет сходную форму и соответствует повышению чувствительности по сравнению с исходным уровнем.
Таблица Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам S. aureus АТСС 25923, подвергшегося воздействию метотрексата Рокситромицин Ципрофлокса Эритромицин Линкомицин Рифампицин Ванкомицин Оксациллин Гентамицин пенициллин Меропенем Линезолид CМТ, мг/л Фузидин Бензил цин * * – – – – – * – * * * – * – * 100 * – * * * * – – * * * 500 – – – Примечания к таблицам 5 - 9: СМТ – концентрация метотрексата в питательной среде;
– случаи повышения выраженности изменений чувствительности УПБ к АБП при возрастании концентраций МТ в среде культивирования;
– таблицы составлены по объединнным данным диско-диффузионного метода и ме тода серийных разведений;
- повышение чувствительности, - снижение чувствительности;
* - статистически достоверные различия с контролем, p0, Таблица Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам E. faecalis АТСС 29212, подвергшегося воздействию метотрексата Бензилпенициллин Ципрофлоксацин Стрептомицин Эритромицин Доксициклин Ампициллин Рифампицин Ванкомицин Гентамицин Фурадонин Линезолид CМТ, мг/л * * * * * – – – * * * – – – – * * Таблица Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам E. coli АТСС 25922, подвергшейся воздействию метотрексата Ципрофлоксацин Цефтриаксон Тетрациклин Ампициллин Линкомицин Полимиксин Цефтазидим Гентамицин Меропенем Фурадонин Амикацин CМТ, мг/л * – – – – – – – * * * – – – – – – – * – – – – – – – – * * – – – – – – Таблица Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам K. pneumoniae 119, подвергшейся воздействию метотрексата Ципрофлоксацин Цефтриаксон Тетрациклин Ампициллин Линкомицин Полимиксин Цефтазидим Гентамицин Меропенем Фурадонин Амикацин CМТ, мг/л * – 1 * – – – – – – 10 * * * – – – – 100 * * * – – 500 Таблица Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам P. aeruginosa АТСС 27853, подвергшейся воздействию метотрексата Ципрофлоксацин Карбенициллин Тетрациклин Полимиксин Цефтазидим Гентамицин Меропенем Азтреонам Амикацин CМТ, мг/л Цефепим * – – – – * * – – – – – * * * – – * – – – – Таблица Анализ результатов оценки влияния метотрексата на чувствительность условно-патогенных бактерий к антибактериальным препаратам Разнонаправленные эффекты правленными на всм диапа чувствительность к которым ния чувствительности к ко ния чувствительности к ко трексата (включая тенден Число препаратов, измене Число препаратов, измене торым являются наследуе при действии разных кон Общее число препаратов, зоне концентраций мето торым являются однона достоверно изменялась Штаммы условно-патогенных бактерий Повышение центраций Снижение мыми ции) S. aureus АТСС 25923 7 3 4 - 3 E. coli АТСС 25922 5 4 1 - 3 E. faecalis АТСС 29212 7 5 1 1 1 P. aeruginosa АТСС 27853 4 2 1 1 1 K. pneumoniae 119 4 3 1 - – учтены только статистически достоверные изменения чувствительности На основании полученных нами результатов и данных литературы можно констатировать, что наблюдаемое повышение уровня УПБ в составе микрофло ры толстой кишки не является результатом прямого действия препаратов цитостатиков на их клетки. Наблюдаемый избыточный рост факультативной микрофлоры, по-видимому, не связан с цитостатическими эффектами препара тов в отношении облигатных представителей микрофлоры, поскольку анало гичные изменения в кишечном микробиоценозе имеют место при введении преднизолона – препарата с нецитостатическим механизмом действия. Можно предположить, что микроэкологические взаимоотношения нарушаются не на уровне влияния препаратов на рост и развитие микроорганизмов, а в результате влияния на ряд их свойств: в случае облигатных представителей микрофлоры – на способность секретировать субстанции, обуславливающие антагонистиче ские эффекты в отношении УПБ, в случае оппортунистических микроорганиз мов – на чувствительность к указанным субстанциям.
Изменения адгезивных свойств трактуются как одна из причин изменения численности УПБ в составе микрофлоры толстой кишки, однако данный меха низм не является универсальным. Повышение показателей адгезии ЛНЭБ на фоне введения ПЗ рассматривается в контексте тенденции к повышению их со держания в составе микробиоценоза кишечника: допускается, что повышение численности происходит за счт клеток с повышенной адгезивностью. В то же время, при введении ЦФ происходит гораздо более выраженное повышение уровня ЛНЭБ, не сопровождающееся повышением показателей их адгезии. В связи с этим можно предположить, что ПЗ специфическим образом усиливает экспрессию адгезинов у энтеробактерий в условиях in vivo. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Alverdy J. & Aoys E. (1991), продемонстрировавшими повышенный уровень адгезии энтеробактерий к сли зистой оболочке кишечника при введении крысам дексаметазона.
Снижение иммунитета, развивающееся на фоне введения цитостатиков, рассматривается в качестве одного из ведущих механизмов, обуславливающих наблюдаемое нами повышение численности УПБ в составе полостной микро флоры кишечника экспериментальных животных. Ещ одна из возможных при чин – нарушение целостности и функций слизистой оболочки кишечника.
При воздействии метотрексата на условно-патогенные бактерии in vitro не отмечено значимого влияния препарата на адгезивные свойства S. aureus, E.
faecalis и E. сoli. В отношении E. coli констатировано, что пониженные показа тели адгезии бактерий этого вида, выделенных у мышей на фоне введения ме тотрексата, и отсутствие прямого влияния препарата на показатели адгезии E.
coli АТСС 25922 in vitro свидетельствует об отсутствии универсального меха низма изменения численности эшерихиозной микрофлоры в результате прямо го влияния препарата на адгезивные свойства. При этом нельзя исключить из бирательного влияния МТ на адгезивные свойства отдельных штаммов.
Характер воздействия МТ на лекарственную устойчивость АБП был раз личным в условиях воздействия in vivo и in vitro.
Наиболее выраженные отличия лекарственной устойчивости от анало гичных показателей контрольной группы выявлены у штаммов, выделенных у мышей на фоне введения ЦФ и ПЗ;
достоверно изменнные уровни чувстви тельности имели место в первую очередь у кишечных палочек: для типичных КП было выявлено повышение чувствительности к АБП;
в отношении КПСФА и ЛНЭБ отмечено как повышение, так и снижение чувствительности к АБП.
Причины выявленных изменений лекарственной устойчивости могут быть связаны с мутагенными эффектами, способными привести к появлению устойчивых мутантов, либо, наоборот, к повышению чувствительности в ре зультате утраты или нарушения структуры и функционирования генов, обу славливающих резистентность;
возможна элиминация плазмид лекарственной устойчивости. Предположение о наличии различных причин изменения анти биотикорезистентности условно-патогенных бактерий основывается на выяв ленном нами разнонаправленном характере изменений рассматриваемых пока зателей под влиянием исследуемых препаратов: имело место как повышение, так и снижение чувствительности.
Антибиотикорезистентность УПБ менялась на фоне изменения их попу ляционный уровней, а при изменении численности популяций бактерий может иметь место изменение соотношения чувствительных и устойчивых клеток.
Другим механизмом, объясняющим полученные результаты, может быть пря мое или косвенное влияние взятых для исследования препаратов на процессы обмена генетическим материалом между бактериями, включая факторы лекар ственной устойчивости. Это может происходить как на генетическом уровне в результате влияния препаратов-цитостатиков на репликацию ДНК, так и на уровне микроэкологических взаимоотношений, поскольку при наблюдаемых выраженных сдвигах численности УПБ может существенно изменяться интен сивность процессов внутри- и межпопуляционного генетического обмена.
In vitro, в условиях прямого воздействия МТ, отмечено как снижение, так и повышение чувствительности к АБП, а также разнонаправленные эффекты при воздействии разными концентрациями МТ;
преимущественно наблюдалось снижение чувствительности: выявлено 17 эпизодов снижения чувствительно сти, 8 – повышения и 2 – разнонаправленного воздействия (под «эпизодом» здесь понимается выявление статистически достоверного изменения чувстви тельности одного штамма УПБ к одному АБП). Отмечены как наследуемые ( эпизодов, 37% от общего числа выявленных случаев изменения антибиотикоре зистентности, из них 6 – снижение чувствительности, 4 – повышение), так и не наследуемые (17 эпизодов, или 63%, из них 11 – снижение чувствительности, – повышение, 2 – разнонаправленное действие). Среди изменений антибиоти корезистентности преобладают ненаследуемые. Как в случае наследуемых, так и ненаследуемых изменений преобладает снижение чувствительности.
Вероятно, воздействие МТ является специфическим, что выражается в избирательности эффектов в отношении разных АБП. Особенно наглядно это проявляется при сравнении чувствительности к препаратам из одной группы:
например, при воздействии МТ на K. pneumoniae 119 наблюдается статистиче ски достоверное снижение чувствительности данного штамма к амикацину на всм диапазоне концентраций МТ, тогда как в отношении гентамицина в диапа зоне концентраций МТ от 10 до 500 мг/л отсутствует даже тенденция к измене нию чувствительности K. pneumoniae 119 к данному препарату;
при воздей ствии МТ на E. coli ATCC 25922 на всм диапазоне концентраций препарата имеет место повышение чувствительности данного штамма к цефтриаксону (при воздействии 1, 100 и 500 мг/л МТ изменения статистически достоверные, при 10 мг/л - тенденция), тогда как в отношении цефтазидима не выявлена даже тенденция к изменению чувствительности E. coli ATCC 25922 к данному препа рату.
Наследуемое повышение чувствительности УПБ к некоторым АБП может быть связано с элиминацией факторов резистентности, например, плазмид, в результате воздействия МТ. Наследуемое снижение чувствительности можно объяснить направленным действием МТ на гены, ответственные за синтез мо лекул-мишеней, подвергающихся действию АБП. Ненаследуемые изменения чувствительности говорят о том, что эффекты МТ способны быть обратимыми, и при формировании новых генераций бактерий исходные свойства восстанав ливаются.
Результаты выполненных исследований показывают, что цитостатики яв ляются самостоятельными факторами, способными вызывать нарушения состо яния микрофлоры организма, а также изменения свойств е отдельных предста вителей. Характер воздействия рассматриваемых препаратов, по-видимому, яв ляется комплексным и может реализовываться как путм прямого воздействия на клетки микроорганизмов, так и опосредованно через макроорганизм и мик роэкологические взаимоотношения. Прогнозирование эффектов цитостатиков в отношении микроорганизмов в клинических ситуациях может быть затруднено множественностью факторов, воздействующих на организм пациента, различи ями направленности влияния одних и тех же препаратов на микроорганизмы в зависимости от конкретных условий. Это указывает на необходимость макси мально широкого использования мер микробиологического мониторинга у па циентов, получающих рассматриваемые препараты, с целью выявления и кор рекции микроэкологических нарушений, а также выбора рациональной анти бактериальной терапии в случае развития инфекционных осложнений на фоне иммуносупрессии, вызываемой цитостатиками.
ВЫВОДЫ Введение метотрексата, циклофосфамида и преднизолона белым мышам 1.
вызывает динамические изменения в составе полостной микрофлоры тол стой кишки. Микроэкологические нарушения, развивающиеся под влия нием циклофосфамида и преднизолона, зависят от продолжительности применения препаратов, усиливаясь в более поздние сроки их введения.
Действие препаратов избирательно в отношении уровней колонизации 2.
кишечника отдельными представителями микрофлоры: циклофосфамид вызывает избыточный рост энтеробактерий, преднизолон – стафилокок ков;
применение метотрексата - повышение численности стафилококков и снижение - энтеробактерий.
Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных 3.
бактерий in vivo выражается в снижении показателей адгезии: при дей ствии циклофосфамида – стафилококков, метотрексата – энтеробактерий.
Введение преднизолона вызывает повышение показателей адгезии лакто зонегативных энтеробактерий. Показатели адгезии энтеробактерий кор релируют с их популяционными уровнями в кишечном микробиоценозе.
На фоне воздействия метотрексата, циклофосфамида и преднизолона in 4.
vivo меняется антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий.
Эффекты препаратов являются разнонаправленными: у типичных кишеч ных палочек констатировано повышение чувствительности, у кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью, лактозонегативных энтеробактерий и стафилококков - как повышение, так и снижение чув ствительности, что указывает на наличие различных механизмов воздей ствия исследуемых препаратов на антибиотикорезистентность условно патогенных бактерий.
Воздействие метотрексата in vitro проявляется в зависящем от концен 5.
трации препарата замедлении развития популяций всех условно патогенных бактерий, за исключением P. aeruginosa АТСС 27853, изме нении культуральных свойств S. aureus АТСС 25923, показателей адгезии K. pneumoniae 119 и P. aeruginosa АТСС 27853, антибиотикорезистентно сти всех исследованных штаммов. Повышения устойчивости к мето трексату на фоне его воздействия не отмечено ни in vivo, ни in vitro.
Метотрексат оказывает прямое влияние на антибиотикорезистентность 6.
условно-патогенных бактерий, приводя, преимущественно, к повышению резистентности;
выявленные изменения, выраженность которых зависит от концентрации препарата, являются в большей мере ненаследуемыми;
однако 37% полученных изменений – наследуемые, что в последующих генерациях может существенно изменять структуру популяции бактерий по рассматриваемому признаку.
Практические рекомендации При ведении больных, получающих цитостатики, необходимо учи тывать способность данных препаратов вызывать микроэкологические нарушения;
для данной категории пациентов целесообразен контроль со стояния кишечного микробиоценоза, проведение профилактики и кор рекции дисбактериоза кишечника.
Возможность изменения антибиотикорезистентности условно патогенных бактерий при применении цитостатиков следует учитывать при выборе рациональной терапии инфекционных осложнений, развив шихся у пациентов, получающих данные препараты. Эффективность ле чения инфекционных осложнений возможно повысить за счт мер микро биологического мониторинга лекарственной устойчивости возбудителей.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Шитов, Л.Н. Изучение влияния циклофосфана на антибиотикорезистент ность синегнойной палочки / Л.Н. Шитов // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА, Ярославль 2004. - С. 28-29.
2. Шитов, Л.Н. Влияние метотрексата на рост и резистентность кишечной па лочки к некоторым антибактериальным препаратам / Л.Н. Шитов, Н.С. Борисо ва / Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА, Ярославль 2005. - С. 27-28.
3. Романов, В.А. Влияние метотрексата на резистентность кишечной палочки к некоторым антибактериальным препаратам / В.А. Романов, Л.Н. Шитов, Н.С.
Борисова // Научно-практическая ревматология. - №3. – 2005. – С.106.
4. Шитов, Л.Н. Влияние циклофосфамида на некоторые показатели микробио ценоза кишечника мышей / Л.Н. Шитов // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА, Ярославль 2007. - С. 31-32.
5. Шитов, Л.Н. Влияние циклофосфамида на рост возбудителей гнойно воспалительных заболеваний / Л.Н. Шитов, В.А. Романов, А.А. Макарушин // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпиде миологов, микробиологов и паразитологов: В 3-х т. Москва, 2007. Т. 2. С.
285-286.
6. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на численность стафилококков в составе микрофлоры толстой кишки / Л.Н. Шитов // Фундаментальные иссле дования. – 2008. - №1. – С.151-152.
7. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на численность и видовой состав энтерококков в составе микрофлоры толстой кишки / Л.Н. Шитов // Фундамен тальные исследования. – 2008. - №1. – С.152-154.
8. Шитов, Л.Н. Показатели микрофлоры толстой кишки у белых мышей, полу чавших метотрексат: дозозависимость эффекта и влияние путей введения / Л.Н.
Шитов // Современные наукомкие технологии. – 2008. - №5. – С. 83-85.
9. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на численность и антибиотико резистентность стафилококков в составе микрофлоры толстой кишки белых мышей / Л.Н. Шитов // Современные возможности клинической лабораторной диагностики в клинико-диагностическом процессе: Сб. науч.-практ. конф. – Ярославль: ООО «Изд. дом «Верхняя Волга», 2008. - С.103-106.
10. Шитов, Л.Н. Влияние метотрексата на некоторые показатели микробиоце ноза толстой кишки / Л.Н. Шитов // Сборник научных работ студентов и моло дых ученых ЯГМА, Ярославль 2008. - С. 78-79.
11. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на численность энтеробактерий в составе микрофлоры толстой кишки / Л.Н. Шитов // Материалы Пятого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва, 2-4 декабря 2008. Под ред. Р.Г. Василова. – М.: ИАЦ, 2008. – С. 255-257.
12. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на некоторые характеристики микрофлоры толстой кишки белых мышей / Л.Н. Шитов // Сборник материалов V съезда ревматологов России: Москва, 23-27 марта 2009. – С. 131.
13. Шитов, Л.Н. Сравнительная оценка влияния иммунодепрессантов различ ных групп на некоторые показатели микробиоценоза толстой кишки белых мышей / Л.Н. Шитов // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборник научных работ студентов и молодых учных Всероссийской конференции с международным участием, 22 апреля 2009, Ярославль: ООО "ЯрМедиаГруп", 2009. - С.79-80.
14. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на антибиотикорезистентность стафилококков и кишечных палочек / Л.Н. Шитов // Сборник материалов X международного конгресса: «Современные проблемы аллергологии, иммуноло гии и иммунофармакологии»: Казань, 20-23 мая 2009. - C. 266.
15. Шитов, Л.Н. Влияние метотрексата на рост и развитие популяции условно патогенных микроорганизмов. / Л.Н. Шитов // Актуальные вопросы медицин ской науки: Сборник научных работ сотрудников Ярославской государственной медицинской академии, посвящнный 65-летию ЯГМА. – Ярославль: ООО «ЯрМедиаГруп», 2009. – С. 157-160.
16. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на популяционный уровень и адгезивные свойства условно-патогенных бактерий толстой кишки бе лых мышей / Л.Н. Шитов, В.А. Романов // Журн. микробиологии, эпиде миологии и иммунобиологии. - 2009. - №6.- С. 12-16.
17. Шитов, Л.Н. Влияние метотрексата на антибиотикорезистентность стафилококков и кишечных палочек / Л.Н. Шитов, В.А. Романов // Фун даментальные исследования. - 2010. - №4. - С. 86-91.
Список сокращений АБП – антибактериальные препараты АФАМ – аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы ГМ – гемолитические микроорганизмы ИАМ – индекс адгезивности микроорганизма КП – кишечные палочки КПСФА – кишечные палочки со сниженной ферментативной активностью ЛНЭБ – лактозонегативные энтеробактерии МПК – минимальная подавляющая концентрация МТ – метотрексат ПЗ – преднизолон СПА – средний показатель адгезии УПБ – условно-патогенные бактерии ЦС – цитостатики ЦФ – циклофосфамид ATCC – American type culture collection