Новый эффективный подход для получения рекомбинантных белков основного фактора роста фибробластов (fgf-2) и лиганд связывающего внеклеточного домена рецептора ii типа tgf- (trii-ed) в e. coli

На правах рукописи

ЕЛИСТРАТОВ ПАВЕЛ АЛЕКСЕЕВИЧ НОВЫЙ ЭФФЕКТИВНЫЙ ПОДХОД ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ОСНОВНОГО ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ (FGF-2) И ЛИГАНД СВЯЗЫВАЮЩЕГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО ДОМЕНА РЕЦЕПТОРА II ТИПА TGF- (TRII-ED) В E. COLI Специальность: 03.01.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ.

Научные руководители: профессор, д.б.н. Д.А.Долгих к.б.н. М.Э. Гаспарян

Официальные оппоненты: профессор, д.х.н. В.И. Тишков д.б.н. Л.А. Новикова

Ведущая организация: Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита состоится « 24 » марта 2011 г. в « 14.00 » часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан: « 21 » февраля 2011 года Учёный секретарь диссертационного совета, к.б.н. А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние 30 лет индустрия биотехнологии создала более 50 успешных фармацевтических продуктов, основанных на терапевтических рекомбинантных белковых препаратах, таких как инсулин, интерфероны, цитокины, гормоны, факторы роста, биоинженерные антитела, ферменты и ингибиторы ангиогенеза.

Более 500 новых рекомбинантных белковых препаратов в настоящее время проходят клинические испытания. Экспрессия белков в E.coli и их последующее выделение и очистка является одним из самых популярных способов получения рекомбинантных белков. Причинами этого являются простота культивации, быстрый рост, большое разнообразие векторных систем, безопасность и экономическая выгодность процесса.

Фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) или основной фактор роста фибробластов (basic – bFGF) является членом большого семейства структурно похожих белков, которые влияют на рост, дифференцировку, миграцию и жизнеспособность (выживаемость) клеток различного происхождения. Белок FGF-2 стимулирует рост и развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез), а также нормальное заживление ран и рост тканей. Он может служить терапевтическим агентом для лечения ран различного происхождения, а при его введении в организм не наблюдается значительных побочных эффектов и общей токсичности. Белок FGF-2 эффективен как при лечении поверхностных ран и ожогов, так и при остром повреждении внутренних органов (в частности, легких и кишечника). Он способствует лечению незаживающих ран различного происхождения, в том числе ран, возникающих при радиационном поражении и при диабете. В настоящее время рекомбинантные препараты FGF-2 рассматриваются как хорошие средства для терапии ран различного происхождения. Разработка методов получения высокоочищенного, высокоактивного и стабильного препарата рекомбинантного FGF-2 человека без N- или С- концевых тагов и с высокими выходами белка является важной задачей и открывает широкие возможности для успешного использования FGF-2 как в доклинических, так и клинических испытаниях для стимуляции различных регенерационных процессов.

Другой группой факторов роста терапевтического назначения является семейство трансформирующих факторов роста- (TGF-), которое включает в себя пять изоформ полипептидов: TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 и TGF-5. Эти многофункциональные белки регулируют рост и дифференцировку клеток, индуцируя синтез белков внеклеточного матрикса и модулируя иммунный ответ. В настоящее время TGF- рассматривается в качестве многообещающего терапевтического средства при терапии ран, лечении остеопороза, ишемических повреждений и аутоиммунных заболеваний.

Однако многочисленные исследования показали, что существует ряд фибропролиферативных нарушений, при которых избыточная экспрессия TGF- играет ключевую роль. Суперэкспрессия TGF-1 наблюдается при гломерулонефрите, пульмонарном фиброзе, циррозе печени и при образовании келоидных рубцов. Это позволяет предположить, что молекулы-антагонисты TGF- могут быть эффективны при лечении этих заболеваний. Высокий уровень TGF- продуцируется также многими типами опухолей, включая меланому и рак груди, толстой кишки, пищевода, желудка, печени, легких, поджелудочной железы и простаты, а также при гематологических злокачественных заболеваниях. Нерегулируемая иммуноподавляющая активность TGF провоцирует развитие опухолей, в частности, на поздних стадиях болезни, когда опухоль начинает метастазировать. Накопленные доклинические и клинические данные указывают на то, что вещества, блокирующие сигнальные пути TGF-, могут быть использованы для лечения фиброзных нарушений и раковых заболеваний.

Одной из успешных стратегий для блокирования сигнальных путей TGF является непосредственная нейтрализация отдельных изоформ TGF- в крови.

Нейтрализующие TGF- реагенты могут быть разделены на две категории:

нейтрализующие антитела и ловушки лиганда, такие, например, как его растворимые рецепторы. Сигналы TGF- передаются посредством 2-х типов рецепторов: типа I и типа II (белки TRI и TRII). Исследования показали, что рекомбинантный растворимый внеклеточный домен рецептора TGF- типа II (TRII-ED, ED-extracelullar domain) обладает антифиброгенной и антиопухолевой активностью при метастазирующих опухолях, в результате нейтрализации высокого содержания TGF-1 и TGF-3 в крови.

Молекула TRII-ED обогащена остатками цистеина, которые образуют 6 дисульфидных связей, что затрудняет ее ренатурацию в прокариотических клетках, в частности, при экспрессии рекомбинантного белка в штаммах E.coli. Разработка эффективных методов экспрессии и очистки высокоактивного препарата белка TRII-ED в E.coli расширит возможности его применения в клинике для терапии рака и фиброзных нарушений.

Препарат может быть использован также для диагностики активной и латентной форм TGF- в плазме крови при различных заболеваниях, с помощью метода иммуноферментного анализа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Как альтернативный подход препарат рекомбинантного белка TRII-ED может быть иммобилизован на сорбентах и использован для адсорбции TGF- при его нежелательно высоком содержании в крови (метод гемоперфузии). Этот подход имеет преимущество, так как исключает нежелательные побочные эффекты, возникающие при введении белковых препаратов непосредственно в кровь.

Цель исследования.

Разработка новых эффективных подходов экспрессии в E.coli рекомбинантных белков терапевтического назначения основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и лиганд связывающего растворимого внеклеточного домена рецептора II типа TGF (TRII-ED), разработка методов очистки этих препаратов и исследование их биологической активности.

Задачи исследования.

1. Получить эффективные экспрессирующие конструкции для продукции рекомбинантных белков FGF-2 и TRII-ED в штаммах E.coli.

2. Разработать и оптимизировать методику очистки целевых рекомбинантных белков FGF-2 и TRII-ED.

3. Получить целевые белки в количествах, необходимых для проведения исследований.

4. Исследовать физико-химические свойства полученных рекомбинантных белков FGF-2 и TRII-ED с помощью методов спектроскопии кругового дихроизма, ЯМР спектроскопии и масс-спектроскопии.

5. Исследовать биологическую активность полученного рекомбинантного белка FGF-2 путем стимуляции роста фибробластов.

6. Исследовать лиганд-связывающие свойства рекомбинантного белка TRII-ED с помощью метода ELISA.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В данной диссертационной работе были разработаны новые эффективные подходы для экспрессии в E.coli и очистки рекомбинантных человеческих белков основного фактора роста (FGF-2), его мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S с улучшенной растворимостью и лиганд-связывающего внеклеточного домена рецептора II типа TGF- (TRII-ED). Разработанные методики позволяют получить высокоочищенные и высокоактивные стабильные препараты, 100-120 мг FGF-2 и 140-150 мг TRII-ED из 1 л культуры клеток, что на 2 порядка больше, чем в ранее описанных работах. Такой высокий выход целевых белков позволяет рассматривать полученные препараты FGF-2 и TRII-ED как потенциальные терапевтические средства, пригодные для диагностических и клинических испытаний. Низкая стоимость полученных препаратов открывает широкие возможности для их последующего использования в терапевтических нуждах.

Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: Первый студенческий симпозиум по биоинженерии, 27- октября 2006 г., Москва, Россия;

XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», 20-23 апреля 2007 г., Москва, Россия;

V Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 16- марта 2009 г., Москва, Россия;

XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 8-11 февраля 2010 г., Москва, Россия. II международный симпозиум «Биофарма-2010: от науки к промышленности», 17-20 мая 2010 г., Ереван, Армения.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе статьи, 5 тезисов конференций и 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка, 4 таблицы. Список литературы включает 207 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение препарата рекомбинантного белка FGF-2 человека.

1.1. Синтез гена FGF-2 и клонирование его в экспрессионный вектор pET-32a Последовательность ДНК, кодирующая внеклеточный фрагмент FGF-2 (513 пар нуклеотидов), была синтезирована из 20 перекрывающихя олигонуклеотидов (каждый длиной 35-42 оснований) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученный ген был клонирован в плазмидный вектор pET-32a по сайтам рестрикции BglII и HindIII вслед за геном несущего белка тиоредоксина (Trx) и, таким образом, сделан вектор для экспрессии FGF-2 – pET-32a/FGF-2. Вектор pET-32a предназначен для продукции в E. coli гибридных белков с тиоредоксином на N-конце и целевым белком на С-конце, которые соединяются линкером, содержащим сайт узнавания энтеропептидазы (непосредственно перед целевым белком) и последовательность из шести гистидиновых остатков (6x His-tag), для очистки белка с помощью аффинной хроматографии (Рис. 1).

Преимущество данной генетической конструкции заключается в том, что несущий белок тиоредоксин обеспечивает высокую экспрессию и растворимость целевого белка в составе слитного белка тиоредоксин/целевой белок и способствует его правильному сворачиванию. Наличие 6x His-тага в составе слитного белка облегчает очистку с помощью аффинной хроматографии, а после его расщепления высокоспецифичной протеиназой (в данной работе энтеропептидазой) целевой белок не содержит дополнительных тагов. Результатом является очищенный белок FGF-2 с природной третичной структурой и нативным N-концом.

Рис. 1. Схематическое изображение слитного белка Trx/FGF-2 в векторе pET-32a.

1.2. Экспрессия и очистка слитного белка Trx/FGF-2 в E.coli Для экспрессии гибридного белка Trx/FGF-2 был выбран штамм E. coli BL21(DE3), предназначенный для работы с системами экспрессии, основанными на активности промотора бактериофага Т7. Штамм E.coli BL21(DE3) экспрессирует Т7 РНК-полимеразу под промотором lacUV5. Это делает возможным индуцировать экспрессию рекомбинантных белков добавлением ИПТГ (изопропил--D тиогалактопиранозид) – специфического активатора Т7-промотора. Штамм E. coli BL21(DE3) трансформировали полученным экспрессирующим вектором pET-32a/FGF-2 и оптимальную концентрацию индуктора ИПТГ (изопропил--тиогалактопиранозид) подобрали в предварительных экспериментах (Рис. 2).

Наибольший уровень экспрессии слитного белка Trx/FGF-2 (примерно 1 г из 1 л культуры клеток E. coli) был достигнут при индукции клеток с помощью 0.02 мМ ИПТГ при росте в богатой среде TB в течение 24 часов при 25C (Рис. 2).

В результате экспрессии был получен слитный белок Trx/FGF-2 молекулярной массой примерно 34 кДа (17.25 кДа FGF-2 и 17.07 кДа тиоредоксин с линкером). После разрушения клеток на Френч прессе в буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия, мМ хлорида натрия и 10 мМ имидазола (рН 8.0), слитный белок Trx/FGF-2 очистили из растворимой фракции цитоплазматических белков с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе. Неспецифически связанные белки отмывали буфером для разрушения клеток, содержащим 20 мМ имидазола, после чего слитный белок элюировали с помощью того же буфера, содержащего 250 мМ имидазола (Рис. 3, лот 4).

Концентрация ИПТГ, мМ 0.0 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 0.75 1. кДа 66– 45– Trx/FGF- 31– 21– 1 2 3 4 5 6 7 Рис. 2. Экспрессия слитного белка Trx/FGF-2 в штамме E.coli BL21(DE3). Пробы, содержащие по 10 мкл ночной культуры, анализировали на 12 % ДСН-ПААГ. 1-9 – клетки, трансформированные плазмидной ДНК pET-32a/FGF-2, индуцированные различными концентрациями ИПТГ.

1.3. Расщепление слитного белка Trx/FGF-2 энтеропептидазой и очистка целевого белка FGF- Расщепление гибридного белка Trx/FGF-2 проводили с помощью рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека (получена в нашей лаборатории). Полное расщепление Trx/FGF-2 происходил при соотношении фермент–субстрат 1:75 000, в буфере, содержащей 50 мМ Tris-HCl (pH 7.8) и 50 мМ NaCl, в течение 16 часов при комнатной температуре. После расщепления слитного белка Trx/FGF-2 остаточную активность энтеропептидазы убирали с помощью аффинной хроматографии на колонке с STI агарозой (STI – соевый ингибитор трипсина). При расщеплении слитного белка образуется целевой белок FGF-2 (17.25 кДа) и белок носитель тиоредоксин с тагами (17.07 кДа), которые на полиакриламидном геле идут как одна полоса около 17 кДа (Рис.

3). При длительной инкубации слитного белка с энтеропептидазой образуется белок с молекулярным весом 15 кДа, что связано с неспецифическим расщеплением тиоредоксина с С-конца (примерно 2 кДа) и, как было показано ранее, является результатом расщепления тиоредоксина после остатка аргинина 143.

Природный белок FGF-2 имеет высокое сродство к гепарину. Поэтому, после расщепления слитного белка Trx/FGF-2 энтеропептидазой окончательную очистку целевого белка FGF-2 проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой. После нанесения препарата, колонку отмывали фосфатным буфером (pH 7.5) содержащим 300 мМ NaCl и целевой белок FGF-2 элюировали этим же буфером в присутствии 1.5 M хлорида натрия (Рис. 3, лоты 6-7).

Рис. 3. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка FGF-2 человека. 1 – маркеры молекулярных масс;

2 – препарат ночной культуры;

3 – фракция цитоплазматических белков;

4 – препарат слитного белка Trx/FGF-2 после очистки на Ni-NTA-агарозе;

5 – препарат слитного белка Trx/FGF-2 после расщепления энтеропептидазой;

6,7 – препарат FGF-2, очищенный на гепарин-сефарозе FGF-2;

8 – фракция белков, не связавшихся с гепарин-сефарозой.

Очищенный белок FGF-2 диализовали против буфера, содержащего 50 мМ фосфатного буфера (рН 7.5) и 150 мМ хлорида натрия, после чего стерилизовали пропусканием через стерильный фильтр и хранили при 4С. В результате, было получено примерно 10 мг высокоочищенного препарата FGF-2 из 100 мл культуры клеток. Выход очищенного препарата FGF-2 составил примерно 100 мг из 1 л культуры клеток.

Использование двух различных стадий аффинной хроматографии (Ni-NTA агарозы, для очистки слитного белка Trx/FGF-2 и гепарин-сефарозы, для окончательной очистки целевого белка FGF-2) позволило получить высокоочищенные препараты FGF-2 (степень очистки примерно 98 % по данным ДСН-ПААГ). После переноса очищенного FGF-2 на мембрану PVDF, была определена N- концевая последовательность MAAGSI, что соответствует остаткам 1-6 белка FGF-2 человека.

Для определения молекулярной массы полученного нами препарата FGF-2, а также анализа его чистоты, был использован метод масс-спектроскопии (Рис. 4). Масс спектрометрия показала наличие в образце только одного основного пика с молекулярной массой 17258 Да, что хорошо соответствует расчетной массе FGF-2 17257 Да. На графике масс-спектра присутствовал также пик с вдвое меньшей кажущейся молекулярной массой 8630 Да, который соответствует иону молекулы FGF-2 с зарядом 2+.

Рис. 4. Масс-спектр рекомбинантного белка FGF-2.

Таким образом, использование нами нового подхода экспрессии слитного белка Trx/FGF-2 сильно увеличило выход экспрессии белка в растворимой форме, что значительно облегчает процедуру очистки белка. Известно, что неправильно собранный белок FGF-2 имеет низкую растворимость и образует димеры, тримеры и агрегаты, так как в его молекуле имеются 4 неспаренных остатков цистеина. Благодаря наличию белка носителя тиоредоксина, очищенный слитный белок Trx/FGF-2 образовал относительно мало агрегатов, и после расщепления энтеропептидазой только примерно 30 % целевого белка FGF-2 агрегировало (Табл. 1). В результате разработанной методики экспрессии и очистки было очищено примерно 100 мг препарата FGF-2 из 1 литра культуры клеток,.

Высокие выходы, а так же относительно низкая стоимость позволят в будущем использовать препарат в клинических испытаниях, для терапии различных регенерационных процессов, в частности для лечения незаживающих ран различного происхождения.

Надо отметить, что разработанные нами подходы позволяют получить стабильный уровень экспрессии слитного белка Trx/FGF-2, что тобеспечивает ожидаемые выходы целевого белка при каждом новом выделении препарата FGF-2 (Табл. 1).

Табл. 1. Выходы очистки белка FGF-2 из 100 мл культуры клеток.

Усредненные данные приведены из пяти независимых экспериментов.

Стадии очистки Количество белка, Выход от мг предыдущей стадии, % Trx/FGF-2, очищенный на Ni-NTA 41± 7 агарозе Trx/FGF-2 после диализа 35± 5 Trx/FGF-2 после расщепления L- 28 ± 4 (14 FGF-2) 88. HEP и удаления агрегатов FGF-2 после очистки на гепарин- 10± 3 71. сефарозе 1.4. Исследование вторичной структуры препарата рекомбинантного FGF- методом спектроскопии кругового дихроизма Для определения вторичной структуры очищенного рекомбинантного белка FGF- был получен его спектр кругового дихроизма на спектрополяриметре J-500C (Jusco, Япония) в кювете с длиной оптического пути 0.01 см в дальней ультрафиолетовой области 190-240 нм (Рис. 5). Результаты расчета вторичной структуры FGF-2 с помощью программы Contin II показали, что в белке преобладает структура (63%), -спирали составляют 4 %, а 33 % белка имеет неупорядоченную структуру. Эти результаты соответствуют приводимым в литературе данным для образцов FGF-2, полученных различными способами.

CD[mdeg] - - - - 190 200 220 240 Wavelength [nm] Рис. 5. Спектр кругового дихроизма рекомбинантного белка FGF-2.

1.5. Исследование биологической активности рекомбинантного белка FGF- Биологическую активность препарата FGF-2 тестировали на фибробластах NIH3T из костного мозга человека с помощью набора реактивов фирмы Promega “The CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay” методом МТТ (3-(4,5 диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиум бромид). Фибробласты клеточной линии NIH3T3 были выращены при различных концентрациях FGF-2 в течение 72 часов в присутствии и отсутствии дексаметазона – гормонального препарата противовоспалительного, противоаллергического, десенсибилизирующего действия (Рис.

6). Двукратная стимуляция роста клеток NIH3T3 под действием FGF-2 наблюдался при концентрации 1-2 нг/мл, и ED50 составила 0,3 нг/мл. Эти данные сопоставимы с митогенной активностью нативного белка FGF-2 (ED50 = 0,2 нг/мл) и различных рекомбинантных препаратов (ED50 = 0,3-1,2 нг/мл) на клетках NIH3T3. Тестируемый гормон дексаметазон не влиял на рост клеточной линии NIH3T3.

Рис. 6. Митогенная активность рекомбинантного препарата FGF-2 на клетках NIH3T фибробластов в присутствии и отсутствии дексаметазона (декс.). Количество клеток в каждой лунке определили после инкубации с различными концентрациями FGF-2 в течение 72 часов.

2. Получение и исследование мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S 2.1. Экспрессия и очистка мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S Молекула FGF-2 содержит четыре остатка цистеина, которые не образуют дисульфидные мостики. Известно, что при получении рекомбинантных препаратов FGF- образуются димеры, тримеры и агрегаты за счет образования дисульфидных связей между молекулами. Ранее было показано, что замена двух остатков цистеина (C78 и С96) на остатки серина в молекуле FGF-2 улучшает растворимость белка и увеличивает биологическую активность.

Мутантный вариант FGF-2, содержащий двойную мутацию был получен введением замен нуклеотидных остатков в соответствующие кодоны в гене белка с помощью метода сайт-направленного мутагенеза.

Полученным плазмидным вектором pET-32a/FGF-2/С78S/С96S трансформировали бактериальный штамм E. сoli BL21(DE3). Экспрессию и очистку мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S проводили по методике, разработанной для белка FGF-2 дикого типа.

После разрушения клеток ночной культуры, слитный белок Trx/FGF-2/С78S/С96S очистили на Ni-NTA агарозе из общей фракции цитоплазматических белков. Очищенный белок расщепили рекомбинантной каталитической субъединицей энтеропептидазы человека, после чего целевой белок FGF-2/С78S/С96S очистили с помощью аффинной хроматографии на гепарин-сефарозе (Рис. 7).

Уровень экспрессии мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S и белка дикого типа практически не отличались (примерно 1 грамм с 1 литра культуры), однако, количество растворимого белка в цитоплазматической фракции выросло от 50 % (в случае дикого типа) до 75 % (Табл. 2).

кДа Trx/FGF-2/ С78S/С96S FGF-2/ С78S/С96S 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 7. Очистка FGF-2/С78S/С96S из растворимой фракции цитоплазматических белков.

1 – маркеры молекулярных масс;

2 – растворимая фракция цитоплазматических белков;

3-4 – слитный белок Trx/FGF-2/С78S/С96S после очистки на Ni-NTA;

5 Trx/FGF 2/С78S/С96S после расщепления энтеропептидазой;

6 – не связанная с гепарин сефарозой белковая фракция;

7-9 – фракции очищенного FGF-2/С78S/С96S.

Окончательные результаты из 5 независимых экспериментов показали, что выход очищенного мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S составляет примерно 120 мг из 1 л культуры клеток, что на 20 % больше, чем для белка дикого типа, экспрессированного и очищенного в аналогических условиях (Табл. 2).

Табл. 2. Ход очистки FGF-2/С78S/С96S из 100 мл культуры клеток. Усредненные данные приведены из пяти независимых экспериментов.

Стадии очистки Количество белка, Выход от мг предыдущей стадии, % Очищенный на Ni-NTA агарозе 53 ± 7 Trx/FGF-2/С78S/С96S Trx/FGF-2/С78S/С96S после 44 ± 5 диализа Trx/FGF-2/С78S/С96S после 33 ± 4 расщепления L-HEP (16.5 мг FGF-2/С78S/С96S) FGF-2/С78S/С96S после очистки на 12 ± 3 гепарин-сефарозе Известно, что в отсутствие восстановительных реагентов FGF-2 образует олигомеры. Анализ кристаллической структуры FGF-2 показал, что димеризация может происходить при участии поверхностных остатков цистеина 78 и 96, тогда как цистеины 25 и 92 недоступны. Анализ белковых проб на ДСН-ПААГ в присутствии и в отсутствие -меркаптоэтанола показал, что препарат FGF-2 дикого типа содержал примерно 5-7 % димерных молекул, тогда как препарат мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S состоял только из мономеров (Рис. 8).

Рис. 8. Наличие димерных молекул в препаратах FGF-2 и FGF-2/С78S/С96S. Пробы, содержавшие по 15 мкг белка, нагревали в течение 5 мин при 95° в присутствии и в отсутствие -меркаптоэтанола и анализировали в 12 % ДСН-ПААГ. 1 – маркеры молекулярных масс;

2-3 – FGF-2 с и без -меркаптоэтанола, соответственно;

4-5 – FGF-2/С78S/С96S с и без -меркаптоэтанола, соответственно.

2.2. Биологическая активность мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S Был проведен также сравнительный анализ биологической активности препаратов FGF-2 дикого типа и мутанта FGF-2/С78S/С96S на фибробластах линии NIH3T3 (Рис. 9).

Оба препарата обладали практически одинаковой активностью.

Рис. 9. Сравнение митогенной активности препаратов FGF-2 и FGF-2/С78S/С96S на клетках NIH3T3 фибробластов. Количество клеток в каждой лунке определили после инкубации с различными концентрациями FGF-2 в течение 48 часов.

Двукратная стимуляция роста клеток NIH3T3 под действием FGF-2 и FGF 2/С78S/С96S наблюдалась при концентрации 3,2 нг/мл, и ED50 (эффективная доза) составила 0,3 нг/мл.

Ранее было показано, что прямая экспрессия FGF-2 в разных штаммах бактерии позволяет получить примерно 1-5 мг белка из 1 л культуры клеток. Низкий выход белка отчасти обусловлен тем, что FGF-2 экспрессируется в бактериях в виде телец включения и плохо поддается ренатурации. Слитный белок глутатион-S-трансфераза/FGF-2 был очищен из бактерий с выходом 20 мг из 1 л культуры клеток, однако активность этого препарата был значительно ниже по сравнению c природным FGF-2. Новый подход экспрессии FGF-2 в составе слитного белка Trx/FGF-2 позволил получить высокий уровень экспрессии в растворимом виде, что сильно облегчает очистку белка.

Таким образом, разработанные нами в данном исследовании методики экспрессии и очистки рекомбинантного белка FGF-2 позволяют получить высокоочищенный, высокоактивный и стабильный препарат. Высокие выходы (примерно 100 мг из 1 л культуры клеток) и низкая стоимость препарата делают его доступным средством для доклинических и клинических испытаний.

3. Получение рекомбинантного препарата TRII-ED из клеток E.coli 3.1. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка TRII-ED Синтез гена, кодирующего белок TRII-ED (аминокислотные остатки 4-136, пар нуклеотидов), и его клонирование в плазмидный вектор pET-32a были выполнены аналогичным образом, как и для гена белка FGF-2, что описано в Главе 1.1.

Для экспрессии слитного белка Trx/TRII-ED полученным плазмидным вектором pET-32a/TRII-ED был трансформирован бактериальный штамм E.coli BL21(DE3).

Слитный белок экспрессировали, задав условия температуры роста 28 °C и время роста клеток 24 часа. Экспериментально подобрали оптимальную концентрацию индуктора T7 промотора ИПТГ, которая составила 0.05 мМ (Рис. 10).

ИПТГ (мМ) 0.0 0.01 0.02 0.05 0.10 0.20 0.50 1. кДа Trx/TRII-ED 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 10. Экспрессия белка Trx/TRII-ED при различных концентрациях ИПТГ. Пробы, содержащие по 10 мкл ночной культуры, анализировали на 12% ДСН-ПААГ. 1-маркеры молекулярных масс;

2-9 – клетки, трансформированные плазмидной ДНК pET-32a/TRII ED, индуцированные различными концентрациями ИПТГ.

В результате тщательного подбора условий экспрессии удалось получить как минимум 1 г слитного белка Trx/TRII-ED из 1 л культуры клеток.

После разрушения клеток ночной культуры штамма BL21(DE3)/pET-32a/TRII-ED слитный белок Trx/TRII-ED был очищен с помощью аффинной хроматографии из растворимой цитоплазматической фракции белков на Ni-NTA-агарозе (Рис. 11).

Рис. 11. Очистка слитного белка Trx/TRII-ED на Ni-NTA агарозе. Пробы, содержащие по 10-15 мкг белка, анализировали на 15% ДСН-ПААГ. 1 – 10 мкл ночной культуры клеток;

2 – нерастворимая фракция белков, растворенная в 8 М мочевине;

3 – растворимая фракция цитоплазматических белков;

4 – белки, не связавшиеся с Ni-NTA агарозой;

5 –фракция белков элюированных с колонки 250 мМ имидазолом.

Надо отметить, что примерно 90% Trx/TRII-ED с молекулярной массой 32.1 кДа (17 кДа тиоредоксин с линкерами и 15.1 кДа – TRII-ED) - экспрессировалось в растворимой форме. Раннее было показано, что при прямой экспрессии Trx/TRII-ED в штаммах E.coli белок полностью находился в нерастворимой форме в составе телец включения, что сильно затруднял его очистку и ренатурацию.

Очищенный слитный белок Trx/TRII-ED расщепили рекомбинантной легкой цепью энтеропептидазы человека в течение примерно 16 часов при комнатной температуре при соотношении фермент–субстрат 1:100 000. Далее целевой белок TRII ED был очищен от несущего белка тиоредоксина на Ni-NTA-агарозе (Рис. 12).

Посчитанная молекулярная масса целевого белка TRII-ED (4- аминокислотные остатки) составляет 15105.05 Да, однако очищенный TRII-ED визуализируется в 15% ДСН-ПААГ как полоса, соответствующая 17 кДа, примерно на одном уровне с несущим белком тиоредоксином. При длительной расщепления происходит неспецифическое расщепление молекулы тиоредоксина энтеропептидазой после остатка аргинина 143 с образованием пептида с молекулярной массой 15.4 кДа (Рис. 12А, линии 2 и 5), как было описано ранее.

После переноса очищенного TRII-ED на мембрану PVDF с помощью метода трансблоттинга, была определена N-концевая последовательность HVQKSVNN, что соответствует остаткам 4-11 TRII-ED человека.

Рис. 12. Очистка TRII-ED после расщепления слитного белка Trx/TRII-ED энтеропептидазой. Пробы, содержащие по 10-15 мкг белка, анализировали на 15% ДСН ПААГ. (А) 1 – очищенный Trx/TRII-ED до расщепления энтеропептидазой;

2-3 – Trx/TRII-ED после расщепления энтеропептидазой;

4 – белок, не связавшийся с Ni-NTA агарозой (очищенный TRII-ED);

5 – белок, элюированный с колонки 250 мМ имидазолом.

(В) 500 нг очищенного белка TRII-ED, визуализированного с помощью окрашивания нитратом серебра после приготовления проб в присутствии и отсутствии ДTT (1,4 дитиотреитол).

Эксперименты показали, что выход очищенного белка TRII-ED сильно зависит от процедуры ренатурации (Табл. 3). Только 0.81 мг TRII-ED было в итоге получено из мг слитного белка Trx/TRII-ED (из 100 мл клеточной культуры), когда слитный белок не подвергался процедуре ренатурации. Сильное увеличение (более чем в 7 раз) выхода белка было достигнуто после того, как элюированный с колонки Ni-NTA агарозы Trx/TRII-ED был подвергнут ренатурации, используя буферную систему с окисленным/восстановленным глутатионом. Белковый раствор Trx/TRII-ED по каплям добавили в буфер, содержащий 75 мМ трис-гидрохлорид, 0.5 M L-аргинин (pH 8.0), окисленный и восстановленный глутатион в соотношении 1 к 50 (0.04 мМ и 0.2 мМ соответственно) и инкубировали при 10С в течении 72 часов. Окончательная концентрация белка в буфере для ренатурации составила 0.15 мг/мл. В аналогичных условиях белок более эффективно ренатурировал, когда связанный с Ni-NTA агарозой Trx/TRII-ED медленно перемешивали в растворе для ренатурации. Такой подход ренатурации позволило очистить 14 мг TRII-ED из 100 мл культуры клеток (Табл. 3).

Получение функционально активного белка TRII-ED, имеющего 12 остатков цистеинов, которые формируют 6 дисульфидных связей, в бактериальных экспрессирующих системах довольно трудная задача. Главная причина того, что в клетках E.coli продуцируются неактивные эукариотические белки, заключается в невозможности формирования правильных дисульфидных связей из-за редуцированного цитоплазматического окружения и отсутствия тиол-заменяющих факторов. Это часто приводит к продукции нефункциональных белков в виде телец включения, которые требуют ренатурации in vitro. Было описано несколько экспериментов экспрессии TRII ED в E.coli, и во всех случаях целевой белок был очищен из телец включения после процедуры ренатурации. Выход очищенного белка всегда был низок (примерно 1-5 мг белка с литра культуры клеток). В результате разработанной в данной работе методов ренатурации, выход целевого белка TRII-ED составил 140 мг из 1 л культуры клеток, что в 50-100 раз больше, по сравнению со всеми описанными ранее работами, где были использованы различные экспрессионные системы.

Табл. 3. Количество очищенного белка TRII-ED из 100 мл культуры клеток.

Усредненные данные приведены из четырех независимых экспериментов.

Условия ренатурации Очистка Очищенный TRII-ED Выход Trx/TRII-ED после расщепления на Ni-NTA (мг) Trx/TRII-ED (мг) (%) Без ренатурации 87±7 0.81±0.7 2. (40 мг TRII-ED) Ренатурация 87 ±7 5.9±1.2 14. Trx/TRII-ED в растворе (40 мг TRII-ED) Ренатурация Trx/TRII-ED, 87±7 14.02±1.1 35. связанного с Ni-NTA (40 мг TRII-ED) агарозой 3.2. Исследование физико-химических свойств рекомбинантного TRII-ED.

С помощью метода ДСН-ПААГ и окрашивания нитратом серебра, а также HPLC хроматографии и масс-спектроскопии было показано, что выделенный препарат TRII ED высокоочищен и гомогенен (Рис. 12В, 13, 14).

Анализ препарата TRII-ED методом масс-спектроскопии показал единичный пик 15105.39 Да, что на 12 Да выше, чем посчитанная молекулярная масса окисленной нативной формы TRII-ED, содержащей 4-136 аминокислотные остатки (15093.05 Да) (Рис. 13).

Рис. 13. MALDI-TOF Масс-спектр очищенного препарата TRII-ED.

Возможно, во время приготовления образцов для MALDI-TOF масс-спектрометрии на матрице дигидроксибензойной кислоты и двукратного промывания образцов 5% муравьиной кислотой происходит восстановление всех 6 дисульфидных связей и масса белка увеличивается (15093.05 Да плюс 12 Да из-за 12 атомов водорода).

Гомогенность очищенного рекомбинантного белка была подтверждена методом HPLC-хроматографии, когда при пропускании препарата TRII-ED через колонку был зарегистрирован один единичный пик (Рис. 14).

Рис. 14. IUPAC-обратнофазная хроматография TRII-ED.

A ReproSil-Pur 300 C8, 3 мкм (Dr. Maisch Gmbh) колонка была использована и препарат TRII-ED был элюирован линейным градиентом 10-55% ацетонитрила в водном растворе 0.1% ТФА. Фракции элюированного целевого белка детектировались по поглощению при длине волны 280 нм.

Анализ спектра кругового дихроизма очищенного препарата TRII-ED показал, что в белке преобладают -структуры (53%). Содержание -спиралей составляет 10 %, а 37 % белка имеет неупорядоченную структуру (Рис. 15).

Рис. 15. Спектр кругового дихроизма белка TRII-ED.

Эти результаты соответствуют приводимым в литературе данным для образцов TRII ED, полученных различными способами.

3.3. Исследование лиганд-связывающей активности TRII-ED Лиганд-связывающие свойства очищенного рекомбинантного препарата TRII-ED (аминокислотные остатки 4-136) из E. coli были сравнены с коммерчески доступным рекомбинантным препаратом TRII-ED (полученный из клетках мышиной миеломы линии NSO, аминокислотные остатки 1-136), используя метод иммуноферментного анализа (ИФА) для TGF-.

Результаты иммуноферментного анализа (ELISA).показывали, что очищенный из E.coli препарат TRII-ED демонстрировал сродство к лиганду TGF-1, сопоставимый с коммерческим препаратом TRII-ED, экспрессируемый в клетках мышиной миеломы линии NSO (Рис. 16). В обоих случаях связывание TGF-1 возросло при повышении концентрации иммобилизиванного рецептора TRII-ED от 200 до 400 нг/мл и достиг насыщению при концентрации 1000 нг/мл. Эти данные указывают, что гликолизированная (из NSO клеток) и негликолизированная (из E.coli) формы TRII-ED обладают схожими свойствами иммобилизации к пластиковым ячейкам.

Рис. 16. Исследование лиганд-связывающей активности TRII-ED с помощью метода иммуноферментного анализа. Растворимый рецептор TRII-ED в концентрациях 0, 200, 400 и 1000 нг/мл был иммобилизован на ячейках 96-луночного планшета. После отмывки и блокирования ячеек, TGF-1 был добавлен в каждую ячейку. Связывание лиганда с рецептором определяли с помощью биотинилированных анти-TGF-1 антител (R&D; Systems, США) с последующим добавлением стрептавидина, конъюгированной пероксидазы хрена. Кривые зависимости эффекта от дозы построили по поглощению субстрата пероксидазы хрена о-фенилендиамина (OPD) при 492 нм. В неиммобилизированных с TRII-ED ячейках (контрольные) были детектированы значения поглощения 0.040-0.045 ОЕ.

Далее было показано, что лиганд-связывающая активность рекомбинантного белка TRII-ED сильно зависел от способа его получения и очистки, в частности от наличия процедуры ренатурации. Было показано, что ренатурированный препарат TRII ED имеет существенно более высокое сродство к лиганду TGF-1, чем препарат TRII ED, очищенный без этапа ренатурации (Рис. 17). Таким образом, разработанная нами методика ренатурации не только существенно улучшает выход белка, но и значительно влияет на его лиганд-связывающую активность.

Рис. 17. Влияние процедуры ренатурации на лиганд-связывающие свойства TRII-ED, проверенное методом иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали коммерческий рекомбинантный препарат TRII-ED (из клеток NSO).

Очевидно, что наличие 12 цистеиновых остатков в молекуле TRII-ED, которые образуют 6 дисульфидных связей, затрудняет процесс правильного сворачивания белка при экспрессии в штаммах E.coli, и дальнейшая очистка белка без процедуры ренатурации приводит к образованию неактивных растворимых молекул с неправильной вторичной структурой.

Надо отметить, что очищенный в данной работе препарат TRII-ED сохранял стабильность в течение как минимум одного года без потери лиганд-связывающих свойств, при хранении как в лиофилизированном виде, так и в растворе при температуре 4 С (Рис. 18).

Таким образом, разработанные в данном исследовании методики экспрессии, ренатурации и очистки рекомбинантного белка TRII-ED позволяют получить высокоочищенный, биологически активный и стабильный препарат с высоким сродством к лиганду TGF-. Высокие выходы (примерно 140 мг из 1 л культуры клеток) очищенного препарата делают его доступным реагентом для доклинических и клинических испытаний.

Рис. 18. Тест на стабильность препарата TRII-ED при помощи метода иммуноферментного анализа. Сравнение лиганд-связывающих свойств препаратов TRII-ED, очищенных в разные периоды: 07.04.2010 – свежевыделенный препарат;

07.04.2009 – препарат после хранения в растворе, содержащей 50 мМ фосфатного буфера (pH 7.5) и 150 мМ NaCl при 4С;

09.04.2009 – лиофилизированный белок после хранения при -20С.

Относительно дешевая процедура, высокая биологическая активность и значимые выходы получения белка TRII-ED без N- и C-концевых тагов позволяют рассматривать рекомбинантный препарат как потенциальный реагент биомедицинского назначения для терапии рака и фиброзных заболеваний. Рекомбинантный TRII-ED также может использоваться как средство диагностики для определения концентрации TGF- в сыворотке или плазме крови человека при различных заболеваниях, используя метод иммуноферментного анализа. В качестве альтернативного подхода, для удаления возникающих при раковых заболеваниях нежелательно высоких количеств TGF- в крови, рекомбинантный TRII-ED может быть иммобилизован на сорбент и использован для гемосорбции. Такой подход позволяет избежать побочных эффектов, вызванных внутривенным введением белковых препаратов. Адсорбционные колонки, заполненные сорбентом, который способен связывать латентную форму TGF-, использовались для прямой гемосорбции у крыс с привитой гепатоцеллюлярной карциномой. Было показано, что единичная обработка не только снижала величину опухоли, но и существенно увеличивала выживаемость животных.

ВЫВОДЫ 1. Получен штамм-продуцент E. coli BL21(DE3)/pET-32a/FGF-2 для получения фактора роста фибробластов FGF-2 и его мутантного варианта FGF-2/С78S/С96S.

Целевые белки экспрессировали в составе слитного белка с тиоредоксином.

2. Разработаны методы очистки, позволившие получить примерно 100 мг белка FGF-2 и 120 мг FGF-2/С78S/С96S из 1 литра культуры клеток.

3. Показано, что полученные препараты FGF-2 и FGF-2/С78S/С96S обладают одинаково высокой стабильностью и пролиферативной активностью по отношению к фибробластам мыши.

4. Получен штамм-продуцент E. coli BL21(DE3)/pET-32a/TRII-ED для экспресии лиганд-связывающего домена рецептора II типа цитокина TGF в составе гибридного белка тиоредоксин/TRII-ED 5. Разработаны методы ренатурации и очистки, позволившие получить примерно 140 мг стабильного белка TRII-ED из 1 литра культуры клеток.

6. Показано, что полученный гомогенный препарат TRII-ED имеет столь же высокую лиганд-связывающую активность по отношению к TGF, как и аналогичный рецептор, полученный из клеток млекопитающих.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. Гаспарян М.Э., Елистратов П.А., Дризе Н.И., Нифонтова И.Н., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Гиперэкспрессия в Escherichia Coli и очистка рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (FGF-2), Биохимия, 2009;

74: 272 – 277.

2. Gasparian M.E., Elistratov P.A., Yakimov S.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., An efficient method for expression in Escherichia coli and purification of the extracellular ligand binding domain of the human TGF type II receptor, J. Biotechnol., 2010;

148: 113 – 118.

Патентная заявка Гаспарян М.Э., Елистратов П.А., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Рекомбинантная плазмидная ДНК pET-32a, кодирующая ген лиганд-связывающего домена рецептора II типа трансформирующего фактора роста- человека (TRII), штамм бактерий Escherichia coli – продуцент слитного белка тиоредоксин/TRII и способ ренатурации и очистки целевого белка TRII. Патентная заявка №2009148142, от 24.12.2009, ИБХ РАН.

Решение о выдаче патента от 19.10.2010.

Тезисы конференций 1. Елистратов П.А., Повышение биологической активности основного фактора роста фибробластов FGF-2 путём введения мутаций в его ген. Первый студенческий симпозиум по биоинженерии. Москва, Россия. Тезисы докладов, 2006, с. 6 – 7.

2. Елистратов П.А., Экспрессия и очистка мутантного варианта рекомбинантного белка основного фактора роста фибробластов FGF-2. XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2007». Москва, Россия. Тезисы докладов, 2007, с. 17.

3. Elistratov P.A., Gasparian M.E., Dolgikh D.A., A novel and effective method for expression and purification of type II transforming growth factor-B receptor. 5th International congress Biotechnology: state of the art and prospects of development. Moscow, Russia. Abstracts book, 2009, pp. 127 – 128.

4. Елистратов П.А., Гаспарян М.Э., Долгих Д.А., Получение и исследование физико химических свойств лиганд-связывающего домена типа II (TR II) TGF (трансформирующего фактора роста ). XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, Россия. Тезисы, 2010, стр. 35.

5. Gasparian M.E., Elistratov P.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., A novel effective approach for overexpression in Escherichia coli and purification of recombinant proteins TRAIL, FGF-2 and TRII. The second international symposium «Biopharma-2010: from science to industry». Yerevan, Armenia. Abstracts, 2010, pp.13 – 14.