Вадимович роль белков клеточного цикла и протеолитических ферментов в патогенезе бокового амиотрофического склероза (клинико-биохимическое исследование)
На правах рукописи
БРЫЛЕВ ЛЕВ ВАДИМОВИЧ РОЛЬ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА (клинико-биохимическое исследование) 14.00.13 – Нервные болезни 03.00.04 – Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва – 2009 2
Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН и в Лаборатории функциональной биохимии нервной системы Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:
доктор медицинских наук М.Н. Захарова доктор биологических наук, профессор Н.В. Гуляева ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор медицинских наук, профессор А.С. Кадыков доктор биологических наук, профессор В.З. Ланкин ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова
Защита состоится “10” ноября 2009 года в 12 часов на заседании совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д.001.006.01 при Учреждении Российской Академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦН РАМН (125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80) Автореферат разослан “ ” 2009 года
Ученый секретарь совета по защите кандидатских и докторских диссертаций, кандидат медицинских наук М.А. Домашенко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Боковой амиотрофический склероз (БАС) является фатальным нейродегенеративным заболеванием. Вопрос этиологии и патогенеза БАС до настоящего времени не решен, что приводит к поздней диагностике заболевания и к неэффективности разнообразных терапевтических подходов.
Cложность разработки патогенетического лечения определяется несколькими основными причинами. Следует отметить, что БАС является мультифакториальным заболеванием, и это существенно затрудняет выделение основных патогенетических механизмов в качестве мишеней для воздействия. Важную роль играет генетическая предрасположенность, которая определяется мутациями в различных генах, реализуется под воздействием факторов внешней среды и запускает целый ряд патологических процессов. Доказано участие в патогенезе БАС эксайтотоксичности, окислительного стресса, патологического агрегирования белков, нарушения аксонального транспорта, дефицита нейротрофических факторов, аберрантной активации клеточного цикла, патологии астроцитов и нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) (Захарова М.Н. и соавт., 2009;
Shaw P.J., 2005). В результате, при отсутствии данных, убедительно доказывающих решающую роль того или иного механизма и данных о запускающем заболевание молекулярном механизме, ставится вопрос о комплексной терапии, хотя эффективность такого подхода пока не показана.
Кроме того, до сих пор остается открытым вопрос о причинах гетерогенности клинических и морфологических проявлений болезни у человека. Принято считать, что избирательность поражения мотонейронов определяется особенностями их морфологического строения, рецепторного пула мотонейронов и недостаточностью кальций связывающих белков. Тем не менее, у каждого пациента болезнь начинается с поражения определенной группы мотонейронов, имеет индивидуальный для каждого пациента темп прогрессирования, в ряде случаев клиническую картину дополняют когнитивные и вегетативные нарушения. У пациентов старшего возраста, при бульбарной и первично генерализованной формах заболевания БАС течет более «злокачественно» (Завалишин И.А., 2009;
Mitsumoto H., 2001;
Norris F.H., 1992). Эти факты говорят о том, что, возможно, необходим индивидуальный подход к лечению каждого пациента, в то время как в клинических рандомизированных испытаниях не учитываются индивидуальные особенности течения БАС у того или иного пациента.
Подавляющая часть наших представлений о механизмах патогенеза БАС получена в модельных условиях (на животных и клеточных линиях), а эти результаты не могут быть прямо перенесены на заболевание человека. Так, на мышах и нейрональных культурах с мутацией в гене цитозольной супероксид дисмутазы (СОД1) убедительно продемонстрировано участие каспаза-зависимых и каспаза-независимых механизмов программированной клеточной гибели (ПКГ). Результаты, полученные на материале пациентов с БАС, значительно более фрагментарны. Несоответствие усугубляется тем, что существует множество различных моделей БАС. Наряду с линией мышей с мутацией G93A в гене СОД1, которая наиболее широко используется в качестве модели БАС, существует более десяти различных моделей с другими мутациями в гене СОД1. Кроме того, патология мотонейронов описана у мышей с мутациями в гене алсина, легких цепей нейрофиламентов, эндотелиального фактора роста, а также у мышей с увеличенной экспрессией периферина или динамантина. У каждой из перечисленных моделей есть уникальные особенности клинических и морфологических проявлений нейродегенерации (Kato S., 2008). В связи с этим остается открытым вопрос о возможности прямой трансляции на человека наших знаний о моделях БАС.
Изучение патогенеза и причин гетерогенности заболевания у человека наряду с исследованием аутопсийного материала может быть основано на исследовании прижизненных маркеров патологического процесса. Так, исследования крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) подтвердили участие в патогенезе заболевания эксайтотоксичности, оксилительного стресса, нейровоспаления и дефицита нейротрофических факторов (Turner M.R. et al., 2009). Показано, что в крови больных БАС повышено содержание глутамата (Ilzecka J. et al., 2003), уровень активных метаболитов кислорода (Захарова М.Н., 2001), концетрация интерлейкина 6 (Ono S. et al., 2001) и моноцитарного хемоаттрактанта, а также ряда других маркеров (Simpson E.P. et al., 2004). В ЦСЖ повышен уровень макрофагального хемоаттрактанта (Tanaka M. et al., 2006), снижено содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (Moreau C. et al., 2006), эритропоэтина (Brettschneider J. et al., 2007);
кроме этого, снижен антиоксидантный потенциал ЦСЖ больных БАС (Захарова М.Н., 2001;
Siciliano G. et al., 2007). С помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) в различных режимах – Т1, диффузионно взвешенного изображения, функционального МРТ и спектроскопии – удалось визуализировать как преимущественное поражение кортикоспинального тракта, так и вовлечение в процесс других популяций нейронов, в частности нейронов лобных извилин у пациентов с когнитивными нарушениями (Waragai M. et al., 1997;
Ciccarelli O. et al., 2006;
Tessitore A. et al., 2006;
Lule D. et al., 2007). Часть биохимических и МРТ-маркеров показали свою диагностическую и прогностическую ценность (Turner M.R. et al., 2009). Однако, до сих пор ни один из них не вошел в клиническую практику, а в диагностике и прогнозе спорадического БАС используются лишь клинические и нейромиографические критерии.
Таким образом, поиск новых прижизненных маркеров БАС является актуальной научной задачей. Этот поиск должен быть основан на выявлении периферических маркеров универсальных патогенетических механизмов, таких как аберрантная активация клеточного цикла, патология глиальных клеток, нарушение проницаемости ГЭБ, активация каспаз и других протеолитических ферментов. Сопоставление уровня маркеров с клинической картиной заболевания – длительностью, формой, вариантом, темпом прогрессирования болезни, а также с возрастом больного – возможно, позволит выявить патогенетически наиболее значимый механизм, пролить свет на причины клинической гетерогенности болезни и установить последовательность патологических событий.
Цель исследования: изучение роли белков клеточного цикла и протеолитических ферментов в патогенезе БАС и поиск новых диагностических маркеров заболевания.
Задачи исследования:
Определить экспрессию белков клеточного цикла - циклин-зависимой киназы-1 (cdk 1.
1), циклин-зависимой киназы-4 (cdk-4), циклина B1- в цереброспинальной жидкости больных боковым амиотрофическим склерозом.
Определить активность протеолитических ферментов – каспазы-3, калпаина-1, 2.
катепсина В – в цереброспинальной жидкости больных боковым амиотрофическим склерозом.
Оценить активность модуляторов протеолитических ферментов – каспазы-3, калпаина 3.
1 и катепсина В – в цереброспинальной жидкости больных боковым амиотрофическим склерозом.
Изучить содержание маркеров клеточной гибели и нейронспецифических белков – 4.
лактатдегидрогеназы, нейронспецифической енолазы, фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов – в цереброспинальной жидкости больных боковым амиотрофическим склерозом Оценить проницаемость гематоэнцефалического барьера у пациентов с боковым 5.
амиотрофическим склерозом путем измерения альбуминового индекса.
Провести клинико-биохимические сопоставления уровня изучаемых маркеров с 6.
формой, вариантом течения, длительностью заболевания и характером его прогрессирования.
Научная новизна исследования:
Впервые проведено комплексное клинико-биохимическое исследование уровней белков клеточного цикла, активности протеолитических ферментов и их модуляторов в ЦСЖ больных БАС, позволяющее оценить вклад аберрантной активации клеточного цикла и дисбаланса протеолитических систем в патогенез БАС.
Впервые показано увеличение экспрессии циклин-зависимой киназы-1 в ЦСЖ больных БАС. Установлена связь уровня экспрессии циклин-зависимой киназы-1 с формой и длительностью заболевания. Продемонстрировано, что повышенная экспрессия этого белка клеточного цикла определяет неблагоприятный прогноз болезни, так как уровень cdk-1 выше у пациентов с быстрым темпом прогрессирования БАС.
Впервые в ЦСЖ больных БАС выявлено специфичное для данного заболевания повышение калпаиноподобной активности при низких значениях рН (КПАк). Показана связь КПАк в ЦСЖ с формой, длительностью болезни и с уровнем маркеров клеточной гибели.
Полученные данные указывают на возможное сходство исследуемого фермента с известными калпаинами.
Впервые показано, что ЦСЖ пациентов с БАС имеет специфический профиль влияния на активность протеолитических ферментов. При сравнении с контрольной группой и больными рассеянным склерозом (РС) установлено, что в ЦСЖ пациентов с БАС повышена степень ингибирования калпаина-1 и степень ингибирования катепсина В. Продемонстрировано, что активность ингибиторов калпаина-1 и катепсина В зависит от формы и длительности заболевания. Выявлено, что степень ингибирования катепсина В при добавлении ЦСЖ больных БАС обратно коррелирует со степенью дыхательных нарушений.
При анализе свойств ингибиторов калпаина-1 и катепсина В впервые показано, что в ЦСЖ как в норме, так и при патологии, содержатся низкомолекулярные (менее 10 кД) ингибиторы калпаина-1 и катепсина В.
Научно-практическая значимость работы:
В работе выявлены признаки активации клеточного цикла и дисбаланса протеолитических систем, что имеет важное теоретическое значение для понимания патогенеза БАС.
Полученные данные дают основание предположить, что аберрантная активация клеточного цикла и протеолитические системы участвуют в нейродегенеративном процессе при БАС.
При анализе ЦСЖ выявлен новый, не описанный ранее, фермент, обладающий калпаиноподобной активностью при низких значениях рН. Показано, что в ЦСЖ присутствуют низкомолекулярные ингибиторы цистеиновых протеаз, калпаина-1 и катепсина В.
Показано, что уровень экспрессии циклин-зависимой киназы-1 и альбуминовый индекс могут быть использованы в качестве маркеров прогрессирования болезни. Повышение уровня циклин-зависимой киназы-1 и альбуминового индекса на ранних стадиях болезни является плохим прогностическим фактором и характерно для быстро прогрессирующего течения БАС.
Установлено, что в диагностике БАС может быть использован анализ уровня фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов в ЦСЖ, калпаиноподобная активность в ЦСЖ, степень ингибирования калпаина-1 и катепсина В при добавлении ЦСЖ.
Перечисленные маркеры согласно полученным данным обладают высокой чувствительностью и специфичностью.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Развитие патологического процесса при боковом амиотрофическом склерозе происходит на фоне повышения экспрессии белка клеточного цикла, циклин-зависимой киназы-1, и дисбаланса протеолитических систем в цереброспинальной жидкости.
2. Нейродегенеративный процесс сопровождается повышением уровня маркеров клеточной гибели в цереброспинальной жидкости и нарушением гематоэнцефалического барьера.
3. Активация клеточного цикла и увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера могут служить пусковыми механизмами програмированной клеточной гибели и аксональной дегенерации, в то время как активация протеолитических систем происходит на более поздних этапах патологического процесса.
4. Наиболее выраженные изменения биохимических показателей происходят при самой «злокачественной», бульбарной, форме бокового амиотрофического склероза.
5. Исследованные маркеры могут быть использованы в диагностике и прогнозе течения нейродегенеративного процесса при БАС.
Апробация работы Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников первого, второго, третьего, пятого, шестого неврологических и научно-консультативного отделений, лабораторий патологической анатомии, нейрохимии и клинической биохимии НЦН РАМН 08.09.2009 г. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференции молодых ученых 29.12.2008 в НЦН РАМН, а также на 11 конгрессе Европейского общества неврологов (EFNS) (Бельгия, Брюссель, 2007);
на 18 конгрессе Международной Ассоциации, посвящённой заболеваниям мотонейрона (ALS/MND Association) (Канада, Торонто, 2007).
Публикации По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи, 4 тезиса научных конференций и глава в монографии (в соавторстве).
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики пациентов и методов исследования, главы, посвященной результатам, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа иллюстрирована таблицами и 38 рисунками. Библиография включает в себя 232 источника, из них отечественных и 218 зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика больных В исследуемую группу было включено 75 больных с достоверным диагнозом БАС (Brooks B.R. et al., 2000). В контрольную группу было включено 40 больных с острой хирургической патологией, которым проводилась спинномозговая анестезия. Группу сравнения составили пациентов с рассеянным склерозом (РС).
Клиническое обследование больных БАС проводилось в 6-ом неврологическом отделении НЦН РАМН. У всех больных была детально изучена клиническая картина заболевания с использованием данных анамнеза, неврологического и соматического статуса, а также результатов нейроофтальмологического и отоневрологического исследований. Всем больным проводилось электромиографическое исследование и оценка функции внешнего дыхания методом спирометрии.
В части случаев для исключения БАС-подобных синдромов были применены биохимические, иммунологические и рентгенологические методы исследования, включая компьютерную томографию и магнитно-резонансную томографию головного и спинного мозга.
Среди общего числа больных БАС было 43 (57,3%) мужчин и 32 (42,7%) женщин. Возраст больных БАС был от 24 до 76 лет, составляя в среднем 51,2±10,8 лет. В зависимости от первичного уровня поражения выделено 3 группы больных с различными формами БАС согласно ранее предложенным классификациям (Хондкариан О.А. и соавт., 1978;
Norris F.H., 1992). Шейно-грудная форма БАС была диагностирована у 38 (50,7%) человек, пояснично крестцовая – у 20 (26,7%), бульбарная – у 17 (22,6%).
Все больные были также разделены на подгруппы в зависимости от варианта течения, длительности заболевания и темпа прогрессирования патологического процесса. Смешанный вариант течения заболевания имел место у 51 больного (68%). Преобладание сегментарно ядерных нарушений (“переднероговой вариант”) или пирамидной симптоматики наблюдалось у 21 (28%) и 3 (4%) больных, соответственно. Длительность заболевания до 1 года отмечена у 29 больных (38,7%), от 1 года до 2 лет – у 21 (28%), более 2 лет – у 25 (33,3%).
Темп прогрессирования у больных оценивали по нарастанию неврологического дефицита (с использованием функциональной шкалы неврологического дефицита – ALS Functional Rating Scale Revised, FRS-R) и скорости распространения патологического процесса на другие уровни (Cedarbaum J.M. et al., 1999). В обследованной группе быстрый темп прогрессирования наблюдался у 48 (64%) больных, медленный – у 27 (36%) человек.
У пациентов, включенных в исследование, неврологический дефицит по шкале ALSFRS-R варьировал от 15 до 39 баллов, жизненная емкость легких – от 50 до 100%. Основные клинические характеристики больных представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Клиническая характеристика больных БАС, включенных в исследование.
Медиана Ниж. Верх.
Показатель квартиль квартиль Длительность (мес.) 15,0 9,0 24, ЖЕЛ (% от ДЖЕЛ) 86,0 72,8 99, Тяжесть (ALSFRS-R) 31,0 27,0 35, Срок до генерализации (мес.) 7,5 4,0 14, Средний возраст контрольной группы составил 56,7±12,4 лет;
по возрасту контрольная группа была сопоставима с группой больных БАС. В контрольной группе, так же как в группе пациентов с БАС, преобладали мужчины (соотношение 1,3:1). Забор ЦСЖ производили однократно перед введением препарата для спинномозговой анестезии.
Среди общего числа больных РС было 3 (18.75%) мужчин и 13 (81.25%) женщин. Возраст больных РС был от 22 до 46 лет, составляя в среднем 38.7±8.5 лет, по возрасту группа сравнения была сопоставима с группой больных БАС.
Люмбальная пункция всем больным была произведена после получения информированного согласия. Пробы ЦСЖ хранились при температуре -70°C.
Биохимические методы исследования Биохимические исследования проводились в лаборатории функциональной биохимии нервной системы ИВНДиФ РАН и в НЦН РАМН.
При проведении биохимических исследований все образцы измерены в двух параллелях.
Экспрессию циклинзависимой киназы-1 (cdk-1) определяли с помощью прямого иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) по методике, разработанной в лаборатории. В работе были использованы поликлональные кроличьи антитела к cdk-1 (Santa Cruz, США) в концентрации 1 мкг/мл и козьи антивидовые антитела к кролику, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США) в концентрации 1 мкг/мл.
Люминесценцию регистрировали на флуориметре Victor 3. В качестве стандартной пробы использовали гомогенат глиомы.
Калпаиноподобную активность при рН 7.4 (КПАн) определяли согласно методическим рекомендациям, приведенным в работе Bizat et al. (2003), с некоторыми модификациями.
Образец ЦСЖ смешивали с реакционной средой, содержащей флюорогенный субстрат калпаина Ac-LY-AMC (Biomol, США). Флюоресценцию измеряли при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 и 440 нм соответственно. Калпаиноподобную активность при рН 5.5 (КПАк) определяли тем же способом в таких же условиях, за исключением рН реакционной среды. В дополнительных экспериментах определяли степень ингибирования КПАк специфическим ингибитором калпаина ALLN (Biomol, США). Использовали три концентрации ингибитора: 5, 20 и 50 мкМ.
Активность каспазы-3 определяли спектрофлюориметрически способом, описанным ранее (Stepanichev et al., 2003). Образец ЦСЖ смешивали с реакционной средой, содержащей флюорогенный субстрат каспазы-3 Ac-DEVD-AMC (Biomol, США). Флюоресценцию измеряли при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 и 440 нм соответственно.
Степень влияния ЦСЖ на активность протеолитических ферментов, каспазы-3, калпаина 1 и катепсина В, измеряли также флюрометрическим методом. ЦСЖ добавляли к среде, содержащий соответствующий очищенный фермент (рекомбинантную человеческую каспазу 3 (BioSource International Inc., США);
активный очищенный человеческий калпаин-1 (Sigma, США);
активный очищенный бычий катепсин В (Sigma, США) и его специфический флюорогенный субстрат. В качестве положительного контроля использовали пробу без добавления ЦСЖ для определения общей активности фермента. Измерение производили в 384-луночной плашке NUNC 384. Флюресценцию измеряли при температуре 37оС в динамике в течение 60 минут с интервалом измерений 10 мин при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 и 440 нм соответственно.
Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) проводили согласно методическим рекомендациям, приведенным в работе Lases E.C. et al. (2004), с модификациями.
Для определения концентрации нейронспецифической енолазы (НСЕ) в ликворе больных БАС и людей контрольной группы мы использовали коммерческий набор для НСЕ ELISA (Chemicon, USA).
Для определения концентрации фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов (фНФТ) в ЦСЖ больных РС, БАС и людей контрольной группы был использован коммерческий набор для фНФТ ELISA (Chemicon, USA). Аналитическая чувствительность набора 0.0585 нг/мл, диапазон детекции – от 0.0293 до 15 нг/мл. Все этапы производили согласно методическим указаниям.
Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., США) для персонального компьютера. Для нормально распределенных признаков вычислялось среднее значение и стандартное отклонение, результаты представлены в виде среднее±стандартное отклонение.
При выполнении описательной статистики для количественных признаков, распределенных не по нормальному закону, вычислялись медиана и интерквартильный размах-нижний 25% и верхний 75%-ный интервалы. Результаты представлены в виде медианы (нижний квартиль;
верхний квартиль). Сравнение двух независимых групп по одному признаку для количественных, качественных, порядковых и номинальных признаков проводилось с помощью критерия Манна-Уитни. Сравнение трех независимых групп по одному признаку выполнялось по методу Краскела-Уоллиса. Взаимосвязь двух признаков анализировалась при помощи корреляционного анализа по Спирмену, с вычислением коэффициента корреляции R.
Для оценки диагностической ценности исследованных в работе маркеров патологического процесса был проведен ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic). Уровень достоверности выбран на уровне р0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Экспрессия белков клеточного цикла в ЦСЖ.
Определение уровня cdk-1 в ЦСЖ проводили у 20 пациентов с БАС. В контрольную группу вошло 9 пациентов. Группу сравнения составили 16 пациентов с РС.
Таблица 2.
Экспрессия cdk-1 (единицы люминисценции) в ЦСЖ больных.
Нижний Верхний Группа Медиана квартиль квартиль БАС • Все (n=20) 724,5 217,8 1105, • Быстрый темп (n=13) 843,5* 661,5 1090, 245 128 1135, • Медленный темп (n=7) 926,3* 340,8 1632, РС (n=16) 251,5 134,0 619, Контроль (n=9) Достоверность различий по сравнению с контролем: * – при р0.05;
тест Манна Уитни.
Уровень экспрессии cdk-1 в общей группе больных БАС не отличался от уровня в группах контроля и сравнения, в то время как уровень экспрессии в группе больных РС достоверно превышал значения, полученные в контрольной группе (p0,05). Однако, значения люминесценции в подгруппе больных БАС с быстрым темпом прогрессирования (n=13) достоверно отличались от контроля (p=0,015) (таб. 2). Также значения люминесценции в группе больных БАС с быстрым темпом прогрессирования с высокой степенью достоверности отличались от группы БАС с медленным темпом прогрессирования (n=7) (p=0,01). Кроме того, отмечена связь экспрессия cdk-1 в ЦСЖ больных БАС с длительностью заболевания. В группе больных БАС наибольшая экспрессия cdk-1 отмечена в подгруппе больных с длительностью болезни менее одного года. В этой подгруппе экспрессия cdk-1 превышает таковую в контрольной группе и в подгруппе больных с длительностью заболевания более двух лет (p0,05). Уровень cdk-1 обратно коррелирует с длительностью БАС (r=-0,68 p0,02) (рис. 1). При анализе экспрессии cdk-1 в ЦСЖ у пациентов с разными формами БАС наиболее выраженное повышение экспрессии было выявлено в подгруппе больных с бульбарной формой заболевания (n=9). Только в этой подгруппе экспрессия cdk-1 была достоверно выше, чем в контрольной группе (p0,05).
Экспрессия cdk- Рисунок 1. Зависимость экспрессии cdk-1 от длительности заболевания Таким образом, нами впервые проведено определение содержания cdk-1 в ЦСЖ.
Экспрессия этого белка клеточного цикла повышена в отдельных подгруппах больных с БАС и у пациентов с РС, что, возможно, указывает на вклад cdk-1 в патогенез неврологических заболеваний. Следует подчеркнуть, что максимальный уровень cdk-1 зафиксирован на ранних стадиях БАС, при наиболее злокачественной, бульбарной, форме и при быстром прогрессировании болезни.
Полученные результаты согласуются с данными литературы, указывающими на важную роль реактивации клеточного цикла в реализации программированной клеточной гибели.
Показано, что при нейродегенеративных заболеваниях, таких как БАС, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, в поврежденных нейронах повышена экспрессия белков клеточного цикла, в том числе cdk-1. Последняя, наряду с циклином В, регулирует переход клетки из фазы S в фазу G2. Переход нейронов в фазу G2 при болезни Альцгеймера дополнительно подтвержден методом in situ гибридизации, с помощью которого было зафиксировано удвоение ДНК в гибнущих нейронах (Yang Y. et al., 2001). Повышение экспрессии белка клеточного цикла преимущественно в начале заболевания, продемонстрированное в нашей работе, можно соотнести с данными об активации экспрессии белков клеточного цикла (циклин D, циклин B, PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток)) в нейронах пациентов с умеренными когнитивными нарушениями, не достигшими уровня деменции, характерной для болезни Альцгеймера (Yang Y. et al., 2003).
Большинство авторов сходится во мнении, что результатом повышенной экспрессии белков клеточного цикла может стать увеличение синтеза проапоптотических белков (Liu D.X. et al., 2004), регулирующих активность протеолитических ферментов, и аномальное фосфорилирование внутриклеточных белков (Vincent I. et al., 2003). В нашем исследовании было проведено определение активности протеолитических ферментов и концентрации фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов в ЦСЖ больных БАС.
Активность протеолитических ферментов и их модуляторов в ЦСЖ.
Определение активности протеолитических ферментов в ЦСЖ проводилось в подгруппе из 30 пациентов с БАС и у 19 больных из контрольной группы. Основная и контрольная группы были сопоставимы по возрасту и полу.
В результате проведенных экспериментов по определению активности каспазы-3 и катепсина В в ЦСЖ установлено, что использованный нами метод регистрации активности этих ферментов не позволяет выявить их активность. Это может быть связано как с недостаточной чувствительностью метода, так и с тем, что активные формы каспазы-3 и катепсина В отсутствуют в ЦСЖ как в норме, так и при БАС.
Калпаиноподобная активность при кислых значениях рН (КПАк) в ЦСЖ пациентов с БАС составила 0.14 (0.12;
0,21) пмоль/мин/мг белка, что достоверно выше, чем в контроле 0.07 (0.04;
0,09) пмоль/мин/мг белка (р0.005) (рис. 2). Калпаиноподобная активность при нейтральных значениях рН (КПАн) в контрольной группе составила 0.26 (0.21;
0,38) пмоль/мин/мг белка, в группе пациентов с БАС 0.31 (0.23;
0,37) пмоль/мин/мг белка. Между группами не было выявлено статистически значимых различий.
КПАк существенно повышена по сравнению с контролем при каждой форме заболевания.
В наибольшей степени отличие от контроля выражено в группе пациентов с бульбарной формой БАС (n=7) (р0.005). Достоверные отличия КПАк от контроля обнаружены у пациентов с пояснично-крестцовой (n=8) (р0.05) и с шейно-грудной (n=15) (р0.05) формами БАС. У пациентов с длительностью заболевания от 1 года до 2 лет (n=10) КПАк достоверно превосходит контрольный уровень (р0.0005), так же как и у пациентов с длительностью заболевания до 1 года (n=15) (р0.01). КПАк у групп пациентов с длительностью заболевания до 1 года и от 1 года до 2 лет различается на уровне значимой тенденции (рис. 3).
* Рисунок 2. Активность КПАк в ЦСЖ пациентов с БАС.
Достоверность различий: * – при р0.05;
тест Манна-Уитни. Данные представлены в виде медианы и верхнего квартиля.
** # * Рисунок 3. Активность КПАк в зависимости от длительности БАС.
Достоверность различий: # – при р0.1, * – при р0.05, ** – при р0.001;
тест Манна Уитни. Данные представлены в виде медианы и верхнего квартиля.
В ЦСЖ как в норме, так и при БАС содержится фермент, обладающий КПАк. Для получения дополнительных сведений о природе этого фермента был проведен ряд экспериментов, в ходе которых определяли степень ингибирования КПАк специфическим ингибитором калпаина ALLN. При увеличении концентрации ингибитора от 5 до 50 мкМ достоверно уменьшается остаточная КПАк (р0.05). При концентрации ингибитора 50 мкМ остаточная активность составляет менее 40%. Следовательно, КПАк, по-видимому, принадлежит протеазе, сходной по свойствам с калпаином.
Экспериментальные данные, полученные на мышах с мутацией в гене СОД1, подтверждают участие различных цистеиновых протеаз, в том числе калпаина, катепсина и каспаз в нейродегенерации при БАС (Guegan C. et al., 2001;
Sathasivam S. et al., 2005;
Wootz H. et al., 2006). Повышение активности катепсина В, который является секретируемой протеазой, описано при воспалительных заболеваниях нервной системы и метастазах в головной мозг. Активность несекретируемых цистеиновых протеаз в ЦСЖ у пациентов была зарегистрирована лишь в исследовании больных с черепно-мозговой травмой (Haerter L. et al., 2001). В этой группе пациентов была повышена активность каспазы-3 в ЦСЖ и выявлены продукты расщепления спектрина, специфичные для каспазы-3 и для калпаина (Farkas O. et al., 2005). При хронических нейродегеративных заболеваниях в ЦСЖ ранее не было зафиксировано прямых или косвенных признаков повышения активности каспазы-3 или калпаина. Возможно, это связано с более медленным темпом клеточной гибели или с наличием в ЦСЖ ингибиторов данных ферментов, которые не позволяют детектировать их активность.
В нашей работе впервые было показано, что в ЦСЖ больных БАС повышена КПАк.
Наиболее выраженное повышение КПАк отмечено у пациентов с бульбарной формой БАС и длительностью болезни от 1 до 2 лет. Эти данные указывают на то, что на развернутой стадии патологического процесса важную роль нем играет активация протеолитического фермента со сходными с калпаином свойствами.
Наряду с определением активности протеолитических ферментов в ЦСЖ больных БАС и больных контрольной группы нами было проведено изучение модуляторов протеаз в ЦСЖ.
Основанием для такого подхода послужили литературные данные о патогенетической значимости нарушенных соотношений протеаз со своими ингибиторами при неврологических заболеваниях (Nagai A. et al., 2000;
Lorenzl S. et al., 2003). В нашей работе мы использовали описанный ранее подход (Kodama H. et al., 2002) и определяли степень ингибирования чистых ферментов при добавлении ЦСЖ больных БАС, пациентов контрольной группы и группы сравнения. Мы впервые применили данную методику для исследования ЦСЖ больных с неврологическими заболеваниями.
Активность модуляторов протеолитических ферментов Активность модуляторов протеолитических ферментов в ЦСЖ была определена в подгруппе из 34 больных БАС, у 21 пациента из группы контроля и у 10 пациентов с РС.
Было установлено, что ЦСЖ пациентов из контрольной группы активирует каспазу-3, ингибирует катепсин В и калпаин 1. ЦСЖ пациентов с БАС в условиях нашего эксперимента на 37,7% (26,6;
40,2) ингибирует активность чистого калпаина 1, что достоверно более выражено, чем ЦСЖ пациентов контрольной группы (20,8% (18,5;
34,5), p0,05). ЦСЖ пациентов с БАС на 87,5% (85,1;
90,6) ингибирует активность чистого катепсина В, что также достоверно более выражено, чем ЦСЖ пациентов контрольной группы (78,1% (72,3;
84,6), p0,05) (рис. 4). Отличий по влиянию на ферменты ЦСЖ пациентов с РС от ЦСЖ группы контроля не получено.
* * Рисунок 4. Активность ферментов при добавлении ЦСЖ пациентов с БАС По оси ординат - активность ферментов в процентах активности чистого фермента.
Достоверность различий по сравнению с контрольной группой: * – при р0.05;
тест Манна-Уитни. Данные представлены в виде медианы и верхнего квартиля.
При клинико-биохимических сопоставлениях было показано, что в группах пациентов с шейно-грудной (n=17) и бульбарной формами (n=8) БАС степень ингибирования калпаина достоверно отличалась от группы контроля (p0,05), а в группе с пояснично-крестцовой формой (n=9) БАС достоверного отличия от группы контроля по этому показателю зафиксировано не было. При сравнении пациентов с разной длительностью заболевания с группой контроля достоверно более выраженное ингибирование калпаина получено лишь в группе пациентов с длительностью болезни менее 1 года (n=12) (p0,05).
Степень ингибирования катепсина обратно коррелирует с жизненной емкостью легких (r=-0,60 p=0,01 n=16). Достоверных различий этого показателя в группах пациентов с различными формами и с разным темпом развития заболевания не выявлено. Достоверно более выраженное ингибирование катепсина В по сравнению с группой контроля получено в группе пациентов с длительностью болезни менее 1 года (n=12) (p0,05), при большей длительности заболевания отличие от группы контроля не достигало достоверности (p0,1).
В группах пациентов с пояснично-крестцовой (n=9) и бульбарной (n=8) формами БАС степень ингибирования катепсина В достоверно отличалась от группы контроля (p0,05), в группе с шейно-грудной (n=17) формой БАС достоверного отличия от контроля по этому показателю зафиксировано не было (p0,1).
Таким образом, был выявлен специфический для БАС спектр влияния ЦСЖ на активность протеолитических ферментов. В ЦСЖ пациентов с БАС, по-видимому, повышено содержание ингибиторов калпаина-1 и катепсина В.
Способность ЦСЖ здоровых доноров ингибировать калпаин-1 описана лишь одной группой исследователей, которые приписывают калпаин-ингибирующую активность низкомолекулярному соединению (Kodama H. et al., 2002). Изменений содержаний данного вещества в ЦСЖ при различных заболеваниях описано не было. Известно также, что в ЦСЖ содержится специфический ингибитор катепсина-В, цистатин С, однако по данным литературы его содержание при БАС снижается(Ranganathan S. et al., 2005). Данное противоречие позволило сделать предположение о наличии в ЦСЖ неизвестного ранее ингибитора катепсина В. В связи с вышесказанным, нами была предпринята попытка охарактеризовать содержащиеся в ЦСЖ вещества, которые ингибируют калпаин-1 и катепсин В.
В эксперименте с пропусканием ЦСЖ через фильтр с порами, позволяющими пройти веществам с молекулярной массой менее 10 кД, было показано, что ингибитор калпаина имеет молекулярную массу ниже 10 кД.
В результате гельфильтрации ЦСЖ на колонке protein pak 60 было получено 65 фракций с разной молекулярной массой. Показано, что ингибирующей активностью в отношении катепсина В обладают две фракции ЦСЖ, первая имеет молекулярную массу 13-15 кД, вторая – менее 1 кД. Первая фракция по молекулярной массе соответствует цистатину С, вторая фракция – неизвестному ранее ингибитору катепсина В.
Таким образом, полученные нами результаты подтверждают гипотезу о вкладе дисбаланса протеолитических систем в патогенез БАС. Нами впервые показано повышение активности калпаиноподобной протеазы с оптимумом рН в кислой области в ЦСЖ больных БАС, а также повышенную степень ингибирования калпаина и катепсина В ликвором пациентов с БАС. Мы впервые выявили в ЦСЖ низкомолекулярный ингибитор катепсина В, содержание которого, по-видимому, нарастает по мере прогрессирования БАС.
Для установления источника белков, содержание которых изменено в ЦСЖ больных БАС, мы оценили уровень маркеров клеточной гибели и нейронспецифических белков в ЦСЖ, а также состоятельность гематоэнцефалического барьера.
Маркеры клеточной гибели и нейронспецифические белки в ЦСЖ Активность лактатдегидрогеназы В группу пациентов с БАС, у которых в ЦСЖ была измерена активность ЛДГ вошло человек. В контрольную группу было включено 26 человек. Группу сравнения составили пациентов с РС.
Активность ЛДГ достоверно выше в ЦСЖ пациентов с БАС, чем в контрольной группе (р0,05) и в группе пациентов с РС (р0,05) (таб. 3).
Таблица 3.
Активность ЛДГ (нмоль/мин/мг белка) в ЦСЖ больных.
Группа Медиана Нижний квартиль Верхний квартиль 42,8* 23,7 60, БАС (n=45) 31,3 26,3 41, Контроль (n=26) 18,0 15,3 26, РС (n=16) Достоверность различий по сравнению с контрольной группой: * – при р0.05;
тест Манна-Уитни.
При сравнении с группой контроля достоверное повышение активности ЛДГ зафиксировано у пациентов с длительностью заболевания от 1 до 2 лет (р0,05), а также у пациентов с пояснично-крестцовой (n=12) (р0,05) и бульбарной (n=10) формой заболевания (р0,05). У пациентов с длительностью заболевания менее года и более двух лет, а также при шейно-грудной (n=23) форме БАС активность ЛДГ не отличалась от таковой в группе контроля.
В группе больных БАС корреляций активности ЛДГ с длительностью заболевания, оценкой по шкале ALSFRS-R, жизненной емкостью легких выявлено не было. Активность ЛДГ прямо коррелировала с КПАк в ЦСЖ больных БАС (r=0,72;
p0,00005) (рис.5), также с концентрацией НСЕ (r=0,86;
p0,001).
Пациенты с БАС 0, r=0.72;
р0. r=0.72;
0, КПк, пмоль/мин/мг белка p0.00005 0, 0, 0, 0, 0, 0 20 40 60 80 100 Активность ЛДГ, нмоль/мин/мг белка Рисунок 5. Корреляция КПАк и ЛДГ в группе пациентов с БАС Причиной повышения активности ЛДГ в ЦСЖ может быть активация анаэробного гликолиза и гибель нейронов в условиях гипоксии у пациентов с дыхательными нарушениями.
Источником ЛДГ в ЦСЖ может быть также плазма крови, так как у больных БАС уровень ЛДГ в крови наиболее выражено повышается при развитии амиотрофий на стадии генерализации заболевания. В рамках проведенной работы установить причину повышения активности ЛДГ в ЦСЖ больных БАС не представляется возможным. Тем не менее, корреляция активности ЛДГ с НСЕ может указывать на то, что ЛДГ, являясь неспецифическим маркером клеточной гибели, отражает выраженность нейродегенерации.
Повышение активности ЛДГ в нашей работе было специфичным для БАС и не отмечено при РС. Литературные данные, однако, указывают на то, что повышение активности ЛДГ в ЦСЖ происходит при воспалительных заболеваниях ЦНС, при опухолях головного мозга (Nussinovitch M. et al., 2002). На основании предположения, что повышение активности ЛДГ вызвано гибелью нейронов в условиях гипоксии, можно заключить, что корреляция активности ЛДГ с КПАк указывает на связь разрушения нейронов с активацией калпаиноподобной протеазы.
Нейронспецифическая енолаза Содержание НСЕ в ЦСЖ было определено в подгруппе из 16 больных БАС и у пациентов из группы контроля. Экспрессия НСЕ ЦСЖ больных БАС составила 14,0 нг/мл (9,8;
18,9) и не отличалась от контрольной группы – 11,9 нг/мл (8,7;
16,5). Уровень НСЕ, по видимому, не может быть использован в качестве маркера нейродегенеративного процесса при БАС.
Фосфорилирофанные тяжелые цепи нейрофиламентов В группу пациентов с БАС, у которых в ЦСЖ была измерена концентрация фНФТ вошло 10 больных. В контрольную группу было включено 7 человек. Группу сравнения составили 16 пациентов с РС.
Концентрация фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов в ЦСЖ достоверно выше в группе больных БАС, чем в контрольной группе (р0,05) и чем в группе больных РС (р0,05) (таб. 4). В группе больных РС отмечена тенденция к более высокой, чем в группе контроля экспрессии фНФТ (р0,1). Подгруппы больных БАС, выделенные по форме или по длительности заболевания не отличаются друг от друга по концентрации фНФТ в ЦСЖ.
Однако достоверное отличие от контрольной группы зафиксировано для пациентов с меньшей длительностью заболевания (группы с длительностью до 1 года и 1-2 года) (р0,05), а также у пациентов с шейно-грудной (n=5) и бульбарной (n=3) формами заболевания (р0,05). Выявлена корреляция концентрации фНФТ с жизненной емкостью легких (r=0.69, p=0.04), что также указывает на повышение уровня нейрофиламенов в ЦСЖ преимущественно на ранних стадиях БАС. Полученные результаты согласуются с данными литературы, в соответствии с которыми в ЦСЖ больных БАС повышается содержание фНФТ (Brettschneider J. et al., 2006;
Reijn T.S. et al., 2009).
Таблица 4.
Концентрация фНФТ в ЦСЖ больных.
Группа Число Медиана, Нижний квартиль, Верхний квартиль, нг/мл нг/мл нг/мл 10 1,3* 0,9 1, БАС 1,1# 16 0,4 1, РС 7 0,2 0,0 0, Контроль Достоверность различий по сравнению с контролем: # – при р0.1, * – при р0.05;
тест Манна-Уитни.
Мы впервые показали, что фНФТ более выражено повышается на ранних стадиях заболевания и зависит от формы БАС. Из морфологических исследований на мышах с мутацией в гене СОД1 известно, что на досимптомной стадии гибнет до 50% мотонейронов спинного мозга (Bendotti C. et al., 2004). В нашей работе показано, что нейродегенерация активно продолжается в течение первого года после появления первых симптомов у пациентов с БАС, а позднее концентрация нейрофиламентов в ЦСЖ снижается, видимо, в связи с тем, что большая часть нейронов погибла. Наши данные находят свое подтверждение в работе по исследованию уровня другого нейроспецифического белка, легкой цепи нейрофиламентов, в ЦСЖ больных БАС, где была показана отрицательная корреляция длительности болезни с концентрацией маркера (Zetterberg H. et al., 2004).
Гематоэнцефалический барьер Альбуминовый индекс, отражающий проницаемость гематоэнцефалического барьера, был измерен в подгруппе из 24 больных БАС. Повышение альбуминового индекса указывает на нарушение ГЭБ.
Верхняя граница нормальных значений альбуминового индекса (Qнорм) была рассчитана по формуле Reiber для каждого пациента индивидуально (Reiber H., 1995). У 50% пациентов с БАС альбуминовый индекс превышал нормальные расчетные значения (рис.6).
Рисунок 6. Альбуминовый индекс у пациентов с БАС (n=24).
Альбуминовый индекс не коррелировал с содержанием cdk-1, а также с КПАк и активностью модуляторов цистеиновых протеаз, что подтверждает гипотезу об интратекальном происхождении данных белков.
При проведении клинико-биохимических сопоставлений было установлено, что альбуминовый индекс был достоверно выше у пациентов с быстрым темпом прогрессирования БАС (n=14) (р0,05) и у пациентов на стадии генерализации, чем у пациентов, не достигших этой стадии (р0,05). Показано, что у пациентов с бульбарной формой (n=5) альбуминовый индекс достоверно выше, чем у пациентов с пояснично крестцовой формой БАС (n=8). Достоверных отличий между группами, выделенными по длительности заболевания, выявлено не было. Полученные данные согласуются с данными более ранних работ, где показано повышение проницаемости ГЭБ у пациентов с БАС, однако в опубликованных исследованиях доля пациентов с нарушением ГЭБ составляла около 30% (Brettschneider J. et al., 2006), что несколько меньше, чем в нашей работе.
Таким образом, наши результаты указывают на возможную самостоятельную патогенетическую роль повышенной проницаемости ГЭБ в развитии БАС и согласуются с моделью Zlokovic-Cleveland (Zlokovic B.V. et al., 2008). Согласно этой модели повреждение ГЭБ при БАС приводит к выходу плазменных белков из кровяного русла и отеку, вызывающему локальную ишемию в ткани спинного мозга. Патологическое воздействие ишемии усугубляется нарушенной регуляцией экспрессии фактора роста эндотелия при БАС.
Дополнительным подтверждением возможной роли повышенной проницаемости ГЭБ в патогенезе БАС служит выявленная в нашей работе тенденция к корреляции между альбуминовым индексом и концентрацией тяжелых цепей нейрофиламентов (r=0,58;
p=0,07).
На основании данных литературы и проведенного исследования содержания белков клеточного цикла, протеолитических ферментов и их модуляторов, а также маркеров клеточной гибели и проницаемости ГЭБ можно сделать предположение о последовательности патогенетических событий при БАС. Пусковым механизмом нейродегенерации может служить реактивация клеточного цикла и повышение проницаемости ГЭБ. Источником cdk-1, уровень которой в ЦСЖ обратно коррелирует с длительностью заболевания, по-видимому являются гибнущие нейроны. Ингибиторы калпаина и катепсина В, уровень активности которых превышал контрольный только в первый год болезни, по-видимому, также выходят из разрушенных нейронов. Можно предположить, что повышение КПАк преимущественно на второй год болезни связано с тем, что фермент с калпаиноподобной активностью синтезируется астроцитами или клетками воспаления. Этот фермент может определять описанное в литературе токсическое действие ЦСЖ на мотонейроны (Vijayalakshmi K. et al., 2009) и поддерживать тем самым прогрессирование заболевания.
Полученные данные, проливающие свет на отдельные аспекты патогенеза БАС, могут в дальнейшем быть использованы разработке новых подходов в лечении БАС, а также в диагностике и прогнозе заболевания.
Диагностическая ценность маркеров ЦСЖ Для оценки возможного вклада исследованных в работе маркеров патологического процесса был проведен ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic). В результате показатели были распределены в порядке убывания площади под ROC-кривой (AUC), которая отражает предсказательную способность модели, то есть диагностическую ценность каждого маркера (таб. 5).
Таблица 5.
Диагностическая ценность маркеров AUC 95% доверительный p интервал фНФТ 0,914 0,676-0,994 0, Степень ингибирования 0,824 0,620-0,945 0, калпаина- КПАк 0,816 0,676-0,914 0, Степень ингибирования 0,795 0,601-0,923 0, катепсина В cdk-1 0,683 0,485-0,842 0, Активность ЛДГ 0,653 0,531-0,762 0, Мы подтвердили высокую диагностическую ценность концентрации фНФТ (Brettschneider J. et al., 2006), а также впервые показали возможность использования степени ингибирования протеолитических ферментов при добавлении ЦСЖ и КПАк в ЦСЖ в качестве чувствительных и специфичных диагностических маркеров.
Таким образом, полученные результаты расширяют наши представления о роли белков клеточного цикла и протеолитических ферментов в патогенезе заболевания и могут быть использованы для разработки диагностических и прогностических маркеров БАС.
Выводы:
1. Установлено, что в патогенезе БАС важную роль играет реактивация клеточного цикла: она проявляется повышением в ЦСЖ экспрессии циклин-зависимой киназы-1, обратно коррелирующей с длительностью заболевания (r=-0,68 p0,02). Наиболее выраженное повышение экспрессии зафиксировано на ранних стадиях заболевания, у пациентов с бульбарной формой БАС и в подгруппе больных с быстрым темпом течения БАС.
2. У больных БАС выявлены нижеследующие признаки дисбаланса протеолитических систем в ЦСЖ:
• повышение калпаиноподобной активности при низких значениях рН (КПАк), наиболее отчетливое на втором году заболевания, а также у пациентов с бульбарной формой БАС;
• специфический профиль влияния ЦСЖ больных БАС на активность протеолитических ферментов – повышение степени ингибирования калпаина-1 и катепсина В. Степень ингибирования калпаина-1 и катепсина В более выражена на начальных стадиях заболевания, а также у пациентов с бульбарной формой БАС.
3. Впервые описан низкомолекулярный ингибитор катепсина В в ЦСЖ с молекулярной массой менее 1 кД.
4. Установлено, что в ЦСЖ больных БАС повышено содержание маркеров клеточной гибели – активности лактатдегидрогеназы (достоверное повышение у пациентов с длительностью заболевания от 1 до 2 лет и у лиц с пояснично-крестцовой и бульбарной формой БАС) и концентрации фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов (достоверное повышение у пациентов с меньшей длительностью заболевания и у лиц с шейно-грудной и бульбарной формами БАС). Подтверждена роль тяжелых фосфорилированных цепей нейрофиламентов в качестве диагностического маркера при БАС.
5. Показано, что у 50% пациентов с БАС повышена проницаемость гематоэнцефалического барьера. Установлено, что альбуминовый индекс выше у пациентов с быстрым темпом прогрессирования заболевания и на стадии генерализации, чем у пациентов, не достигших этой стадии.
6. Активация клеточного цикла в нейронах и увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера, по-видимому, могут служить пусковыми механизмами програмированной клеточной гибели и аксональной дегенерации при БАС, в то время как активация протеолитических систем происходит на более поздних этапах и, возможно, поддерживает активность патологического процесса.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Брылев Л.В., Яковлев А.А., Онуфриев М.В., Захарова М.Н., Завалишин И.А., Гуляева Н.В.
Калпаиноподобная и лактатдегидрогеназная активности в спинномозговой жидкости больных боковым амиотрифическим склерозом.// Нейрохимия. 2007. №3. С. 267-275.
2. Брылев Л.В., Нелькина Е.Н., Яковлев А.А., Онуфриев М.В., Шабалина А.А., Костырева М.В., Захарова М.Н., Завалишин И.А., Гуляева Н.В. Модуляторы активности цистеиновых протеаз и маркеры клеточной гибели в спинномозговой жидкости пациентов с боковым амиотрофическим склерозом.// Нейрохимия. 2009. №2. С. 143-148.
3. Брылев Л.В. Ингибиторы протеаз в цереброспинальной жидкости при неврологических заболеваниях.// Нейрохимия. 2009. №3. С. 245-252.
4. Захарова М.Н., Васильев А.В., Брылев Л.В. Этиология и патогенез бокового амиотрофического склероза.// В кн. Боковой амиотрофический склероз. ред. И.А.
Завалишин. Москва. 2007. С. 353-425.
5. Gulyaeva N.V., Brylev L.V., Yakovlev A.A., Nelkina E.N., Zakharova M.N. “Proteolytic” markers of neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis.// Neuroscience Meeting Planner.
Washington, DC. Society for Neuroscience. 2008. P. 643.
6. Brylev L.V., Yakovlev A.A., Onufriev M.V., Zakharova M.N., Gulyaeva N.V. Proteolytic enzymes involved in neuronal cell death in cerebrospinal fluid of patients with amyotrophic lateral sclerosis.// Eur. J. Neurol. 2007. Vol. 14 (Suppl. 1). P. 257.
7. Brylev L., Nelkina E., Onufriev M., Yakovlev A., Zakharova M., Gulyaeva N. Modulation of proteolytic activieties by CSF of normal subjects and patients with neurodegenerative and neuroinflammatory diseases.// Amyotrophic Lateral Sclerosis. 2007. Suppl. 1. Pp. 122-123.
8. Zakharova M.N., Gulyaeva N.V., Belezkiy I.P., Yakovlev A.A., Brylev L.V., Zavalishin I.A.
Pathologic activity in cerebrospinal fluid of sALS patients.// Amyotrophic lateral sclerosis and motor neuron diseases. 2005. Vol. 4 (Suppl. 1). P. 139.
Принятые сокращения:
БАС – боковой амиотрофический склероз ГЭБ – гематоэнцефалический барьер ДЖЕЛ – должная жизненная емкость легких ЖЕЛ – жизненная емкость легких КПАк – калпаиноподобнаяю активность при рН 5. КПАн – калпаиноподобнаяю активность при рН 7. ЛДГ – лактатдегидрогеназа МРТ – магнитно-резонансная томография НСЕ - нейронспецифическая енолаза ОБМ – основной белок миелина ПКГ – программированная клеточная гибель РС – рассеянным склерозом СOД1 – цитозольная супероксиддисмутаза фНФТ – фосфорилированные тяжелые цепи нейрофиламентов ЦСЖ – цереброспинальная жидкость ALSFRSR – Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale Revised (пересмотренная функциональная шкала БАС) cdk-1 – циклин-зависимая киназа- cdk-4 – циклин-зависимая киназа- ELISA – прямой иммуноферментный твердофазный анализ