Обнаружение nmda-рецепторов в лимфоцитах и их характеристика
На правах рукописи
МАШКИНА АННА ПЕТРОВНА ОБНАРУЖЕНИЕ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ В ЛИМФОЦИТАХ И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА 03.01.04 «биохимия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2010 г.
Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.
Ломоносова.
доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
БОЛДЫРЕВ Александр Александрович доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Чернов Николай Николаевич доктор биологических наук, профессор Гуляева Наталья Валерьевна Ведущее учреждение: Гематологический Научный Центр РАМН
Защита состоится «21» мая 2010 г. в ч. мин. на заседании диссертационного учёного совета Д.213.203.13. при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, Аграрный факультет РУДН, аудитория 453.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо Маклая, д.6.
Автореферат разослан «19» апреля 2010 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д.213.203.13., доктор биологических наук, профессор Лукашова Е. В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Интактный мозг является иммунопривилегированным органом, где не обнаруживается лимфоузлов и не встречаются лимфоциты. Эта особенность мозга поддерживается за счет существования гематоэнцефалического барьера, который не дает клеткам иммунной системы мигрировать в мозг из кровотока.
Более того, кроме астроцитов в ЦНС не встречаются другие клетки, способные презентировать молекулы MHC (Major Histocompatibility Complex) (Engelhardt, 1996;
Sehgal and Berger, 2000). Однако, при развитии нейродегенеративных заболеваний это свойство, обеспечивающее стабильную работу ЦНС в нормальных условиях, грозит развитием аутоиммунных реакций (Gendelman, 2002).
Недавно в литературе появились данные о непосредственной регуляции функций иммунокомпетентных клеток со стороны нервной системы (Wrona, 2005). Эта регуляция может осуществляться как через эндокринную систему, включающую гормоны гипоталамуса (Munck and Guyre, 1991), так и через «симпатические пути» за счет иннервации лимфоидных органов (Shimizu et al., 1994). В осуществлении нормального «диалога» между нервной и иммунной системами большое значение имеют такие нейромедиаторы, как дофамин и ацетилхолин (Basu and Dasgupta, 2000;
Pavlov et al., 2003;
Saeed et al., 2005). В последнее время к ним относят и глутамат.
Глутамат является возбуждающим нейротрансмиттером мозга. Долгое время глутаматные рецепторы, в том числе и рецепторы NMDA-класса, обеспечивающие когнитивные процессы и память, считались специфическими маркерами нейрональной ткани. Однако в последнее время в литературе появились косвенные данные о том, что функционально активные NMDA рецепторы могут присутствовать и в иммунокомпетентных клетках (Lombardi et al., 2001;
Ganor et al., 2003). Вышеперечисленные факты поднимают вопрос о том, каким образом данный класс рецепторов может участвовать в функциональном ответе лимфоцитов и в их взаимодействии с нервной тканью.
В первую очередь это относится к патологическим состояниям, характеризующимся воспалительными процессами в ЦНС, к ишемии головного мозга, рассеянному склерозу, болезни Альцгеймера и гипергомоцистеинемии, процессам, протекающим на фоне выраженного окислительного стресса.
Общей чертой в развитии таких заболеваний является значительное повышение уровня свободного глутамата как в мозге и спинномозговой жидкости, так и в плазме крови, что приводит к нейрональной смерти вследствие развития экзайтоксических механизмов (Carpenter, 2002), и привлечения лимфоцитов в очаг воспаления. В связи с вышесказанным, установление экспрессии NMDA рецепторов в клетках иммунной системы и исследование их возможного участия в этих процессах является актуальной проблемой, имеющей значение для современной биохимии.
Целью данной работы явилось доказательство присутствия NMDA рецепторов в лимфоцитах грызунов и человека и характеристика их функциональной активности.
Задачи исследования:
1. Используя ОТ-ПЦР, выявить экспрессию канальной NR1 субъединицы NMDA-рецептора в лимфоцитах.
2. Исследовать влияние N-метил-D-аспартата (NMDA) на уровень ионов кальция и продукцию активных форм кислорода (АФК) в лимфоцитах методом проточной цитометрии.
3. Выявить субпопуляции лимфоцитов, активируемых NMDA, с помощью флуоресцентно-меченых моноклональных антител к поверхностным маркерам (метод иммунофенотипирования) в сочетании с нагрузкой клеток флуоресцентным зондом на активные формы кислорода (АФК) - DCFН2-DA (2,7 дихлордигидрофлуоресцеин-диацетатом).
4. Оценить долю клеток в общей популяции лимфоцитов, презентирующих NMDA-рецепторы в норме и после их активации «in vitro» интерлейкином-2 (ИЛ-2) или фитогемагглютинином (ФГА).
5. Установить наличие NMDA-рецепторов на поверхности лимфоцитов, активированных «in vivo» в процессе спинномозговой травмы.
6. Исследовать влияние NMDA на продукцию интерферона различными субпопуляциями лимфоцитов, активированных «in vitro».
Научная новизна и практическая ценность работы В настоящей работе охарактеризовано влияние агониста глутаматных рецепторов на лимфоциты NMDA-класса, N-метил-D-аспартата, периферической крови человека и крыс. В работе впервые установлено наличие в лимфоцитах периферической крови крыс мРНК, кодирующей основную белковую субъединицу NMDA-рецепторного комплекса (NR1). Методом проточной цитометрии было продемонстрировано, что под действием NMDA в Т-лимфоцитах и NK-клетках (natural killer cells) увеличивается уровень ионов Са2+, сопровождающийся возрастанием уровня АФК. Т-лимфоциты оказались субпопуляцией, более чувствительной к NMDA по сравнению с NK-клетками, в то время как на продукцию АФК В-лимфоцитами NMDA действия не оказывал.
При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания показано связывание антител с внеклеточным доменом NMDA-рецепторного комплекса на мембране лимфоцитов, а также усиление экспрессии этих рецепторов в результате инкубации клеток, активированных интерлейкином-2 или фитогемагглютинином в присутствии NMDA. В условиях индуцированного воспаления спинного мозга «in vivo» нами было показано, что Т-лимфоциты, мигрировавшие в очаг воспаления, презентируют NMDA-рецепторы на своей мембране. NMDA отрицательно влияет на реактивную способность лимфоцитов, препятствуя синтезу интерферона (IFN-) в субпопуляциях NK клеток и Т-лимфоцитов.
Полученные результаты расширяют представления об экспрессии и функции NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы, и позволяет предполагать участие этих рецепторов в регуляции иммунного ответа.
Апробация работы Результаты исследований были доложены на XXI международном конгрессе “Молекулярные основы неврологических и психиатрических заболеваний” (Словакия, Мартин, 2006 г.), на XXIX ежегодном собрании Японского нейрохимического общества (Япония, Киото, 2006 г.), на Всероссийской нейрохимической конференции в Санкт-Петербурге (сентябрь 2008 г.). Апробация работы прошла в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии Научного центра неврологии РАМН (февраль 2010 г.) и на кафедре биохимии МГУ имени М.В. Ломоносова (сентябрь г.).
Публикации Материалы диссертации отражены в 8 публикациях.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, включающей описание материалов и методов ( главы), результатов исследования и их обсуждения (7 глав), Заключения и Выводов. Диссертация изложена на 114 стр. печатного текста, содержит рисунка и 3 таблицы. Список литературы включает 424 наименования.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования явились лимфоциты периферической крови крыс и человека.
Отбор крови. В работе использовалась кровь доноров без выраженных патологий, которая отбиралась у каждого донора многократно. Забор крови осуществляли из локтевой вены с утра, натощак. Кровь собирали в полистироловую пробирку с гепарином (конечная концентрация 100 ед/мл).
При выделении клеток для последующего роста в культуре отбор крови осуществляли в стерильных условиях с использованием вакуумных пробирок.
Отбор крови у крыс линии Wistar проводили под анестезией. Взрослых животных перед опытом усыпляли хлоралгидратом, взятым из расчета 400- мг вещества на 1 кг веса животного и отбирали кровь из яремной вены с помощью шприца, содержащего раствор гепарина (50 ед/мл крови).
Выделение лимфоцитов. Процедуру выделения лимфоцитов проводили не позднее 2 часов с момента отбора крови. Выделение периферических мононуклеарных клеток проводили в градиенте фикола (плотность 1,077±0,001), используя стандартную среду выделения «LymphoSep» (ICN Biomedicals) и следуя указанному производителем протоколу. Разведение крови осуществляли изотоническим раствором Хенкса (рН 7,2).
Собранные после выделения клетки дважды отмывали, и полученный осадок ресуспендировали в небольшом объеме раствора Хенкса (0,5 – 1 мл). В случае необходимости от моноцитов избавлялись путем адгезии пробы на пластике при 37С в течение 40 мин. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.
Для выделения очищенной субпопуляции NK-клеток использовали набор «NK Cell Isolation Kit II (human)» фирмы «Milteny Biotec» (Германия), проводя работу в стерильных условиях в соответствии с инструкцией производителя.
Первичная культура периферических лимфоцитов. Клетки выделяли описанным выше способом, избавляясь от моноцитарной фракции. Все работы проводили в стерильном ламинарном боксе. После отмывания клетки суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированную эмбриональную сыворотку телят, глутамин (2 мM), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мг/мл), и инкубировали в 5% СО2-инкубаторе.
Плотность клеточной суспензии составляла 2106 кл/мл. О появлении мертвых клеток в ходе эксперимента судили по окраске проб с трипановым синим. Активированные лимфоциты получали в результате инкубации с фитогемагглютинином (ФГА-П, ПанЭко, Россия) (10 µг/мл) или рекомбинантным ИЛ-2 (600 ед/мл) (Suresnes, Франция) в течение 72 ч.
Модель индуцированного компрессионного повреждения спинного мозга у крыс. Воспаление создавали путем внедрения катетера в спинной мозг животного (Tarlov et al., 1953). В опытах были использованы взрослые самцы крыс линии Lewis весом 300-330 г. Первичную анестезию проводили ингаляцией 2-4% галотана (Zentiva, Польша). В ходе операции под хирургическим микроскопом в арке позвонка T10 просверливали отверстие диаметром 1,5 мм. Через полученное отверстие вводили катетер “Intramedic” (Becton Dickenson, США), наполняемый водой через герметично присоединенный шприц Hamilton (тип 1705) с помощью специального удерживающего устройства. Катетер вводили в пространство между аркой позвонка и твердой мозговой оболочкой и продвигали вверх вдоль позвоночного столба на 1 см. Таким образом, очаг воспаления приходился на место уширения катетера при наполнении его водой и располагался на уровне 8-9 позвонков грудного отдела. Катетер наполняли 12,5 µл жидкости и фиксировали на 5 мин. Затем жидкость откачивали и извлекали катетер. Слои мягких тканей и кожи в месте разреза сшивали и прекращали анестезию.
После операции животных содержали в больших клетках в течение 4- дней. По окончании этого срока крыс подвергали глубокой анестезии и перфузировали через большой круг кровообращения физиологический раствор и 0,1 M фосфатный буфер с 4% параформальдегидом. Спинной мозг извлекали и переводили в фиксирующий раствор на 1 сутки. По прошествии этого времени спинной мозг разрезали на сегменты длиной в 5 мм и переносили в 30% раствор сахарозы. Для каждой временной точки было использовано не менее трех животных.
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПОДХОДЫ И РЕГИСТРИРУЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ Выделение РНК и обратная транскрипция. Выделение тотальной РНК из лимфоцитов периферической крови крыс линии Wistar проводили с использованием стандартного набора для выделения РНК «RNeasy Mini Kit» («Qiagen», Германия). Количество лимфоцитов, использовавшихся для выделения, составляло 5 106 клеток.
Обратную транскрипцию проводили в смеси объемом 20 µл, содержащей 10 µг тотальной РНК, 40 ед ингибитора РНКаз IRNase («Синтол», Россия), 1 µл Random-нуклеотидов (исходная концентрация 0,5 мг/µл), инкубировали в течение 1 мин при 94°С для отжига праймеров и мгновенно охлаждали до 4°С.
После этого в инкубационную смесь вносили 5 ед. IRNase, 6 µл 5кратного MLV-буфера («Синтол», Россия), 1 µл дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP, концентрация 10 мМ) («Fermentas», Литва), 1 µл фермента MLV-ревертазы («Синтол», Россия) и проводили реакцию обратной транскрипции при 42°С в течение 40 мин, после чего смесь инкубировали 3 мин при 93°С для остановки реакции.
Полимеразная цепная реакция. Для проведения ПЦР использовали набор «PCR-Core» фирмы «ИзоГен» (Россия), рассчитанный на проведение реакции в объеме 20 µл. Конечные концентрации реагентов в одной пробе составляли 1 ед Taq-полимеразы, 20 мМ KCl, 15 мM сульфата аммония, 65 мМ µМ Трис-HCl-буфера мМ (рН 8,8), 2,5 MgCl2, дезоксинуклеотидтрифосфатов.
В качестве затравочных нуклеотидов использовали уникальные пары праймеров к консервативным последовательностям генов всех классов глутаматных рецепторов и гена GAPDH, составленные В.И. Казеем (лаборатория клинической нейрохимии ГУ НЦ неврологии РАМН). В пробирку вносили 2 µл ДНК-матрицы и праймеры (в концентрации 1 µМ), на реакционную смесь наслаивали 30 µл минерального масла и проводили амплификацию в амплификаторе «Терцик» (Россия). Отрицательным контролем служили пробы, в которые в качестве матрицы вносили продукт выделения тотальной РНК без последующей реверсии;
остальные компоненты присутствовали в тех же количествах.
ПЦР проводили в следующем режиме: исходная денатурация матрицы – мин при 95°С;
денатурация – 94°С, 30 сек;
отжиг праймеров – 60°С или 67°С, 60 сек;
элонгация – 72°С, 60 сек. Заключительная достройка продуктов реакции – 72°С, 10 мин. Реакцию проводили в течение 36 циклов.
Электрофорез ДНК. Визуализацию продукта ПЦР проводили методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в ТАЕ буфере. Агарозу растворяли в однократном ТАЕ буфере при 100°С, охлаждали до 60°С и добавляли бромистый этидий из расчета 0,5 µг/мл. Гель заливали в плашки слоем толщиной 4 мм. Электрофорез проводили при напряжённости поля 10 В/см.
Результат визуализировали при помощи UVP трансиллюминатора.
Проточная цитометрия. Измерения проводили на приборе «Beckman Coulter, EPICS» (USA), оснащенном аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 485 нм. В каждой пробе анализировали 10 000 событий. В качестве параметра, характеризующего интенсивность флуоресценции внутриклеточного маркера АФК (DCFН2-DA), использовали среднее значение флуоресценции, которое характеризует стационарный уровень АФК в клеточной популяции. При анализе некроза или взаимодействия клеток со специфическими антителами определяли процент клеток, характеризующихся флуоресценцией, вызванной взаимодействием соответствующих красителей со специфическими лигандами.
Определение внутриклеточного уровня АФК. Для определения внутриклеточного уровня АФК клетки в течение 30 мин нагружали флуоресцентным красителем DCFН2-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетатом, ex 485 нм, em 535 нм) в конечной концентрации 100 µМ.
Краситель растворяли в DMSO так, чтобы концентрация растворителя в образце была не выше 0,1% (Boldyrev et al., 1999).
Определение доли мертвых клеток. Для идентификации некроза в клеточной популяции лимфоциты или нейроны окрашивали иодидом пропидия (PI, ex 485 нм, em 610 нм) в конечной концентрации 10 µМ. Краситель добавляли к клеточной суспензии за 5 мин до измерения, окраска оставалась стабильной в течение 30 мин.
Клеточную суспензию окрашивали Иммунофенотипирование.
моноклональными антителами к СD-маркерам поверхности лимфоцитов (CD45, CD3, CD16, CD56, CD19), конъюгированным с флуоресцентными красителем фикоэритрином (PE). В случае окрашивания лимфоцитов человека преципитацию антител проводили следующим образом: к 50 µл суспензии, содержащей 500 тысяч клеток, добавляли 5 µл антител («Сорбент» Россия), инкубировали 45 мин при +40С, дважды отмывали, а осадок ресуспендировали в 50 µл среды Хенкса. Анализ проводили методом проточной цитометрии.
Лимфоциты крысы окрашивали по аналогичной методике моноклональными анти-CD антителами (10 µг/мл) производства Becton Dickenson (США). Для определения изменения уровня АФК в различных субпопуляциях лимфоцитов использовали метод иммунофенотипирования с одновременной нагрузкой флуоресцентным красителем DCFН2-DA (Patrick et al., 1987).
Определение экспрессии NR1-субъединицы в первичной культуре лимфоцитов. Определение экспрессии NMDA-рецепторного белкового комплекса на поверхности лимфоцитов проводили методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с моноклональными (mouse anti-rat) антителами к NR1-субъединице NMDA-рецептора (3 µг/мл) (GTX30182, GenTex, USA) с последующей окраской ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианат) коньюгированными поликлональными «козьими» Fab-фрагментами к IgG мыши (10 µг/мл) (ab 6669, Abcam, USA). В качестве положительного контроля использовали связывание анти-NR1 антител с гранулярными клетками мозжечка крысы.
Для нейронов и лимфоцитов процедуру окрашивания проводили сходным образом. Клетки после отмывания от среды выделения разводили в растворе Хенкса до концентрации (1-5) х 106 кл/мл и инкубировали 40 мин при комнатной температуре в присутствии первичных антител. После этого клетки отмывали в растворе Хенкса при 400 г в течение 10 мин и прокрашивали вторичными антителами, меченными флуоресцентным красителем (ФИТЦ).
Инкубацию проводили в течение 30 мин в темноте, после чего клетки повторно отмывали в тех же условиях. Для того, чтобы исключить неспецифическую флуоресценцию вторичных антител, контрольные пробы прокрашивали с ними без предварительной инкубации с первичными антителами.
Определение количества интерферон- (IFN-) продуцирующих клеток.
Стимуляцию продукции интерферона- лимфоцитами проводили растворами рекомбинантного ИЛ-2 (600 ед/мл) и ФГА (10 µг/мл) в присутствии и в отсутствие 500 µМ NMDA в течение 12 ч. Далее к суспензии добавляли брефелдин А до концентрации 10 µг/мл и инкубировали 6 ч. Затем пробы разделяли на аликвоты и окрашивали моноклональными антителами к СD маркерам, как описано выше. После этого клетки фиксировали в 300 µл 4% раствора параформальдегида в течение 20 мин, отмывали и добавляли пермеабилизующий буфер, содержащий 1% азид натрия и 3% сапонина;
инкубацию проводили в течение 15 мин. Далее клетки в течение 30 мин окрашивали ФИТЦ-конъюгированными моноклональными анти-IFN антителами (5 µл на 100 мкл клеточной суспензии) в 100 µл пермеабилизирующего буфера. Чтобы избавиться от несвязавшихся антител, клетки дважды отмывали пермеабилизующим буфером. Полученную суспензию ресуспендировали в 0,1 М фосфатно-солевом буфере и определяли количество окрашенных лимфоцитов на проточном цитометре.
Количественное определение IFN- проводили с помощью коммерческого набора для иммуноферментного анализа (ИФА) «Human IFN ELISA Kit» производства «Pierce Endogen» (США). В качестве проб использовали супернатант после центрифугирования суспензии активированных лимфоцитов, инкубированных с NMDA в течение 18 ч. Для приготовления стандартов использовали прилагающийся к набору стандарт IFN-. Постановку ИФА производили согласно протоколу производителя.
Приготовление срезов спинного мозга. Из участка спинного мозга длиной 3 см, содержащего очаг воспаления, с помощью криостата готовили срезы толщиной 40 µм. Срезы помещали в 0,1 М раствор фосфатного буфера (PB) и применяли стандартный протокол окрашивания для визуализации лимфоцитов. Чтобы открыть эпитопы для взаимодействия с антителами и блокировать неспецифическое связывание, срезы инкубировали в 0,1 M фосфатно-солевого буфере, содержащем 0,2% Triton X-100 (Sigma, США) и 5% сухое молоко (“Cell signaling, Tec.”, Германия) в течение 2 ч при 4oC, затем отмывали 3 раза.
Для обнаружения лимфоцитов, находящихся в очаге воспаления, применяли несколько независимых способов окрашивания. Срезы инкубировали с моноклональными анти-CD3 антителами (40 мкг/мл), коньюгированными с фикоэритрином (PE) (Becton Dickenson, США), в течение 24 ч при 4oC. За 30 мин до окончания инкубации добавляли DAPI (4`-6 Diamino-2-phenylindole) (Molecular Probes, Нидерланды) для окрашивания клеточных ядер. Полученные срезы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.
В случае световой микроскопии срезы инкубировали с моноклональными анти-CD3 антителами (50 µг/мл) (Becton Dickenson, США) в течение 24 ч и применяли трехступенчатую систему окрашивания с использованием биотинилированного goat-anti-mouse IgG в качестве вторичных антител и комплекс Streptavidin-HRP (Vectastain elite ABC KIT, США) совместно с диаминобензидином (DAB) (Fluka, Финляндия).
Чтобы показать экспрессию NMDA-рецепторов в лимфоцитах, мигрировавших в очаг воспаления в спинном мозге, применяли двойное окрашивание срезов моноклональными анти-CD3 антителами в сочетании с вторичными goat-anti-mouse антителами (40 µг/мл), конъюгированными с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 594 (“Invitrogen Molecular Probes”, США). После этого срезы инкубировали с anti-NR1 моноклональными антителами (2,5 мкг/мл) и вторичными антителами (50 мкг/мл), конъюгированными с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488 (“Leigeh”, Нидерланды). В обоих случаях инкубацию с первичными моноклональными антителами проводили в течение 24 ч при 4oC, после чего срезы отмывали раза по 10 мин в 0,1 М PBS. С вторичными антителами срезы инкубировали 2 ч и отмывали трижды.
В качестве позитивного контроля использовали срезы, окрашенные только anti-NR1 моноклональными антителами и вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488. На срезах были отчетливо видны тела моторных нейронов, экспрессирующие NMDA рецепторы. В качестве негативного контроля использовали срезы спинного мозга и суспензии клеток, подвергнутых стандартной процедуре окрашивания с исключением первичных антител из растворов. После этого срезы переносили на предметные стекла, покрытые 0,1% желатином, высушивали и покрывали смолой для флуоресцентной микроскопии. Для анализа использовали флуоресцентный микроскоп Olympus BX 40, оборудованный цифровой фотокамерой.
Статистическая обработка результатов. В экспериментах для каждого опыта использовали не менее 3 животных, измерения проводили не менее, чем в 3 параллельных пробах. Обработку результатов проводили, используя для сравнения полученных выборок критерий Стьюдента.
Достоверными считали различия при p0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение экспрессии мРНК глутаматных рецепторов NMDA-класса в периферической крови крысы Доказательство экспрессии мРНК, кодирующей субъединицы глутаматных рецепторов, проводили методом обратной транскрипции (ОТ) и последующей ПЦР (RT-PCR) с нуклеотидными праймерами, специфическими к определенному участку искомой последовательности гена NMDA-рецептора.
На Рис. 1 представлена электрофореграмма продуктов амплификации.
1 2 3 Рис. 1. Электрофореграмма образцов, полученных после проведения RT PCR в лимфоцитах крысы (агарозный гель 1,5 %). 1 - набор молекулярных маркеров GeneRuler длиной от 250 до 10000 пар оснований;
2 - отрицательный контроль, не содержащий матрицы ДНК;
3 - положительный контроль с праймерами к гену ГАФД;
4 - NR1 субъединица NMDA-рецепторов.
Проведенный анализ показал наличие в пробах кДНК к NR1-субъединице NMDA-рецептора, что является доказательством экспрессии мРНК, полученной из лимфоцитов периферической крови крысы. Аналогичные результаты были опубликованы (Miglio et al., 2005), где была показана экспрессия мРНК к NR1 и NR2-субъединицам в лимфоцитах человека.
2. Идентификация NR1 субъединицы NMDA-рецепторного комплекса на поверхности лимфоцитов Экспрессия NR1 субъединицы является необходимым условием для формирования NMDA-рецепторного комплекса в мембране вне зависимости от того, в сочетании с какими субъединицами (NR2 и/или NR3), ко экспрессирующимися в конкретных условиях, формируется ионный канал (Cull-Candy et al., 2001). Поэтому в наших экспериментах мы определяли присутствие именно NR1 субъединицы на клеточной поверхности лимфоцитов с помощью окраски антителами, специфичными к внеклеточному участку аминокислотной последовательности этого белка.
2.1 Окраска клеток моноклональными антителами (GTX30182) к NR1-субъединице. Использовавшиеся в эксперименте антитела к NR субъединице были специфичны к белку крысы. Сравнение аминокислотной последовательности участка, к которому специфичны моноклональные антитела GTX30182, у человека и крысы показывает 100% гомологию. Кроме того, высокий консерватизм (гомология 99%) белковой последовательности NR1 в области N-конца позволяет предположить близкую или даже идентичную конформацию белка для этих видов, что дает основание для использования этих антител на лимфоцитах как крыс, так и человека.
Анализ показал наличие окраски 5,5±1% интактных лимфоцитов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, что позже было подтверждено в другой лаборатории (Miglio et al., 2005). Таким образом, результат исследований, проведенных с использованием специфических антител к NR1-субъединице NMDA-рецептора, доказывает поверхностную экспрессию белковой субъединицы NR1 NMDA-рецепторного комплекса на внешней мембране субпопуляции лимфоцитарных клеток.
Несмотря на то, что мы не анализировали экспрессию остальных белковых субъединиц NMDA-рецепторного комплекса, комплексный анализ полученных данных свидетельствует об экспрессии данного рецептора в лимфоидных клетках, хотя не исключено, что его структура и функциональные свойства у лимфоцитов могут отличаться от таковых для NMDA-рецепторов, экспрессируемых в нейрональных тканях.
2.2. Усиление экспрессии NR1 субъединицы в результате инкубации активированных клеток с NMDA. Для клеток иммунной системы известны два состояния, в которых они различаются как морфологически, так и функционально. В кровотоке лимфоциты циркулируют в состоянии покоя, однако под действием пролиферирующих агентов и цитокинов воспаления они способны активироваться и мигрировать в очаг воспаления, где происходит распознавание антигенов и управление работой макрофагов. Доля активированных лимфоцитов в периферической крови зависит от состояния метаболизма. В связи с этим мы изучили изменение экспрессии NR субъединицы в лимфоцитах как до, так и после их активации пролиферативным агентом ИЛ-2 и цитокином ФГА в условиях «in vitro».
В экспериментах с окрашиванием лимфоцитов моноклональными антителами мы показали, что достоверно значимых изменений уровня экспрессии после активации не происходит. Одновременно мы обнаружили, что инкубация суспензии лимфоцитов, обогащенной Т-лимфоцитами и NK клетками, полученной из периферической крови человека и активируемой цитокином совместно с 500 µM NMDA приводит к существенному возрастанию количества NR1-позитивных клеток (Рис. 2).
В то же время, внесение в среду одного NMDA не вызывало изменения количества клеток, несущих на своей поверхности NR1 субъединицу NMDA рецептора. Динамика появления NR1-позитивных лимфоцитов во времени показана на Рис. 2. Через 48 ч активации клетки, несущие NMDA-рецепторы, составляли около половины, а через 72 ч – почти 100% всей популяции. Таким образом, с увеличением времени инкубации активированных лимфоцитов в присутствии NMDA усиливается экспрессия клетками субъединицы NR1, при этом число NR1-позитивных клеток, инкубировавшихся без NMDA, не изменяется. В этих экспериментах мы обнаружили еще один интересный феномен: антагонист NMDA-рецепторов MK-801 (25 µМ) препятствовал появлению NR1 субъединицы на поверхности лимфоцитов, активированных ИЛ-2 в присутствии NMDA. % NR1-позитивных лимфоцитов 100 0 10 20 30 40 50 60 70 Время, часы Рис. 2. Количество NMDA-позитивных клеток в переживающих культурах периферических лимфоцитов в контроле (1) и, стимулированных ФГА ( µг/мл) и инкубированных в присутствии 500 µМ NMDA (2) в зависимости от времени инкубации.
При этом инкубация клеток с одним агонистом и/или антагонистом NMDA-рецепторов в отсутствие ФГА или ИЛ-2 не вызывала достоверных изменений экспрессии. Результаты этих экспериментов приведены на Рис. 3.
% NR1-позитивных лимфоцитов % NR1-позитивных лимфоцитов Б Б А Б 40 20 0 NMDA NMDA+MK- MK- Контроль NMDA NMDA+MK- MK- Контроль 801 Рис. 3. Количество NMDA-позитивных клеток в переживающей культуре периферических лимфоцитов в контроле (А) и после стимуляции ИЛ-2 ( ед/мл) в присутствии 500 µМ NMDA и 25 µМ MK-801 (Б). Время инкубации 72 ч.
Известно, что в нейронах, экспрессирующих NMDA-рецепторы, идет конститутивный синтез NR1-субъединиц, которые долгое время могут удерживаться в эндоплазматическом ретикулуме. В результате в нейронах обнаруживается значительный фонд свободных NR1-субъединиц, не ассоциированных с NR2-субъединицами, что позволяет клетке быстро регулировать количество и функциональную активность рецепторов в синапсе (Prybylowski and Wenthold, 2004). Можно предположить, что в проведенных нами экспериментах инкубация активированных периферических лимфоцитов с агонистом глутаматных рецепторов NMDA-класса ведет к запуску процессов, приводящих либо к усилению синтеза рецепторных субъединиц, либо к активации процессов их экстернализации и сборки функционально активных рецепторов.
Механизмы, лежащие в основе наблюдаемого феномена, требуют дальнейшего изучения, однако сами факты свидетельствуют, что существует положительная связь между воздействием NMDA на периферические лимфоциты и экспрессией этими клетками рецепторов к соответствующему лиганду, что может служить свидетельством вовлечения глутаматных рецепторов NMDA-класса в регуляцию процессов клеточной активации или модификации функциональных свойств лимфоцитов.
3. Влияние NMDA на уровень АФК и внутриклеточного Ca2+ в различных субпопуляциях лимфоцитов В нашей лаборатории косвенным методом (измерение люминол зависимой хемилюминесценции) ранее было показано, что инкубация NMDA c лимфоцитами человека приводит к увеличению продукции АФК (Тунева и соавт., 2003). Известно, что в нейронах рост уровня АФК под действием агонистов NMDA-рецепторов непосредственно связан с увеличением концентрации цитоплазматического Са2+, поступающего в клетку через Са каналы, управляемые этими рецепторами (или находящиеся в их составе).
Мы предположили, что если глутаматные NMDA-рецепторы лимфоцитов имеют сходство с таковыми в нейронах, то связывание агонистов с этими рецепторами также должно приводить к увеличению концентрации внутриклеточного Са2+. Ионы Са2+ в клетках выполняют роль вторичных мессенджеров, и одним из результатов увеличения концентрации кальция в клетке является активация фосфолипазы А2. В результате происходит накопление лизофосфолипидов и арахидоновой кислоты, наблюдается активация различных протеинкиназ и накопление свободных радикалов.
Нашей задачей было установить, участвует ли Са2+ в процессе накопления АФК в лимфоцитах человека под действием NMDA. Кроме этого мы изучали действие NMDA как на уровень АФК в общей фракции лимфоцитов человека и грызунов, используя флуоресцентный зонд DCFН2-DA, так и на уровень внутриклеточного Ca2+, применяя зонд Fluo-3 AM. После 30 мин инкубации суспензии лимфоцитов человека с 500 µМ NMDA мы наблюдали рост флуоресценции DCF до 185±54% и Fluo-3 AM до 146±11% от контрольного уровня. Эффект NMDA устранялся в присутствии специфического антагониста NMDA-рецепторов D-AP5 (D-2-amino-5-phosphonopentanoic acid, 1 µM).
Известно, что общая суспензия лимфоцитов неоднородна и содержит клетки нескольких субпопуляций, которые различаются по морфологии и функциональным свойствам. Для того, чтобы определить, на какие именно субпопуляции лимфоцитов оказывает влияние NMDA, мы выявляли ответ каждой субпопуляции, идентифицируемой с помощью избирательной маркировки их с помощью моноклональных антител к специфическим CD маркерам (Clusters of Differentiations) на их поверхности, одновременно нагружая их DCFН2-DA и анализируя ответ на NMDA в проточном цитомере.
Таблица 1. Влияние 500 µМ NMDA на продукцию АФК лимфоцитами человека CD маркер Популяция % от общего Флуоресценция DCF исследуемых количества после инкубации с клеток лимфоцитов NMDA, % от контроля Лимфоциты CD 45 100 185± Т-лимфоциты CD 3 66±10 260± CD 16 NK-клетки 14±6 221± В-лимфоциты CD 19 11±5 88± Моноциты CD 14 2 Оказалось, что увеличение внутриклеточного уровня АФК наблюдается в Т-лимфоцитах и NK-клетках. В таблице 1 представлены данные об изменениях во всех изученных популяциях лимфоцитов. На Рис. 4 представлены результаты окрашивания Т-лимфоцитов с помощью DCFН2-DA, отражающего рост уровня АФК под действием 500 µМ NMDA. Субпопуляцию Т-клеток идентифицировали с помощью PE-конъюгированных анти-CD3 антител.
Мы исследовали действие NMDA на NK-клетки и Т-лимфоциты в диапазоне концентраций 100-1000 µМ (Рис. 5). Нами было выявлено дозо зависимое увеличение уровня АФК в этих клетках, причем характер чувствительности соответствовал тому, что характерно для нейронов (Boldyrev et al., 2000). Интересно, что в области низких концентраций NMDA Т лимфоциты являются более чувствительными к активирующему лиганду, чем NK-клетки, в то время как в области высоких концентраций ответ обеих групп клеток уравнивается. Таким образом, можно сказать, что среди циркулирующих в кровотоке лимфоцитов именно эти клетки являются NMDA чувствительными в отличие от В-лимфоцитов, в которых уровень продукции АФК не изменяется.
Б А В Т-лимфоциты Рис. 4. Эффект 500 мкМ NMDA на продукцию АФК Т-лимфоцитами человека. Клетки, связавшиеся с анти-CD3 антителами, имеют высокую флуоресценцию в красной области спектра (FL2). Интактные клетки представлены на рисунке А. Лимфоциты на рисунке Б и В дополнительно нагружены DCFH-DA для измерения флуоресценции в зелёной области спектра (FL1). На рисунке В представлены клетки после 30 мин инкубации с 500 µМ NMDA;
это приводит к отчетливому усилению флуоресценции DCF, приводящему к сдвигу вправо (по шкале нарастания АФК) субпопуляции клеток, реагирующих с NMDA.
Флуоресценция DCF,% от контроля 0 200 400 600 800 Концентрация NMDA, мкМ Рис. 5. Концентрационная зависимость флуоресценции DCF от NMDA для Т-лимфоцитов (1) и NK-клеток (2).
4. Влияние NMDA на продукцию IFN- лимфоцитами человека В организме лимфоциты могут находиться в двух функционально значимых состояниях: покоя и активации. Связывание их с такими факторами, как ИЛ-2 или ФГА запускает клеточные программы пролиферации, дифференциации и транскрипции генов, значимых для иммунного ответа. Так, сигнал, опосредованный ИЛ-2, приводит к быстрой гетеродимеризации ИЛ-2 рецептора и активации тирозиновых киназ, которые фосфорилируют большое количество внутриклеточных белков, приводя в действие транскрипционные факторы (Cippitelli et al., 1995;
Schroder et al., 2004). Одной из важных особенностей Т-лимфоцитов и NK-клеток является способность синтезировать интерферон- (IFN-), который может лизировать опухолевые и зараженные вирусом клетки, а также регулировать работу макрофагов (Gesbert et al., 1998).
Количество накапливающегося IFN-у, пг/мл Б % NK-клеток, продуцирующих IFN-у А 14 6 Контроль ИЛ-2 ИЛ NMDA Контроль ИЛ-2 ИЛ NMDA 2+NMDA 2+NMDA Рис. 6. Эффект NMDA на продукцию IFN- лимфоцитами человека (А определение количества IFN- продуцирующих клеток, Б - определение накапливающегося IFN-).
Мы изучили влияние NMDA на продукцию IFN- клетками, активированными ФГА и ИЛ-2 по стандартной методике. Чтобы наиболее полно охарактеризовать этот процесс, мы применяли два разных подхода, определяя количество клеток, способных синтезировать IFN-, а также проводя количественное измерение IFN- в среде культивирования клеток.
Количество IFN--синтезирующих лимфоцитов определяли после окрашивания суспензии анти-CD16 и анти-CD3 антителами, конъюгированными с фикоэритрином, и моноклональными антителами к IFN-, конъюгированными с ФИТЦ, и их последующего анализа в проточном цитометре. Клетки инкубировали с ИЛ-2 и ФГА в течение 18 ч в присутствии 500 µМ NMDA.
Как видно из Рис. 6А, на покоящиеся лимфоциты NMDA влияния не оказывает, однако после стимуляции клеток ИЛ-2 их инкубация с 500 µМ NMDA приводит к снижению количества IFN--продуцирующих клеток практически до уровня контроля. На Рис. 6Б приведены результаты исследования накопления во внеклеточной среде IFN-, высвобождаемого активированными NК-клетками. Полученные данные подтверждают, что NMDA подавляет синтез этого цитокина. Аналогичные результаты были получены при активации Т-лимфоцитов и NK-клеток с ФГА (10 мг/мл).
5. Характеристика Т-лимфоцитов в очаге воспаления, созданном механическим повреждением спинного мозга Исходя из данных, полученных в экспериментах «in vitro», и сведений, известных из литературы, мы предположили, что влияние NMDA на лимфоциты может иметь наибольшее значение при активации их в условиях воспаления в мозге. Ведь экспрессия NMDA-рецепторов иммунокомпетентными клетками начинается при условии их активации в присутствии NMDA. Естественным аналогом и агонистом NMDA-рецепторов в организме является глутамат. Как известно, концентрация этого нейромедиатора увеличивается в межсинаптической области нейрональных контактов, спинно-мозговой жидкости и плазме в условиях воспаления, вызванного различными патологиями. Это может провоцировать усиленную экспрессию NMDA-рецепторов возбужденными лимфоцитами.
Для индукции воспаления использовали технику искусственного компрессионного повреждения спинного мозга (Spinal Cord Injury, SCI), впервые описанную Тарловым (Tarlov et al., 1953). В этих условиях инфильтрация лимфоцитов в ткань происходит в течение 1 недели после создания SCI. Мы исследовали срезы спинного мозга животных на разных сроках после воспаления и убедились, что в поврежденной ткани уже на 5 день после операции наблюдается аккумуляция лимфоцитов, причем скопление их происходит, в основном, в белом веществе непосредственно в очаге воспаления (Рис. 7).
На Рис. 7А представлен вид среза, окрашенного DAPI (4,6-diamidino-2 phenylindole), иллюстрирующий повреждение в дорсальной области спинного мозга. DAPI связывается с ДНК и, таким образом, визуализирует ядра клеток.
На фотографии отчетливо видны неокрашенные регионы, соответствующие разрывам ткани спинного мозга, характерным для гистологической картины данной модели воспаления. На Рис. 7Б изображен срез, окрашенный anti-CD антителами для флуоресцентной микроскопии, показывающий накопление Т лимфоцитов в очаге воспаления.
Несмотря на то, что модель SCI достаточно хорошо изучена, до сих пор в литературе не существовало данных о времени начала миграции лимфоцитов в поврежденную ткань спинного мозга. В наших исследованиях было продемонстрировано, что до 4 дня включительно в срезах практически не обнаруживается лимфоцитов, однако начиная с 5 дня в местах повреждения ткани наблюдается активная инфильтрация Т-лимфоцитов, которые мы идентифицировали при помощи моноклональных антител к CD3 рецептору.
Пик аккумуляции лимфоцитов приходится на 6-7 сутки после операции, и в дальнейшем лимфоциты обнаруживались в срезах в течение всех 14 дней наблюдения. На Рис. 7 представлен вид срезов, взятых из зоны очага воспаления, окрашенных моноклональными анти-CD3 антителами для световой микроскопии на 4 (В), 6 (Г) и 14 (Д) дни после операции. На фотографиях стрелками обозначены лимфоциты, связавшиеся с антителами. Они имеют характерную округлую форму и хорошо различимы в массиве поврежденной ткани.
6. Т-лимфоциты, активированные “in vivo” с помощью SCI, экспрессируют NR1 субъединицу NMDA-рецептора Методом двойного окрашивания NR1 субъединицы и CD3 рецептора Т лимфоцитов по методике, описанной выше, мы показали, что все Т-лимфоциты, инфильтрирующиеся в очаг воспаления, несут на своей мембране NR1 субъединицу NMDA-рецептора. Для лучшей визуализации на Рис. 8 синий цвет флуоресцентной метки Alexa fluor 594 заменен на красный с помощью компьютерной программы.
На Рис. 8А стрелками отмечены лимфоциты, концентрирующиеся в очаге воспаления, окрашенные обоими видами антител. На Рис. 8Б в качестве позитивного контроля представлен срез спинного мозга, окрашенный антителами к NR1-субъединице NMDA-рецептора. На срезах видны тела моторных нейронов в латеральной области серого вещества с неокрашенными ядрами и дендритными отростками, презентирующие NMDA-рецептор.
Известно, что далеко не все лимфоциты, мигрировавшие в воспаленный мозг в течение первой недели, задерживаются там. Большая их часть возвращается обратно в кровоток спустя короткий промежуток времени.
Остается лишь небольшой пул клеток, по-видимому, способный распознавать тканевые маркеры, а возможно, и причину, вызвавшую инфильтрацию (Hickey, 1991). Накапливающиеся лимфоциты способны регулировать активность макрофагов, действуя на них цитокинами, такими как интерлейкины и интерферон-, и влияя на протекание воспалительных реакций (Lodge, 1996).
Интересно отметить, что все Т-лимфоциты, обнаруженные нами в поврежденной ткани, презентируют NMDA-рецепторы, что может быть свидетельством тканеспецифичности данного пула клеток. Естественным агонистом этих рецепторов в клетках, которые их экспрессируют, может быть глутамат. В таком случае его функция может заключаться в модуляции свойств иммунокомпетентных клеток.
А Б А Г В Рис. 7. Вид срезов спинного мозга крысы, взятых из очага воспаления, индуцированного введением катетера с 12,5 мкл жидкости. Срезы окрашены флуоресцентным красителем DAPI (А) для визуализации сайта повреждения и PE-конъюгированными моноклональными анти-CD3 антителами (Б) для идентификации лимфоцитов методом флуоресцентной микроскопии.
В, Г и Д соответствуют картине срезов, Д взятых на 4, 6 и 14 день после операции и CD3 окрашенных антителам к Д рецепторам Т-лимфоцитов (световая микроскопия).
Рис. 8. Срезы спинного мозга с находящимися в очаге воспаления Т лимфоцитами (А) и мотонейронами в сером веществе (Б), презентирующими NR1 субъединицу NMDA-рецептора (6 день после операции). Жёлтый цвет лимфоцитов получается в результате двойного окрашивания антителами к NR-1 субъединице (зелёный) и CD3-маркеру (красный).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе мы впервые продемонстрировали экспрессию NMDA-рецепторов в иммунокомпетентных клетках, а также показали, что уровень этой экспрессии зависит от функционального состояния лимфоцитов и присутствия NMDA. Результаты исследований указывают на то, что активация лимфоцитов NMDA происходит по механизмам, аналогичным описанному для нейронов, и влечет за собой снижение иммунореактивности клеток. Активация NMDА-рецепторов приводит к подавлению синтеза интерферона-.
В условиях воспаления спинного мозга «in vivo» все лимфоциты, накапливающиеся в очаге воспаления, несут на своей поверхности NMDA рецепторы. Длительная активация глутаматных рецепторов должна приводить к истощению иммунной системы. В случае, когда развитие патологических процессов сопровождается накоплением токсических метаболитов, как, например, гомоцистеина, который является конгенером глутамата, способным активировать NMDA-рецепторы, экзайтотоксический эффект гомоцистеина может быть направлен не только на нейроны, но и на клетки иммунной системы, экспрессирующие эти рецепторы. Таким образом, NMDA-рецепторы в иммунокомпетентных клетках могут выполнять функции модуляции иммунного ответа.
Более того, NMDA-рецепторы играют важную роль в развитии и регуляции воспаления в ЦНС или в других тканях в условиях повышенных концентраций агонистов NMDA-рецепторов.
ВЫВОДЫ 1. С помощью ОТ-ПЦР впервые продемонстрировано наличие мРНК для канальной субъединицы NMDA-рецептора в лимфоцитах крысы.
2. N-метил-D-аспартат, специфический агонист глутаматных рецепторов NMDA-класса, вызывает рост свободных радикалов в лимфоцитах, ассоциированный с увеличением концентрации внутриклеточного Ca2+.
3. Анализ субпопуляций лимфоцитов, чувствительных к NMDA, показал, что в реализации клеточного ответа на NMDA участвуют Т-лимфоциты и NK-клетки.
4. Доля лимфоцитов, несущих NMDA-рецепторы, существенно возрастает при стимуляции лимфоцитов «in vitro» интерлейкином-2 или ФГА.
5. В опытах «in vivo» на модели спинномозговой травмы у крыс показано, что лимфоциты, мигрирующие в очаг воспаления, несут на своих мембранах NMDA-рецепторы.
6. NMDA подавляет синтез INF- в субпопуляциях Т-лимфоцитов и NK клеток, стимулированных ИЛ-2 или ФГА.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Boldyrev A., Kazey V., Leinsoo T., Mashkina A., Tyulina O., Johnson P., Tuneva J., Chittur S. and Carpenter D. (2004) Rodent lymphocytes express functionally active glutamate receptors Biochem. Biophys. Res.
Commun.;
324,133-139.
2. Boldyrev A., Mashkina A., Tyulina O., Johnson P., Tuneva J and Carpenter D.
(2004) Glutamate effects on ROS levels in rodent lymphocytes. J.
Neurochem.;
90 (Suppl. 1),AP7-01.
3. Boldyrev A., Bulygina E., Davydova O., Mashkina A., Vladychenskaya E., Tyulina O. (2006) Functional role of glutamate receptors of NMDA-class in immune system. 29th Annual Meeting Neurochem. Soc. Jap.,
Abstract
#20001.
4. Mashkina A., Tyulina O., Kovalenko E., Kanevski L., Johnson P., Boldyrev A.
(2006) Glutamate Receptor-mediated increases in reactive oxygen species affect human lymphocyte interferon- production. 11th Int. Congress “Molecular basis of neurological and psychiatric disorders”, p. 66.
5. Mashkina A., Tyulina O., Solovyova T., Kovalenko E., Kanevski M., Johnson P., Boldyrev A. (2007) The excitotoxic effect of NMDA on human lymphocyte immune function. Neurochem. Int., 51, 356-360.
6. Махро А.В., Машкина А.П., Соленая О.А., Трунова О. А., Козина Л.С., Арутюнян А.В., Булыгина Е.Р. Пренатальная (2008) гипергомоцистеинемия как модель окислительного стресса мозга. Бюлл.
Эксп. Биол. Мед., 146, №7, 37-39.
7. Махро А.В., Машкина А.П., Соленая О.А., Трунова О.А., Тюлина О.В., Булыгина Е.Р., Болдырев А.А (2008) Карнозин защищает от окислительного стресса, вызванного гипергомоцистеинемией.
Нейрохимия, 25, №3, 1–8.
8. Mashkina A., Vanicky I., Boldyrev A. (2010) NMDA-receptors are expressed in lymphocytes activated both “in vitro” and “in vivo”. Cell Molec. Neurobiol.
(accepted).
Краткая аннотация диссертационной работы А. П. Машкиной «Обнаружение NMDA-рецепторов в лимфоцитах и их характеристика».
Работа посвящена изучению влияния специфического агониста глутаматных рецепторов NMDA-класса, N-метил-D-аспартата, на лимфоциты периферической крови человека и крыс. В работе методом ОТ-ПЦР впервые установлено наличие в лимфоцитах периферической крови крыс мРНК, кодирующей основную белковую субъединицу NMDA-рецепторного комплекса (NR1). При помощи иммуноцитохимического окрашивания показано присутствие соответствующего белка на мембране клеток, активированных в условиях «in vitro» и «in vivo». В ходе работы было установлено, что NMDA вызывает окислительный стресс лимфоцитов и отрицательно влияет на реактивную способность этих клеток.
Summary of Ph.D. Thesis by Mashkina A. entitled “Detection of NMDA receptors in lymphocytes and its description” The study is devoted to investigation of N-methyl-D-aspartathe, a specific agonist of NMDA-class glutamate receptors, on human and rat peripheral blood lymphocytes (PBL). In this work for the time by means of RT-PCR has been shown the presence of mRNA coding canal protein subunit of NMDA-receptor complex in rat PBL. With help of immunocytochemical staining the presence of corresponding protein on membrane of cells, activated “in vitro” and “in vivo” conditions, has been shown. As a result of this work it has been established that NMDA causes oxidative stress in lymphocytes and influences negatively on their immunoreactivity.