Физиологические подходы к восстановлению локальной гемодинамики
На правах рукописи
Тюменцева Наталья Валерьевна ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ВОССТАНОВЛЕНИЮ ЛОКАЛЬНОЙ ГЕМОДИНАМИКИ 03.00.13. - «Физиология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Екатеринбург – 2006 2
Работа выполнена в Институте иммунологии и физиологии УрО РАН, на кафедре физиологии человека и животных Уральского государственного университета (г. Екатеринбург)
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Юшков Борис Германович
Официальные оппоненты: академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук Захаров Юрий Михайлович доктор биологических наук Проценко Юрий Леонидович
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Тюменский государственный университет» Министерства образования и науки РФ
Защита состоится «» 2006 года в часов на заседании диссертационного совета Д 004.027.01 в Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620041 г. Екатеринбург, ул. Первомайская,
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ГСП – 593, ул. Софьи Ковалевской / Академическая, 22 / 20.
Автореферат разослан «_» 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Тузанкина И. А.
ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования. Патология сердечно-сосудистой системы занимает ведущее место среди всех заболеваний. Поиск новых методов ее лечения остается актуальной проблемой современной биологии и медицины. В последние годы исследователи и практические врачи стали больше уделять внимания проблеме новообразования сосудов в больном организме – ангиогенезу. Однако многие его аспекты до настоящего момента недостаточно исследованы. Последнее, прежде всего, относится к разработке эффективных методов восстановления нарушенного кровоснабжения тканей. При этом в этой проблеме выделяют два основных направления: восстановление кровотока в магистральных сосудах и восстановление микроциркуляции.
В экспериментальной физиологии и клинической медицине восстановление кровотока при поражении магистральных сосудов чаще всего осуществляется путем формирования коллатерального кровотока и протезированием сосудов.
Для стимуляции образования коллатеральных сосудов наиболее перспективным оказалось введение в организм урокиназы, рекомбинантных ангиогенных факторов роста (FGF-1 и 2 и VEGF165) и их генов (VEGF165, VEGF121, VEGF189 и FGF-5) (Парфенов Е. В., Ткачук В. А., 2000), или плазмидной кДНК VEGF165 (Baumgartner I., 1998).
Вместе с тем, в практической медицине наиболее широкое распространение для восстановления магистрального кровотока получила не стимуляция коллатерального кровотока, а пластика артерий.
Для протезирования артерий чаще всего используют собственные сосуды организма (аутовены, аутоартерии) (Балацкий О. А., 1990;
Дибиров М. Д., 2001;
Лебедев Л. В., 1990;
Шнейдер Ю.А., 2001, 2004), алловены и аллоартерии (сосуды, взятые от трупов;
вены и артерии пупочного канатика) (Андреев И. Д., 1983, 1985;
Аничков М. Н., 1984;
Трошин А. З.,1984), ксенопротезы, получаемые при ферментативно-химической обработке артерий млекопитающих (Асланов А. Д., 2003;
Биленко М. В., 1960;
Дронов А. Ф., 1983), искусственные протезы из синтетических материалов, в частности, наиболее используемого, в настоящее время, политетрафторэтилена (Белов Ю.
В, 1997;
Бокерия Л. А., 1996;
Гусинский А. В., 2002;
Евдокимов А. Г., 2000;
Лазарев С. М., 2000;
Лебедев Л. В., 1997;
Шнейдер Ю. А., 2002;
Paaske W. P., 1994).
В связи с появившейся возможностью культивирования клеток и тканей вне организма в последние десятилетия наметился новый подход – искусственное конструирование сосудов за пределами организма. При этом используются несколько подходов: покрытие внутренней поверхности синтетической основы культурой эндотелиальных клеток (Седов В. М., 2004;
Ballermann B. J., 1998;
Nugent H. M., 2003), генетически трансформированными эндотелиоцитами (Dunn P. F., 1996), мезотелиальными клетками сальника (Verhagen H. J., 1995, 1996), засевание биополимерных каркасов культурой гладкомышечных клеток (Hoerstup S. P., 2001), покрытие биоразлагаемых полимеров клетками из подкожной и бедренной вен (Matsumura G., 2003;
Watanabe M., 2001), засевание биоосновы стволовыми клетками (Anderson D.G., 2004). Niklason L. E. еt al. (1999) показали возможность формирования артерий in vitro при сокультивировании гладкомышечных и эндотелиальных клеток.
Однако в теоретическом и практическом плане наиболее перспективным представляется формирование сосудов в самом организме. Ключевым вопросом в этом случае является получение качественного протеза, который служил бы основой для дальнейшего сосудообразования. В роли такой основы могла бы быть использована формирующаяся в процессе воспалительной реакции вокруг инородного тела соединительнотканная капсула (Campbell G. R., 1983;
Campbell J.H., 2000;
Efendy J. L., 2000).
Для улучшения кровоснабжения поврежденных тканей не менее важно восстановление микроциркуляторного русла (Гончарь М. Г., 1990;
Чернух А.
М., 1971).
В качестве клеток, влияющих на процесс неоангиогенеза в ишемизированную зону вводят мононуклеары костного мозга (Esato K., 2002;
Hamano K., 2001;
Hasebe H., 2004;
Higashi Y., 2004;
Hirata K., 2003), клетки предшественники эндотелиоцитов (Masuda H., 2000), стромальные клетки костного мозга (Шумаков В. И., 2003;
Al-Khaldi A., 2003;
Chen J., 2003), мезенхимальные стволовые клетки (Abedin M., 2004), эндотелиальные предшественники пуповинной крови (Pesce M., 2003;
Yang C., 2003), гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови (Юрасов С. В., 1997), эмбриональные стволовые клетки (Levenberg S., 2002), мононуклеары периферической крови (Kamihata H., 2004), тромбоциты периферической крови совместно с мононуклеарами (Iba O., 2002).
Имплантация стволовых клеток в ишемизированную область вызывает неоваскулогенез, обусловленный не только непосредственным участием стволовых клеток в формировании неокапилляров, но значительной экспрессией этими клетками факторов ангиогенеза (Takakura N., 2000).
Таким образом, достижения экспериментальной и клинической ангиологии последних лет наметили новые пути восстановления нарушенного кровоснабжения тканей. Однако, базируясь, в основном, на эмпирических данных, последние требуют изучения фундаментальных законов ангиогенеза. В этом плане приоритетными направлениями являются получения аутопротезов и восстановление микроциркуляторного русла с помощью стволовых клеток.
Цель исследования: разработать теоретическое и экспериментальное обоснование восстановления магистрального кровотока и микроциркуляторного русла.
Задачи исследования:
1. Изучить скорость формирования соединительнотканных аутопротезов на разных материалах, используемых в качестве имплантатов.
2. Оценить качество образуемого соединительнотканного протеза в зависимости от места введения используемых основ.
3. Исследовать скорость образования ангиопротеза в зависимости от вида экспериментального животного и выраженности у него подкожно-жировой клетчатки.
4. Определить зависимость формирования аутопротеза от функциональной активности печени, от состояния эндокринной и иммунной систем.
5. Установить эксплуатационные свойства соединительнотканного протеза после его аутотрансплантации в сосуды артериального типа.
6. Исследовать восстановление микроциркуляторного русла после введения в ишемизированную зону стволовых клеток.
Научная новизна исследования:
Впервые показано, что в процессе воспаления, вызванного введением в организм инородного тела, возможно получение соединительнотканной капсулы, заданных размера и форм, которая может быть использована для пластики сосудов.
Выявлено, что наиболее подходящими имплантатами для образования соединительнотканных протезов являются материалы с пористой структурой.
Обнаружено, что процесс формирования соединительнотканной капсулы интенсивнее протекает при подкожном введении имплантата, чем при внутрибрюшинном.
Установлено, что с увеличением массы животного скорость формирования соединительнотканной капсулы замедляется.
Показано, что гиперфункция надпочечников, стимуляция моноцитарно макрофагального звена и В-звена иммунной системы, а также частичная гепатэктомия стимулируют созревание соединительнотканной капсулы, в то время как, надпочечниковая недостаточность, ингибиция фагоцитирующих мононуклеаров оказывают противоположный эффект на этот процесс.
Впервые продемонстрировано, что соединительнотканный протез, трансплантируемый в артерии разного типа, обеспечивает кровоток в оперируемом сосуде, служит основой для формирования элементов сосудистой стенки и индуцирует коллатеральное кровообращение.
Установлено, что процесс ангиогенеза связан либо с дифференцировкой истинных стволовых кроветворных клеток в эндотелиоциты, либо эндотелиальные клетки и кроветворные клетки имеют общего предшественника.
Теоретическая значимость работы. Полученные данные расширяют знания о механизмах репаративного ангиогенеза. Теоретически обосновывают возможность использования соединительнотканного протеза для пластики магистральных сосудов. Демонстрируют роль эндокринной, иммунной систем, функционального состояния печени на формирование аутопротезов, и обосновывают возможность целенаправленного медикаментозного воздействия на этот процесс. Показаны физиологические механизмы, обеспечивающие кровоток в протезируемых сосудах. Теоретически обоснована возможность восстановления микроциркуляторного русла с помощью клеток костного мозга, и прослежена связь эффективности такой трансплантации с содержанием в ткани стволовых кроветворных клеток.
Практическая значимость работы. Предложен новый метод получения сосудистых протезов и использование их для восстановления кровотока при повреждении магистральных артерий мышечного (бедренная) и мышечно эластического (сонная) типов (Патент за №2260379 “Способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей”). Обоснована возможность применения для восстановления микроциркуляторного русла при ишемических поражениях органов и тканей стволовых клеток костного мозга.
Положения, выносимые на защиту.
1. Для пластики артериальных и венозных сосудов может быть использована соединительнотканная капсула, образующаяся вокруг инородного тела.
2. Качество соединительнотканного аутопротеза зависит от используемого в качестве имплантата материала, от места его введения, вида животных.
3. На формирование соединительнотканного протеза оказывают влияние эндокринная и иммунная системы, а также функциональное состояние печени.
4. Имплантированный в сосуд аутопротез служит основой для образования сосудистых структур и может инициировать формирование коллатерального кровообращения.
5. Клетки костномозгового происхождения эффективны для восстановления микроциркуляторного русла.
Апробация работы. Работа апробирована на заседании научно практического общества хирургов (г. Екатеринбург, 2004г.), на конференции «Фундаментальные науки - медицине» (г. Москва, 2004г.), на Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы:
фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (г. Новосибирск, 2004г.), на международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (г. Тюмень, 2005г.), на IX итоговой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке” (г. Киров, 2005г.), на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (г. Санкт Петербург, 2005г.), на X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2005г.), на XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (г.
Санкт-Петербург, 2005г.), на научной конференции молодых ученых «Современные методы диагностики и лечения заболеваний в клинике и в эксперименте» (г. Москва, 2005г.), на 1-ом съезда физиологов СНГ (г. Дагомыс, 2005г.), на международной конференции «Эмбрион человека как клинический и лабораторный объект» (г. Екатеринбург, 2005г.), на V Сибирском физиологическом съезде (г. Томск, 2005г.), на XI Всероссийской научно практической конференции «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2006г.), на Ученом Совете биологического факультета УрГУ им. А. М. Горького (г.
Екатеринбург, 2006 г.). По материалам исследования опубликовано 21 научная работа.
Внедрение. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре физиологии человека и животных Уральского государственного университета имени А. М. Горького, в научных разработках Института иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии Наук, в учебном процессе на кафедре общей хирургии Уральской государственной медицинской академии, в учебном процессе на кафедре патофизиологии Челябинской государственной медицинской академии, в работе центра “Новые медицинские технологии” г. Москва.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, четырех глав с изложением и обсуждением результатов собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 363 источника (из них 84 отечественных). Работа изложена на 231 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 44 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Методические вопросы исследования. Эксперименты выполнены на мышах линии СВА массой 30 г - 30 шт., белых беспородных крысах массой 200-250 г – 350 шт., морских свинках массой 400-500 грамм – 10 шт., кроликах массой 5-6 кг – 30 шт., свиньях породы белая украинская массой 45-50 кг – шт. Экспериментальные животные содержались в условиях обычного лабораторного вивария и находились на обычном пищевом рационе в соответствии с правилами, определенными приказом М № 163 от 10.03.1966 г.
«О нормах кормления лабораторных животных и «продуцентов».
Имплантацию основы мышам, крысам, морским свинкам проводили под эфирным наркозом, а кроликам и свиньям под местной анестезией 0,5%-ым раствором новокаина подкожно или внутрибрюшинно. Свиньям имплантаты вшивали в подкожно-жировую клетчатку внутренней поверхности бедра. В качестве основы использовали стерильные трубки из стекла, силикогеля, целлоидина, дерева, железа, стали, миллипора (миллипоровый целлюлозный фильтр, НА 0,45), полихлорвинила и полиэтилена в виде цилиндра одинакового размера. Имплантаты для эксперимента брали с наружным диметром 2 мм, длиной 10 мм для мышей и 20 мм для остальных животных. Формирование соединительнотканной капсулы оценивали еженедельно у крыс на протяжении 6-сти недель, а у других животных – на 4 и 5 недели.
Для выявления роли гипоталамо-гипофизарной надпочечниковой оси нейроэндокринной системы на формирование соединительнотканных аутопротезов, использовали двустороннюю адреналэктомию или введение преднизолона в дозе 12 мг/кг ежедневно на протяжении 4-х недель.
Для изучения функциональной активности макрофагов использовали введение препаратов с противоположным действием: тамерита, активирующего моноцитарно-макрофагальное звено, в терапевтической дозе 2 мг/кг и повышенной - 10 мг/кг, и каррагенана в дозе 7,5 мг/кг на протяжении всего эксперимента.
Для определения влияния лимфоидных клеток на процесс формирования соединительнотканных аутопротезов использовали введение даларгина, стимулирующего преимущественно В-звено, в дозе 0,05 мг/кг.
С целью исследования влияния функционального состояния печени на процесс образования соединительнотканных аутопротезов использовали частичную гепатэктомию (2/3 массы органа) по методу G. M. Higgins и R. M.
Anderson.
В экспериментах по аутотрансплантации сосудов использовали 5-ти недельные соединительнотканные аутопротезы, полученные на полихлорвиниловых трубках, вшитых под кожу спины экспериментальных животных – крыс, кроликов. Специальной антикоагулянтной терапии во время операции и в послеоперационном периоде не проводили. Вшитые аутопротезы оставляли в организме крыс на срок 3 недели, 3 и 6 месяцев, у кроликов – на и 6 месяцев, после чего их извлекали.
Проходимость протезированных сосудов оценивали несколькими методами. В случае пластики сонной артерии крысы, перевязывали контрлатеральный сосуд, и отсутствие церебральных нарушений свидетельствовало о проходимости аутопротеза. Извлечение протезов начинали с дистального конца, и наличие кровотечения указывало также на проходимость трансплантата.
Проходимость протеза у кроликов через 6 месяцев после операции на бедренной артерии проводили с использованием системы ультразвукового дуплексного сканирования с помощью прибора Siemens Sonoline Antares (USA) и рентгенографии на рентгенодиагностическом телеуправляемом комплексе «Электрон» - КРТ (г. Санкт – Петербург).
Для гистологических исследований аутопротезы фиксировали в 10%-ом растворе нейтрального формалина. После стандартной проводки материал заливали в парафиновые блоки. Затем на микротоме делали срезы толщиной 3 5 мкм.
Срезы окрашивали гематоксилином – эозином. Использовали также окраски на коллагеновые волокна - по Ван-Гизону, на эластические волокна по Вейгерту, на тучные клетки - азуром II, толуидиновым синим или основным коричневым по Шубичу, для определения эндотелиоцитов – на щелочную фосфатазу (две методики окрашивания).
Наряду с морфологическим описанием гистологических препаратов проводили морфометрические исследования соединительнотканных протезов.
Определяли: толщину стенки аутопротеза, общее количество клеток на единицу площади (0,01 мм2), соотношение между отдельными типами клеток (фибробласты, фиброциты, лимфоциты, макрофаги, сегментоядерные гранулоциты, плазматические клетки) из расчета на 1000 клеток. Кроме того, высчитывали коэффициент фибробласты/фиброциты, количество тучных клеток на единицу площади и степень их дегрануляции, индекс дегрануляции тучных клеток.
Измерения толщины стенки протезов проводили с помощью цифровой цветной видеокамеры “САМ 2800” и программного обеспечения «Видеотест – мастер. Морфология», а для подсчета общего количества клеток и содержания тучных клеток в препарате использовали окулярную измерительную сетку Автандилова.
Материал для электронной микроскопии брали из проксимального и дистального отделов аутопротеза, артерии выше места анастомоза через месяца после протезирования бедренной артерии кролика. Материал фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида, импрегнацию проводили 0,1% раствором четырехокиси осмия. Далее кусочки обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в эпоксидную смолу аралдит.
Аралдитовые блоки резали на ультрамикротоме “ЛКБ”. Полученные срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу.
Приготовленные описанным методом препараты были изучены в электронном микроскопе “Джеол” – 200 СХ при ускоряющем напряжении 80 киловольт и рабочем увеличении 7300.
Ишемию задней конечности получали путем перевязки бедренной артерии крыс. Восстановление микроциркуляции осуществляли путем введения в зону ишемии 107 клеток костного мозга, селезенки или легкого. Контролем во всех случаях служила контрлатеральная конечность с перевязанной артерией, в которую вводили физиологический раствор.
Подсчет количества капилляров в мышце производили в 20 случайных полях зрения площадью 0,017 мм2 каждый с последующим пересчетом на 1мм2.
Микрофотографии с гистологических препаратов получали с помощью цифровой цветной видеокамеры “САМ 2800”.
Обработку результатов проводили на основе методов вариационной статистики с применением параметрических критериев, используя компьютерную программу «Microsoft Excel». Вычислялась средняя арифметическая величина, стандартное отклонение, ошибка средней арифметической величины. Для оценки достоверности различий между двумя средними арифметическими определяли критерий Стьюдента и затем находили р (вероятность ошибки). При р0,05 различия между средними арифметическими величинами считались достоверными. Кроме этого, использовали критерии Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса.
Результаты исследования и их обсуждение.
Проведенные исследования свидетельствуют, что в процессе воспаления, вызванного введением в организм инородного тела, возможно получение соединительнотканной капсулы заданных формы и размеров.
Для динамики ее образования на ранних этапах характерно накопление клеточных элементов при отсутствии волокнистых структур (Рис.1), а на поздних сроках капсула отличается более упорядоченной морфо-структурной организацией, появлением коллагеновых и эластических волокон с продольно циркулярной ориентацией (Рис. 2).
Рисунок 1. Препарат стенки Рисунок 2. Препарат стенки аутопротеза, сформированного у аутопротеза, сформированного у крыс при подкожном введении крыс при подкожном введении миллипоровой основы, через 1 миллипоровой основы, через неделю от начала эксперимента. недель от начала эксперимента.
Окр. гематоксилином и эозином. Ув. х100. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.
х100.
Этапы образования соединительнотканной капсулы не связаны ни с местом введения имплантата (подкожно, внутрибрюшинно), ни с видом животного (мышь, крыса, морская свинка, кролик, свинья).
В то же время, скорость формирования капсулы определяется целым рядом факторов.
Она зависит от места введения имплантата и в брюшной полости процесс идет медленнее, чем под кожей.
Существенное влияние оказывает вид животного. У эталонных животных - крыс формирование качественных протезов, в основном, завершается к 6-й неделе. С увеличением массы животного скорость формирования соединительнотканной капсулы замедляется.
Для образования соединительнотканных аутопротезов важна природа используемого в качестве основы материала. Так, на стекле, силикогеле, целлоидине, дереве, железе, стали, не удается получить достаточно качественного протеза на протяжении всего эксперимента. Подходящими материалами для получения аутопротезов являются миллипоровые и полихлорвиниловые трубки. Однако трубки, сформированные из миллипорового фильтра, при увеличении размеров теряют способность сохранять форму, легко деформируются при движении экспериментального животного. В связи с этим, в практическом плане наиболее перспективен полихлорвинил.
На процесс формирования соединительнотканных аутопротезов, как и на воспаление в целом, существенное влияние оказывает состояние организма, в частности, эндокринная и иммунная системы, а также функциональное состояние печени.
Полученные данные свидетельствуют, что при недостатке гормонов коры надпочечников образование соединительнотканной капсулы тормозится, что находит свое отражение в более длительном сохранении рыхлой соединительно ткани и замедлении образовании коллагеновых волокон. В то время как, введение преднизолона ускоряет замену рыхлой соединительной ткани волокнистой и появление коллагеновых и эластических волокон с продольно циркулярной ориентацией.
Влияние лимфоидных клеток на этот процесс определяется с одной стороны реактивностью иммунной системы, а с другой - природой используемого материала. При стимуляции лимфоидных клеток даларгином (преимущественно В-звена) формирование соединительнотканной капсулы на миллипоровой трубке замедляется. В то время как на полихлорвиниловой основе замена рыхлой соединительной ткани волокнистой ускоряется.
Антигенпрезентирующие клетки, в частности система фагоцитирующих мононуклеаров, также влияют на качество образующегося аутопротеза и при их стимуляции тамеритом в терапевтической дозе 2 мг/кг ускоряется формирование соединительнотканной капсулы. Однако, чрезмерная стимуляция макрофагов большой дозой тамерита (10 мг/кг) отменяет данный эффект, и образующиеся в этом случае протезы не отличаются от аутопротезов животных, которым препарат не вводился (Табл. 1).
Ингибиция же активности фагоцитирующих мононуклеаров каррагенаном, замедляет формирование аутопротезов, что проявляется в наличии рыхлой соединительной ткани и замедлении образования волокнистых структур.
Таблица 1.
Характеристика аутопротезов через 4 недели после имплантации под кожу полихлорвиниловой основы при изменении функциональной активности макрофагов Показатели Контроль Тамерит Тамерит Каррагенан 2 мг/кг 10 мг/кг 7,5 мг/кг Толщина стенки, мм 0,1±0,01 0,02±0,001* 0,21±0,02*! 0,30±0,02*!
Кол-во клеток на 0,01 мм2 57,46±1,6 244,7±0,001* 50,95±1,87*! 65,31±1,6*!
Фибробласты 21,9±4,5 36,7±7,5 19±1,9 ! 44,15±5,1* Фиброциты 31,3±3,8 208±7,5* 29±2,5 ! 18,09±5 !
Фибробласты + 53,2±1,6 244,7±0,001* 48,02±1,24* ! 62,24±0,9*!
фиброциты Коэффициент фибробласты/фиброциты 0,69 0,18 0,66 2, Лимфоциты 2,6±1,1 0 1,5±0,9 1,04±0, Сегментоядерные 0,9±0,6 0 0,8±0,3 2,02±0, нейтрофилы Макрофаги 0,7±0,5 0 0,6±0,1 Плазматические клетки 0 0 0 Примечание: * - различие с контролем достоверно (р0,05), ! – различие с животными, получавшими тамерит 2мг/кг достоверно (р0,05) Таким образом, прослеживается отчетливая связь образования капсулы с количеством и функциональной активностью таких клеток иммунной системы как лимфоциты и макрофаги. В то же время полученные данные свидетельствуют, что тучные клетки существенно не влияют на этот процесс.
При частичной гепатэктомии формирование соединительнотканных аутопротезов ускоряется. При разной скорости накопления клеток фибробластического ряда (контроль - 53,2±1,6 на 0,01 мм2;
гепатэктомия 162,2±0,001 на 0,01 мм2 (р0,05)) после частичной гепатэктомии повышается дифференцировка фибробластов в фиброциты, при этом коэффициент фибробласты/фиброциты падает (контроль – 0,69;
гепатэктомия – 0,19), и, вероятно, возрастает их функциональная активность, что приводит к ускорению формирования волокнистых структур.
Полученные соединительнотканные протезы оказываются весьма эффективными для протезирования артериальных сосудов, что подтверждается экспериментальными исследованиями на крысах и кроликах. Ангиопротезы имеют достаточно прочную структуру, так как при восстановлении кровотока после аутопротезирования они сохраняют форму трубки, не отмечается аневризмы протезов, ранних или поздних кровотечений через стенку трансплантатов. Хотя их предельная прочность в 2,6 раза меньше, чем, например, у сонной артерии. Соединительнотканные аутопротезы обладают биологической инертностью и хорошей приживляемостью благодаря полной антигенной совместимости.
Сосудистые аутопротезы, имплантированные в сонную артерию крыс и бедренную артерию кроликов, на все сроки наблюдения сохраняют проходимость (Рис. 3), о чем свидетельствует отсутствие, в случае пластики сонной артерии, церебральных нарушений при перевязке контрлатерального сосуда, отсутствие трофических нарушений в тканях дистальнее протеза и нормальное их функционирование, наличие кровотечения при перерезке артерии дистальнее места протезирования, а также данные морфологических исследований. Это подтверждается также данными гистологических исследований, ультразвукового дуплексного сканировании (Рис.4), рентгеноангиографией (Рис. 5) и электронной микроскопией (Рис. 6).
Рисунок 3. Аутопротез через 6 месяцев Рисунок 4. Изображение ультразвукового после протезирования бедренной артерии дуплексного сканирования бедренной кролика артерии кролика через 6 месяцев после операции Рисунок 5. Рентгеноангиограмма Рисунок 6. Электроннограмма среза протезируемой бедренной артерии проксимального отдела аутопротеза.
кролика через 6 месяцев после операции Признаки эндотелизации и формирования базальной мембраны. Ув. х На соединительнотканной основе протеза происходит формирование сосудистых структур, в частности, со стороны артерии происходит нарастание эндотелиальной выстилки с базальной мембраной. Процесс наиболее активно протекает в проксимальной области, т. е. по направлению кровотока (Рис. 6).
Вместе с тем, для формирования сосуда наиболее уязвимым звеном является место анастомоза, где возможно сужение его просвета в результате несовпадения диаметра протеза и диаметра протезируемой артерии. В этом случае дополнительно образуются коллатеральные сосуды. При формировании гемостатической пробки в области сосудистого шва на ее поверхности образуются элементы сосудов.
Таким образом, соединительнотканный аутопротез может выступать не только в качестве основы для формирования нормального сосуда, но способен, также, индуцировать ангиогенез с образованием коллатерального кровообращения.
Для улучшения кровоснабжения поврежденных тканей не менее важно восстановление микроциркуляторного русла.
В экспериментальной физиологии и клинической медицине для стимуляции ангиогенеза чаще всего используют костный мозг. Однако при приготовлении взвеси костномозговых клеток в нее на ряду со стволовыми клетками могут попасть эндотелиоциты и их предшественники, тучные клетки, выделяющие целый ряд ангиогенных факторов, секретирующие ростковые факторы макрофаги и т. д.
Таким образом, роль стволовых гемопоэтических клеток в ангиогенезе до настоящего времени не нашла убедительного экспериментального обоснования.
В решении этой проблемы теоретически возможно два подхода:
использование для восстановления микроциркуляторного русла чистой культуры истинных стволовых клеток, либо использование взвеси клеток, отличающихся по их содержанию. Так как на сегодняшний день не существует методик для получения чистых стволовых клеток, то в экспериментальных исследованиях был применен второй подход.
В ишемизированную конечность животных вводили одинаковое количество – 107 клеток костного мозга, селезенки, легкого. При этом исходили из того факта, что все эти ткани характеризуются выраженной сосудистой сетью, но отличаются по концентрации стволовых кроветворных клеток. Так, в костном мозге 1-3 стволовых клеток приходится на 104 кариоцитов, в селезенке уже на 105, а в периферической крови – основном источнике гемопоэтических стволовых клеток в легких – на 106.
Полученные данные свидетельствуют, что эффективность восстановления микроциркуляторного русла в ишемизированной конечности в целом совпадает с содержанием в тканях стволовых гемопоэтических клеток (костный мозг – 75,3±5,6 капилляров на 1 мм2 ;
селезенка – 62,5±8,1 капилляров на 1 мм2;
легкое – 39,4±6,3 капилляров на 1 мм2 ), и практически не зависит от выраженности сосудистого русла и количества тучных клеток.
Так, ткани костного мозга и легкого, не отличаются по количеству сосудов (2,22±0,12 и 2,1±0,19 на 0,01 мм2 соответственно), в то время как в селезенке число сосудов значительно меньше - 0,18±0,01 на 0,01 мм2. Однако при трансплантации взвеси клеток легкого, по сравнению с костным мозгом, капилляров образуется меньше. А значит, вряд ли клетки, влияющие на ангиогенез, находятся в сосудах.
Наибольшее количество тучных клеток содержится в костном мозге 379 000 на 107 клеток, меньше в легких – 149 000 на 107 клеток, и минимальное количество в селезенке – 48 000 на 107 клеток. В то же время при введении в мышцы клеток костного мозга и селезенки образуется практически одинаковое количество капилляров, а значит, тучные клетки оказывают незначительную роль на процесс ангиогенеза.
Таким образом, эти результаты являются косвенным подтверждением того представления, что в восстановлении микроциркуляции важное место занимают либо стволовые гемопоэтические клетки, либо общие для гемопоэтических клеток и эндотелиоцитов предшественники, либо содержание клеток–предшественников эндотелиоцитов в разных тканях находится в том же соотношении, что и стволовых гемопоэтических клеток. Однако, несмотря на то, что решение данного вопроса требует дальнейших исследований, результаты данных экспериментов подтверждают эффективность применения клеток костного мозга для восстановления ткани, подвергнувшейся ишемии.
ВЫВОДЫ 1. Для пластики крупных магистральных сосудов может быть использована соединительнотканная капсула, образующаяся при воспалении вокруг инородного тела. При этом используемая основа позволяет формировать протез заданной формы и размера.
2. Формирование соединительнотканной капсулы наиболее эффективно протекает на имеющем пористую структуру миллипоре, который, однако, сохраняет жесткую структуру лишь при небольших размерах трубки, в связи с чем в практическом плане удобнее полихлорвинил. В случае других материалов (стекло, целлоидин, сталь, железо, силикогель, дерево) качество образуемой капсулы не позволяет использовать ее для ангиопластики.
3. Качество соединительнотканного протеза определяется местом имплантации основы. При ее помещении под кожу образуется более прочный протез и формирование идет быстрее, чем при внутрибрюшинном введении.
4. Скорость образования ангиопротеза имеет четкую видовую зависимость.
С увеличением массы тела животного и снижением метаболических процессов в ряду мышь, крыса, морская свинка, кролик, свинья, образование соединительнотканного протеза замедляется.
5. Образование соединительнотканного протеза зависит от эндокринной и иммунной систем организма, от функциональной активности печени.
Гормоны надпочечников, активация моноцитарно-макрофагального звена и В-звена иммунной системы, а также частичная гепатэктомия стимулируют созревание соединительнотканной капсулы.
Надпочечниковая недостаточность, ингибиция фагоцитирующих мононуклеаров оказывают противоположный эффект на этот процесс.
6. Трансплантация аутопротеза в сосуд вызывает различные физиологические эффекты. Он служит основой для формирования сосудистых структур, в результате нарастания со стороны артерии эндотелиальной выстилки и появления миоцитов. Протез также индуцирует образование коллатеральных сосудов.
7. Трансплантация клеток костного мозга представляет собой эффективный метод восстановления микроциркуляторного русла в области ишемии.
Этот эффект не зависит от концентрации в клеточной взвеси эндотелиоцитов и их предшественников, а также тучных клеток.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Черешнев В.А. Система крови и адаптация организма к экстремальным факторам / В.А. Черешнев, Б.Г. Юшков, М.Н. Сумин, Н.В. Тюменцева, Ю.С. Храмцова, И.Г. Данилова // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т.90. №10. – С. 1193-1202.
2. Тюменцева Н.В. Метод формирования сосудистых протезов in vivo для аутотрансплантации / Н.В. Тюменцева, С.Ю. Медведева, Б.Г. Юшков // Материалы второй Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы:
фундаментальные, экологические и клинические аспекты»/ - Новосибирск, 2004. - С. 414 415.
3. Юшков Б.Г. Роль надпочечников в формировании аутопротезов для ангиопластики / Б.Г. Юшков, В.А. Черешнев, Н.В. Тюменцева, Д.И. Крохин, В.В. Ходаков, С.Ю. Медведева // Вестник Уральской медицинской академической науки. – Екатеринбург, 2004. - № 3. – С.57-60.
4. Юшков Б.Г. Влияние гормонов надпочечников на формирование аутопротезов для сосудистой пластики / Б. Г. Юшков, Н. В. Тюменцева // Фундаментальные науки – медицине.
Тезисы докладов. - М.- 2004.- С.201-203.
5. Данилова И.Г. Целесообразность использования иммуномодулятора тамерит при репаративных процессах различных тканей / И.Г. Данилова, Б.Г. Юшков, М.Т. Абидов, Н.В.
Тюменцева // Russian Journal of Immunology. – 2004. - Т.9, № 1. – С. 239.
6. Ходаков В.В. Экспериментальное обоснование метода получения аутопротезов для артерий / В.В. Ходаков, Д.И. Крохин, С.Ю. Медведева, Б.Г. Юшков, Н.В. Тюменцева // Хирургия. – 2005. - № 9. – С. 10-13.
7. Тюменцева Н.В. Аутопротезы в пластике сосудов / Н.В. Тюменцева, Д.И. Крохин, Б.Г. Юшков // Материалы международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». – Тюмень, 2005. – С. 263.
8. Тюменцева Н.В. Роль стимуляторов и ингибиторов макрофагов в формировании аутопротезов для ангиопластики / Н.В. Тюменцева, Д.И. Крохин // Материалы IX итоговой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке”. – Киров, 2005. – С. 54.
9. Крохин Д.И. Метод получения сосудистых протезов для ангиопластики / Д.И.
Крохин, Н.В. Тюменцева // Материалы IX итоговой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке».
– Киров, 2005. – С. 17.
10. Черешнев В.А. Роль функциональной активности системы фагоцитирующих мононуклеаров в формировании аутопротезов для ангиопластики / В.А. Черешнев, Н.В.
Тюменцева, Б.Г. Юшков, И.Г. Данилова, В.В. Ходаков, Д.И. Крохин, С.Ю. Медведева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2005. – Т.140, № 8. – С. 186-188.
11. Тюменцева Н.В. Особенности внутрибрюшинного формирования сосудистых аутопротезов для ангиопластики / Н.В. Тюменцева, Д.И. Крохин // Тезисы докладов X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2005. – С. 263.
12. Тюменцева Н.В. Влияние гепатэктомии на формирование сосудистых аутопротезов для ангиопластики / Н. В. Тюменцева, Д. И. Крохин // Материалы XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». Санкт-Петербург, 2005. – С. 79-81.
13. Тюменцева Н.В. Сравнение соединительнотканных протезов для ангиопластики, полученных в организме крыс и кроликов / Н.В. Тюменцева, Б.Г. Юшков, Д.И. Крохин, В.В.
Ходаков, С.Ю. Медведева // Бюллетень Сибирской медицины. – Т.4. - Приложение 1. – Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда. – Томск: СибГМУ. – 2005. - С. 22.
14. Тюменцева Н.В. Особенности формирования аутопротезов для ангиопластики у разных животных / Н.В. Тюменцева, Б.Г. Юшков, К.В. Мерсаидов, В.В. Ходаков // Материалы научной конференции молодых ученых «Современные методы диагностики и лечения заболеваний в клинике и в эксперименте”. – М., 2005. – С. 462-463.
15. Тюменцева Н.В. Новый метод получения сосудистых аутопротезов для ангиопластики / Н.В. Тюменцева, Б.Г. Юшков, Д.И. Крохин, В.В. Ходаков // Научные труды 1-ого съезда физиологов СНГ. – Дагомыс, 2005. – Т.2. – С. 153-154.
16. Тюменцева Н.В. Возможность стимуляции формирования сосудистых аутопротезов препаратом «Тамерит» / Н.В. Тюменцева, Д.И. Крохин // Вестник молодых ученых: Приложение к серии науки о жизни: Материалы Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». – СПб., 2005. – С. 122.
17. Юшков Б.Г. Система гемопоэза и морфогенез / Б.Г. Юшков, В.А. Черешнев, Н.В.
Тюменцева, О.С. Арташян, А И. Кузьмин // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2005. - № 4. – С. 226-229.
18. Юшков Б.Г. Способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей / Б.Г.
Юшков, В.В. Ходаков, Н.В. Тюменцева, Д.И. Крохин, М.А. Ранцев // Бюллетень.
Изобретения. Полезные модели. - 2005. – Ч.3, № 26. – С. 423.
19. Юшков Б.Г. Стволовые клетки и сосудообразование / Б.Г. Юшков, Н.В.
Тюменцева, В.А. Черешнев, А.И. Кузьмин // Вестник Уральской медицинской академической науки: Приложение: Материалы Международной конференции “Эмбрион человека как клинический и лабораторный объект”. – Екатеринбург, 2005. - С. 43.
20. Тюменцева Н.В. Особенности формирования соединительнотканных аутопротезов у разных видов животных / Н.В. Тюменцева, Р.К. Гафарова // Тезисы докладов XI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2006. - С. 245.
21. Юшков Б.Г. Стволовые клетки и сосудообразование / Б.Г. Юшков, Н.В.
Тюменцева, Д.С. Ослина, В.Г. Климин, А.И. Кузьмин, Р.К. Гафарова // Вестник Уральской медицинской академической науки. – Екатеринбург, 2006. - № 1. – С. 132-134.