Взаимодействие сигнальной системы оксида азота cо сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии– реперфузии печен
На правах рукописи
Шупик Мария Александровна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ОКСИДА АЗОТА CО СФИНГОМИЕЛИНОВЫМ ЦИКЛОМ И ПЕРОКСИДНЫМ ОКИСЛЕНИЕМ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ТОКСИЧЕСКОГО СИГНАЛА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА В УСЛОВИЯХ ИШЕМИИ– РЕПЕРФУЗИИ ПЕЧЕНИ 03.01.02 – биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва, 2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, Алесенко Алиса Владимировна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Куроптева Зоя Вениаминовна доктор биологических наук, профессор, Манухина Евгения Борисовна
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» (ФГБУ РКНПК) Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г.
Москва
Защита состоится « » 2012 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук (ИБХФ РАН) по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им.
Н.Н. Семенова Российской академии наук (ИХФ РАН).
С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ИБХФ РАН www.ibcp.chph.ras.ru.
Автореферат разослан « » 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Л.И. Мазалецкая
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Оксид азота (NO) проявляет исключительное многообразие биологических функций, проникая через плазматические мембраны, и участвует в передаче межклеточных сигналов как вторичный посредник в составе внутриклеточных эффекторных систем, например, при проведении сигнала запрограммированной клеточной гибели – апоптоза. В зависимости от ряда условий NO проявляет двойственные свойства в отношении процесса апоптоза. Критической детерминантой про- либо антиапоптотической роли NO являются его концентрация, источник и тип клеток. Биохимический механизм, лежащий в основе про- и антиапоптотических свойств NO, определяется пересечением многих сигнальных систем, участвующих в проведении сигнала апоптоза с поверхности клеточной мембраны в ядро. Особое значение при реализации программы апоптоза играет взаимодействие сигнальной системы NO и сфингоминлинового цикла (СФМ-цикл).
СФМ-цикл, а именно изменение активности его ферментов – сфингомиелиназ (СФМаз) и последующая генерация плейотропного медиатора – церамида являются ключевыми событиями ряда патофизиологичексих процессов в клетке, таких как клеточная гибель, пролиферация и дифференцировка. Функциональная взаимосвязь между сигнальными системами NO и СФМ-цикла определяется также общей субклеточной локализацией ферментов синтеза NO, NO-синтаз (NOS), и присутствием церамида и СФМаз в структурных элементах плазматической мембраны – кавеолах и рафтах. Полная характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия сигнальных путей NO/NOS и церамид/СФМазы, могла бы способствовать пониманию их места в сложной сети других сигнальных систем и способов контроля процессов апоптоза, дифференцировки и воспаления.
Активность сигнальных систем NO/NOS и церамид/СФМаза модулируется окислительным статусом клетки. В условиях окислительного стресса NO и O2.– образуют пероксинитрит, который является очень сильным оксидантом. Активность СФМаз также находится под контролем про- и антиоксидантных систем. Известно, что N-СФМаза активируется Н2О2 и ингибируется глутатионом. Церамид вызывает дисфункцию митохондрий и индуцируют окислительный стресс. Взаимосвязь между окислительной системой и СФМ-циклом, существующая в живых клетках, вносит существенный вклад в развитие апоптоза при кислород-зависимых патологиях, включая ишемические повреждения.
Поскольку сигнальные системы NO и СФМ-цикла активируются провоспалительными цитокинами, в первую очередь фактором некроза опухоли альфа (TNF-), что сопровождается индукцией окислительного стресса, то естественным представляется изучение не только двух систем, NO и СФМ-цикла, но и их зависимости от активации окислительных процессов и экспрессии TNF-.
Наиболее адекватной моделью для изучения последовательности активации и взаимосвязи этих двух сигнальных систем с уровнем продуктов ПОЛ и накоплением TNF- является экспериментальная ишемия и последующая реперфузия.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было показать наличие взаимосвязи сигнальной системы NO со СФМ-циклом и ПОЛ в норме и при проведении токсического сигнала TNF- в условиях ишемии–реперфузии печени.
В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние соединений-доноров NO: динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), нитрозоглутатиона (GSNO) и нитрита натрия (NaNO2) на изменения параметров СФМ-цикла (активность СФМаз, уровень сфингомиелина (СФМ) и церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов.
2. На модели ишемии-реперфузии печени определить изменения в содержании NO в зависимости от сроков ишемии и последующей реоксигенации.
3. Исследовать характер активности СФМаз и параметры ПОЛ (диеновые конъюгаты) в зависимости от длительности периодов ишемии и реперфузии.
4. Изучить изменения содержания TNF- в зависимости от сроков ишемии реперфузии.
5. Изучить влияние TNF- на параметры СФМ-цикла (активность N-СФМазы и концентрацию церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.
6. Изучить влияние церамида на уровень TNF- и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.
7. Исследовать состояние ДНК в ишемизированной печени и при реперфузии.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Между сигнальными системами NO и СФМ-цикла в организме животных (печень мышей) существует взаимосвязь: соединения-доноры NO: ДНКЖ, GSNO и NaNO2 влияют на параметры СФМ-цикла (активность N-СФМазы, уровень СФМ и церамида) в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов, при этом наблюдается зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла от механизма освобождения NO из его доноров: ДНКЖ и GSNO, непосредственно содержащие NO в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние сроки после их введения животным, а NaNO2, механизм образования NO из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл только через несколько часов после инъекции.
2. Существует корреляция между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введения доноров NO, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.
3. Ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания NO в печени, наиболее выраженного при реперфузии.
В процессе ишемии–реперфузии наблюдается образование 4.
провоспалительного цитокина TNF-, которое опережает изменения уровня содержания NO в печени.
5. Существует взаимное влияние TNF- и параметров СФМ-цикла: TNF модулирует активность N-СФМазы и приводит к образованию церамида и продуктов ПОЛ, а продукт СФМ-цикла, церамид, вызывает накопление TNF- и продуктов ПОЛ в печени мышей.
6. При реперфузии наблюдается активация СФМ-цикла и ПОЛ и высокое содержание TNF- и NO. В этих условиях развивается апоптоз, что подчркивает взаимосвязь сигнальных систем NO, TNF- и СФМ-цикла, в результате чего наблюдается совместный эффект этих сигнальных систем, приводящий к гибели клеток ишемизированного органа.
Научная новизна. Впервые проведено исследование in vivo влияния доноров NO: ДНКЖ, GSNO и NaNO2 на СФМ-цикл. Показано, что введение животным доноров NO приводит к изменениям параметров СФМ-цикла в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов. Обнаружена корреляция между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров NO, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.
Впервые методом ЭПР-спектроскопии с использованием спиновой ловушки показано, что ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания NO, наиболее выраженного при реперфузии. При этом показано, что накопление провоспалительного цитокина TNF опережает изменения уровня содержания NO в печени.
Показано наличие взаимного влияния TNF- и компонентов СФМ-цикла в организме животных (печень мышей).
На фоне резкого повышения уровня NO и TNF- при реперфузии ишемизированной печени наблюдается активация СФМ-цикла, сопровождающаяся развитием окислительного стресса и апоптоза.
Научно-практическая значимость. Результаты исследования имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания механизмов регуляции дифференцировки, пролиферации, апоптоза клеток в норме и при кислород зависимых патологиях при участии сигнальных систем NO, СФМ-цикла и ПОЛ.
Обнаруженная нами взаимосвязь этих сигнальных систем свидетельствует о возможности влияния на клеточные процессы, находящиеся под контролем NO, путем воздействия на СФМ-цикл и ПОЛ. Например, активаторы и ингибиторы ключевых ферментов СФМ-цикла – кислой и нейтральной СФМаз – могут оказывать существенное влияние на эффективность терапии, направленной на восстановление печени, подвергнутой ишемии-реперфузии.
Предложен механизм проведения апоптотического сигнала при ишемии реперфузии печени, заключающийся в накоплении TNF- и последующей активации СФМ-цикла и повышении концентрации NO, которые совместно индуцируют апоптоз в клетках печени. Таким образом, полученные нами данные могут быть использованы в медицине при разработке тактики лечения ряда заболеваний, связанных с патологией ишемии-реперфузии, таких как инсульт, инфаркт, атеросклероз, а также при трансплантации органов с использованием препаратов нового поколения на основе ингибиторов СФМ-цикла.
Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им Н.М.Эмануэля РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ института, а также поддержана грантами “Фундаментальные науки - медицине” и РФФИ № 02-04 48228.
Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.
Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 3 статьях и 13 тезисах.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 121 стр., включая рисунка и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, глав “Обзор литературы”, “Результаты и обсуждение” и “Заключение”, выводов, списка сокращений и библиографического указателя (203 источника, из них 189 опубликованы в зарубежных изданиях).
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Объекты, материалы и методы исследования Основным предметом исследования являлись оксид азота, фактор некроза опухоли альфа, сфингомиелиназа и липиды, выделенные из печени животных.
Активность СФМаз измеряли по методу (Hostetler et al., 1979) c использованием N-метил-[14С]-сфингомиелина. Радиоактивность определяли на счетчике «Delta» (Нидерланды).
Содержание белка в гомогенате определяли по методу (Lowry et al., 1951).
Низкомолекулярную ДНК выделяли и анализировали методом горизонтального электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле по методу (Herrmann et al., 1994).
Липиды экстрагировали из печени по методу (Bligh and Dyer, 1959), их количество определяли гравиметрически.
Липидный состав изучали методом ВЭТСХ на пластинках фирмы «Merck» (Германия) с последующим денситометрированием.
Идентификацию TNF- проводили с помощью ECL-иммуноблоттинга, используя поликлональные антитела производства фирмы «Santa Cruz» (США), специфически связывающиеся с TNF- крысы и мыши.
Идентификацию NO проводили на ЭПР-спектрометре Е-109E фирмы «Varian» (США) при СВЧ мощности 10 мВт, СВ частоте 9.32 ГГц, амплитуде высокочастотной модуляции магнитного поля 0.2 мТл при частоте 100 кГц. Уровень NO в ткани печени определяли с использованием спиновой ловушки, компоненты которой вводили животным путем инъекций диэтилдитиокарбамата натрия (ДЭТК-Na) (620 мг/кг в мл физраствора интраперитонеально) и FeSO47H2O c цитратом Na (25 и 125 мг/кг соответственно, в 1 мл физраствора подкожно в область левого бедра).
Работа с животными. В работе использовали мышей линии С57 black и крыс линии Wistar, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище.
Ишемию печени, захватывающую 40% органа, проводили на крысах.
Срединная лапаратомия была проведена под наркозом (внутривенное введение бриетала в дозе 50 мг/кг). В качестве контроля использовали печень ложнооперированных животных.
ДНКЖ, GSNO и NaNO2 в 15 мМ Hepes буфере pH 7.4 вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 1.5, 7.5 и 15.0 мг/кг. Контрольным животным вводили 15 мМ Hepes буфер pH 7.4.
С2-церамид («Biomol», CША) растворяли в 5% растворе этанола и вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 2.5 и 5.0 мг/кг. Контрольным животным вводили 5% раствор этанола.
Рекомбинантный TNF- растворяли в изотоническом растворе NaCl и вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 5.0 мг/кг. Контрольным животным вводили изотонический раствор NaCl.
Обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6.1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при *р0.05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.
2. Результаты исследования 2. 1. Изучение влияния соединений-доноров NO на показатели СФМ-цикла (активность N-СФМазы, содержание СФМ и церамида) и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей NO является важным посредником в ряде физиологических и патологических процессов, таких как апоптоз, вазорелаксация, воспаление. Действие NO в клетке происходит при взаимодействии с другими внуктриклеточными мессенджерными молекулами и их генерирующими ферментами, в том числе, со СФМ-циклом.
На культурах клеток, в том числе гепатоцитов, показано, что соединения доноры NO могут оказывать влияние на СФМ-цикл. В зависимости от типа клеток и концентрации NO способен как активировать СФМ-цикл (активировать N-СФМазу, вызывать накопление церамида, понижать содержание СФМ), так и ингибировать СФМ-цикл (ингибировать N-СФМазу, понижать содержание церамида, повышать концентрацию СФМ). Также, в зависимости от чувствительности клеток к NO и/или их функционального состояния, NO способен как вызывать окислительный стресс, так и проявлять антиоксидантные свойства. На момент выхода наших работ данных литературы о воздействии NO в организме животных на СФМ-цикл представлено не было. В качестве соединений-доноров могут выступать S-нитрозотиолы (RS-NO) и динитрозильные комплексы негемового железа ((RS)2Fe(NO)2), образование которых непосредственно в живых клетках и тканях подтверждено рядом научных работ.
Поэтому в своей работе мы использовали источники NO экзогенной природы – ДНКЖ, GSNO и NaNO2.
Влияние ДНКЖ на СФМ-цикл. ДНКЖ вводили мышам внутрибрюшинно в дозах 1.5, 7.5 и 15.0 мг/кг. При введении ДНКЖ в дозе 1.5 мг/кг показатели СФМ цикла не меняются (рис.1А-С, кривые 1). При введении ДНКЖ в дозах 7.5 и 15. мг/кг обнаружено дозозависимое обратимое ингибирование параметров СФМ-цикла – снижение активности N-СФМазы, увеличение содержания СФМ и понижение содержания церамида в печени мышей.
ДНКЖ в дозе 7.5 мг/кг снижает активность N-СФМазы на 20% через 15-30 мин после инъекции. Спустя 60 мин активность фермента повышается до уровня близкого к показателям нормы, а через 120-240 мин - совпадает с контрольными значениями (рис.1А, кривая 2). При введении этой дозы ДНКЖ содержание СФМ в ходе эксперимента повышается на 20-25% в течение 15-30 мин, а затем постепенно снижается на сроки 60-120 мин и через 240 мин достигает параметров контроля (рис.1В, кривая 2). Количество церамида в клетках печени после введения ДНКЖ в дозе 7.5 мг/кг уменьшается через 30-60 мин и нормализуется спустя 120-240 мин (рис.1С, кривая 2).
ДНКЖ в дозе 15.0 мг/кг снижает активность N-СФМазы на 30% через 15- мин после введения препарата. Через 60-120 мин активность фермента на 20% ниже нормы, а спустя 240 мин соответствует показателям контроля (рис.1А, кривая 3).
Уровень СФМ при этом повышен в течение 15-60 мин, достигает наибольшего увеличения – на 40% спустя 30 мин и через 120-240 мин стремится к контрольным значениям (рис.1В, кривая 3). Содержание церамида уменьшается на 20-25% в течение 15-60 мин, максимально – на 25% через 30 мин после инъекции ДНКЖ, и нормализуется спустя 120-240 мин (рис.1С, кривая 3).
А В Сфингомиелин, % от контроля 1 ДНКЖ 1.5 мг / кг 100 Активность сфингомиелиназы, 2 ДНКЖ 7.5 мг / кг 2 3 ДНКЖ 15.0 мг / кг % от контроля 1 ДНКЖ 1.5 мг / кг 2 ДНКЖ 7.5 мг / кг 3 ДНКЖ 15.0 мг / кг 0 30 60 90 120 150 180 210 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения ДНКЖ, мин Время после введения ДНКЖ, мин С Ц е р а м и д, % от контроля 1 ДНКЖ 1.5 мг / кг 2 ДНКЖ 7.5 мг / кг 3 ДНКЖ 15.0 мг / кг 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения ДНКЖ, мин Рис.1. Влияние ДНКЖ на активность N-СФМазы (А), содержание СФМ (В) и церамида(С) в печени мышей.
Влияние GSNO на СФМ-цикл. В физиологических условиях в организме животных происходит образование нитрозотиолов, соединений, рассматриваемых в настоящее время как основное депо NO в клетках млекопитающих, а GSNO – из них наиболее стабилен. Роль GSNO в качестве донора NO может быть различной. В литературе имеются данные о том, что при такой кислород-зависимой патологии как астма, в зависимости от дозы GSNO является либо цитопротекторным агентом, либо триггером апоптоза и окислительного стресса.
В нашей работе GSNO вводили внутрибрюшинно в дозах 1.5, 7.5 и 15.0 мг/кг.
Введение GSNO в дозе 1.5 мг/кг не влияет на показатели СФМ-цикла (рис.2А-С, кривые 1). При введении GSNO в дозах 7.5 и 15.0 мг/кг этот донор NO, как и ДНКЖ, дозозависимо и обратимо ингибирует СФМ-цикл: снижает активность N-СФМазы, увеличивает содержание СФМ и понижает содержание церамида в печени мышей.
GSNO в дозе 7.5 мг/кг снижает активность N-СФМазы на 20-25% через 15- мин после инъекции, а через 120-240 мин активность фермента равна контрольными значениями (рис.2А, кривая 2). Содержание СФМ в ходе эксперимента повышается на 20-30% в течение 15-30 мин, а затем постепенно снижается на сроки 120-240 мин и через 240 мин достигает параметров контроля (рис.2В, кривая 2). Количество церамида уменьшается в течение 30-60 мин, и нормализуется спустя 120-240 мин (рис.2С, кривая 2).
GSNO в два раза большей концентрации, 15.0 мг/кг, снижает активность N СФМазы до 50% уже через 15 мин после введения препарата. Через 30-60 мин активность фермента на 30% ниже нормы, через 120 мин – на 20%, а спустя 240 мин соответствует показателям контроля (рис.2А, кривая 3). Уровень СФМ при этом повышен на 20-60% в течение 15-120 мин, и достигает наибольшего увеличения – на 60% через 30 мин эксперимента;
через 240 мин количество СФМ близко к контрольным значениям (рис.2В, кривая 3). Содержание церамида уменьшается на 20-30% в течение 30-60 мин, максимально – на 30% через 30 мин после инъекции GSNO, и нормализуется спустя 120-240 мин (рис.3С, кривая 3).
А В Сфингомиелин, % от контроля 1 Активность сфингомиелиназы, 1 GSNO 1.5 мг / кг 2 GSNO 7.5 мг / кг 2 3 GSNO 15.0 мг / кг % от контроля 3 60 1 GSNO 1.5 мг / кг 2 GSNO 7.5 мг / кг 3 GSNO 15.0 мг / кг 40 0 30 60 90 120 150 180 210 240 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения GSNO, мин Время после введения GSNO, мин С Ц е р а м и д, % от контроля 70 GSNO 1.5 мг / кг GSNO 7.5 мг / кг 3 GSNO 15.0 мг / кг 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения GSNO, мин Рис.2. Влияние GSNO на активность N-СФМазы (А), содержание СФМ (В) и церамида (С) в печени мышей.
Влияние NaNO2 на СФМ-цикл. NaNO2 вводили мышам в дозах 5.0 и 15. мг/кг. Введение NaNO2 в дозе 5.0 мг/кг не оказывает влияния на показатели СФМ цикла (рис.3А-С, кривые 1). Введение NaNO2 в дозе 15.0 мг/кг, как и ДНКЖ и GSNO, ингибирует СФМ-цикл, но оказывает заметное действие в концентрациях в 2 раза больших, чем ДНКЖ и GSNO, и на более поздние сроки – начиная с 120 мин после инъекции препарата (рис.3А-С, кривые 2).
Через 120-240 мин после инъекции животным NaNO2 в дозе 15.0 мг/кг активность N-СФМазы понижается на 20% (рис.3А, кривая 2), концентрация СФМ увеличивается на 20 % (рис.3В, кривая 2), а содержание церамида имеет тенденцию к понижению (рис.3С, кривая 2).
А В Активность сфингомиелиназы, Сфингомиелин, % от контроля 1 NaNO2 5.0 мг / кг 2 NaNO2 15.0 мг / кг % от контроля 60 1 NaNO2 5.0 мг / кг 2 NaNO2 15.0 мг / кг 50 0 30 60 90 120 150 180 210 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения NaNO2, мин Время после введения NaNO2, мин С Церамид, % от контроля 1 NaNO2 5.0 мг / кг 2 NaNO2 15.0 мг / кг 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения NaNO2, мин Рис.3. Влияние NaNO2 на активность N-СФМазы (А), содержание СФМ (В) и церамида (С) в печени мышей.
Влияние доноров NO на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей. Анализ содержания продуктов ПОЛ показывает дозозависимое понижение уровня содержания диеновых конъюгатов в печени мышей при введении животным соединений-доноров NO.
ДНКЖ и GSNO вводили внутрибрюшинно в дозах 1.5, 7.5 и 15.0 мг/кг.
Инъекция ДНКЖ (рис.4А, кривая 1) и GSNO (рис.4В, кривая 1) в дозе 1.5 мг/кг не влияет на показалели ПОЛ. Ведение ДНКЖ и GSNO в дозах 7.5 и 15.0 мг/кг вызывает понижение содержания продуктов ПОЛ в печени мышей.
ДНКЖ в дозе 7.5 мг/кг снижает уровень диеновых конъюгатов в 1.2 раза через 15-30 мин, затем, в течение 60-240 мин показатели ПОЛ стремятся к контрольным значениям (рис. 4А, кривая 2). ДНКЖ в дозе 15.0 мг/кг снижает уровень диеновых конъюгатов в 1.5 раза через 15-30 мин, в 1.2-1.3 раза через 60-120 мин, спустя 120- мин показатели ПОЛ равны контрольным значениям (рис.4А, кривая 3).
GSNO в дозе 7.5 мг/кг снижает уровень диеновых конъюгатов в 1.2 раза через 15-30 мин, после 120-240 мин эксперимента результаты измерений близки к показателям нормы (рис.4В, кривая 2). GSNO в дозе 15.0 мг/кг снижает уровень диеновых конъюгатов в 1.5 раза через 15 мин, в 1.3 раза через 30-60 мин, а спустя 120-240 мин показатели ПОЛ стремятся к уровню контрольных значений (рис.4В, кривая 3).
NaNO2 вводили мышам в дозах 5.0 и 15.0 мг/кг. Введение NaNO2 в дозе 5. мг/кг не оказывают влияния на показатели ПОЛ (рис.4С, кривая 1). Введение NaNO2 в дозе 15.0 мг/кг ингибирует процессы ПОЛ, но оказывает заметное действие в концентрациях в 2 раза больших, чем ДНКЖ и GSNO, и понижает уровень показателей ПОЛ в 1.2 раза на более поздние сроки – начиная с 120 мин после инъекции препарата (рис.4С, кривая 2).
Следует отметить однонаправленность изменений активности N-СФМазы и параметров ПОЛ при введении доноров NO, которая характеризуется высокими коэффициентами линейной корреляции и подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.
А В Диеновые конъюгаты, Диеновые конъюгаты, нм/мг липидов нм/мг липидов 1 1 GSNO 1.5 мг / кг 1 ДНКЖ 1.5 мг / кг 15 2 GSNO 7.5 мг / кг 2 ДНКЖ 7.5 мг / кг 3 GSNO 15.0 мг / кг 3 Д Н К Ж 15. 0 м г / к г 0 30 60 90 120 150 180 210 240 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения ДНКЖ,мин Время после введения GSNO, мин С Диеновые конъюгаты, нм/мг липидов 1 NaNO2 5.0 мг / кг 2 N a N O 2 15. 0 м г / к г 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения NaNO2, мин Рис.4. Влияние ДНКЖ (А), GSNO (В) и NaNO2 (С) на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.
Изучение влияния TNF- на показатели СФМ-цикла (активность N 2.2.
СФМазы и содержание церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей В настоящее время показано, что TNF- участвует в реализации иммунного клеточного ответа, влияет на пролиферацию, рост и дифференцировку клеток и способен индуцировать гибель клеток, как путем некроза, так и апоптоза. При этом в ряде исследований было продемонстрировано как цитотоксическое, так и цитопротекторное действие TNF-. Подавляющее большинство экспериментов по изучению способности химических соединений вызывать апоптоз, активировать ПОЛ и СФМ-цикл проводятся на клеточных моделях. Показано, что провоспалительные цитокины, в том числе TNF-, индуцируют образование АФК, продуктов ПОЛ и церамида во многих типах клеток, а фармакологическое ингибирование АФК в некоторых случаях позволяет предотвратить активацию СФМ-цикла.
Влияние TNF- на показатели СФМ-цикла: активность N-СФМазы и содержание церамида в печени мышей. В нашей работе рекомбинантный TNF в дозе 5.0 мг/кг вводили мышам внутрибрюшинно. Через 120-240 мин после инъекции TNF- активность N-СФМазы повышается на 40-60 % (рис.5А). На фоне повышения активности N-СФМазы уровень содержания церамида в печени увеличивается на те же сроки, максимально – на 50 % через 240 мин после начала эксперимента (Рис.5В).
А В 180 Церамид, % от контроля Активность сфингомиелиназы, 140 % от контроля 100 TNF- 5.0 мг/кг TNF- 5.0 мг/кг 60 0 30 60 90 120 150 180 210 240 0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения TNF-, мин Время после введения TNF-, мин Рис.5. Влияние TNF- на активность N-СФМазы (А) и содержание церамида (В) в печени мышей.
Влияние TNF- на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей. Анализ содержания продуктов ПОЛ показывает увеличение уровня диеновых конъюгатов в 1.3 раза через 30 мин и в 1.3-1.5 раз через 120-240 мин после введения TNF- в дозе 5.0 мг/кг (рис.6), что подтверждает данные in vitro о развитии окислительного стресса под воздействием TNF-.
Подавление первой волны ПОЛ (через 30 мин) может объясняться способностью TNF- активировать синтазы NO. Активация NOS приводит к образованиию NO, который может проявлять антиоксидантные свойства и, Диеновые конъюгаты, как мы показали, подавлять процессы ПОЛ.
нм/мг липидов Таким образом, наши результаты показывают, что TNF- способен активировать СФМ-цикл и окислительный стресс в печени in vivo.
TNF- 5.0 мг/кг Рис.6. Влияние TNF- на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.
0 30 60 90 120 150 180 210 Время после введения TNF-, мин Изучение влияния церамида на содержание TNF- и интенсивность 2.3.
процессов ПОЛ в печени мышей Предполагая возможность взаимного влияния TNF-, компонентов СФМ-цикла и продуктов ПОЛ, мы, помимо изучения воздействия TNF- на СФМ-цикл и ПОЛ, исследовали влияние токсического продукта СФМ-цикла, церамида, на накопление в печени мышей провоспалительного цитокина TNF- и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты).
Влияние церамида на содержание TNF- в печени мышей.
Внутрибрюшинное введениие церамида в дозе 2.5 мг/кг (50 мкг/мышь) приводит к повышению содержания TNF- в печени животных через 8 и 16 ч после введения препарата в 2.2 и 1.9 раза соответственно (рис.7). Через 24 ч после начала эксперимента количество TNF- приближается к контрольным значениям.
Введение церамида в дозе 5.0 мг/кг (100 мкг/мышь) приводит к интенсификации образования TNF- на все изученные нами сроки – 8, 16, 24 ч. Через 8 ч после введения препарата содержание TNF- достигает значений, превышающих TNF-, % от контроля контрольные в 2.4 раза. Через 18 и 24 ч содержание TNF- повышено в 2.0 и 1.8 раз соответственно (рис.7). Таким образом, показано, что церамид способен самостоятельно индуцировать экспрессию в печени животных при TNF внутрибрюшинном введении.
церамид 2.5 мг / кг церамид 5.0 мг / кг Рис.7. Влияние церамида на содержание 0 8 16 TNF- в печени мышей.
В р е м я п о с л е в в е д е н и я ц е р а м и д а, ч а с ы Влияние церамида на интенсивность процессов ПОЛ в печени мышей. В условиях, в которых было изучено изменение содержания TNF- в печени мышей при введении церамида в дозе 2.5 и 5.0 мг/кг веса (50 и 100 мкг на животное), определено содержание продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) через 8, 18, 24 ч.
Введение церамида в дозе 2.5 мг/кг повышает уровень продуктов ПОЛ.
Максимально – в 1.5 раза через 18 ч (рис.8). Церамид в дозе 5.0 мг/кг, вызывает достоверное повышение содержания диеновых конъюгатов в печени в 1.5 раза уже через 8 ч. Через 18 и 24 ч уровень продуктов ПОЛ повышен в 1.8 и 1.5 раза соответственно (рис.8). Таким образом, мы Диеновые конъюгаты, показали, что церамид способен индуцировать ПОЛ и накопление TNF- в нм/мг липидов печени животных. Можно предположить, что образование церамида, индуцируемое TNF-, приводит к увеличению содержания самого TNF-, который, в свою очередь, вызывает накопление церамида за счет церамид 2.5 мг / кг 20 церамид 5.0 мг / кг активации СФМ-цикла.
0 8 16 Рис.8. Влияние церамида на интенсивность В р е м я п о с л е в в е д е н и я ц е р а м и д а, ч а с ы процессов ПОЛ в печени мышей.
2.4. Изучение содержания TNF-, продуктов ПОЛ, NO и активности СФМаз при ишемии–реперфузии печени Ишемия или кислородное голодание тканей наблюдается при инфаркте миокарда и инсульте, при оперативных вмешательствах на печени и других органах.
Поражение тканей происходит из-за гибели клеток по механизму апоптоза.
Сигнальные пути, по которым ишемия и последующая реперфузия вызывают апоптоз, могут включать секрецию TNF-, NO, инициацию ПОЛ и СФМ-цикла.
Однако эти сигнальные системы в зоне ишемии изучались раздельно и преимущественно на клетках сердца, мозга и почек. Чтобы понять механизм ишемических повреждений, как в процессе прекращения кровотока, так и при последующем его восстановлении, крайне актуальным является анализ изменений параметров всех сигнальных систем, участвующих в этих процессах, и последовательности их включения, что позволит, в конечном счете, проводить более грамотную и эффективную терапию ишемизированного органа.
Определение содержания TNF- при ишемии–реперфузии. В наших экспериментах методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител показано, что в печени крыс, подвергнутых ложной операции, количество TNF практически не детектируется. Однако уже после 15 мин ишемии количество TNF возрастает и составляет 2.5 пг/мг белка, а через белка 60 мин ишемии его содержание практически удваивается (рис.9). Вероятно, такое быстрое пг/мг накопление TNF- в ишемизированной доле печени происходит в связи с тем, что он не, транспортируется кровью в этих условиях в TNF другие органы.
0 15 30 45 Рис.9. Изменение содержания TNF- при Время ишемии, мин ишемии печени.
При 5, 15 и 30 мин реперфузии печени, перенесшей 30 мин ишемию, содержание TNF- в зоне ишемии экстремально увеличивается на все сроки реперфузии – почти в два раза по сравнению с ишемизированной печенью (рис.10А).
Реперфузия доли печени, подвергнутой ишемии в течение 60 мин, также сопровождается ростом содержания TNF-, которое практически не отличается от показателей, наблюдаемых в процессе реперфузии печени, подвергнутой менее длительной, 30 мин ишемии (рис.10В).
А В 5, TNF-, пг/мг белка TNF-, пг/мг белка 5, 5, 5, 4,5 4, 4, 4, 4, 3, 4, 3, 4, 2, 3, 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 Время реперфузии Время реперфузии после 60 мин ишемии, мин после 30 мин ишемии, мин Рис.10. Изменение содержания TNF- при реперфузии печени после 30 (А) и 60 (В) мин ишемии.
Определение содержания диеновых конъюгатов при ишемии–реперфузии.
Изменение содержания продуктов ПОЛ отражает изменения в балансе про- и антиоксидантных систем в ишемизированном органе. На все сроки ишемии– реперфузии нами показано увеличение содержания продуктов ПОЛ в 1.2-1.5 раза.
Наибольших значений концентрация диеновых конъюгатов достигает через 30 мин ишемии (рис.11А). Снижение содержания продуктов ПОЛ через 60 мин ишемии печени по сравнению с 30 мин ишемией может определяться различными причинами, например, истощением субстратов окисления (полиненасыщенных жирных кислот) и недостатком кислорода.
А В Диеновые конъюгаты, Диеновые конъюгаты, реперфузия после 30 мин ишемии нмоль/мг белка реперфузия после 60 мин ишемии нмоль/мг белка контроль 2 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 Время ишемии, мин Время реперфузии, мин Рис.11. Изменение содержания продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) при ишемии (А) и реперфузии (В) печени крыс.
Реперфузия печени, перенесшей 30-мин ишемию, приводит к нормализации показателей ПОЛ уже через 30 мин после восстановления кровотока. В то же время после длительной ишемии (60 мин) наблюдается стабильный рост количества диеновых конъюгатов (рис.11В) на все сроки реперфузии.
Наиболее значительное превышение содержания продуктов ПОЛ (в 1.8-2. раза) отмечено через 60 мин после восстановления кровотока в доли печени, подвергнутой длительной ишемии (60 мин) (рис.11В). Следует отметить, что 60 мин ишемия печени вызывает резкие токсические явления, которые приводят к высокой смертности животных (до 80%). По-видимому, накопление продуктов ПОЛ при реперфузии длительно ишемизированного органа, в котором развиваются необратимые процессы, отражает именно это обстоятельство.
Определение содержания NO при ишемии–реперфузии. Рядом исследователей показано изменение активности ферментов, продуцирующих NO, и повышение содержания нитритов и нитратов в клетках и органах, подвергнутых ишемии–реперфузии.
В своих опытах на модели ишемии–реперфузии печени мы детектировали образование непосредственно NO методом ЭПР-спектроскопии. Нами показано, что содержание NO в печени увеличивается в течение 30-60 мин ишемии и составляет 20 40 нмоль/мг ткани, что превышает показатели нормы в 1.5-2.0 раза (рис.12А).
В процессе реперфузии содержание NO резко возрастает, в 2-5 раз при 15- мин реперфузии после 30 мин ишемии, и достигает семикратного увеличения через 60 мин реперфузии после 60 мин ишемии (рис.12В).
А В 50 реперфузия после 30 мин ишемии ткани NO, нмоль/мг ткани реперфузия после 60 мин ишемии контроль NO, нмоль/мг 0 15 30 45 60 0 10 20 30 40 50 Время реперфузии, мин Время ишемии, мин Рис.12. Изменение содержания NO при ишемии (А) и реперфузии (В) печени.
Изменение активности СФМаз при ишемии–реперфузии. Рядом исследователей показана роль компонентов СФМ-цикла при кислород-зависимых патологиях, в том числе при ишемии–реперфузии сердца и мозга. В наших экспериментах было изучено изменение активности A- и N-СФМаз в доле печени с ишемией в течение 15, 30 и 60 мин и последующей реперфузией этой доли печени от 15 до 60 мин.
Изменение активности N-СФМазы при ишемии–реперфузии. 15-ти мин ишемия не изменяет активность N-СФМазы, однако нарушение кровоснабжения органа на более длительные сроки – 30 и 60 мин – приводит к падению активности фермента в 1.4 раза (рис.13А). После 30 мин ишемии восстановление кровотока возвращает показатели активности N-СФМазы к норме уже через 15 мин, и далее – в течение 30 и 60 мин реперфузии уровень активности фермента соответствует контрольным значениям (рис.13В).
Иная картина наблюдается после 60 мин ишемии. После 60 мин ишемии и мин реперфузии активность N-СФМазы также нормализуется, или незначительно превышает показатели нормы, однако через 30 и 60 мин реперфузии после 60 мин ишемии активность N-СФМазы повышается в 1.2 раза (рис.13В).
А В Активность N-СФМазы, Активность N-СФМазы, 800 имп/мин/мг белка имп/мин/мг белка 550 реперфузия после 30 мин ишемии 450 реперфузия после 60 мин ишемии контроль 0 15 30 45 0 10 20 30 40 50 Время реперфузии, мин Время ишемии, мин Рис.13. Изменение активности N-СФМазы при: ишемии (А) и реперфузии печени после 30 и 60 мин ишемии (В).
Изменение активности A-СФМазы при ишемии–реперфузии. Характер зависимости активности A-СФМазы от сроков ишемии не такой как у N-СФМазы.
Активность A-СФМазы в зоне ишемии снижается в два раза только в течение 30 мин, а через 60 мин ишемии превышает контрольные значения в 1.4 раза (рис.14А). После 30 мин ишемии реперфузия не вызывает нормализацию активности фермента, ее значения остаются стабильно ниже нормы, на уровне 30 мин ишемии (рис.14В).
После длительной, 60-мин, ишемии, восстановление кровотока также приводит к ингибированию активности A-СФМазы уже через 15 мин, а также далее – спустя 30 и 60 мин реперфузии (рис.14В).
А В Активность A-СФМазы, Активность A-СФМазы, реперфузия после 30 мин ишемии имп/мин/мг белка имп/мин/мг белка 280 реперфузия после 60 мин ишемии 260 контроль 0 15 30 45 0 10 20 30 40 50 Время реперфузии, мин Время ишемии, мин Рис.14. Изменение активности А-СФМазы при: ишемии (А) и реперфузии печени после 30 и 60 мин ишемии (В).
Определение деградации ДНК при ишемии–реперфузии. Для анализа состояния ДНК, изолированной из доли печени, подвергнутой длительной ишемии (60 мин) и последующей реперфузии в течение 15, 30 и 60 мин, был проведен электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле. Мы обнаружили, что в ишемизированном органе после 60 мин ишемии ДНК все еще стабильна, однако ее разрушение начинается сравнительно быстро после реперфузии. Спустя 60 мин реперфузии фрагменты ДНК представляют собой типичную апоптотическую “лестницу” (рис.15).
1 - контроль 2 - ишемия 60 мин 3 - ишемия 60 мин + репрефузия 15 мин 4 - ишемия 60 мин + репрефузия 30 мин 5 - ишемия 60 мин + репрефузия 60 мин Рис.15. Деградация ДНК при ишемии–реперфузии печени.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Механизмы, по которым ишемия и последующая реперфузия вызывают апоптоз, могут включать секрецию TNF-, накопление продуктов ПОЛ и активацию сигнальных систем NO и СФМ-цикла. СФМ-цикл взаимодействует с другими сигнальными системами, такими, как система генерации активных форм кислорода, в том числе NO. Особое значение во взаимодействии NO со СФМ-циклом играет провоспалительный цитокин TNF-, поскольку он способен модулировать как активность ферментов, синтезирующих NO, так и активность СФМаз, индуцирующих СФМ-цикл. В свою очередь, продукты реакции этих ферментов, NO и церамид, влияют на экспрессию TNF-. Кроме того, окислительный стресс и накопление продуктов ПОЛ, вызываемые TNF-, являются основным звеном его цитотоксического действия. Пересечение во времени этих событий может привести к усилению проапоптотического сигнала, индуцируемого каким-либо фактором, в нашем случае, ишемией и последующей реперфузией. В связи с этим задачей нашего исследования явилось изучение сигнальных систем NO, СФМ-цикла и ПОЛ в норме и при проведении токсического сигнала TNF- при патологии ишемии–реперфузии.
В настоящее время в литературе появились доказательства зависимости активности СФМаз от уровня NO. Исследования, проведенные на клеточных культурах, показали, что NO в зависимости от концентрации и типа клеток способен как вызывать апоптоз, генерацию церамида и активировать СФМазы, так и ингибировать процесс апоптоза и блокировать синтез церамида. В свою очередь, церамид может повышать уровень экспрессии ферментов, продуцирующих NO, активировать их, приводить к накоплению нитритов и нитратов во внутриклеточной среде, или, наоборот, ингибировать NOS.
В нашей работе впервые исследовалось влияние доноров NO на СФМ-цикл в организме животных. Соединения-доноры NO: ДНКЖ, GSNO и NaNO2 в диапазоне исследованных концентраций ингибируют СФМ-цикл и ПОЛ в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов. Изменения параметров СФМ цикла (активность N-СФМазы, уровень СФМ и церамида) определяются механизмом освобождения NO из его доноров: ДНКЖ и GSNO, непосредственно содержащие NO в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние, уже через 15 мин, сроки после их введения животным, а NaNO2, механизм образования NO из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл и ПОЛ только через 2 ч после инъекции.
Ранее при ишемии параметры СФМ-цикла и содержание NO и TNF исследовали раздельно и в фиксированные сроки, преимущественно на клетках сердца, мозга и почек. Однако ни в одном из опубликованных исследований не проводилось комплексное изучение характера поведения сигнальных систем NO, СФМ-цикла, ПОЛ и TNF- при индукции апоптоза в условиях ишемии печени и последующей ее реперфузии у животных. В наших экспериментах установлено, что при ишемии печени первым значимым событием является накопление TNF- уже через 15 мин после прекращения кровотока. Эти данные согласуются с данными экспериментов, проведенных на сердце и мозге, что ишемические повреждения сопровождаются повышением содержания TNF-. Изменения содержания NO и активности СФМаз в печени происходят только спустя 30 мин после начала ишемии.
При изучении изменения активности СФМаз в ишемизированной печени и после ее реперфузии мы обнаружили резкое снижение активности N-СФМазы на сроках ишемии 30-60 мин и ее резкий рост при реперфузии. A-СФМаза на начальные сроки ишемии (15 и 30 мин) ингибируется, а после 60 мин ишемии ее активность возрастает, превышая контрольный уровень в 1.8 раза. При последующей реперфузии активность этой изоформы фермента резко падает. То есть, при ишемии печени до мин, при которой выживают все животные, снижена активность как N-СФМазы, так и A-СФМазы, а после 60 мин ишемии, когда гибнет 80 % животных, A-СФМаза активирована. По-видимому, на ранних сроках ишемии возможна защитная реакция организма, способная ингибировать активность СФМаз, в результате чего не происходит накопление критического уровня церамида. Это предположение находится в соответствии с нашими данными по введению животным доноров NO, которые показывают, что в исследованных концентрациях NO ингибирует активность N-СФМазы и снижает уровень церамида в печени. При длительной, 60 мин ишемии, когда активирована одна из изоформ СФМазы (A-СФМаза), вероятность накопления проапоптического уровня церамида резко увеличивается, особенно при реперфузии, когда наблюдается активация и другой изоформы фермента (N-СФМазы). В этих условиях уровень церамида является достаточным для проведения сигнала апоптоза, в ходе которого погибает часть поврежденных клеток при реперфузии после 60 мин ишемии, что мы видим в своих экспериментах, анализируя состояние ДНК.
Накопление TNF- происходит как при ишемии, так и после реперфузии, однако деградация ДНК по типу апоптотической лестницы наблюдается только при реперфузии после 60 мин ишемии, когда активируется N-СФМаза, что приводит к накоплению проапоптотических агентов СФМ-цикла, и происходит резкое повышение содержания NO. В процессе реперфузии содержание NO резко возрастает, в 2-5 раз при 15-30 мин реперфузии после 30 мин ишемии, и достигает семикратного увеличения через 60 мин реперфузии после 60 мин ишемии.
Для понимания механизма взаимодействия TNF- и СФМ-цикла при индукции апоптоза большое значение имеют наши данные о влиянии церамида на экспрессию TNF- в печени. Так, мы показали, что церамид вызывает накопление TNF- в печени животных. Эти данные дают возможность предположить, что образование церамида, индуцируемое эндогенным TNF- в ишемизированной печени, может приводить к генерации новых порций TNF-, который вновь, активируя СФМазу, приводит к накоплению церамида. Когда уровень церамида достигает критических значений, события в клетке завершаются апоптозом. Именно этот процесс возможен в ишемизированной печени после реперфузии. По такой же схеме могут взаимодействовать церамид и NO в высоких концентрациях, который также индуцирует накопление церамида, а церамид, в свою очередь, индуцирует синтез NO.
Активация при ишемии всех систем, связанных с усиленной генерацией церамида, на наш взгляд, является основным условием, при котором клетки печени входят в апоптоз в условиях ишемии–реперфузии.
Большой вклад в развитие ишемических повреждений вносят окислительные процессы в липидах. Ранее нами и другими исследователями была показана связь активности СФМ-цикла с окислительным статусом клеток. В своей работе мы обнаружили корреляцию между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введения соединений-доноров NO, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.
Наши результаты демонстрируют, что пусковым механизмом апоптоза при ишемии–реперфузии может быть накопление в ишемизированном органе TNF-, который индуцирует накопление NO. Эти события активируют СФМазу, которая расщепляет СФМ до проапоптотического агента церамида. Чтобы уровень церамида достиг критических значений, содержание NO и TNF- должно быть высоким, особенно в процессе реперфузии, когда наблюдается деградация ДНК. В свою очередь, церамид, генерируемый при ишемии, способен поддерживать, и даже увеличивать содержание NO и TNF-. То есть, в критических условиях в клетке возможен активный процесс обратной регуляции. Верятнее всего, именно он имеет место при вхождении клеток в апоптоз. Чтобы этот лавинообразный процесс остановить, необходимо прекратить генерацию церамида, то есть, ингибировать активность СФМаз.
Предложенный нами механизм индукции апоптоза в условиях ишемии– реперфузии печени позволяет рассмотреть новые препараты для предупреждения ишемических повреждений, как при пересадке донорской печени, так и при хирургических вмешательствах на печени. Такими новыми препаратами могут выступить ингибиторы СФМаз. Блокирование СФМ-цикла не позволит развиваться апоптозу даже при наличии высокого содержания TNF-, который не способен самостоятельно вызывать апоптоз клеток печени. В то время как церамид индуцирует апоптоз во многих типах клеток даже в отсутствии TNF-. Поэтому в ишемизированном органе необходимо, в первую очередь, ингибировать активность СФМаз, которые участвуют в генерации индукторов апоптоза.
Автор выражает искреннюю благодарность проф. А.В. Алесенко, проф. А.Ф.
Ванину и д.б.н. Л.Б. Дудник за постоянное внимание и поддержку при проведении настоящей работы, а также м.н.с. Е.С. Мочаловой за помощь в проведении экспериментов.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ NO – оксид азота СФМаза – сфингомиелиназа NOS – синтаза оксида азота A-СФМаза – кислая сфингомиелиназа ДНКЖ – динитрозильные комплексы железа N-СФМаза – нейтральная сфингомиелиназа GSNO – нитрозоглутатион ПОЛ – пероксидное окисление липидов СФМ-цикл – сфингомиелиновый цикл TNF- – фактор некроза опухоли альфа СФМ – сфингомиелин АФК – активные формы кислорода ВЫВОДЫ 1. Показано наличие взаимосвязи между сигнальными системами NO и СФМ цикла в организме животных (печень мышей). Введение доноров NO: ДНКЖ, GSNO и NaNO2 приводит к ингибированию СФМ-цикла в зависимости от дозы и времени прошедшего после введения препаратов. При этом наблюдается зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла (активность N-СФМазы, уровень СФМ и церамида) от механизма освобождения NO из его доноров: ДНКЖ и GSNO, непосредственно содержащие NO в своей структуре, ингибируют параметры СФМ цикла на ранние, уже через 15 мин, сроки после их введения животным, а NaNO2, механизм образования NO из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл только через 2 ч после инъекции.
2. Обнаружена корреляция между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров NO, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.
3. Ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания NO в печени, наиболее выраженного при реперфузии.
В процессе ишемии–реперфузии наблюдается образование 4.
провоспалительного цитокина TNF-, которое опережает изменения уровня содержания NO в печени.
5. Показано наличие взаимного влияния TNF- и компонентов СФМ-цикла в организме животных (печень мышей). Внутрибрюшинное введение TNF модулирует активность N-СФМазы, приводит к накоплению проапоптотического агента церамида и продуктов ПОЛ. В свою очередь, продукт СФМ-цикла, церамид вызывает накопление в печени TNF- и продуктов ПОЛ.
6. На фоне резкого повышения уровня NO и TNF- при реперфузии ишемизированной печени наблюдается активация СФМ-цикла, сопровождающаяся развитием окислительного стресса. В этих условиях развивается апоптоз, что подчркивает взаимосвязь сигнальных систем NO, TNF- и СФМ-цикла, в результате чего наблюдается совместный эффект этих сигнальных систем, приводящий к гибели клеток ишемизированного органа.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Алесенко А.В., Гальперин Э.И., Дудник Л.Б., Мочалова Е.С., Платонова Л.В., Шингарова Л.Н., Шоно Н.И., Шупик М.А. Роль фактора некроза опухоли альфа и активации сфингомиелинового цикла в индукции апоптоза в условиях ишемии/реперфузии печени // Биохимия. 2002. Т. 67. № 12. С. 1932-1643.
2. Alessenko A.V., Shupik M.A., Bugrova A.E., Dudnik L.B., Shingarova L.N., Mikoyan V.D., Vanin A.F. The relation between sphingomyelinase activity, lipid peroxide oxidation and NO-releasing in mice liver and brain // FEBS Lett. 2005. Vol. 579(25). P.
5571-5576.
3. Шупик М.А., Ванин А.Ф., Алесенко А.В. Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии // Биохимия. 2011. Т.76. № 11. С. 1489-1504.
4. Шупик М.А., Алесенко А.В., Микоян В.Д., Ванин А.Ф. Связь сигнальных систем оксида азота и сфингомиелиновго цикла в индукции апоптоза при ишемии/реперфузии печени // В сб. трудов Международной конференции “Биохимическая физика, ИБХФ РАН-ВУЗы”, 9-11 ноября, 2009, Москва;
Изд-во ООО “еПолиграф”. С. 268-270.
5. Алесенко А.В., Шупик М.А. Взаимодействие оксида азота с сигнальной системой сфингомиелинового цикла и окислением липидов в печени мышей // В сб.:
“Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии”, 2011. С. 157-161.
6. Алесенко А.В., Дудник Л.Б., Платонова Л.В., Шупик М.А., Гальперин Э.И.
Активация сигнальных систем сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов в ишемизированной/реперфузированной печени // Тез. докл. III Съезда биохимического общества. С.-Петербург, 2002. С. 424.
7. Алесенко А.В., Дудник Л.Б., Мочалова Е.С., Шупик М.А., Гальперин Э.И.
Взаимодействие сигнальных систем сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов, индуцируемых фактором некроза опухоли альфа, в условиях ишемии/реперфузии печени // Тез. докл. VI Международной конф.
“Биоантиоксидант”, Москва, 2002. С. 30.
8. Шупик М.А., Дудник Л.Б., Ванин А.Ф., Алесенко А.В. Влияние доноров NO на уровень пероксидных продуктов окисления липидов, генерируемых при апоптозе, индуцированном ЦГИ в печени крыс // Там же. С. 639-640.
9. Alessenko A.V., Dudnik L.B., Mochalova E.S., Shupik M.A., Galperin E.I. The signal transduction pathways by which ischemia-reperfusion leads to apoptosis involve TNF- secretion, sphingomyelinase activation and initiation of lipid peroxidation // ЕASL Conference, Madrid, (Spain), 2002. Р. 44.
10. Shupik M.A., Dudnik L.B., Vanin A.F., Alessenko A.V. Influence of nitric oxide donors on the sphingomyelinase activity, accumulation of lipid peroxidation products and DNA degradation in mice liver // EASL Сonference, Madrid (Spain), 2002. Р. 24.
11. Shupik M.A., Alessenko A.V. Role of lipid peroxidation, TNF-a accumulation and activation of sphingomyelin cycle in apoptosis, induced by reperfusion of ischemic liver // Physiological Society Spring Workshop “Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress”, April 3-5, 2003, Budapest (Hungary). Р. 55.
12. Шупик М.А., Алесенко А.В., Микоян В.Д., Ванин А.Ф. Связь сигнальных систем оксида азота и сфингомиелиновго цикла в индукции апоптоза при ишемии/реперфузии печени // Международная молодежная конференция “Биохимическая физика, ИБХФ РАН-ВУЗы”, 9-11 ноября, 2009, Москва.
13. Шупик М.А. Фактор некроза опухолей - индуктор сигнальных систем оксида азота и сфингомиелинового цикла в процессе ишемии/реперфузии печени крыс // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов 2010”, 12-15 апреля, 2010, Москва. С. 69.
14. Shupik M.A., Alessenko A.V. Influence of NO-donors on the sphingomyelinase activity and accumulation of lipid peroxide products in mice liver // 8th International Sphingolipid Club Meeting, 30 June-4 July, 2010, Glasgow (UK). Р. 46.
15. Шупик М.А., Алесенко А.В., Ванин А.Ф., Микоян В.Д. Взаимодействие сигнальных систем оксида азота и сфингомеилинвого цикла при ишемии-реперфузии // Международная конференция “Успехи химической физики”, 21-23 июня, 2011, Черноголовка. С. 216.
16. Alessenko A.V., Shupik M.A. Cross-communication between nitric oxide generation, activation of sphingomyelin cycle pathway and lipid peroxidation in mice liver // XIX Intern. Conference “New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology”, 31 May-9 June, 2011, Gurzuf (Ukraine).