Иммунологические показатели при экспериментальном моделировании генерализованных инфекций
На правах рукописи
Букин Евгений Константинович ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИНФЕКЦИЙ 03.00.06 – вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Кольцово – 2008
Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Игнатьев Георгий Михайлович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна доктор биологических наук Таранин Александр Владимирович
Ведущая организация:
ГУ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва)
Защита состоится « 23 » мая 2008 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559;
тел. (8-383) 336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Автореферат разослан « » апреля 2008 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Карпенко Л.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В течение длительного времени разработка средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний носила эмпирический характер. Лишь последние достижения иммунологии позволили сформулировать общие принципы создания иммунобиологических препаратов. В частности, экспертами Комитета по биологической стандартизации ВОЗ рекомендовано проводить разработку средств вакцинопрофилактики инфекций в тесной взаимосвязи с изучением иммунопатогенеза заболевания [Capron et al., 1994]. Имея сведения об особенностях патогенеза изучаемой нозологии, можно вести прицельный поиск терапевтических агентов, влияющих на ключевые патологические звенья заболевания. В связи с этим доклинические испытания вакцин необходимо осуществлять на адекватной экспериментальной модели заболевания, имитирующей основные патофизиологические звенья заболевания у человека. Данный подход подразумевает установление общих закономерностей изменения неспецифических и специфических факторов иммунитета у иммунизированных животных не только в ходе вакцинального процесса, но и после заражения [Игнатьев, 2003]. Без этого нельзя решить принципиальный вопрос: исследуемый препарат неэффективен при данной инфекционной патологии или выбранная экспериментальная модель непригодна для тестирования иммунобиологических препаратов.
Экспериментальные и клинические исследования показывают, что в ответ на внедрение инфекционного агента организм отвечает универсальной, генетически запрограммированной реакцией, реализующейся в виде воспаления. Существуют сложные механизмы регуляции воспаления, но ведущая роль в поддержании гомеостаза отводится системе цитокинов [Черешнев и др., 2001].
Цитокины – главные сигнальные молекулы иммунной системы, модулирующие активность её клеток, определяющие активацию врождённого и формирование адаптивного иммунного ответа. В зависимости от превалирующей способности активировать или подавлять развитие воспалительной реакции цитокины подразделяются на провоспалительные и противовоспалительные. В последнее время появились убедительные данные о том, что клинический исход инфекции во многом зависит от баланса продукции про-/противовоспалительных медиаторов [Черешнев и др., 2001;
Bidwell et al., 1999;
Dinarello, 2001;
Feldmann et al., 2004;
Rice et al., 2005]. Кроме того, при системной активации цитокины воздействуют на ткани и органы, не вовлечённые в инфекционный процесс. В этом случае медиаторы вместо защитной функции оказывают повреждающее действие, что наблюдается при генерализованных формах инфекционных заболеваний. Для генерализованных инфекций характерно развитие синдрома системного воспалительного ответа (SIRS – systemic inflammatory response syndrome), концепцию которого разработал R.C.Bone [Bone et al., 1992;
Bone, 1996;
Bone et al., 1997].
SIRS – это манифестация определённых клинико-лабораторных критериев, свидетельствующих об активации цитокиновой сети и комплекса функционально связанных клеток (система фагоцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов, лимфоцитов). Следовательно, изучение реакции цитокиновой системы играет важную роль для оценки адекватности используемой экспериментальной модели и исследования влияния испытываемых препаратов на течение генерализованных инфекций.
Данный подход мы применили для изучения иммунопатогенеза некоторых генерализованных бактериальных и вирусных инфекций, для которых ранее были разработаны экспериментальные модели на мышах линии BALB/c.
Среди возбудителей кишечных инфекций человека следует выделить энтерогеморрагическую E.coli О157:Н7, которая вызывает развитие гемолитико-уремического синдрома (ГУС), являющегося ведущей причиной острой почечной недостаточности у детей [Karch et al., 2005]. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что ГУС – системная патология, связанная с активацией цитокинового каскада [Ochoa et al., 2003]. Существующие средства терапии E.coli О157:Н7 инфекции малоэффективны, поэтому разработка вакцин для профилактики заболевания остаётся актуальной задачей. В настоящий момент все исследованные вакцинные препараты оказались неэффективными, но в ходе испытаний стала ясна протективная роль мукозального иммунитета [Li et al., 2000;
Lovett, 1998]. Поэтому в качестве кандидатной вакцины нами был предложен препарат EHEC CIP O157:H7, полученный по технологии ghosts. Препарат представляет собой бактериальную стенку со всеми поверхностными антигенами в нативной форме, что возможно благодаря контролируемой экспрессии гена Е фага fX174 в культуре бактерий [Lubitz et al., 1999;
Szostak et al., 1996], и способен индуцировать мукозальный иммунитет [Jalava et al., 2003].
Первоначально развитие SIRS ассоциировали с бактериальными инфекциями, но подобный феномен системной активации системы цитокинов встречается и при ряде вирусных заболеваний. В первую очередь это относится к вирусным геморрагическим лихорадкам, в т.ч. и лихорадке Денге, вызываемой представителем сем. Flaviviridae – вирусом Денге (ВД). Заболевание является наиболее значимой арбовирусной инфекцией человека: только по официальным данным ежегодно регистрируется свыше 50 миллионов случаев лихорадки, и летальность при тяжёлых формах заболевания достигает 20% [WHO, 2002]. Несмотря на громадную значимость лихорадки Денге, до сих пор не создано средств специфической профилактики и лечения инфекции. Это диктует необходимость поиска патогенетических средств терапии заболевания.
Ведущим патогенетическим событием при развитии лихорадки Денге является усиление проницаемости сосудистого русла, обусловленного «цитокиновым штормом» и нарушением кадгеринового комплекса эндотелия [Schnittler et al., 2003]. Изменение структуры кадгеринового комплекса возникает в результате его взаимодействия с b-цепью фибрина, включающего аминокислотные остатки с 15 по 42-ой (Bb15-42) [Bach et al., 1998]. Показано, что синтетический олигопептид Bb15-42 (препарат FX-06) при моделировании на животных острого нарушения коронарного кровообращения оказывал протективный эффект на сосуды [Petzelbauer et al., 2005].
Несколько позднее была установлена способность препарата ингибировать системную продукцию провоспалительных цитокинов [Zacharowski et al., 2007]. Совокупность этих данных послужила основой для изучения влияния препарата FX-06 на течение экспериментальной ВД-инфекции.
Не менее значимым представителем сем. Flaviviridae является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который остаётся ведущей причиной нейроинфекций в Евразии [Burke et al., 2001;
Gresikova et al., 1997]. Вирусный КЭ, в отличие от лихорадки Денге, протекает преимущественно с поражением центральной нервной системы, но при ряде летальных случаев, вызванных новыми субтипами вируса, отмечалось развитие геморрагического синдрома [Ternovoi et al., 2003]. Подобно лихорадке Денге, при вирусном КЭ генерализация инфекции так же сопровождается системной гиперпродукцией ряда цитокинов, что подтверждено экспериментально [Игнатьев и др., 2003] и клиническими наблюдениями [Тимофеев и др., 2002;
Atrasheuskaya et al., 2003]. В настоящее время наблюдается эволюция данной природно-очаговой инфекции: изменение клинической картины заболевания, случаи инфекции среди иммунизированных людей, что, вероятно, связано с проникновением в эндемичные регионы новых субтипов вируса и индивидуальными особенностями иммунного реагирования [Иерусалимский, 2001].
В связи с этим необходим тщательный анализ клинических и экспериментальных данных для решения практической задачи оценки прогноза развития и исхода инфекции КЭ, оценки протективности существующих вакцин. В частности, представляется целесообразным определение общих закономерностей развития иммунного ответа у вакцинированных животных после заражения.
В связи с этим целью работы являлось изучение иммунологических показателей при генерализованных инфекционных заболеваниях на моделях бактериальной (энтерогеморрагическая Escherichia coli O157:H7) и вирусных (вирус клещевого энцефалита и вирус лихорадки Денге) инфекций, выявление общих факторов иммунопатогенеза и использование новых подходов для оценки профилактических и лечебных препаратов.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
1. Выявление особенностей иммунного ответа у мышей линии BALB/c при экспериментальном моделировании E.coli O157:H7 инфекции.
2. Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата EHEC CIP O157:H7 ghosts при парентеральной и мукозальной иммунизации мышей BALB/c по показателям неспецифического и специфического иммунитета.
3. Сравнительное изучение системной продукции цитокинов, динамики гуморального и клеточного иммунитета после заражения вирусом клещевого энцефалита интактных мышей BALB/c и мышей, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита.
4. Исследование динамики гематологических показателей и системной продукции цитокинов при моделировании у мышей BALB/c экспериментальной лихорадки Денге.
5. Оценка влияния синтетического фрагмента молекулы фибрина Bb15-42 (препарат FX-06) на течение экспериментальной вирусной лихорадки Денге.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые продемонстрирована способность препарата EHEC CIP 105282 ghosts индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ в эксперименте. Показано, что мукозальная иммунизация мышей данным препаратом обеспечивает формирование протективного иммунитета к заражению гетерологичным штаммом E.coli O157:H7.
Впервые показано, что применение препарата FX-06 (синтетического деривата молекулы человеческого фибрина) оказывает терапевтический эффект при экспериментальном моделировании лихорадки Денге на мышах. Полученные данные могут лечь в основу для дальнейшей разработки патогенетических средств терапии вирусной лихорадки Денге у людей.
В результате проделанной работы при моделировании E.coli O157:H7 инфекции и флавивирусных инфекций была показана возможность динамического мониторинга системного уровня цитокинов для определения тяжести течения и прогнозирования исхода инфекционного процесса, оценки эффективности вакцин и терапевтических препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Цитокиновая реакция при моделировании E.coli O157:H7 инфекции на мышах линии BALB/c соответствует системной продукции некоторых цитокинов (ФНО-a, ИЛ-1b, ИЛ-6 и ИЛ-10) при патологии, обусловленной E.coli O157:H7, у людей.
2. Препарат EHEC CIP 105282 ghosts стимулирует специфический гуморальный, в том числе мукозальный, и клеточный иммунный ответ. Мукозальная иммунизация препаратом EHEC CIP 105282 ghosts превосходит по иммуногенным и протективным свойствам парентеральный способ иммунизации.
3. Динамика и концентрация сывороточных цитокинов у интактных мышей BALB/c и иммунизированных вакциной клещевого энцефалита после заражения вирусом клещевого энцефалита достоверно отличаются.
4. Динамика изменения гематологических показателей и реакция цитокиновой системы при заражении мышей BALB/c адаптированным штаммом вируса Денге 2-го серотипа соответствуют данным характеристикам при вирусной лихорадке Денге у человека.
5. Показана возможность патогенетической терапии экспериментальной лихорадки Денге с помощью синтетического фрагмента молекулы фибрина Bb15-42.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Nice, April 1-4, 2006);
Молекулярная диагностика инфекционных болезней (Минск, 17-18 мая года). По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, в том числе три в реферируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы (26 источников на русском языке и 253 – на английском). Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и рисунков.
Список использованных сокращений: в/б – внутрибрюшинно, в/м – внутримышечно, ВД – вирус лихорадки Денге, ГУС – гемолитико-уремический синдром, ИЛ – интерлейкин, ИФА – иммуноферментный анализ, ИФН- – интерферон-гамма, КЭ – клещевой энцефалит, ЛПС – липополисахариды, ОСО – отраслевой стандартный образец, ОТ-ПЦР – обратная транскрипция – полимеразная цепная реакция, РБТ – реакция бласттрансформации, ФНО- – фактор некроза опухолей альфа, EHEC – энтерогеморрагическая E.coli, CARS – compensatory anti-inflammatory response syndrome (синдром компенсаторного противовоспалительного ответа), SIRS – systemic inflammatory response syndrome (синдром системного воспалительного ответа).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы Животные. В работе были использованы сосунки и 4-6-недельные самцы мышей линии BALB/c (гаплотип H-2d). Животные содержались на стандартном рационе с достаточным количеством воды.
Бактериальные препараты. Энтерогеморрагическая E.coli серотипа O157:H7 (штамм CIP 103571, получен из коллекции Института Пастера, Франция). Количество жизнеспособных бактерий в суспензии и в биологических образцах определялось методом подсчёта колоний, образуемых на агаризованной среде Луриа-Бертани. Проверка принадлежности культуры E.coli к серогруппе O осуществлялась с помощью латексного агглютинационного набора E.coli O157 Latex Test (Oxoid Ltd., Англия) согласно инструкции производителя.
Препарат EHEC CIP 105282 ghosts был любезно предоставлен профессором Werner Lubitz (University of Vienna, Австрия).
Вирусные препараты. В работе использовали вирус КЭ (штамм Absettarov) и вирус Денге 2-го серотипа (ВД-2, номер депонента в музее вирусов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» – V345, номер доступа в GenBank – AY927231), ранее адаптированный к мышам линии BALB/c [Atrasheuskaya et al., 2003].
Инфекционную активность вирусных суспензий определяли методом титрования на 4-недельных самцах мышей линии BALB/c при в/б заражении животных. Расчёт активности производили методом Кербера в модификации Ашмарина-Воробьёва [Ашмарин и др., 1962].
Вакцины КЭ. В работе использованы ОСО иммуногенности вакцин КЭ (№ 42-28-48-04П, МИД50 0,007/мл) и культуральная очищенная концентрированная инактивированная сухая вакцина КЭ (серия №884, на основе штамма 205) производства ФГУП НИИПВЭ.
Препарат FX-06 – синтетический олигопептид (GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR), содержащий N-концевой участок b-цепи молекулы фибрина человека (Bb15-42), был любезно предоставлен профессором Peter Petzelbauer (Medical University of Vienna, Австрия).
Диагностическая ОТ-ПЦР для обнаружения РНК вируса КЭ проводилась по ранее описанному протоколу [Годовикова и др., 1994]. Наличие РНК ВД-2 в исследуемом образце осуществляли двухраундовой ОТ-ПЦР с использованием праймеров, структура которых была рассчитана на основании имеющихся в базе GenBank последовательностей ВД с помощью программы OligoScan v. 3.0, разработанной и любезно предоставленной д.б.н. К.М.Чумаковым (Laboratory of Methods Development, FDA, США).
Исследование продукции специфических антител в сыворотке крови и образцах кишечных смывов осуществлялось методом твердофазного ИФА. В качестве специфических антигенов были использованы препарат EHEC CIP 105282 ghosts и вирусные антигены, полученные методом сахарозно-ацетоновой экстракции из мозга инфицированных сосунков мышей.
Исследование показателей клеточного иммунитета проводилось определением числа -IFN продуцирующих спленоцитов в ответ на стимуляцию специфическими антигенами с помощью коммерческого набора «ELISpot mouse IFN-g» (R&D; Systems, Inc., Minneapolis, США) в соответствии с инструкцией производителя. Параллельно оценивалась пролиферация спленоцитов фотометрическим методом по ранее описанной методике [Scudiero et al., 1988].
Концентрация сывороточных цитокинов измерялась на иммуноферментных тест-системах производства «R&D; Systems» (Minneapolis, США) в соответствии с инструкцией производителя.
Определение гематологических показателей (количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и величины гематокрита) проводили на гематологическом анализаторе Cell–Dyn (Sequoia-Turner corporation, США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Определение концентрации фибриногена в плазме крови проводилось спектрофотометрически по модифицированной методике Wycoff [Wycoff, 1960].
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., 2001). В зависимости от эксперимента, были использованы непараметрические (критерий c2, точный критерий Фишера) и параметрические (дисперсионный анализ) критерии сравнения. Для оценки степени взаимосвязи между показателями рассчитывался ранговый коэффициент корреляции Спирмена (). Расчёт кривых выживаемости проводился моментным методом Каплана-Мейера. Для сравнения кривых выживаемости использовался логранговый критерий.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение иммуногенных и протективных свойств препарата EHEC CIP 105282 ghosts 1.1 Свойства препарата EHEC CIP 105282 ghosts при пероральном и парентеральном способе иммунизации. Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата EHEC CIP ghosts проводилась на мышах линии BALB/c. Было выбрано несколько схем иммунизации, которые представлены в таблице 1.
Таблица Характеристика групп мышей в эксперименте по изучению свойств препарата EHEC CIP Количество Кратность Группа Препарат Путь введения Протективность,% мышей иммунизации 70 0 сутки 86, A EHEC CIP 105282 пероральный (1мг, соответствует 4,8х109 0 и 28 сутки 93, B микробных клеток, в 0 сутки 40, C 70 мкл фосфатно-солевого внутримышечный буфера) 0 и 28 сутки 46, D фосфатно-солевой буфер 0 сутки 26, E пероральный (30 мкл) 0 и 28 сутки 30, F Введение исследуемого препарата, так же как и применение плацебо, не вызывало видимых изменений в поведении животных. На 55-е сутки после первой иммунизации все мыши были интрагастрально заражены гетерологичным, по отношению к вакцинному препарату, штаммом CIP 103571 E.coli O157:H7 (108КОЕ/мышь). Перед заражением исследование фекалий мышей во всех группах на наличие E.coli серогруппы O157 дало отрицательный результат. Наблюдение за животными осуществлялось на протяжении 21 суток после инфицирования. С 4-х суток наблюдали внешние проявления инфекции: снижение двигательной активности и реакции на внешние раздражители, отказ от корма, перед гибелью у большинства мышей отмечались судороги. Гибель животных наблюдалась до 10-х суток. После заражения у мышей группы А и В выделение возбудителя с испражнениями происходило с 1 по 3-и сутки, в то время как в группах, иммунизированных в/м и плацебо, бактерия в фекалиях обнаруживалась в течение 7 суток. Следует отметить, что в крови у мышей контрольных групп на 5 и 6-е сутки после инфицирования выявили присутствие E.coli серогруппы О157. У мышей, иммунизированных препаратом EHEC CIP 105282, развитие бактериемии не было обнаружено.
Лучший протективный эффект был достигнут у животных, иммунизированных per os.
Достоверных различий между показателями выживаемости мышей, иммунизированных в/м, и контрольных групп выявлено не было (c2=2,32;
p=0,128).
В ходе эксперимента проводилось исследование формирования специфического гуморального иммунитета как системного, так и мукозального (рис. 1). Во всех группах продукция специфических IgG в кишечном тракте была ниже порога чувствительности метода.
Сывороточные IgG A Log2(1/титр) B C D 2 E 0 F 0 7 14 21 28 35 42 49 57 64 Сывороточные IgA A Log2(1/титр) B C D E F 0 7 14 21 28 35 42 49 57 64 IgA в кишечных смывах IgA/суммарные IgA A обратный титр B C D E F 0 7 14 21 28 35 42 49 57 64 сутки от начала эксперимента Рис. 1 Динамика формирования гуморального иммунитета у мышей BALB/c при пероральной (группы А и В) и в/м иммунизации (группы С и D) препаратом EHEC CIP 105282 ghosts (1мг/мышь) и последующего заражения гетерологичным штаммом E.coli O157:H7 (на 55-е сутки, интрагастрально, 108КОЕ/мышь). Е и F – контрольные группы. Результат представлен как среднее показателей у мышей ± стандартное отклонение.
Системный IgG-ответ формировался как при пероральном, так и парентеральном введении EHEС CIP 105282. Однако только введение препарата per os индуцировало продукцию специфических IgA в сыворотке и кишечном тракте. Системный и мукозальный IgA-ответ у иммунизированных в/м, так же как и у контрольных животных (группа Е и F), формировался только после заражения.
Оценка формирования клеточного иммунитета у мышей проводилась еженедельно после иммунизации EHEС CIP 105282 и на 2, 9, 16-е сутки после заражения гетерологичным штаммом E.coli O157:H7. Достоверный прирост показателей пролиферативной активности спленоцитов при стимуляции антигенами E.coli O157:H7, определяемый в РБТ, у иммунизированных мышей отмечался уже на 14-е сутки: индекс стимуляции составлял 1,40±0,10 (показатели у интактных мышей – 1,04±0,08, р=0,0082). При этом динамика показателей пролиферативной активности спленоцитов не зависела от способа иммунизации. Установлено, что увеличение индекса стимуляции на 49-е сутки у животных, иммунизированных двукратно (1,62±0,12 и 1,60±0,14 в группе В и D соответственно), по сравнению с показателями на 28-е сутки (1,46±0,10 и 1,42±0,12 в группе В и D соответственно), было недостоверно (p0,05). У мышей контрольных групп индекс стимуляции достигал максимальных значений (1,20±0,10) на 16-е сутки после заражения, но статистически не отличался от исходных показателей пролиферативной активности спленоцитов (р=0,097).
Независимо от РБТ спленоцитов, формирование специфического клеточного ответа оценивалось в тесте ELISpot по количеству спленоцитов, продуцирующих ИФН- в ответ на стимуляцию антигенами E.coli O157:H7. Динамика показателей теста была аналогична показателями РБТ: формирование пула антиген-специфических лимфоцитов отмечалось на 14-е сутки после иммунизации препаратом EHEС CIP 105282, в контрольных группах достоверное увеличение количества -ИФН-подуцирующих спленоцитов не наблюдалось даже после заражения.
Важно отметить, что во всех группах мышей на протяжении всего эксперимента пролиферативный ответ спленоцитов при стимуляции Т-клеточным митогеном (конканавалином А) сохранялся на постоянном уровне (индекс стимуляции – 2,26±0,18). Это подтверждает отсутствие у препарата EHEС CIP 105282 иммуносупрессивного действия. Кроме того, показатели РБТ и ELISpot теста при стимуляции спленоцитов неспецифическим антигеном вируса кори в ходе эксперимента достоверно не увеличивались. Это свидетельствует в пользу отсутствия у исследуемого препарата неспецифического стимулирующего действия.
В ходе эксперимента также были установлены особенности реакции цитокиновой системы у контрольных и вакцинированных мышей после заражения гетерологичным штаммом E.coli O157:H7.
Как видно на рис. 2, у мышей, получавших плацебо (группа Е и F), происходило прогрессивное нарастание до 9-х суток системной продукции провоспалительных медиаторов – ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, причём начальный подъём сывороточной концентрации этих цитокинов по времени совпадал с развитием бактериемии (5-е сутки). Таким образом, активация продукции провоспалительных медиаторов в контрольных группах отражала развитие SIRS.
Развитие инфекции у иммунизированных EHEС CIP 105282 мышей также сопровождалось увеличением системной продукции провоспалительных медиаторов на 5-9 сутки. Однако, концентрации цитокинов повышались не столь выражено и возвращались к исходному уровню на 11-е сутки после инфицирования. Более того, у иммунных животных отмечена прямая корреляция системной продукции ИФН- и ИЛ-12 с показателями ELISpot теста, отражая активацию клеточного иммунитета. Выраженный подъём уровня данных цитокинов в контрольной группе указывал на системный характер воспаления.
ФНО-альфа ИЛ- A A B B C C D D E E 100 F F 0 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 ИНФ-гамма ИЛ-10 A 140 A 120 B B C C D D 40 50 E E F 0 F 0 1 3 5 7 9 11 0 1 3 5 7 9 11 ИЛ-1бета ИЛ- 300 A 200 A B 160 B C 120 C D 80 D E 40 E F 0 F 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 Рис. 2. Динамика системной продукции цитокинов у мышей BALB/c контрольных групп (E и F) и мышей, иммунизированных препаратом EHEC CIP 105282 ghosts (A и B – перорально, C и D – в/м, 1мг/мышь), после заражения E.coli O157:H7, штамм 103571 (на 55-е сутки, интрагастрально, 108КОЕ/мышь). Е и F – контрольные группы. По оси абсцисс – сутки после заражения, по оси ординат – концентрация (пг/мл). Результат представлен как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.
1.2 Свойства препарата EHEC CIP 105282 ghosts при ректальном способе иммунизации Стратегия создания профилактической вакцины против инфекций, вызываемых энтерогеморрагическими штаммами E.coli, в первую очередь, должна быть направлена на предотвращение колонизации возбудителем кишечного тракта [Conlan et al., 1999b;
Li et al., 2000].
Вероятно, это и определило эффективность пероральной иммунизации препаратом EHEC CIP ghosts за счёт индукции мукозального иммунитета. Но возникает вопрос о влиянии кислотного содержимого желудка и протеолитических ферментов кишечного тракта на свойства препарата. В связи с этим, нами были изучены свойства препарата EHEC CIP 105282 ghosts при введении per rectum.
Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата при ректальном введении проводилась по схеме, аналогичной предыдущему эксперименту: после первичной вакцинации половина мышей была повторно иммунизирована на 28-е сутки, в качестве контроля были использованы мыши, которым в эти же сроки ректально вводился фосфатный буфер (таблица 2).
Таблица Характеристика групп мышей в эксперименте по изучению иммуногенных и протективных свойств препарата EHEC CIP 105282 при ректальном способе введения Количество Кратность Группа Препарат Протективность,% мышей иммунизации EHEC CIP 70 0 сутки A (1мг, соответствует 4.8х микробных клеток, в 30 мкл 0 и 28 сутки B 70 фосфатно-солевого буфера) 0 сутки C фосфатно-солевой буфер 70 53, (30 мкл) 0 и 28 сутки D 70 53, После заражения мышей на 55-е сутки гетерологичным штаммом CIP 103571 E.coli O157:H (108КОЕ/мышь) отмечалось развитие инфекции. Ранее описанные проявления инфекции в контрольных группах наблюдались на 4-9 сутки, в то время как для иммунизированных мышей было характерно только некоторое снижение двигательной активности У контрольных животных регистрировалось длительное выделение возбудителя с испражнениями (с 1 по 7-е сутки) и транслокация бактерии в системный кровоток на 5 и 6-е сутки после инфицирования. У вакцинированных мышей наличие бактерии в фекалиях было транзиторным (13 сутки) и не сопровождалось развитием бактериемии.
Неожиданным стал тот факт, что при ректальной иммунизации препарат EHEC CIP ghosts, вне зависимости от кратности введения, обладал 100% протективными свойствами. Доля выживших животных в контрольных группах была одинакова (53,3 %).
Динамика формирования клеточного иммунитета соответствовала показателям предыдущего эксперимента. После ректальной иммунизации EHEC CIP 105282 ghosts, так же как и при введении препарата per os, формирование пула специфических лимфоцитов отмечалось с 14-х суток, что подтверждено результатами РБТ спленоцитов и ELISpot теста. Однако, было выявлено принципиальное отличие: повторная иммунизация в группе В индуцировала достоверно более высокий пролиферативный ответ спленоцитов на 49-е сутки, по сравнению с показателями в группе А.
Особого внимания заслуживают показатели специфического гуморального иммунитета после ректального введения исследуемого препарата. В частности, интересны результаты анализа мукозального ответа в различных отделах кишечного тракта (дуоденальный, поперечноободочный и ректальный).
Ректальное введение ЕНЕС CIP 105282 ghosts индуцировало синтез специфических сывороточных IgG и IgA уже к 14-м суткам (рис. 3). После повторной вакцинации в группе В отмечалось достоверное усиление продукции сывороточных иммуноглобулинов G к 49-м суткам.
Кроме того, у иммунизированных животных к 14-м суткам после первичного введения препарата отмечалось появление специфических IgA в смывах из прямой кишки (рис. 4). Повторная иммунизация вызывала практически двукратное нарастание синтеза специфических антител в ректальном отделе кишечника. Появление IgA в смывах из поперечной ободочной кишки наблюдали только на 7-е сутки после заражения мышей. Несмотря на проведённую иммунизацию, продукции специфических IgG во всех отделах кишечного тракта, а также IgA в проксимальных отделах кишечника не зарегистрировано на протяжении всего эксперимента.
Сывороточные IgA Сывороточные IgG Log2(1/титр) Log2(1/титр) 10 A A 8 B B 6 C C D D 0 7 14 21 28 35 42 49 55 62 69 0 7 14 21 28 35 42 49 55 62 69 сутки от начала эксперимента сутки от начала эксперимента Рис. 3. Динамика формирования системного гуморального иммунитета у мышей BALB/c при ректальной иммунизации препаратом EHEC CIP 105282 ghosts (1мг/мышь) и последующего заражения E.coli O157:H7, штамм 103571 (на 55-е сутки, интрагастрально, 108КОЕ/мышь). Результат представлен как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.
После заражения у мышей контрольных групп также формировался системный IgG и IgA ответ.
Продукция IgA в ректальном отделе кишечника отмечалась к 7-м суткам после инфицирования, но содержание антител в смывах было достоверно ниже, чем у иммунизированных мышей. Кроме того, в контрольных группах специфические IgA в смывах из поперечной ободочной кишки выявлялись только с 14-х суток после заражения.
IgA в смывах из поперечной ободочной кишки IgA в смывах из прямой кишки титр IgA/суммарные IgA IgA/суммарные IgA 2, обратный титр 1,5 A A B B 1 1, обратный C C D 0,5 D 0, 0 0 7 14 21 28 35 42 49 55 62 69 76 0 7 14 21 28 35 42 49 55 62 69 сутки от начала эксперимента сутки от начала эксперимента Рис. 4. Динамика мукозального иммунитета у мышей BALB/c при ректальной иммунизации препаратом EHEC CIP 105282 ghosts (1мг/мышь) и последующего заражения E.coli O157:H7, штамм 103571 (интрагастрально, 108КОЕ/мышь). Результат представлен как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.
Цитокиновая реакция при моделировании E.coli O157:H7 инфекции у мышей, иммунизированных ректально, не отличалась от показателей у мышей, иммунизированных per os.
Благоприятный исход заболевания коррелировал с усилением продукции Th1-цитокинов (ИФН-g и ИЛ-12) на ранних этапах инфекции и незначительным подъёмом уровня провоспалительных медиаторов (ФНО-a, ИЛ-1b) и ИЛ-6. Напротив, летальный исход ассоциировался с ранним усилением системной продукции ФНО-a, ИЛ-1b и последующим резким повышением концентраций в сыворотке крови всех исследованных цитокинов. На 59 сутки отмечалось выраженное повышение активности ИЛ-6 и ИЛ-10, что, по-видимому, отражало развитие регуляторного дисбаланса в иммунной системе.
Полученные данные свидетельствуют о том, что существует связь между течением и исходом экспериментальной E.coli O157:H7 инфекции и системной продукцией цитокинов в процессе развития заболевания. Важно отметить, что динамика цитокинового ответа в контрольных группах соответствовала клиническим данным при развитии генерализованных форм инфекции [Litalien et al., 1999;
Kita et al., 2000;
Lee et al., 2002;
Torres et al., 2006]. Общность ключевых патогенетических механизмов, описанных в ходе клинических исследований и полученных в нашем эксперименте, в очередной раз указывают на правомерность использования мышей BALB/c в качестве экспериментальной модели E.coli O157:H7 инфекции.
Сравнительное изучение различных способов введения EHEC CIP 105282 ghosts позволяет утверждать, что только при мукозальной иммунизации достоверно снижается летальность у инфицированных мышей. По-видимому, формирующийся при в/м введении препарата системный IgG ответ предотвращает развитие бактериемии, а протективный иммунитет обусловлен преимущественно факторами мукозального иммунитета. Дополнительным свидетельством в пользу ключевой роли мукозального иммунитета в развитии резистентности к E.coli О157:H7 является тот факт, что даже однократная иммунизация EHEC CIP 105282 ghosts per rectum обеспечила 100% выживаемость мышей после заражения. Можно предположить, что клеточный иммунитет так же играет позитивную роль при E.coli О157:H7 инфекции, на что указывает формирование пула антиген-специфических лимфоцитов у иммунизированных мышей.
2. Изучение иммунологических показателей при экспериментальном моделировании вирусного клещевого энцефалита (КЭ) Исследование иммунологических показателей у мышей BALB/c, иммунизированных вакциной КЭ, после заражения вирусом КЭ проводилась в рамках государственных испытаний вакцины серии № 884 (на основе штамма 205). В качестве препарата сравнения был использован ОСО отраслевой стандартный образец вакцины КЭ. Животным осуществлялось подкожное введение препаратов на 0, и 5-е сутки, в контрольной группе в эти же сроки вводилась буфер для разведения. Через 7 суток после последней иммунизации всех мышей заражали в/б вирусом КЭ (штамм Absettarov) в дозе 3, lgЛД50/мышь. Развитие инфекции во всех группах было подтверждено обнаружением в крови на 3-и сутки после инфицирования РНК вируса КЭ методом ОТ-ПЦР. Все животные контрольной группы погибли к 9-м суткам, средняя продолжительность жизни павших животных составил 7,48±0,43 суток.
Напротив, все иммунизированные мыши выжили.
При изучении гуморального иммунитета было установлено, что перед заражением у иммунизированных животных специфические IgG содержались в титре 1:640. На 5 и 21-е сутки после заражения у иммунных мышей титр IgG увеличился и составил 1:1280 и 1:2560 соответственно. В контрольной группе не было выявлено продукции специфических к вирусу КЭ иммуноглобулинов класса G, но отмечалось на 7-е сутки после заражения появление специфических IgM в низких титрах (1:20).
При исследовании клеточного иммунитета методом ELISpot по продукции -ИФН и в РБТ спленоцитов было показано, что введение вакцины серии №884 и ОСО вызывает появление пула лимфоцитов, отвечающих пролиферацией на введение антигенов КЭ: перед заражением индекс стимуляции в этих группах составлял 1,76±0,18 и 1,78±0,14, в контрольной группе 1,06±0,08. После заражения у иммунных мышей наблюдалось усиление пролиферативного ответа спленоцитов и увеличение количества продуцирующих -ИФН клеток. В контрольной группы достоверных изменений показателей тестов не было выявлено. При этом у вакцинированных животных сохранялся высокий уровень ответа на стимуляцию конканавалином А и ЛПС S. typhimurium, что свидетельствовало об отсутствии у инактивированной вакцины КЭ выраженных иммуносупрессивных свойств. Пролиферативный ответ на стимуляцию неспецифическими антигенами вируса Мачупо статистически достоверно не отличался от спонтанной пролиферации спленоцитов в ходе всего эксперимента, подтверждая отсутствие значимого неспецифического стимулирующего влияния исследуемых вакцинных препаратов на иммунную систему животных.
Анализ системной продукции цитокинов показал различную динамику этих показателей после заражения у интактных и вакцинированных мышей (рис. 5). В контрольной группе после заражения отмечалось раннее и прогрессивное усиление продукции провоспалительных цитокинов (ФНО-, ИЛ 1, ИЛ-6, ИЛ-12), свидетельствующее о развитии у этих животных SIRS. Кроме того, ранее была установлена взаимосвязь между уровнем ИЛ-6 и поражением ЦНС [Gruol et al., 1997], что проявлялось развитием у мышей перед гибелью судорожного синдрома. Полученные данные об активности цитокинов у павших животных во многом совпадают с результатами клинических исследований случаев тяжёлого течения КЭ у людей [Тимофеев и др., 2002;
Atrasheuskaya et al., 2003].
Напротив, после заражения у вакцинированных животных отмечено увеличение уровней провоспалительных цитокинов (ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-12) на ранних сроках – 1-3 сутки с последующим их снижением к 7-м суткам. Необходимо отметить, что у этих животных отсутствовало увеличение продукции ИЛ-6. При этом у иммунных мышей отмечались более высокие концентрации -ИФН.
ФНО-альфа ИЛ- 200 0 0 1 3 5 7 9 21 0 1 3 5 7 9 ИЛ- ИФН-гамма 400 0 1 3 5 7 9 0 1 3 5 7 9 ИЛ-1бета ИЛ- 600 200 0 1 3 5 7 9 сутки после заражения 0 1 3 5 7 9 ИЛ- - ОСО - вакцина КЭ (серия №884) - контрольная группа 0 1 3 5 7 9 сутки после заражения Рис. 5 Динамика системной продукции цитокинов у мышей линии BALB/cпосле заражения вирусом КЭ (штаммом Absettarov, 3,14 lgЛД50/мышь). По оси ординат – концентрация (пг/мл).
Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.
Следовательно, проведённая вакцинация способствует ранней активации цитокинового ответа по Th1-типу после заражения вирусом КЭ. Ранняя поляризация Т-клеточного ответа по данному типу, как правило, позволяет эффективно контролировать развитие вирусных инфекций, в частности благодаря синтезу ИФН-g [Ruby et al., 1991;
Karupiah, 1998], что и наблюдалось у иммунных животных. Полученные данные могут быть использованы для разработки новых подходов к оценке протективности вакцин КЭ.
3. Изучение патогенеза и новых направлений терапии экспериментальной вирусной лихорадки Денге (ВД) 3.1 Патогенетические аспекты экспериментальной ВД-инфекции.
Адекватная животная модель инфекционного заболевания должна по ряду клинико лабораторных изменений соответствовать течению инфекции у людей. В связи с этим мы изучали влияние адаптированного штамма вируса Денге 2-го серотипа (ВД-2) на продукцию цитокинов и гематологические показатели у мышей линии BALB/c.
Было установлено, что при в/б инфицировании данным штаммом в дозе 5ЛД50 все животные погибают к 9-м суткам. У павших животных при вскрытии были выявлены признаки развития геморрагического синдрома: усиление сосудистого рисунка на брюшине, наличие очагов фокального геморрагического некроза в селезёнке и печени, дёгтеобразное содержимое в кишечнике.
В/б введение вируса в дозе 0,1ЛД50 не приводило к гибели мышей, но сопровождалось снижением двигательной активности животных, развитием вирусемии на 37 сутки, что было подтверждено результатами ОТ-ПЦР, и формированием вирус специфических IgG в титре 1: на 28-е сутки после заражения.
Данные по изучению динамики гематологических показателей при заражении различными дозами ВД-2 приведены на рис. 5.
Лейкоциты Эритроциты 20 15 10*6/мл 10*6/мл 10 5 0 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 Гематокрит Тромбоциты 10*6/мл % 0 1 3 5 7 9 11 0 1 3 5 7 9 11 сутки после заражения сутки после заражения Рис. 5. Изменение гематологических показателей у мышей BALB/c после в/б заражения адаптированным штаммом ВД-2 в дозе 5ЛД50 ( ) и дозе 0,1ЛД50 ( ). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.
В целом динамика показателей крови при летальном течении экспериментальной ВД- инфекции соответствовала патофизиологическим изменениям, регистрируемым у человека при тяжёлых форма заболевания: развивалась анемия, тромбоцитопения, лейкопения;
наблюдалось увеличение показателей гематокрита, отражающее усиление проницаемости эндотелия [Henchal et al., 1990]. У выживших мышей развитие инфекции сопровождалось лейкоцитозом, а снижение содержания эритроцитов, тромбоцитов и нарастание гематокрита были менее выражены, чем у павших животных.
Заражение различными дозами ВД-2, как видно на рис.6, индуцировало у экспериментальных животных продукцию как провоспалительных (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-12), так и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10).
Ф НО-альф а ИЛ- 400 0 1 3 5 7 9 11 0 1 3 5 7 9 11 ИФ Н-гамма ИЛ- 150 100 50 0 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 ИЛ-1бета ИЛ- 200 0 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 сутки после зараж ения сутки после зараж ения Рис. 6. Изменение системной продукции цитокинов у мышей BALB/c после в/б заражения адаптированным штаммом ВД-2 в дозе 5ЛД50 ( ) и 0,1ЛД50 ( ). По оси ординат – концентрация (пг/мл). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.
При летальном течении инфекции доминировала продукция провоспалительных цитокинов - ФНО-, ИЛ-1. Причем прогрессивное увеличение сывороточной концентрации данных медиаторов подтверждало развитие SIRS у павших животных. У выживших животных развитие иммунного ответа происходило преимущественно по Th1-типу (высокий уровень ИЛ-12, ИФН-), что наблюдается при лёгких формах лихорадки у людей [Bethell et al., 1998;
Chaturvedi et al., 2000]. Развитие тяжёлых форм лихорадки Денге ассоциировано с гиперпродукцией Th2 цитокинов, в частности ИЛ-10 [Chaturvedi et al., 1999;
Green et al., 1999]. Показательным являлось соотношение ИЛ-12/ИЛ-10: у выживших мышей отмечалось увеличение данного показателя, при летальном развитии экспериментальной ВД-инфекции – снижение.
Полученные в эксперименте данные подтверждают адекватность моделирования ВД- инфекции на мышах BALB/c и свидетельствуют о возможности использования предложенной модели для оценки различного рода иммунобиологических препаратов.
3.2 Изучение возможности коррекции экспериментальной ВД-инфекции Традиционно скрининг терапевтических средств для лечения вирусных геморрагических лихорадок основан на изучении их противовирусного действия, но мало внимание обращается на индукцию факторов неспецифического иммунитета, играющих едва ли не ключевую роль в исходе инфекции. Поэтому целесообразным является поиск препаратов, влияющих на данное звено патогенеза лихорадки Денге. В связи с чем было исследовано влияние олигопептидного препарата FX-06, ингибирующего системную продукцию провоспалительных цитокинов [Zacharowski et al., 2007], на течение и исход экспериментальной ВД-инфекции при моделировании на мышах BALB/c.
При подборе дозы препарата FX-06 основывались на результатах ранее проведённых исследований [Petzelbauer et al., 2005]. Нескольким группам мышей BALB/c, инфицированным 5ЛД50 адаптированного штамма ВД-2, препарат вводился в/б 2 раза в сутки в дозе 600, 1200, 2400, 4800 и 9600 мкг/(кг*сут). Введение проводилось с 3 по 9-е сутки включительно, т.е. в период, характеризовавшийся наиболее выраженными изменениями продукции цитокинов. При статистическом анализе кривых выживаемости было установлено, что лучшие показатели выживаемости (40%) наблюдаются при использовании FX-06 в суточной дозе 4800 мкг/(кг*сут).
Для уточнения возможного механизма протективного действия препарата FX-06 при экспериментальной лихорадке Денге было изучено его влияние на динамику гематологических показателей и системную продукцию цитокинов. После заражения животных летальной дозой ВД-2 (5ЛД50) препарат применяли в оптимальной дозе (4800 мкг/кг*сут) с 3-х суток. Контрольной группе животных по аналогичной схеме вводился разводящий буфер.
Все мыши в контрольной группе погибли. Средняя продолжительность жизни павших животных в этой группе составила 6,02 ± 0,36 суток. Как видно на рис. 7, заболевание сопровождалось развитием анемии, тромбоцитопении, лейкопении. Нарастание гематокрита свидетельствовало о потери жидкой составляющей циркулирующей крови. Содержание фибриногена в плазме критически снижалось, косвенно подтверждая развитие ДВС-синдрома.
Введение препарата инфицированным ВД-2 мышам, по сравнению с контрольной группой, достоверно снижало летальность до 55% (p=0,0012). Средняя продолжительность жизни павших животных в группе, получавшей терапию, составила 7,87±0,32 суток. Введение исследуемого препарата предотвращало развитие выраженной анемии и тромбоцитопении, стабилизировало показатели гематокрита. Несмотря на то, что у леченных животных также наблюдалось снижение Э ритроциты Г е м атокрит 15 10*9/мл 10 % 5 0 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 сутки после зараж ения сутки после зараж ения Л е йкоциты Тром боциты 10*6/мл 10*6/мл 10 0 0 1 3 5 7 9 11 0 1 3 5 7 9 11 сутки после зараж ения сутки после зараж ения Ф ибриноге н - контрольная группа мг/мл - терапия FX- 0 1 3 5 7 9 11 сутки после зараж ения Рис. 7. Динамика показателей гемостаза при экспериментальном моделировании ВД инфекции на мышах BALB/c в контрольной группе и группе, получавшей препарат FX- (4800мкг/кг*сут, на 39 сутки). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.
концентрации фибриногена до 7-х суток после заражения, но, начиная с 9-х суток, данный показатель вернулся к исходным значениям.
FX-06 оказывал существенное влияние на цитокиновую систему (рис. 8). Активность главных медиаторов воспаления (ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-6) у мышей на фоне введения препарата на 5, 7 и 9-е сутки была достоверно ниже, чем в контроле. Кроме того, в указанной группе отмечалась ранняя активация продукции ИФН-g. Подобная динамика изменения сывороточной концентрации была отмечена и для ИЛ-12. Продукция ИЛ-10 в «критический период» с 5 по 9-е сутки нарастала в обеих группах, но в группе, получавшей FX-06, подъём был не столь выраженным.
Результаты проведённого исследования указывают на то, что препарат FX-06 обладает протективным действием при использовании его для терапии экспериментальной лихорадке Денге. Препарат положительным образом влияет на течение ВД-2 инфекции у мышей BALB/c и на динамику основных показателей крови. Кроме того, изучаемый олигопептид модулирует активность цитокиновой системы, влияя на системную продукцию как провоспалительных, так и противовоспалительных медиаторов. Однако, применение препарата не позволило полностью предотвратить летальность. Причин тому может быть несколько: неполная (82%) гомология последовательности изучаемого препарата и аналогичного фрагмента мышиного фибрина;
Ф НО-альф а ИЛ- 500 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 ИФ Н-гамм а ИЛ - 400 300 200 100 0 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 ИЛ -1бе та ИЛ- 500 0 0 1 3 5 7 9 11 21 0 1 3 5 7 9 11 сутки после зараж ения сутки после зараж ения Рис. 8 Динамика системной продукции цитокинов при экспериментальном моделировании ВД-инфекции на мышах BALB/c в контрольной группе ( ) и группе, получавшей препарат FX- (4800мкг/кг*сут, на 39 сутки, ). По оси ординат – концентрация (пг/мл). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.
неадекватная дозировка и схема терапии. Более детальное исследование влияния FX-06 не только на основные гематологические показатели и продукцию цитокинов, но и параметры коагуляционной системы, изучение фармакокинетики препарата, разработка новых лекарственных форм помогут скорректировать схемы лечения. Но полученные результаты уже позволяют надеяться, что FX-06 может стать кандидатным средством патогенетической терапии различных форм лихорадки Денге у человека.
Благодарности. Особую благодарность автор выражает проф. Г.М. Игнатьеву за научное руководство при выполнении работы и Отрашевской Е.В. за участие в обсуждении результатов исследования. Автор признателен коллегам по лаборатории и сотрудникам ФГУН ГНЦ ВБ “Вектор”, оказавшим консультативную и практическую помощь в выполнении отдельных разделов диссертационной работы: А.П.Агафонову, Л.Б.Дьячковой, Т.Г.Степановой, В.А.Евсеенко, И.В.Плясунову;
сотрудникам ГИСК им Л.А. Тарасевича М.С.Воробьёвой, М.Н.Расщепкиной;
cотруднику FDA А.А.Неверову. Автор благодарит австрийских коллег, проф.Werner Lubitz (University of Vienna) и проф. Peter Petzelbauer (Medical University of Vienna), за предоставление экспериментальных препаратов и критическую оценку результатов работы.
ВЫВОДЫ 1. Впервые показано, что мукозальная иммунизация (оральная или ректальная) мышей линии BALB/c препаратом EHEC CIP 105282 ghosts приводит к формированию специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунитета, обеспечивающего протективный эффект.
2. Показано, что при экспериментальной E.coli O157:H7 инфекции у мышей BALB/c с 3-х суток после заражения возрастает системная продукция ФНО-a, ИЛ-1b, ИЛ-6, ИЛ-10 и достигает максимума на 9-е сутки. У мышей, иммунизированных препаратом EHEC CIP 105282 ghosts, системная продукция данных цитокинов на 5 9 сутки достоверно ниже и в дальнейшем возвращается к исходным значениям.
3. Развитие экспериментального клещевого энцефалита у мышей линии BALB/c сопровождается прогрессивным увеличением системной продукции ФНО-a, ИЛ-1b, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12 и ИФН-g до момента гибели животных. У вакцинированных животных после заражения на фоне активации специфического гуморального и клеточного иммунитета отмечается увеличение системной продукции цитокинов на 3 5 сутки наблюдения с последующим достоверным снижением их активности.
4. Установлено, что летальное течение экспериментальной лихорадки Денге у мышей линии BALB/c характеризуется развитием анемии, лейкопении, тромбоцитопении, увеличением системной продукцией ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-6 с 3-х суток после заражения и до момента гибели (9-е сутки). Нелетальное течение инфекции характеризуется лейкоцитозом, менее выраженной анемией и тромбоцитопенией;
увеличение системной продукции ФНО-, ИЛ- и ИЛ-6 отмечается на 3 7 сутки, после чего возвращается к исходным показателям.
5. Показано, что при моделировании лихорадки Денге на мышах BALB/c внутрибрюшинное введения синтетического фрагмента молекулы фибрина Bb15-42 приводит к достоверному снижению летальности до 55% (р=0,0012).
Список публикаций по итогам работы:
1. Mayr U.B., Haller C., Haidinger W., Atrasheuskaya A., Bukin E., Lubitz W., Ignatyev G.
Bacterial ghosts as an oral vaccine: a single dose of Escherichia coli O157:H7 bacterial ghosts protects mice against lethal challenge // Infect Immun.- 2005. – Vol.73(8). – р. 4810-4817.
2. Игнатьев Г.М., Букин Е.К., Отрашевская Е.В., Расщепкина М.Н., Воробьева М.С.
Иммунологические показатели у мышей, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита, после заражения вирусом клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. – 2006. – Т.51. – № 5.– С. 22-27.
3. Букин Е.К., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С., Игнатьев Г.М. Изучение показателей гемостаза и продукции цитокинов при экспериментальной инфекции Денге // Вопросы вирусологии. – 2007. – Т.52. – № 2. – С. 32-36.
Доклады и тезисы конференций 1. Bukin E., Atrasheuskaya A., Rasshepkina M., Vorob’eva M., Ignatyev G. Comparison of immune response in immunized and non-immunized mice after challenge with tick-borne encephalitis virus // 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, April 1-4, 2006.
2. Букин Е.К., Atrasheuskaya A.V., Mauro M. Teixeira, Игнатьев Г.М. Применение ОТ-ПЦР для клинической диагностики лихорадки Денге // Международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». Минск, 17-18 мая 2007 г.