Флуорофоры липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека
На правах рукописи
ЯКОВЛЕВА Марина Андреевна ФЛУОРОФОРЫ ЛИПОФУСЦИНОВЫХ ГРАНУЛ ИЗ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА 03.01.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2011 1
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик, Островский Михаил Аркадьевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Дудник Людмила Борисовна доктор биологических наук, профессор, Потапенко Александр Яковлевич
Ведущая организация:
Государственное учебно-научное Учреждение Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова факультет фундаментальной медицины, кафедра медицинской биофизики
Защита состоится «30» ноября 2011г. в 12.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 002.039.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН по адресу:
119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН
Автореферат разослан «_» октября 2011 года
Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 002.039. кандидат химических наук Мазалецкая Л. И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Липофусциновые гранулы (ЛГ) – сложные образования липидно-белковой природы, которые в течение жизни накапливаются в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ) человеческого глаза. Долгое время они считались безопасным побочным продуктом жизнедеятельности клеток. Оказалось, однако, что ЛГ обладают способностью к фотоиндуцированной генерации активных форм кислорода (Островский и др., 1992;
Boulton et al., 1993), что лежит в основе их потенциальной фототоксичности в отношении клетки РПЭ. Исследования последних лет выявили корреляцию между накоплением ЛГ в РПЭ и некоторыми офтальмологическими заболеваниями человека. Это, в первую очередь, старческая макулярная дегенерация сетчатки, которая является основной причиной слабовидения и слепоты пожилых людей, болезнь Штаргардта и другие дегенеративные заболевания. Фототоксичностью ЛГ может быть обусловлена опасность усугубляющего действия коротковолнового (фиолетово-синего) видимого света при дегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.
Структура и состав ЛГ клеток РПЭ, а также влияние процесса старения и действия света на них остаются малоизученными. Протеомный анализ белков ЛГ из клеток РПЭ показал, что в составе гранул присутствуют как специфические для наружных сегментов палочек (НСП) белки (например, рековерин), так и неспецифические белки цитоскелета, ферменты, белки шапероны и канальные белки. Наличие фрагментов белков митохондриального происхождения показывает, что в формировании вещества липофусциновых гранул участвуют не только остатки обломков НСП, не до конца подвергшиеся химическому и ферментативному разложению, но и продукты аутофагоцитоза органелл клеток РПЭ. Показано, что, в отличие от липофусцина из клеток других тканей, флуорофоры ЛГ из РПЭ состоят в основном из производных ретиналя. Идентифицирован и подробно охарактеризован только один из флуорофоров – так называемый N ретинилиден-N-ретинилэтаноламин, или А2Е. Существуют данные, что А2Е может вызывать фотоповреждение клеток.
В связи с этим понимание процессов, происходящих в липофусциновых гранулах РПЭ глаза человека при действии видимого света (изменение содержания в них различных флуорофоров) и в зависимости от возраста, может пролить свет на понимание их роли в развитии дегенеративных заболеваний сетчатки глаза.
Цель диссертационной работы. Изучить влияние видимого света и процесса старения доноров на состав флуорофоров, перешедших в хлороформный экстракт из ЛГ клеток РПЭ кадаверного глаза человека.
Определить флуоресцентные характеристики флуорофоров/групп флуорофоров ЛГ из клеток РПЭ. Провести сравнительную оценку вклада этих флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ.
Основные задачи исследования.
Провести компонентный анализ флуорофоров/групп флуорофоров ЛГ, выделенных из клеток РПЭ кадаверных глаз человека, и определить их спектральные характеристики.
Сравнить компонентный состав флуорофоров/групп флуорофоров из ЛГ, выделенных из клеток РПЭ кадаверных глаз человека различных возрастных групп.
Исследовать действие видимого света на ЛГ, их флуорофор А2Е и другие компоненты хлороформного экстракта из ЛГ.
Провести оценку возможного вклада отдельных флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ РПЭ кадаверных глаз человека.
Научная новизна.
Впервые детально описаны спектры флуоресценции отдельных флуорофоров/групп флуорофоров хлороформного экстракта из ЛГ, выделенных из РПЭ кадаверных глаз человека.
Проведена оценка возможного вклада этих флуорофоров/групп флуорофров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул.
Показано, что А2Е не является основным флуорофором хлороформного экстракта из ЛГ.
Показано, что с возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в ЛГ увеличивается.
Показано, что реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как эпокси-, так и фураноидных ее форм;
эта реакция происходит при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.
Научная и практическая ценность работы Полученные в диссертационной работе результаты имеют фундаментальное значение для понимания природы и состава флуорофоров, содержащихся и накапливающихся в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия с возрастом и при патологии. Знание спектральных характеристик флуорофоров липофусциновых гранул, особенно в зависимости от возраста, представляет практический интерес для дальнейшего усовершенствования метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна, а именно для разработки его компонентного спектрального анализа.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Определены спектральные свойства отдельных флуорофоров/групп флуорофоров липофусциновых гранул клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека.
2. А2Е не является основным флуорофором в суммарном спектре флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул.
Наряду с А2Е значительной флуоресценцией обладают вещества, более полярные, чем А2Е, к которым относятся также окисленные формы А2Е.
3. С возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах увеличивается.
4. Реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как эпокси-, так и фураноидных ее форм;
эта реакция происходит при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.
Апробация диссертации и публикации результатов исследования Основные материалы диссертации опубликованы в 4 статьях;
докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. (Москва, 2007);
итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007);
итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008);
конференции и семинары по научным направлениям программы «Фундаментальные науки – медицине» (Москва, 2010).
Личный вклад соискателя. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов и формулировка выводов исследования осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение результатов), выводов и списка литературы, включающего 124 источников. Диссертация иллюстрирована 42 рисунками и 5 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ГЛАВА 1. Обзор литературы. Дана характеристика физико-химических свойств липофусциновых гранул. Анализируется участие полностью-транс ретиналя в формировании флуорофоров липофусциновых гранул.
Также описываются фотохимические и фотофизические свойства конъюгатов ретиналя, формирующихся в фоторецепторных мембранах.
Обсуждается возможность вклада конъюгатов ретиналя в общую картину аутофлуоресценции глазного дна и обосновывается необходимость экспериментальной проверки этих свойств у других компонентов хлороформного экстракта липофусциновых гранул.
ГЛАВА 2. Материалы и методы. В данном разделе дано подробная методика получения изучаемого объекта (ЛГ), а также описаны методы исследований физико-химических свойств ЛГ и флуорофоров, входящих в их состав, в частности А2Е.
Исследуемым объектом являлись липофусциновые гранулы в фосфатном буфере, которые получали из РПЭ кадаверных глаз человека.
Глаза доноров без каких-либо офтальмологических патологий после выделения роговицы для трансплантации передавались с соответствующим протоколом для исследований из Глазного тканевого банка ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» (Лицензия № 77.01.13.001.Л.000009.09.05 от 12.09.2005 г., действующая до 13.09.2015 г.).
А2Е синтезировали по модифицированной методике, описанной в (Parish et al., 1998). Полностью-транс-ретиналь (ПТР) и этаноламин, в соотношении 2:1 в присутствии уксусной кислоты, смешивали в абсолютном этаноле и перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение дней. После чего производили хроматографическую очистку А2Е от непрореагировавших компонентов.
Флуорофоры экстрагировали из ЛГ по методу Фолча (смесью хлороформ-метанол) (Folch et al., 1957).
Спектры поглощения и флуоресценции регистрировали: спектры оптического поглощения - на спектрофотометре “Shimadzu UV–1601PC» (Япония), спектры флуоресценции - на спектрофлуориметре "Shimadzu RF 5301PC" (Япония).
С целью моделирования в ЛГ процессов старения, ЛГ облучали видимым светом с помощью лампы накаливания КГМ с использованием теплового фильтра со спектром испускания видимого света 400–700 нм.
Поверхностная плотность потока световой энергии, падающей на образец, составляла 280 Вт/м2 для видимого света (400–700 нм) и 200 Вт/м2 для зеленого света (500–700 нм).
Исследование окисления А2Е в темноте проводили путем добавления одинаковых навесок сухого супероксида калия (КО2) к раствору А2Е.
Для разделения флуорофоров хлороформного экстракта из ЛГ использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе. Для этого был использован хроматограф производства фирмы Knauer (Германия), который состоял из двух насосов К 120, спектрофотометрического детектора K-2501, последовательно присоединенному к нему флуориметрического детектора Shimadzu Rf-10Axl (Япония), и колонок Диасфер 120 С18 (4*250 мм, размер сорбента 5 мкм) и Диасфер 120 С18 (4*150 мм, размер сорбента 5 мкм). Детектирование осуществлялось по поглощению на спектрофотометрическом детекторе на длине волны 430 нм. Флуоресценцию регистрировали с помощью флуориметра при варьировании длин волн возбуждения и детектирования флуоресценции.
Разделение проводилось путем линейного градиентного элюирования в системе: от 80% ацетонитрил + 20% воды (+ 0,05% TFA) до 100% ацетонитрил (ВЭЖХ чистоты) за 20 минут;
скорость потока 1,5мл/мин.
Для обработки результатов разделения использовали программное обеспечение EUROChrom for Windows v.5.50 производства Knauer GmbH.
Погрешность измерений для каждого образца определялась из трех отдельно снятых хроматограмм для каждого индивидуального образца.
Относительное процентное содержание компонентов в смеси хлороформного экстракта или в растворе А2Е рассчитывали как процентный вклад площади под отдельным пиком в суммарную площадь всех пиков на хроматограмме, т.е. относительного содержания компонентов в процентах и изменение этого относительного содержания при облучении образцов и их изменения в зависимости от возраста. Поскольку состав хлороформного экстракта из ЛГ почти не известен, т.е. количество веществ, входящих в его состав, определенных структурно мало (в нашем случае точно идентифицированы пики А2Е и его изомеров), то определить для каждого компонента коэффициент экстинкции не представлялось возможным, поэтому количественную характеристику посчитать нельзя, но поскольку качественно состав был неизменен, то в связи с этим нами данные представлялись в виде относительного вклада каждого компонента в суммарный состав и изменение этого вклада в зависимости от влияния света или возраста доноров, при условии детектирования всех хроматограмм в идентичных условиях.
Продукты окисления А2Е изучали методом масс спектрометрического анализа. Масс спектры вещества A2Е были получены на гибридном масс-спектрометре LTQ FT (Thermo Finnigan, Германия), который состоит из линейной квадрупольной ионной ловушки и масс спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ). В качестве источника ионов использовался универсальный источник ионизации Finnigan Ion Max Source, в режиме электроспрея.
Образец растворяли в смеси растворителей ацетонитрил:вода в соотношении 1:1 по объему, с добавлением 1%-ой уксусной кислоты. Электрораспыление образца производилось при напряжении на игле-эммитере 4 кВ и скорости подачи образца в иглу-эммитер 1 мкл/мин. Регистрация масс-спектров проводилась на линейной квадрупольной ионной ловушке в режиме быстрого сканирования. Для обработки и анализа масс-спектров использовалась программа «Qual Browser version 1.4» (Thermo Finnigan, Германия).
Для точной идентификации окисленных форм А2Е в линейной квадрупольной ловушке были проведены МС/МС эксперименты, во время которых молекулярные ионы с определенным отношением массы к заряду, m/z, изолировались, а затем подвергались столкновительно-индуцированной диссоциации с последующим анализом продуктов фрагментации.
Статистическая обработка данных произведена в ППП СТАТИСТИКА. Для проверки гипотезы о различии средних между несколькими группами применяли дисперсионный анализ, а для оценки достоверности различий в 2-х группах - критерий Стьюдента t (Гланц, 1998).
ГЛАВА 3. Результаты исследований.
3.1. Сравнительный анализ влияния видимого света на спектральные характеристики липофусциновых гранул и синтетического А2Е.
Для понимания механизмов фототоксического действия ЛГ на клетку РПЭ в работе было проведено изучение влияния света на физико-химические характеристики ЛГ и синтетического А2Е. Суспензия ЛГ в фосфатном буфере, а также раствор синтетического А2Е в метаноле были подвергнуты интенсивному облучению в диапазоне 390 – 700 нм. Были также исследованы спектральные свойства хлороформных экстрактов, полученных из ЛГ до и после их облучения видимым светом.
3.1.1. Изменение спектров поглощения липофусциновых гранул и синтетического А2Е при облучении их видимым светом.
С целью изучения изменений, которые могут происходить с ЛГ с возрастом и/или при различных патологиях была изучена модельная система этих процессов, а именно облучение видимым светом 390-700 нм суспензии ЛГ, полученных из кадаверных глаз человека.
Суспензия ЛГ в фосфатном буфере, а также раствор синтетического А2Е в метаноле были подвергнуты облучению в диапазоне 390 – 700 нм.
Были также исследованы спектральные свойства хлороформных экстрактов, полученных из ЛГ до и после их облучения видимым светом.
На рисунке 1 приведены спектры поглощения суспензии ЛГ, хлороформного экстракта из ЛГ и раствора синтетического А2Е до и после облучения.
При облучении видимым светом как суспензии ЛГ в фосфатном буфере, так и синтетического А2Е в метаноле спектры поглощения исследуемых образцов изменяются схожим образом. Другими словами, продукты, поглощающие в области 340-430 нм, при облучении практически исчезают, при этом наблюдается появление других продуктов, поглощающих в ультрафиолетовой области. Эти результаты позволяют рассматривать хлороформный экстракт из ЛГ и синтетический А2Е в метаноле как модельные системы для изучения превращения ЛГ при их облучении видимым светом или в процессе старения.
Рис. 1. Спектры поглощения суспензии ЛГ в фосфатном буфере, вставка – дифференциальный спектр поглощения, полученный путем вычитания из спектра поглощения образца после облучения спектра поглощения образца до облучения, (а), хлороформных экстрактов из ЛГ (б) и раствора синтетического А2Е в метаноле (в) до облучения (спектр 1) и после 2-х часов облучения (спектр 2).
3.1.2. Изменение флуоресцентных свойств липофусциновых гранул и синтетического А2Е до и после их облучения видимым светом.
Флуоресценцию всех образцов возбуждали светом с длинами волн 280, 340 и 430 нм, соответствующих максимумам в спектре поглощения хлороформного экстракта из ЛГ.
На рисунке 2 приведены спектры флуоресценции суспензии ЛГ в фосфатном буфере, хлороформного экстракта из ЛГ и раствора синтетического А2Е в метаноле до и после их облучения.
Из рисунка 2 отчетливо видно, что максимумы флуоресценции всех спектров смещаются в коротковолновую область на 25-40 нм. В таблице представлены значения максимумов флуоресценции до и после облучения всех образцов.
Можно предположить, что при облучении образцов содержащиеся в них флуорофоры претерпевают изменения, а продуктами облучения являются их окисленные формы.
3.1.3. Спектры возбуждения флуоресценции суспензии липофусциновых гранул.
Для качественной оценки флуорофоров в суспензии ЛГ были зарегистрированы спектры возбуждения флуоресценции при эмиссии на 335, 450 и 500 нм (рис. 3). Спектр возбуждения с флуоресценцией на 335 нм (рис.
3, а) имеет максимум в области 280 нм. Скорее всего, он принадлежит белковой составляющей ЛГ (флуоресценции триптофана) (White, 1959).
Спектры возбуждения с флуоресценцией на 450 и 500 нм имеют максимумы в области 270, 350 и 450 нм.
Рис. 2. Спектры флуоресценции суспензии ЛГ в фосфатном буфере (а), хлороформного экстракта из ЛГ (б) и раствора синтетического А2Е в метаноле (в) до облучения (спектр 1) и после 2-х часов облучения (спектр 2). Флуоресценцию возбуждали светом с длинами волн 280, 340 и 430 нм (EX нм, EX 340 нм, EX 430 нм, соответственно).
Таблица 1. Максимумы спектров флуоресценции суспензии липофусциновых гранул в фосфатном буфере, растворов хлороформного экстракта из липофусциновых гранул и синтетического А2Е в метаноле до и после 2-х часов облучения видимым светом.
Длина волны Максимумы спектров Исследуемый возбуждения, флуоресценции, нм образец нм Необлученные Облученные образцы образцы видимым светом, 2 часа 280 335, 360, 470 335, 360, Липофусциновые 444, 540 (плечо) 340 470, гранулы 540 (плечо), 430 380 (плечо), Хлороформный 490 380, экстракт из ЛГ 340 475 430 500, 540 (плечо) 280 380, 500 384, Синтетический 340 500 А2Е 430 500 Можно предположить, что коротковолновый максимум в области нм принадлежит окисленным формам производных ПТР, а максимумы в области 350 и 450 нм принадлежат производным ПТР (например, А2Е и ПТР димеру) (Jang et al., 2005).
Из рисунка 3 хорошо видно, что существенный вклад в суммарный спектр флуоресценции вносят продукты, поглощающие в ультрафиолетовой области. Другими словами, для понимания особенностей картины аутофлуоресценции глазного дна желательно было бы учитывать вклад не только А2Е, но и продуктов, поглощающих в более коротковолновой области.
Рис. 3. Спектры возбуждения флуоресценции суспензии ЛГ, зарегистрированной при 335 нм (а), 450 нм (б) и 500 нм (в) до облучения (спектр 1) и после 2-х часов облучения (спектр 2).
3.2. Изучение механизмов окисления А2Е как модельной системы.
В этой главе обсуждаются механизмы оксиленияА2Е. Существует предположение, что процесс окисления А2Е может идти по двум механизмам, за счет свободных радикалов и/или активных форм кислорода, в частности синглетного кислорода.
Спектральный анализ. Раствор А2Е в ацетонитриле облучали видимым светом в диапазоне 390-700 нм. Результаты спектрофотометрического анализа представлены на рисунке 4. Из полученных данных видно, что облучение А2Е полным диапазоном видимого света приводит к его фотоокислению и образованию новых продуктов (рис.
4). Спектр поглощения раствора А2Е в ацетонитриле (рис. 4, кривая 1) имеет два характерных максимума в области 435 и 330 нм. После облучения раствора А2Е видимым светом в течение 3 часов оба максимума в области 435 и 330 нм значительно уменьшаются, и в то же время появляется более коротковолновый максимум в районе 280 нм (рис. 4, кривая 2). При этом происходит окисление А2Е по двойным связям, приводящее к уменьшению длины цепи сопряжения и образованию новых фотоокисленных продуктов А2Е, что хорошо коррелирует с данными литературы (Dillon et al., 2004;
Sparrow et al., 1999;
Holz et al., 1999;
Sparrow et al., 2002;
Ben-Shabat et al., 2002;
Соколов и др., 2005;
Parish et al., 1998).
Рис. 4. Спектры поглощения растворов А2Е в ацетонитриле.
Кривая 1 до облучения видимым светом, кривая 2 после облучения видимым светом.
Хроматографический анализ раствора А2Е до и после его облучения видимым светом с целью детектирования образования новых продуктов.
Исследование раствора А2Е методом ВЭЖХ до и после облучения показало, что при фотоокислении А2Е образуются, по крайней мере, два новых продукта (рис. 5, пики 1 и 2). Не исключено также, что каждый из них может представлять собой смесь изомеров, или очень близких по своим свойствам веществ. На фоне образования этих новых продуктов наблюдается снижение количества А2Е, что является еще одним доводом, подтверждающим образование этих новых продуктов в результате химических модификаций А2Е.
Рис. 5. Хроматограммы образцов растворов А2Е в ацетонитриле до и после облучения видимым светом (обращенная фаза). Детектирование по поглощению на длине волны нм. Колонка Диасфер 120 С18 (4* мм, размер сорбенкта 5 мкм), система: градиент от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% TFA) до 100% ацетонитрила за минут;
скорость потока 1,5мл/мин.
Пики 1 и 2 – продукты окисления А2Е.
Масс-спектрометрический анализ. Продукты фотоокисления А2Е были также исследованы с помощью масс-спектрометрического анализа растворов А2Е в ацетонитриле до и после облучения (рис. 6). Было показано, что после облучения помимо основного пика с отношением m/z 592 (М+), соответствующего неокисленной форме молекулярного иона А2Е, появляются новые пики с m/z 608, 624, 640 и 656, причем каждый из которых отличается от предыдущего по массе на 16 и соответствует окисленным формам A2E. По мере увеличения времени облучения, количество окисленных форм A2E растт по отношению к исходной неокисленной форме, о чем свидетельствует относительное увеличение интенсивности пиков с m/z 608, 624, 640 и 656 по отношению к пику с m/z 592. Данные масс спектрометрического анализа хорошо согласуется с данными, полученными методом ВЭЖХ-анализа. Также была проведена идентификация отдельных пиков в масс-спектре с помощью индуцированной столкновениями диссоциации (CID). Основываясь на результатах этих данных, можно утверждать, что в растворе облученного А2Е присутствуют как эпокси-, так и фуран- продукты окисления А2Е.
Рис. 6. Масс спектры вещества A2Е до и после + облучения. [М] -основной пик А2Е, [М+О]+, [М+2О]+, [М+3О]+ [М+4О]+ - пики, соответствующие моно-, би-, три-, тетра окисленным продуктам А2Е.
Влияние супероксидных радикалов на окисление А2Е. Было исследовано влияние супероксидных радикалов на окисление А2Е в темновых условиях. В качестве источника супероксидных радикалов был использован надпероксид калия (КО2, фирма “Sigma”). Было показано, что при добавлении КО2 к системе, содержащей фосфатный буфер, цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) и А2Е, наблюдается падение интенсивности в длинноволновом максимуме поглощения (рис.7).
Это свидетельствует о том, что в реакции фотоокисления А2Е, вероятно, принимают участие супероксидные радикалы.
Рис. 7. Влияние надпероксида калия на раствор А2Е в ЦТАБе.
Кривая 1 до облучения видимым светом, кривая 2 после облучения видимым светом.
При этом, по-видимому, происходит окисление только более длинноцепочечной системы сопряженных двойных связей молекулы А2Е (Jang et al., 2005). Однако, поскольку в отличие от действия видимого света, при окислении А2Е надпероксидом не происходит уменьшения максимума поглощения при 330 нм, можно полагать, что супероксид не единственный участник процесса фотоокисления А2Е.
3.3. Анализ содержания флуорофоров в хлороформном экстракте из липофусциновых гранул в зависимости от возраста доноров и действия видимого света на ЛГ.
3.3.1. Хроматографический анализ хлороформного экстракта из липофусциновых гранул и А2Е в метаноле до и после их облучения видимым светом.
Поскольку было показано, что при облучении А2Е видимым светом образуются его окисленные продукты (Dillon et al., 2004;
Radu et al., 2004;
Jang et al., 2005), то был проведен сравнительный анализ ВЭЖХ хлороформных экстрактов из ЛГ и синтетического А2Е до и после их облучения (рис. 8).
Рис. 8. Хроматограмма раствора А2Е в метаноле (А) и раствора хлороформного экстракта из ЛГ (Б) (обращенная фаза). Детектирование по поглощению на длине волны 430 нм.
Колонка Диасфер 120 С18 (4*250 мм, размер сорбенкта 5 мкм), система:
градиент от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% TFA) до 100% ацетонитрила за 20 минут;
скорость потока 1,5мл/мин.
До облучения (1) и после облучения видимым светом 1 и 2 часа (2 и 3, соответственно).
Как можно видеть из рисунка 8, при облучении А2Е в метаноле на хроматограмме наблюдается появление 2-х новых пиков – окисленных форм А2Е (рис. 26 А, пики Oxy-A2E). Одновременно с образованием этих новых продуктов наблюдается снижение количества самого А2Е. Следует отметить, что помимо этих идентифицированных окисленных форм на хроматограмме видно появление новых продуктов, которые имеют более короткие времена удерживания по сравнению с А2Е и его оксиформами (рис. 8 А, группы пиков 1 и 2).
Аналогичные результаты были получены и при хроматографическом анализе хлороформных экстрактов из ЛГ до и после их облучения видимым светом (рис. 8 Б). Из рисунка видно, что, как и в случае А2Е, при облучении ЛГ на хроматограмме также наблюдается появление 2-х новых пиков – окисленных форм А2Е (рис. 8 Б, пики Oxy-A2E), при этом наблюдается снижение количества самого А2Е (рис. 8 Б, пики 6, 7 и 8). Также помимо этих идентифицированных окисленных форм на хроматограмме видно увеличение интегральной интенсивности пиков на хроматограмме, соответствующих продуктам, которые имеют более короткие времена удерживания по сравнению с А2Е и его окисленными формами (рис. 8 Б, группы пиков 1 и 2).
Следует подчеркнуть, что времена удерживания появившихся новых пиков продуктов окисления на хроматограммах, как в облученном А2Е в метаноле, так и в хлороформных экстрактах из облученных ЛГ находятся в хорошем соответствии. Это может свидетельствовать о том, что А2Е как в метаноле, так и в составе ЛГ окисляется с образованием продуктов с идентичными свойствами, в том числе спектральными.
Из результатов ВЭЖХ анализа хлороформного экстракта из ЛГ до и после облучения (рис. 8 Б, таблица 2) видно, что относительное содержание основных изомерных форм А2Е (пики 6, 7 и 8) до облучения в сумме составляло около 47%, после облучения (2 часа) – около 41%. Другими словами, относительное содержание окисленных форм А2Е и, возможно, других флуорофоров после облучения увеличивается.
3.3.2. Зависимость относительного содержания различных флуорофоров в липофусциновых гранулах от возраста доноров кадаверных глаз без видимых зрительных патологий.
Из результатов ВЭЖХ анализа хлороформного экстракта из ЛГ до и после облучения следует, что относительное содержание окисленных форм А2Е и, возможно, других флуорофоров после облучения увеличилось.
Имеются данные, согласно которым содержание окисленных форм А2Е в ЛГ также увеличивается с возрастом (Avalle et al., 2004).
В этой связи представляло интерес провести сравнительный ВЭЖХ анализ относительного содержания разных флуорофоров/групп флуорофоров в ЛГ, выделенных из глаз доноров разных возрастных групп. Отсутствие видимой зрительной патологии и следов перенесенных офтальмохирургических операций было установлено офтальмологами Глазного тканевого банка ФГУ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н. Федорова».
Возрастной интервал группы 1 составлял 17-40 лет, возрастной интервал группы 2 составлял 40-70 лет.
Анализ хлороформных экстрактов из необлученных ЛГ, полученных от разных возрастных групп, дал результат, аналогичный результату, полученному в эксперименте по облучению ЛГ. В группе 1 (17-40 лет) относительное суммарное содержание изомерных форм А2Е (пики 6, 7 и 8) составляло в среднем около 52%, в то время как в группе 2 (40-70 лет) – около 47% (р0,05) (табл. 2). Уменьшение содержания изомерных форм А2Е в ЛГ, выделенных из кадаверных глаз старшей по возрасту группы, может означать, что часть А2Е и изо-А2Е в старческих ЛГ перешло в окисленную форму. Показанное нами уменьшение содержания изомерных форм А2Е в облучнных полным видимым светом ЛГ можно рассматривать как модель изменения флуорофорного состава ЛГ в зависимости от возраста или патологии.
Таблица 2. Зависимость относительного процентного содержания различных флуорофоров в липофусциновых гранулах в зависимости от возраста доноров кадаверных глаз без видимых зрительных патологий (M±).
№ Группа 1 Группа 2 Необлуче- Облуче- Облуче пика/груп нные нные нные (17-40 (40- пы пиков лет)* лет)* Липофу- Липофу- Липофу на сциновые сциновые сциновые % % хроматог гранулы гранулы гранулы рамме (рис. 8 Б, (1 час), (2 часа), (рис. 8 Б) (рис. 8 Б, 2) (рис. 8 Б, 1) % % 3) % 14,91±1,76 17,39±0,22 17,83±2,21 18,87±2,31 19,92±1, 19,68±1,23 23,63±1,76 18,87±1,76 22,97±2,25 24,98±2, 3,36±0,56 3,94±0,24 3,72±0,56 3,76±0,76 3,64±0, 4,03±0,78 1,14±0,11 4,65±0,78 3,99±0,35 3,73±0, 5 (Oxy 6,58±0,25 7,05±0,44 7,56±0,23 6,98±0,28 6,32±0, А2Е) 6 (А2Е) 29,52±1,03 33,32±1,05 29,67±1,56 27,91±1,72 26,81±1, 1,39±0,23 1,93±0,32 1,31±0,12 1,03±0, 7 2,03±0, 8 (Iso 19,89±1,12 12,14±1,12 15,77±1,27 14,21±1,31 13,57±1, А2Е) * Среднестатистические данные были рассчитаны по критерию Стьюдента. Достоверность р0,05.
Способность окисленных форм флуорофоров к генерации активных форм кислорода снижается в условиях in vivo в основном за счет хрусталика, отсекающего от сетчатки и РПЭ ультрафиолетовый свет, а с увеличением возраста – и, частично, синюю часть спектра. Тем не менее, уже образованные окисленные формы флуорофоров могут оказывать токсическое действие даже в отсутствии света (Sparrow et. al., 2003).
Поэтому, представляется важным знать количественное соотношение неокисленных и окисленных форм флуорофоров в ЛГ в зависимости от возраста и различной глазной патологии. Регистрация флуоресценции неокисленных и окисленных форм флуорофоров может лежать в основе разработки компонентного спектрального анализа аутофлуоресценции глазного дна – нового неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных глазных заболеваний (Schmitz-Valckenberg et al., 2008).
3.4. Изучение флуоресцентных свойств отдельных флуорофоров и/или их групп в составе хлороформного экстракта липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия.
3.4.1. Спектры поглощения суспензии и хлороформного экстракта липофусциновых гранул.
Для компонентного анализа флуоресцентных свойств ЛГ было проведено экстрагирование из них липофильных соединений с помощью хлороформа. На рисунке 9 представлены спектры поглощения суспензии ЛГ в фосфатном буфере (1) и хлороформного экстракта из ЛГ (2). Видно, что хлороформная фракция содержит вещества с максимумами поглощения в области 280 нм, 340 нм и 430 нм. Эти длины волн и были использованы для возбуждения флуоресценции исследуемых продуктов. Кроме того, для возбуждения флуоресценции была также использована длина волны 488 нм, поскольку в офтальмологической практике она применяется в коммерческом конфокальном сканирующем лазерном офтальмоскопе (Heidelberg, Германия) для регистрации суммарной картины аутофлуоресценции глазного дна.
Рис. 9. Спектры поглощения суспензии ЛГ в фосфатном буфере (1) и хлороформного экстракта из ЛГ (2).
3.4.2. Результаты хроматографического анализа хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, с использованием спектрофотометрии и изучение спектров поглощения отдельных фракций хлороформного экстракта из ЛГ Для разделения смеси веществ в хлороформном экстракте из ЛГ на отдельные составляющие или их группы был проведен хроматографический анализ экстракта и определены спектральные характеристики отдельных компонентов. На рисунке 10 представлена хроматограмма хлороформного экстракта из ЛГ при детектировании по поглощению на длине волны 430 нм.
Видно, что образец содержит довольно большое количество компонентов.
Идентифицированы - А2Е (пик № 15), iso-А2Е (пик № 17), а также окисленные формы А2Е (пики №№ 12 и 13). Природа пиков (1-11) с меньшими временами удерживания не известна. Можно предположить, что эти вещества представляют собой продукты фотодеградации или фотоокисления А2Е. Фракции 18 и 19 могут содержать такие конъюгаты ПТР, как A2-DHP-PE и A2-DHP-E (Wu et al., 2009), а также ПТР-димер, ПТР димер-E, ПТР-димер-PE (Kim et al., 2007).
Для определения спектральных свойств детектируемых веществ были отобраны фракции /а-з/, полученные при проведении хроматографического разделения веществ в хлороформном экстракте и зарегистрированы их спектры поглощения (рис. 11). Из рисунка видно, что по интенсивности спектров поглощения и их максимумов А2Е (пик № 15), iso-А2Е (пик № 17) и окисленные формы А2Е (фракция /е/, пики 12 и 13) являются доминирующими продуктами по поглощению в видимой области спектра (400-500 нм).
Рис. 10. Хроматограмма хлороформного экстракта из ЛГ (обращенная фаза).
Детектирование по поглощению на длине волны 430 нм. Колонка Диасфер 120 С (4*250 мм, размер сорбенкта 5 мкм), система: градиент от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% TFA) до 100% ацетонитрила за 20 минут;
скорость потока 1,5мл/мин.
Вертикальными линиями ограничены группы пиков, которые собирались в виде отдельных фракций для определения спектральных характеристик флуорофоров в экстракте. Эти фракции обозначены буквами /а-з/ (вверху хроматограммы).
Фракции /а-д/ в большей степени поглощают в ультрафиолетовой области и в меньшей степени – в области 400 нм. Фракция /з/ состоит из группы веществ, поглощающих как в коротковолновой области спектра (в области 300 нм), так и в длинноволновой (в области 500-600 нм).
Рис. 11. Спектры поглощения отдельных фракций в ацетонитриле, полученных при хроматографировании хлороформного экстракта из ЛГ.
Буквы обозначают фракции, а цифры номера отдельных пиков на хроматограмме (см.
рис. 10). Спектры получены при отборе фракций от однократного хроматографического анализа.
3.4.3. Результаты хроматографического анализа хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, с использованием флуоресцентной спектрофотметрии и изучение спектров флуоресценции отдельных фракций хлороформного экстракта ил ЛГ.
Для определения флуоресцентных свойств детектируемых продуктов, представленных на хроматограмме (рис. был проведен 10), хроматографический анализ на флуоресцентном детекторе. При этом для сравнения флуоресцентных свойств различных флуорофоров хроматограммы были сняты при разных длинах волн возбуждения (340, 430, 480) и эмиссии (соответственно, 470, 500, 540) (рис. 12). При сопоставлении хроматограмм по поглощению и флуоресценции (рис. 10 и 12, соответственно) отчетливо видно, что интенсивность флуоресценции А2Е по сравнению с другими продуктами не является доминирующей, как это считается в настоящее время (Sparrow et al., 2003;
Wu et al., 2010). Более того, при возбуждении длиной волны 480 нм флуоресценция А2Е практически исчезает на длине волны детектирования 540 нм. Это указывает на то, что в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна (длина волны возбуждения 488 нм) основной вклад могут давать более полярные, нежели А2Е, продукты, имеющие наименьшие времена удерживания.
A2E Рис. 12. Исследование влияния длины волны возбуждения на детектирование флуоресценции компонентов хлороформного экстракта из липофусциновых гранул при хроматографическом разделении (обращенная A2E фаза). Детектирование по флуоресценции, при различных длинах волн возбуждения и детектирования флуоресценции. Колонка Диасфер 120 С18 (4*250 мм, размер A2E сорбенкта 5 мкм), система: градиент от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% TFA) до 100% ацетонитрила за 20 минут;
скорость A2E потока 1,5мл/мин. А (А1) – возбуждение нм, детектирование эмиссии на 470 нм, Б – возбуждение 430 нм, детектирование эмиссии на 500 нм, В - возбуждение 480 нм, детектирование эмиссии на 540 нм.
Как видно из хроматограммы (рис. 12), наибольшая интенсивность флуоресценции обнаруживается у продуктов с характерными временами удерживания до 3-х минут (рис. 10, пики 1 и 2). Вклад флуоресценции этих продуктов остается доминирующим при различных длинах волн возбуждения (340, 430, 480 нм) и эмиссии (соответственно, 470, 500, 540 нм) (рис. 12).
Для более подробного анализа спектральных характеристик отдельных флуорофоров/групп флуорофоров в хлороформном экстракте детектируемые продукты, представленные на хроматограмме (рис. 10), были разделены на группы. В соответствии с этим было отобрано 8 фракций /а-з/ (рис. 10).
Флуоресцентные свойства отдельных фракций исследовали при возбуждении их флуоресценции различными длинами волн (280, 340, 430 и 488 нм). Несмотря на то, что естественный хрусталик практически не пропускает коротковолновый свет до 380-400 нм, тем не менее, для определения спектральных свойств всех исследуемых флуорофоров мы использовали для возбуждения флуоресценции и такие длины волн, как 280 и 340 нм.
а) Флуоресценция, при возбуждении длиной волны 280 нм. Из рисунка 13 видно, что самой сильной флуоресценцией обладает фракция /в/ (максимум в области 420 нм). Наименьшей интенсивностью флуоресценции обладают фракции /а/ и /е/. Все остальные фракции флуоресцируют примерно с одинаковой интенсивностью, независимо от интенсивности по поглощению в этой спектральной области (рис. 11).
Рис. 13. Спектры флуоресценции фракций хлороформного экстракта из ЛГ (длина волны возбуждения 280 нм), обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 10. Рисунок на вставке – спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ при возбуждении длиной волны 280 нм.
б) Флуоресценция, при возбуждении длиной волны 340 нм. Из рисунка 14 видно, что самой сильной флуоресценцией обладают фракции /в/ (максимум в области 420 нм) и /е/ (основные максимумы в области 375 и нм). Полосы флуоресценции этих продуктов по сравнению с остальными довольно узкие. Их спектральные диапазоны ограничиваются примерно нм для фракции /е/ и 500 нм для фракции /в/. Следовательно, эти продукты, скорее всего, не вносят существенного вклада в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна.
Рис. 14. Спектры флуоресценции фракций хлороформного экстракта из ЛГ (длина волны возбуждения 340 нм), обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 10. Рисунок на вставке – спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ при возбуждении длиной волны 340 нм.
в) Флуоресценция, при возбуждении длиной волны 430 нм. При возбуждении отдельных фракций хлороформного экстракта из ЛГ длиной волны 430 нм соотношение интенсивностей их флуоресценции заметно меняется. Из рисунка 15 видно, что наибольшей интенсивностью обладает фракция /а/. В то же время, при возбуждении флуоресценции фракций /в/, /г/, /д/ и /е/ флуоресценция практически не детектируется. Т.е., можно заключить, что исследуемые продукты из этих фракций, поглощающие в коротковолновой области спектра, скорее всего, не вносят существенного вклада в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна. Вместе с тем, продукты, содержащиеся во фракциях /в/, /г/, /д/ и /е/, содержат, судя по литературным данным, окисленные цитотоксичные формы флуорофоров, в первую очередь окисленные формы А2Е и iso-А2Е (Sparrow et al., 2003;
Jang et al., 2005).
В нашей работе идентифицированные окисленные формы А2Е (рис. 10, пики 12 и 13) принадлежат фракции /е/, которая при возбуждении светом нм и более длинноволновым светом уже практически не флуоресцирует.
Фракция /б/ также дает низкую интенсивность флуоресценции при возбуждении длиной волны 430 нм.
Наиболее длинноволновая флуоресценция из анализируемых фракций /а-з/ принадлежит А2Е, iso-А2Е (фракция /ж/) и последней фракции /з/ (максимумы в области 500 нм). Эти фракции вносят, практически, равноценный вклад в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ.
Рис. 15. Спектры флуоресценции фракций хлороформного экстракта из ЛГ (длина волны возбуждения 430 нм), обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 10. Рисунок на вставке – спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ при возбуждении длиной волны 430 нм.
Таким образом, если рассматривать спектральную область 500-600 нм, где детектируется суммарная картина аутофлуоресценции глазного дна, необходимо учитывать вклад не только флуорофоров А2Е и iso-А2Е, но и тех продуктов, которые находятся во фракциях /а/ и /з/. Природа продуктов во фракции /а/ неизвестна. Что касается фракции /з/, то судя по литературным данным, она может содержать, такие конъюгаты ПТР, как A2 DHP-PE и A2-DHP-E (Wu et al., 2009), а также ПТР-димер, ПТР-димер-E и ПТР-димер-PE (Kim et al., 2007).
г) Флуоресценция, при возбуждении длиной волны 488 нм. Для определения вклада отдельных флуорофоров в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна, регистрируемой в клинике с помощью коммерческого конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа («HRA-2, Heidelberg», Германия), мы использовали свет с длиной волны нм.
Из рисунка 16 видно, что в спектральной области 500-600 нм флуоресценция фракций /а/ и /з/ обладает сопоставимой интенсивностью с фракцией /ж/ (А2Е и iso-А2Е).
Кроме того, суммарная интенсивность всех остальных фракций также может вносить заметный вклад в общий спектр флуоресценции.
Рис. 16. Спектры флуоресценции фракций хлороформного экстракта из ЛГ (длина волны возбуждения 488 нм), обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 10. Рисунок на вставке – спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ при возбуждении длиной волны 488 нм.
Диаграмма распределения интенсивностей флуоресценции различных фракций при возбуждении длиной волны 488 нм и регистрации эмиссии на длине волны 570 нм представлены на рисунке 17.
Рис. 17. Диаграмма распределения интенсивностей флуоресценции, возбужденной на длине волны 488 нм, для фракций /а-з/ из хроматограммы на рисунке 10, в точке 570 нм. Вставка – диаграмма распределения интенсивностей флуоресценции, возбужденной на длине волны 488 нм, для суммированных фракций /а-е,з/ и отдельно изомеров А2Е (фракция /ж/) из хроматограммы на рисунке 10, в точке 570 нм.
Из этой диаграммы следует, что А2Е не является основным флуорофором в хлороформном экстракте из ЛГ. В суммарную картину флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ существенный вклад вносят также продукты, детектируемые при хроматографическом анализе на начальных временах удерживания (до 3-х минут) и продукты, выходящие после А2Е и всех его изомерных форм (после 20 минут).
ВЫВОДЫ.
1. Из липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека выделены отдельные флуорофоры и их группы, и определены их флуоресцентные характеристики.
2. Показано, что А2Е не является основным флуорофором в суммарном спектре флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. Наряду с А2Е значительной флуоресценцией обладают флуорофоры, более полярные, чем А2Е, к которым относятся также окисленные формы А2Е.
3. Исследовано действие света на флуорофоры липофусциновых гранул и отдельно на А2Е:
а) Показано, что в результате фотоокисления флуорофоров липофусциновых гранул максимумы спектров их флуоресценции смещаются в коротковолновую область на 25-40 нм.
б) Показано, что при фотоокислении раствора А2Е образуются как эпокси-, так и фураноидные его формы, а сама реакция протекает при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.
4. Исследовано относительное содержание неокисленных и окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах в зависимости от возраста (кадаверные глаза без видимых офтальмологических патологий согласно протоколу, представленному МНТК «Микрохирургия глаза») а) Показано, что в процессе старения относительное содержание окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах увеличивается.
б) Регистрация флуоресценции неокисленных и окисленных форм флуорофоров может лежать в основе разработки компонентного спектрального анализа аутофлуоресценции глазного дна – нового неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных глазных заболеваний.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:
1. М.А. Яковлева, Н.Л. Сакина, А.С. Кононихин, Т.Б. Фельдман, Е.Н.
Николаев, А.Е. Донцов, М.А. Островский. Обнаружение и исследование продуктов фотоокисления флуорофора липофусциновых гранул из клеток пигментного эпителия глаза человека N-ретинилиден-N-ретинилэтаноламин (А2Е). ДАН, 2006, № 409, с. 411-414.
2. Яковлева М.А., Фельдман Т.Б., Полонская З.М., Донцов А.Е., Борзенок С.А.1, Тахчиди Х.П.1, Островский М.А Вызванные видимым светом изменения спектров флуоресценции флуорофоров липофусциновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. Офтальмохирургия, 2009, №5, с. 59-64.
3. Фельдман Т.Б., Яковлева М.А., Донцов А.Е., Островский М.А. Спектры флуоресценции и возбуждения флуорофоров липофусциновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. Известия академии наук. Серия химическая, 2010, №1, с. 269-276.
4. М. А. Яковлева, Т. Б. Фельдман, А. С. Крупенникова, С. А. Борзенок, М. А.
Островский. Флуорофоры липофусциновых гранул, ответственные за аутофлуоресценцию глазного дна человека. Известия академии наук. Серия химическая, 2010, №12, с. 2252-2260.