Диазотрофы содовых солончаков
На правах рукописи
Сорокин Иван Дмитриевич Диазотрофы содовых солончаков Специальность 03.00.07 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва, 2008 2
Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН
Научный консультант: кандидат биологических наук И.К. Кравченко
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Т.Н. Жилина доктор биологических наук А.Л. Степанов
Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Защита диссертации состоится « 12 » мая 2008 г. в 14-00 ч на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, г. Москва, Проспект 60-лет Октября, д.7, к.2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН
Автореферат разослан « » апреля 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Азотфиксация (АФ) является важнейшим звеном в глобальном цикле азота и наряду с фиксацией углекислоты обеспечивает продуктивность биосферы в целом. Многие природные экосистемы лимитированы по доступным соединениям азота, что придает процессу азотфиксации особое значение в круговороте биогенных элементов. Традиционно основное внимание исследователей было направлено на изучение симбиотической азотфиксации в связи с ее значимостью для сельского хозяйства.
Однако за последние годы было убедительно показано, что диазотрофия широко распространена среди прокариот, и микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, присутствуют практически во всех экосистемах, не связанных с агрокультурой (Zehr, 2003). Именно способность к азотфиксации дает возможность прокариотам существовать в эконишах с крайне низким содержанием азота, а также обогащать окружающую среду азотными соединениями.
Исследования процесса азотфиксации в засоленных почвах выполнены главным образом, в таких странах как Пакистан, Индия, Египет, где большие территории возделываемых земель подвержены засолению (Rai, 1991;
Zahran et al., 1995;
Abd-Alla, 1999). Однако они не распространяются на почвы содовых солончаков, характерной особенностью которых является высокая щелочность. В нашей стране почвы содового засоления можно отнести к экзотическим местообитаниям за исключением Юго-Западной Сибири и Забайкалья. В то же время они представляют уникальный природный объект для изучения галоалкалофильных микроорганизмов - экологической группы, которая обладает рядом физиологических особенностей, обусловленных средой обитания.
Изучение процесса азотфиксации важно также для агрономии, которая пытается решить проблемы увеличения плодородия в этих почвах.
В отличие от содовых солончаков, микроорганизмы содовых озер активно исследуются микробиологами в течение последних 10-15 лет (Жилина и др., 2001, 2005;
Jones et al., 1998;
Baumgarte, 2003;
Sorokin and Kuenen, 2005). Благодаря исследованиям, выполненным сотрудниками ИНМИ РАН, получена достаточно полная картина основных компонентов галоалкалофильного сообщества и их взаимодействий (Заварзин и др., 1999). В то же время, сведения о процессе АФ и составе диазотрофных сообществ в содовых местообитаниях остаются весьма ограниченными (Herbst, 1998;
Steward et al., 2004).
В связи с изучение активности и биоразнообразия азотфиксирующих диазотрофов в почвах содовых солончаков, для которых характерно как высокое содержание солей, так и высокая щелочность, представляет научный и практический интерес. В контексте настоящей работы представлялось важным выяснить, существуют ли отличия в диазотрофной микрофлоре содовых солончаков от того, что известно для содовых озер.
Целью данной работы являлось изучение процесса АФ и характеристика диазотрофных микроорганизмов в почвах содового засоления.
В задачи исследования входило:
1. Определение потенциальной АФ в содовых солончаках различной географической принадлежности.
2. Изучение влияния различных факторов на АФ микробных популяций содовых солончаков.
3. Выделение и исследование накопительных культур азотфиксирующих бактерий из образцов содовых солончаков.
4. Выделение, характеристика и таксономическое описание чистых культур диазотрофов из содовых солончаков.
5. Изучение структуры диазотрофных сообществ в накопительных культурах методом молекулярного анализа гена nifH.
Научная новизна. Впервые установлено наличие потенциальной способности к АФ в почвах содового засоления различных географических регионов. С помощью культуральных и молекулярных методов установлено преобладание в диазотрофных накопительных культурах, выделенных при рН 10, грамположительных бактерий с низким ГЦ, относящихся к бациллам и сульфидогенным клостридиям. Из содовых солончаков Центральной Азии и Египта выделены 11 чистых культур галоалкалофильных азотфиксирующих бацилл РНК групп 1 и 6, в которых АФ не была известна. На основании физиологических и филогенетических признаков восемь изолятов описывается как новый род и новый вид “Natronobacillus azotifixans”, два изолята классифицированы как новый вид “Amphibacillus diazotrophicus” и один изолят как новый вид “Bacillus alkalidiazotrophicus”. Все выделенные чистые культуры являются облигатными бродильщиками, рост и АФ активность которых возможны только в щелочных условиях с оптимумом рН 9-10. АФ активность клеток подавлялась уже умеренными концентрациями солей натрия ( 2 M Na+).
Практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о том, что, при наличии благоприятных условий (увлажнение и частичное рассоление) содовые солончаки могут осуществлять одну из важнейших функций плодородных почв – фиксацию атмосферного азота.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2005, Москва, Россия;
III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2007, Москва, Россия;
Second International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (MicroBioWorld), 2007, Севилья, Испания.
Публикации. Основные материалы, обсуждаемые в диссертации, содержатся в статьях и 3 тезисах конференций. 2 статьи сданы в печать.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, описания методов и объектов, экспериментальной части, выводов и списка литературы.
Текст включает 98 страниц, 13 таблиц, 22 рисунка;
список литературы включает 138 наименований, из них 13 на русском и 125 на английском языке.
Место проведения работы и сотрудничество. Микробиологическая часть работы выполнялась в Институте микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН под руководством к.б.н. И.К.Кравченко. Молекулярно-биологическая часть работы выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН при содействии к.б.н.
Е.С.Булыгиной. Образцы содовых солончаков были собраны как в ходе собственной экспедиции в Кулундинскую степь, так и предоставлены д.б.н.
Д.Ю.Сорокиным.
Молекулярный анализ гена nifH был выполнен в сотрудничестве с к.б.н.
Е.С.Булыгиной и асп. Е.В. Задориной, сиквенс-анализ генов 16S-rRNA– с к.б.н.
Т.В. Колгановой. Филогенетический анализ был выполнен к.б.н. Т.П.Туровой, ДНК-ДНК гибридизация – к.б.н. А.М. Лысенко, анализ жирных кислот – д.б.н.
Г.А. Осиповым. Автор выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследований. В работе было использовано 56 образцов содовых солончаков (верхний горизонт 0-5 см), отобранных в 6 регионах, из которых находились в Центральной Азии и 1 – в Северной Африке. Величина рН водной вытяжки варьировала от 9.2 до 10.7, содержание водорастворимых солей – от 1 до 38%, а величина растворимой щелочности – от 20 до 1740 ммол/кг (Табл. 1).
Измерение потенциальной активности азотфиксации (АФ) проводили с помощью ацетиленового метода. Образцы почв образцы увлажняли и выдерживали 2 суток, после этого добавляли раствор глюкозы и вводили 10% ацетилена в газовую фазу. При анализе накопительных и чистых культур ацетилен вводили после видимого прироста биомассы. В газовой фазе периодически измеряли методом газовой хроматографии накопление этилена как индикатора нитрогеназной активности.
Таблица 1. Характеристика образцов содовых солончаков Характеристика образцов Количество рН водной Регион Растворимые Щелочность образцов вытяжки соли (%) ммоль/кг (1:5) Араратская долина 8 9.7- 10.2 0.9-38.8 20- (Армения) Кункурская степь (Читинская 5 9.2-9.9 2.5-7.6 20- область) Барабинская степь (Новосибирская 9 9.8-10.7 2.5-6.0 10- область) Кулундинская степь (Алтайский 7 9.6-10.21 5.3-38.5 230- край) Северо-Восточная 24 9.7-10.8 1.2-12.85 10- Монголия Вади Натрун 3 10-10.3 8.5-10.2 750- (Египет) Выделение накопительных и чистых культур диазотрофов. Для получения активных азотфиксирующих культур использовали минеральную среду на основе карбонатного буфера с содержанием общего натрия 0.6, 2.0 и 4.0 М с максимальной буферной емкостью в диапазоне рН от 9.5 до 10.2. Преимущество данной среды состоит в том, что даже при низкой ее концентрации значения рН остаются стабильным в щелочном диапазоне значений как после стерилизации, так и в ходе длительной инкубации. В качестве субстрата в основном добавляли глюкозу. При выделении накопительной культуры среда не содержала связанного азота, а для чистых культур вносили 10 мг/л дрожжевого экстракта. Выделение накопительных культур проводили из образцов почв различных регионов с наивысшей потенциальной АФ. Чистые культуры диазотрофов выделяли из накопительных культур с устойчивой АФ с использованием сред, содержащих 0. - 2.0 М общего Na+. Из накопительных культур производили десятикратные разведения, выбирали максимальное разведение, где была зарегистрирована АФ, и делали из него высев на агаризованные среды. Колонии различных морфотипов отбирали под контролем бинокуляра и переносили в соответствующую жидкую среду без азота. После проверки на АФ активные культуры повторно проводили через твердую среду до тех пор, пока не достигали однотипности колоний.
Конечную чистоту выделенных культур проверяли путем секвенирования гена 16S rРНК.
Работа с чистыми культурами. Для оценки влияния концентрации Na+ на рост чистых культур использовали карбонатный буфер (рН 10), а для оценки влияния рН использовали буфер HEPES/NaCl (рН 6-8) и NaHCO3/Na2CO3/NaCl (pH 8-11.5).
В опытах по влиянию рН обязательно регистрировали его изменения в ходе роста и в разделе «Результаты» представлены конечные значения. Влияние рН и солености на АФ изучали в «острых» опытах с отмытыми клетками в анаэробных условиях в присутствии 1 мМ сульфида. Активность дыхания измеряли на отмытых клеточных суспензиях с помощью кислородного электрода. Каталазную активность определяли с помощью иодометрического метода.
Молекулярно-биологические методы. Геномную ДНК выделяли с помощью стандартной процедуры щелочного гидролиза с незначительными модификациями, а ее очистку проводили с помощью Wizard-технологии фирмы Promega (США). Фрагмент гена 16S rRNA амплифицировали с использованием универсальных праймеров 11F и 1492R, а фрагмент гена nifH с помощью пары вырожденных праймеров F1-R6 (Марусина и др. 2001. Продукты ПЦР очищали в легкоплавкой агарозе с применением набора PCR-Preps (Promega, США). ПЦР фрагменты nifH гена клонировали согласно протоколу фирмы Promega “pGEM-T и pGEM-T Easy vector systems technical manual” (1997). В качестве векторной системы использовали вектор pGEM-T Easy Vector System I (Promega, США).
Рестрикционный анализ плазмидной ДНК осуществляли с помощью фермента XapI (Apol). Денатурирующий градиентный гель-электрофорез фрагментов гена 16S rРНК (DGGE) проводили согласно протоколу (Schafer and Muyzer, 2001) с использованием денатурирующего градиента 30-70% под напряжением 100 В в течение 16 ч при 60 оС. Сиквенс генов 16S rРНК и nifH проводили в Центре «Биоиженерия» РАН с использованием автоматического капиллярного секвенатора (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, США). Для предварительного анализа полученных нуклеотидных последоватеотностей генов 16S rРНК и nifH использовали программу BLAST. Транслирование нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы ORF Finder, а выравнивание последовательностей - с помощью программы Clustal W 1.75.
Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма “neighbor-joining” (NJ) в программе TREECON.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Потенциальная АФ содовых солончаков различных регионов.
Потенциальная АФ была зарегистрирована в 47 из 56 исследованных образцов и варьировала в широком диапазоне от 0.01 до 47.1 мкг N г-1 сут-1 (Табл.
2). В наиболее активных образцах процесс начинался либо немедленно, либо после короткой лаг-фазы (менее суток) после внесения глюкозы, однако в большинстве случаев активность проявлялась лишь после длительной лагфазы (2-3 сут.), что может свидетельствовать либо о незначительным исходном количестве диазотрофов, либо о их нахождении в виде глубоко покоящихся форм (спор).
Таблица 2. Потенциальная АФ в содовых солончаках Количество образцов с АФ = Количество [мкг N (г. сут)-1] Регион образцов 0.1-10 10-20 20-30 30-40 40- Армения 8 0 0 3 0 Кункурская степь 5 1 0 0 0 Барабинская степь 2 0 2 0 0 Кулунда-север 7 3 2 2 0 Кулунда-юг 7 6 1 0 0 Монголия 24 16 5 1 1 Египет 3 3 0 0 0 Зональные * 3 0 0 0 3 (контроль) Зональные (незасоленные) почвы: дерново-подзолистая, cерая лесная, чернозем выщелоченный (рН от 5.5 до 7.2).
В целом можно констатировать угнетение АФ высокой соленостью и щелочностью, хотя для нескольких образцов с достаточно высокими показателями была выявлена значительная величина АФ. Специальный эксперимент с одним из образцов Кулундинской степи с высокой соленостью показал, что популяция диазотрофов находилась в неактивном состоянии до момента разбавления солевого пула в несколько раз. Аналогичный эксперимент с низкосоленым образцом почвы Барабинской степи (рН 11) показал, что диазотрофы содовых солончаков успешно выживали в условиях с высоким рН среды и оптимум для АФ составлял рН 9.5-9.8.
2. Выделение диазотрофных накопительных культур из образцов содовых солончаков.
Для получения накопительных культур диазотрофов использовали образцы почв содового засоления юга Кулундинской степи, Монголии и Египта, которые, с одной стороны, характеризовались высокой щелочностью а, с другой стороны, обладали существенной потенциальной АФ. Всего в работе было использовано образцов содовых солончаков: 3 образца из Кулундинской степи (13KS, 22KS, 24KS), 12MS - из Монгольской степи и ES 3 - из Египта. Наиболее активные накопительные культуры со стабильно поддерживаемой АФ были получены в статических условиях культивирования с соотношением среда/воздух 3:1 и глюкозой в качестве субстрата. При этом активность сохранялась и при замене воздуха на аргон, что свидетельствовало о селекции диазотрофов-бродильщиков.
Рост всех культур происходил до насыщения среды содой (4 M Na+), однако при + этом АФ резко снижалась при увеличении солености выше 2 M Na за исключением накопительной культуры из наиболее соленого образца 22KS, где слабая АФ была зарегистрирована даже при насыщении содой. Эти данные позволили предположить доминирование в накопительных культурах умеренно галофильных алкалофильных диазотрофов. Микроскопия культур указывала на преобладание грам-положительных, эндоспор-образующих форм, что было подтверждено DGGE анализом 16S rРНК трех накопительных культур (Рис.1).
Идентифицированные ампликоны были отнесены к РНК группе 6-7 рода Bacillus, для представителей которой диазотрофия неизвестна. Однако данный анализ не дал ответ на вопрос, кто из этих компонентов может быть диазотрофом. По современным представлениям все диазотрофные виды группы бацилл сосредоточены в роде Paenibacillus (Achouak et al., 1999). Данный род включает и алкалофильные виды, однако они не обладают диазотрофной активностью (Coelho et al., 2003). В наших накопительных культурах присутствие бактерий этой группы не обнаружено.
13KS 24 KS 12 MS B. arseniciselenatis 13 KS_DGGE Band 24 KS DGGE Band 100 B. halodurans DSM B. halodurans AH- B. alcaliinulinus B. alcalophilus YB B. alcalophilus DSM 3 B. pseudofirmus DSM 99 B. pseudofirmus OF B. vedderi 13 KS_DGGE Band 1 4 B.selenatireducens 6 24 KS DGGE Band 2 12 MS_ DGGE Band 5 B. agaradhaerens 7 B. carboniphilus JCM B. sporothermodurans M B. fumarioli LMG 0. B. methanolicus C B. subtilis Рис.1 DGGE-анализ накопительных диазотрофных культур и результаты филогенетического анализа ампликонов 16S rРНК гена накопительных культур, полученных с помощью DGGE. Полосы 3 и 7 реамплифицировать не удалось.
3. Выделение чистых культур анаэробных диазотрофных галоалкалофилов из накопительных культур.
Анализ предельные разведений накопительных культур, проведенный на средах с глюкозой при 0.6 М-2.0 М Na+ (13 KS, 24 KS, 12 MS) и 2-4 М Na+ (22 KS) в микроаэробных условиях, показал, что диазотрофный компонент составляет не более 0.1% от общего количества клеток, вырастающих на безазотистой щелочной среде. Чистые культуры выделяли путем многократных рассевов серийных разведений на твердые агаризованные среды и всего было получено культуры, способные к росту на безазотистой жидкой среде с глюкозой. Из них только 11 штаммов при пересеве в жидкую среду обладали нитрогеназной активностью до 6 нмоль N2/(мг белка ч), которая была также подтверждена детекцией nifH гена (Табл. 3). Все изоляты представлены подвижными грам положительными перитрихами, образующими эндоспоры. Доминировал морфотип 1-1 с удлиненными клетками и обильным спорообразованием ( штаммов), а два штамма морфотипа 1-2 из высокосоленого образца 22KS отличались укороченными клетками, редким спорообразованием и отсутствием полисахаридов, образуемых доминирующим морфотипом 1-1. Наконец, единственный штамм MS 6 морфотипа 2 из Монгольского образца имел клостридиальную форму клеток, явно отличаясь от остальных штаммов (Рис. 2).
Таблица 3. Чистые культуры диазотрофных бактерий, выделенные из микроаэробных накопительных культур из содовых солончаков на средах с глюкозой при рН 10.
№ Соленость ГЦ моль% Источник Морфотип* + штамма среды, М Na В ДНК 13KS-1 13KS 0.6 1-1 24KS-1 0.6 36. 1- 24KS 24KS-2 1.3 37. 1- 22KS-2 2.0 39. 1- 22KS 22KS-4 4.0 38. 1- MS4-1 0.6 38. 1- MS MS5 1.3 38. 1- MS6 0.6 37. ES1 0.6 37. 1- ES ES2 1.3 36. 1- ES3 2.0 37. 1- 4. Идентификация диазотрофов из содовых солончаков.
Филогенетический анализ последовательностей гена 16S rРНК показал, что все выделенные штаммы попадают в кластер бацилл с низким ГЦ в 16S rРНК группах 1 и 6, в которых гало- и алкалофилия весьма распространены (Рис. 3).
Анализ выявил три филотипа, совпадающих с морфотипическим делением.
Доминирующий морфотип 1-1, включающий 8 штаммов, образует отдельную ветвь, кластирующуюся с галоалкалофильным бродильщиком из содовых озер Amphibacillus tropicus (Жилина и др., 2001). Подтип 1-2 этой группы близок к другому галоалкалофильному виду рода Amphibacillus - Amphibacillus fermentum, описанному в той же работе. Штаммы группы 1-1 между собой имели высокий процент сходства последовательностей, указывающий на принадлежность к MS одному геновиду, что также подтверждается сходством тотальных белков и уровнем ДНК гибридизации (70%). В то же время уровень сходства с ближайшим родственником A. tropicus (95% сходства нуклеотидных последовательностей, 30-35% ДНК-ДНК гомологии) предполагает различие на уровне далеких видов или даже близких родов. Штаммы морфотипа 1-2 также очень близки между собой (85% ДНК гомологии) и образуют кластер видового уровня в группе A. fermentum-A.xylanus. ДНК гомология с группой 1-1 – менее 30%.
Тип 1- Тип 1- MS4- 22КS- Тип 1- Тип 24КS- MS 24KS Рис. 2 Морфология чистых культур диазотрофных бактерий из содовых солончаков, выращенных в микроаэробных условиях с глюкозой при рН 10.
Таким образом, стало очевидным, что род Amphibacillus требует ревизии. В его основе находятся типовой вид A.xylanus, образующий монофилетическую группу с A. fermentum и диазотрофные штаммы 22KS-2 и 22KS-4. Напротив, вид A. tropicus и группа 1-1 диазотрофных штаммов из содовых солончаков образуют независимую ветвь родового уровня. В пользу необходимости такой реорганизации свидетельствует и факт недавнего описания нового рода Halolactibacillus внутри кластера “Amphibacillus” (Ishikawa et al., 2005). Наше предложение по таксономической реорганизации группы “Amphibacillus”, с учетом вновь выделенных диазотрофных представителей из содовых солончаков, сводится к следующему:
1 – в род Amphibacillus sensu stricto входят типовой вид A.xylanusТ, вид A.
fermentum из содовых озер и новый вид “Amphibacillus diazotrophicus” sp. nov., включающий штаммы 22KS-2 и 22KS-4 из содовых солончаков (морфотип 1-2).
2 – диазотрофные штаммы доминирующего морфотипа 1-1 из содовых солончаков (24 KS-1, 24 KS-2, 13KS-1, MS5, MS4-1, ES1, ES2, ES3) предлагается выделить в новый род и вид “Natronobacillus azotifixans” gen. nov. sp. nov. со штаммом 24 KS-1 в качестве типового.
3 – вид Amphibacillus tropicus следует реклассифицировать в качестве новой комбинации “Natronobacillus tropicus” comb. nov.
Несмотря на значительную филогенетическую дистанцию низкий уровень ДНК гомологии, фенотипически A.tropicus достаточно близок изолятам группы 1-1 из содовых солончаков, поэтому логично объединить их в один род.
Наконец, морфотип 2, представленный штаммом MS 6, попадает в РНК группу 6 бацилл с B. arseniciselenatis в качестве ближайщего родственника (Рис.
3). Именно этот филотип и был обнаружен нами методом DGGE в накопительных культурах из Кулундинских образцов (см. рис. 1). Штамм MS 6 сильно отличается от B.arseniciselenatis фенотипически и его филогенетическая дистанция также позволяет описать его в качестве нового вида “Bacillus alkalidiazotrophicus” sp. nov. Уровень ДНК гомологии с B.arseniciselenatis = 60%.
Таким образом, результаты анализа изолятов не совпадали с данным молекулярной детекции. В первом случае доминирующий филотип относится к группе “Amphibacillus”, не детектируемым ни в одной из накопительных культур молекулярным методом. Во втором - один из “доминирующих” филотипов представлен лишь одной культурой из 11 выделенных. Для прояснения ситуации была применена параллельная детекция ключевого функционального гена азотфиксации nifH.
5. Характеристика чистых культур диазотрофных алкалофилов.
Все 3 морфо/фило-типа диазотрофов являются облигатными анаэробами с бродильным типом метаболизма. По этому признаку группы 1-1 и 1-2 сходны с ближайшими родственниками среди амфибацилл, описанными как «аэротолерантные бродильщики» (Жилина и др., 2001). В то же время штамм MS 6, несмотря на филогенетическую близость к Bacillus arseniciselenatis, в отличие от этого необычного анаэроба, устойчив к кислороду и является облигатным бродильщиком, подобно представителям групп 1-1 и 1-2. Наши штаммы, в противоположность амфибациллам из содовых озер, могли расти в условиях усиленной аэрации. Однако при этом потребление кислорода клетками было рудиментарным (1-2 нмоль/(мг белка мин) и, скорее всего, сводилось к флавиновому дыханию.
0. ‘N. azotifixans’ 13KS-1, EU ‘N. azotifixans’ 24KS-2, EU “Natronobacillus ‘N. azotifixans’ ES1, EU ‘N. azotifixans’ MS4-1, EU ‘N. azotifixans’ ES2, EU ‘N. azotifixans’ MS5, EU ” ‘N. azotifixans’ ES3, EU ‘N. azotifixans’ 24KS-1T, EU ‘N. tropicus’ Z-7792T, AF Halolactibacillus xiariensis H-5T, EF Halolactibacillus halophilus M2-2T, AB Halolactibacillus miurensis M23-1T, AB ‘A. sediminis’, AB Amphibacillus sp. YIM-kkny10, AY Bacillus Amphibacillus Amphibacillus sp. YIM-kkny6, AY121432 РНК группа A. xylanus JCM 7361T, D A. fermentum Z-7984T, AF ‘A. haojiensis’ T2, AF ‘A. diazotrophicus’ 22KS-4T, EU 100 ‘A. diazotrophicus’ 22KS-2, EU Gracilibacillus halotolerans DSM 11805T, AF 97 Gracilibacillus dipsosauri NCFB 3027T, X Virgibacillus pantothenticus IAM 11061T, D Virgibacillus proomii LMG 12370T, AJ Halobacillus halophilus NCIMB 2269T, X Halobacillus litoralis DSM 10404T, X Bacillus arseniciselenatis DSM 15340T, AJ “Bacillus alkalidiazotrophicus” MS 6T, EU Bacillus Bacillus pseudofirmus DSM 8715T, X76439 РНК группа Bacillus halodurans DSM 497T, AJ Bacillus alcalophilus DSM 485T, X Рис.3. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа сиквенсов 16S rРНК гена, показывающие положение диазотрофных штаммов из содовых солончаков среди представителей РНК группы 1 и 6 бацилл с низким ГЦ Последнее как раз и приводит к образованию перекиси водорода, активно разлагаемой каталазой. Количественные измерения каталазной активности у выделенных штаммов показали, что их уровни близки к таковым у микроаэрофилов и составили следующие величины, нмоль H2O2/(мин мг белка):
MS 6 (400);
22 KS-4 (120);
MS 5 (220). В то же время диазотрофные бродильщики из содовых солончаков обладают экстраординарной устойчивостью к сульфиду, которую можно объяснить только снижением ингибирующего эффекта данного высокотоксичного соединения в условиях высокого рН. При росте на среде с глюкозой при рН 10 рост представителей группы 1-1 и 1-2 существенно ингибировался при концентрации сульфида более 120-150 мМ Такие концентрации известны лишь для одного местообитания - содового озера Soap Lake в штате Вашингтон (Sorokin et al, 2007). Среди продуктов брожения глюкозы при рН 10 у представителей всех 3 групп в качестве основных продуктов были обнаружены этанол, ацетат и формиат и в качестве минорных – пируват и лактат.
Состав основных продуктов идентичен описанному для амфибацилл из содовых озер (Жилина и др., 2001). Сравнение субстратного профиля представителей группы 1 диазотрофных бродильщиков с родственными видами амфибацилл показало их существенное сходство (Табл. 4). В то же время штамм MS 6 явно отличался от группы “Amphibacillus”.
Таблица 4. Сравнительные характеристики аэротолерантных сахаролитических алкалофильных диазотрофов из содовых солончаков.
"Bacillus "Natronobacillus "Amphibacillus Amphibacillus Свойства tropicus Z-7792T Amphibacillus azotifixans" diazotrophicus" alkalidiazo 24KS-1Т 22KS-4T (Жилина и др., fermentum trophicus" MS 6T Z-7984T /ES1/13KS-1 2001)=“Natrono bacillus tropicus" Морфология овоиды палочки палочки палочки палочки Размеры, 0.8-1.02-3 0.4-0.52.0-6.0 0.4-0.52.0-4.0 0.4-0.52.0-6.0 0.5-0.751.5 мкм 4. Подвижно- перитрих перитрих перитрих перитрих субтерми сть нальный жгутик Эндоспоры + + + + Желтый - + + н.о. н.о.
пигмент Каталаза + + + + + Na+ М, 0.1-1.2 (0.3) 0.2-4.0 (1.0-1.5) 0.2-4.0 (1.0) 0.17-3.6(1.0-1.87) 0.17-3. (оптимум) (1.87) Зависимость - - - - от Cl рН, 7.8-10.4 8-10.5 (9.5-10) 8-10.5 (9.5-10) 8.5-11.5 (9.5-9.7) 7.0-10. (оптимум) (9.5-10) (8.0-9.5) ТoС 32 35-38 35-38 38 36- Сбраживаемые субстраты D-рибоза - w/w/+ w - D-ксилоза - + + - D-арабиноза - w/w/- w - + D-глюкоза + + + + D-фруктоза + + + - + D-манноза - w + - + D-галактоза - + - - Глицерин - - - - Маннит + - + - L-инозит - -/-/w - + Мезо- - - - н.о. н.о.
эритрит Сахароза + + + + + D-мальтоза + w/+/+ + + D-лактоза w w/w/w + - Мелибиоза + -/w/w + + Мелицитоза + -/w/w - н.о. н.о.
Трегалоза + - + + + D- + + + + целлобиоза Рафиноза + -/-/+ - н.о. н.о.
Крахмал + + + + + Гликоген + +/w/w w + + Ксилан - w/w/w w + + D- + - - - глюкозамин Конечные Ацетат, Ацетат, этанол, Ацетат, этанол, Ацетат, этанол, Ацетат, продукты этанол, формиат формиат формиат этанол, брожения формиат формиат µmax (ч-1) 0.50 0.15 0.16 0.07 0. Г+Ц, мол.% 37.1 37.2/37.0/36.6 36.5 39.2 42. Место Содовые солончаки Содовые оз.Магади, оз. Нижнее выделения Северо-Восточная Монголия, солончаки Кения Белое, Юго-Западная Сибирь, Египет Кулундинская Забайкалье степь w – слабый рост;
н.о. – не определено По составу жирных кислот штаммы из содовых солончаков групп 1-1 и 1-2 ближе между собой, чем с реперными видами амфибацилл. Это может служить свидетельством того, что состав липидов (по крайней мере у данной группы) более отражает экофизиологический статус клетки, чем таксономию.
Описание новых диазотрофных галоалкалофилов, выделенных из содовых солончаков.
1. Amphibacillus diazotrophicus sp. nov.
(di.a.zo.tro’phi.cus M.L. masc. adj. diazotrophicus потребляющий молекулярный азот ) Клетки - палочки, одиночные или в парах, 0.4-0.51.5-3 мкм. Подвижны и имеют несколько перитрихальных жгутиков. Клеточная стенка – грамположительного типа. Образует терминальные круглые эндоспоры с невысокой частотой. Облигатный анаэроб, но устойчив к кислороду и обладает высокой каталазной активностью. При анаэробном росте сбраживает глюкозу, ксилозу, маннозу, маннит, фруктозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, мелибиозу, лактозу, в слабой степени - рибозу и арабинозу. Продуктами брожения глюкозы являются формиат, ацетат и этанол. Гидролизует крахмал и в слабой степени гликоген и ксилан. Нуждается в дрожжевом экстракте. Высокая сульфидотолерантность. Способен к азотфиксации. Облигатный алкалофил с пределами роста при рН 7.5-10.6 и оптимумом 9.0-9.5. Рост не зависит от ионов хлора. Облигатно зависит от иона натрия с ростом в пределах от 0.2 М до 4 М и оптимумом около 1 M Na+. Мезофил с оптимумом при 35-38oС. Содержание Г+Ц пар в ДНК 36.5-37 мол.%. Выделен из содового солончака Кулундинской степи (Алтайский край). Типовой штамм 22KS-4T депонирован в DSMZ (DSM18269) и в Коллекции культур ИНМИ (UNIQEM) под номером U381.
2. Natronobacillus azotifixans gen. nov. sp. nov.
Natronobacillus gen. nov.
(Nat.ro.no.ba.cil’lus L. n. natron сода, карбонат натрия;
L. n. bacillus маленькая палочка;
M.L. masc. n. Natronobacillus палочка, нуждающаяся в соде) Длинные, часто искривленные тонкие палочки с перитрихальным жгутикованием.
Грамположительные, с терминальной эндоспорой. Тип метаболизма – бродильный. Каталазо-положительные. Высоко аэро- и сульфидо-толерантные.
Характерна диазотрофная активность и содо-алкалофилия. Представитель 16S rРНК группы 1 бацилл с низким ГЦ. Местообитание – содовые солончаки.
Типовой вид – N. azotifixansазот.
Natronobacillus azotifixans sp. nov.
(a.zo.ti.fi’xans Fr. n. azot азот;
M.L. часть. adj. fixans связывающий;
N.L. adj.
azotifixans азотфиксирующий ) Клетки - палочки, одиночные или в парах, 0.4-0.52-6 мкм. Подвижны и имеют несколько перитрихальных жгутиков. Клеточная стенка – грамположительного типа. Образует терминальные круглые эндоспоры с невысокой частотой.
Облигатный анаэроб, но устойчив к кислороду и обладает высокой каталазной активностью. При анаэробном росте сбраживает глюкозу, ксилозу, маннозу, маннит, фруктозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, мелибиозу, лактозу и в слабой степени рибозу, арабинозу и мелицитозу. Некоторые штаммы используют раффинозу. Продуктами брожения глюкозы являются формиат, ацетат и этанол.
Гидролизует крахмал, гликоген и ксилан. Нуждается в дрожжевом экстракте.
Обладает высокой сульфидотолерантностью. Способен к азотфиксации.
Облигатный алкалофил с пределами роста при рН 7.5-10.6 и оптимумом 9.0-10.
Рост не зависит от ионов хлора. Облигатно зависит от иона натрия с ростом в пределах от 0.2 М до 4 М и оптимумом около 1 M Na+. Мезофил с оптимумом при 35-38oС. Содержание Г+Ц пар в ДНК 36-37.5 мол.%. Местообитание - содового солончаки. Включает близкородственные штаммы, полученные из солончаков Центральной Азии и Африки. Типовой штамм 24KS-1T депонирован в DSMZ под номером DSM18273 и в Коллекции культур ИНМИ РАН (UNIQEM) под номером U378. Выделен из содового солончака Кулундинской степи Алтайского края.
3. Bacillus alkalidiazotrophicus sp. nov.
[al.ka.li.di.a.zo.tro’phi.cus N.L. at. n. alkali (from Arabic al qaliy soda ash);
M.L.
masc. adj. diazotrophicus потребляющий молекулярный азот);
M.L. adj.
alkalidiazotrophicus алкалофил, фиксирующий азот] Клетки – палочки с заостренными концами, 0.6-1.2 3-8 мкм, подвижные с помощью нескольки перитрихальных жгутиков, часто собирающиеся в агрегаты.
Клеточная стенка грамположительного типа. Образует терминальные и субтерминальные овальные эндоспоры, слегка раздувающие клетку. Облигатный анаэроб, но устойчив к кислороду и обладает высокой каталазной активностью.
При анаэробном росте сбраживает глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, мелибиозу, мелицитозу, раффинозу, трегалозу, маннит и в слабой степени лактозу. Продуктами брожения глюкозы являются формиат, ацетат и этанол. Гидролизует крахмал и гликоген. В дрожжевом экстракте не нуждается.
Высокая сульфидотолерантность. Способен к азотфиксации. Облигатный алкалофил с пределами роста при рН 7.8-10.6 и оптимумом 9.5. Рост не зависит от ионов хлора. Облигатно зависит от иона натрия с ростом в пределах от 0.1 М до 1.2 М и оптимумом около 1 M Na+. Мезофил с оптимумом при 35oС.
Содержание Г+Ц пар в ДНК 37.1 мол.%. Местообитание - содовые солончаки.
Типовой штамм - MS 6T депонирован в DSMZ (DSM18275) и в Коллекции культур ИНМИ РАН (UNIQEM) под номером U377. Выделен из содового солончака Северо-восточной Монголии.
6. Влияние рН и солей на рост.
Все выделенные штаммы относятся к натронофилам, что означает независимость от ионов хлора с оптимальным ростом в растворах соды. Данное свойство весьма характерно для изолятов из содовых озер. Однако почвенные организмы с подобным предпочтением до сих пор не описаны. При анаэробном росте с глюкозой в содовых рассолах при рН 10 штаммы группы 1 имели высокую солетолерантность, сходную с описанной для амфибацилл из содовых озер, в то время как штамм MS 6 относится к разряду низко солетолерантных организмов (Рис. 4 а). Штаммы группы 1 оптимально росли в пределах 0.5-1.5 М общего содержания натрия и были способны к росту до насыщения содой. Однако резкое снижение как скорости роста, так и урожая биомассы при концентрации натрия более 2 М свидетельствовало о стрессовой ситуации. Брожение не является эффективным типом метаболизма, следовательно, выделенные штаммы должны обладать особыми механизмами, позволяющими использовать высокое содержание натрия в щелочной среде в свою пользу. В литературе известен факт обнаружения у Amphibacillus sp. Na+-АТФазы. Следовательно, группа амфибацилл является интересной моделью для изучения элементов натриевой энергетики у галоалкалофилов. По отношению к рН штаммы, выделенные нами из содовых солончаков, можно отнести к облигатным алкалофилам (Рис. 4 b).
Скорость роста, % от Скорость роста, % максимальной 60 50 40 30 20 10 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 а b + Na, M Конечный рН Рис. 4. Влияние концентрации соды (а) при рН 10 и рН (b) при содержании общего Na+ 0.6 M на рост галоалкалофильных диазотрофов из содовых солончаков. Символы: – штамм MS 6;
-группа 1-1;
- группа 1-2.
7. Диазотрофная активность и влияние на нее рН и солей.
Диазотрофная активность была зафиксирована в культурах при почти полном отсутствии связанного азота в среде. Группы 1-1 и 1-2 облигатно зависели от дрожжевого экстракта, который не мог быть заменен на витамины, метионин или цистеин. Поэтому минимальная среда для этих штаммов содержала 10 мг/л д дрожжевого экстракта до 50 мг/л фиксация азота блокировалась. В то же время нам не удалось определить АФ для типовых штаммов Amphibacillus – A.tropucus иA.fermentum. Данные бактерии не росли при концентрации дрожжевого экстракта менее 20 мг/л и в этих условиях не фиксировали азот. Штамм MS 6 не нуждался в дрожжевом экстракте, хотя его рост значительно увеличивался в его присутствии, а АФ блокировалась в присутствии 50 мг/л.
Измерение нитрогеназной активности отмытых клеток осложнила быстрая инактивация при центрифугировании, несмотря на использование анаэробных буферов для отмывки от среды. Это удалось преодолеть добавкой к культурам и в буферы сульфида, который в концентрации до 20 мМ не только не ингибировал, но даже стимулировал нитрогеназную активность. Нитрогеназа является внутриклеточным ферментным комлексом, так же как и система сбраживания глюкозы, обеспечивающая нитрогеназу восстановителем и энергией. Поскольку внутриклеточная среда у галоалкалофильных эубактерий поддерживается на уровне нейтральных значений рН, а ионы натрия активно откачиваются за счет антипортеров, можно было ожидать угнетения бродильной и нитрогеназной активностей при высоких рН и солености у изученных диазотрофов. Однако при работе с отмытыми клетками были получены результаты, аналогичные полученным в ростовых экспериментах (см. выше). По отношению к рН клетки вели себя так, как если бы обе системы – нитрогеназная и сбраживающая – являлись внеклеточными с явным оптимумом в щелочной области и с высокой толерантностью к экстремально высоким значениям рН среды (Рис. 5a-b). В то же время солевой стресс был гораздо сильнее выражен с резким снижением нитрогеназной активности при содержании общего натрия свыше 1.0-1.5 М для группы 1 и свыше 0.5 М для MS 6 (Рис. 5c). У большинства штаммов группы нитрогеназная активность полностью блокировалась при содержании общего натрия свыше 3 М, в то время как рост продолжался при 3-4 М. Таким образом, именно высокая концентрация солей, а не высокие значения рН, являются тем экстремальным фактором, который ограничивает ключевые реакции метаболизма изученных штаммов.
8. Детекция nifH в чистых и накопительных культурах диазотрофов из содовых солончаков и у референтных культур.
Чистые культуры С помощью пары вырожденных праймеров F1-R6 (Марусина и др. 2001) наличие ключевого функционального гена нитрогеназы nifH было подтверждено у всех 11 штаммов из содовых солончаков, обладающих диазотрофной активностью, а так же у референтной культуры B.arseniciselenatis, но не у A.tropicus и A.fermentum (Рис. 6). Присутствие диазотрофов в этих группах бацилл (РНК группы 1 и 6) ранее не было показано.
Таким образом, штаммы из содовых солончаков представляют новую ветвь диазотрофных грамположительных бактерий. Филогенетический анализ полученных частичных сиквенсов nifH гена показал что, обнаружена новая филогенетическая ветвь данного гена внутри кластера грамположительных бактерий родственная Paenibacillus и цианобактериям. Полученные сиквенсы образуют 2 подгруппы: штаммы групп 1-1 (“Natronobacillus azotifixans”) и 1- (“Amphibacillus diazotrophicus”) образуют независимый кластер, а штамм MS (“Bacillus alkalidiazotrophicus”) кластируется с ближайшим родственником B.arseniciselenatis (Рис.7).
Активнос ть потребления глю козы, % Н итрогеназная активнос ть, % 70 60 50 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 конечный pH конечный pH a b Н итрогеназная активнос ть, % Рис. 5. Влияние рН (а-b) при содержании общего Na+ 0.6 M и 30 концентрации соды (с) при рН 10 на активность отмытых клеток галоалкалофильных диазотрофов из содовых солончаков. Символы: – 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 штамм MS 6;
-группа 1-1;
- группа 1-2.
Na+, M с M Z7792 22KS-2 22KS-4 MS 6 MS4-1 13KS-1 +K ES 2 ES 3 +K 450 nt M Z7984 ES 1 24KS-1 24KS-2 +K 24KS-1 24KS-2 ES1 ES2 MS5 +K Рис.6. ПЦР-детекция гена nifH у галоалкалофильных диазотрофов из содовых солончаков.
Рис.7. Филогенетическое дерево на основе транслированных аминокислотных последовательностей гена nifH, показывающее положение новых галоалкалофильных бактерий из содовых солончаков среди диазотрофов.
Клонирование nifH гена в микроаэробных накопительных культурах из содовых солончаков. Как уже отмечалось, молекулярный анализ (DGGE) гена 16S rРНК в накопительных культурах выявил только одну из подгрупп диазотрофов (группа 2), представленную лишь одной из 11 выделенных чистых культур. Чтобы понять, являлась ли группа 1 диазотрофов, доминирующим диазотрофным компонентом, клонировали фрагмент гена nifH из 5 накопительных культур. В общей сложности было получено 256 положительных клонов (около 50 на каждую культуру), разделившихся согласно рестрикционному анализу на 10 подгрупп (рис. 8).
M T1 T1 T2 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 B.a.
Рис. 8. Рестрикционные типы клонов nifH гена, обнаруженные в накопительных культурах из содовых солончаков, имеющие отличия в последовательности nifH.
B.a. – nifH из чистой культуры Bacillus aresiniciselenatis.
T =73% T =1. % T T4 =0. % T =1. T % T7 =3.13% T =0.78% T =1.17% T =1.17% Рис.9. Численное распределение типов клонов гена nifH полученных из диазотрофных накопительных культур из содовых солончаков. Общее количество клонов=256.
Распределение клонов по группам показано на Рис. 9. Абсолютное большинство клонов (73%) представлено группой Т1, анализ которой показал высокую гомологию (вплоть до полной идентичности) с nifH генами изолятов группы 1-1.
Это подтверждает результат культурального исследования о их доминировании среди диазотрофного компонента накопительных культур. В этот же кластер вошла минорная группа клонов Т9 и близкие группы Т2 и Т6. 4 группы клонов, включая вторую по численности группу Т5, которая образуют второй крупный кластер, родственный штамму MS6 и B.arseniciselenatis. Два типа клонов имели сиквенсы nifH гена, не представленные чистыми культурами. Они принадлежали кластеру облигатно анаэробных клостридий. Интересно, что помимо явно доминирующих типов, идентичных двум культивируемым группам диазотрофов, в составе накопительных культур присутствовали родственные, но не идентичные, группы, такие, как например группа клонов Т7. Судя по относительно высокой степени дивергенции гена nifH, эта группа может представлять еще один неизученный диазотрофный таксон. Результаты филогенетического анализа nifH гена клонов показаны на Рис. 10, а распределение типов клонов по накопительным культурам - в таблице 5.
Таблица 5. Распределение типов клонов nifH гена в накопительных культурах Количество клонов в накопительных Тип клона культурах 13KS 24KS 22KS ES MS Т-1 37 41 41 30 Т-2 2 0 2 1 Т-3 0 0 1 1 Т-4 0 0 0 2 Т-5 0 3 10 8 Т-6 2 10 3 0 Т-7 0 2 6 0 Т-8 0 0 2 0 T-9 0 0 0 3 Т-10 3 0 0 0 Таким образом, результаты молекулярного анализа nifH гена накопительных культур из содовых солончаков показали, что доминирующую фракцию диазотрофной популяции в них составляют аэротолератные бродильщики, также доминирующие в составе чистых культур, которые, тем не менее, составляют минорный компонент накопительных культур по численности. Кроме аэротолерантных диазотрофов с бродильным обменом, микроаэрофильные накопительные культуры также содержат небольшую фракцию облигатно анаэробных сульфидогенных диазотрофов, которые нам не удалось выделить в чистую культуру. Это неудивительно, поскольку для выделения использовали невосстановленные среды в микроаэробных условиях. Тем не менее, данный факт представляет интерес с точки зрения изучения анаэробного галоалкалофильного сообщества, так как Desulfitibacterium и Desulfotomaculum никогда не обнаруживали среди культивируемых и некультивируемых бактерий в содовых озерах. Общее доминирование эндоспоробразующих грамположительных форм, в отличие от содовых озер, по-видимому, является отличительным признаком содовых солончаков, большую часть времени года находящихся в состоянии иссушения. Кроме того, следует отметить, что азотфиксация в группе грамположительных бактерий не так хорошо изучена (судя по известным чистым культурам и базе данных nifH гена) как у протеобактерий, поэтому дальнейшие исследования зучение таких экстремальных обитаний как содовые солончаки безусловно расширит наши знания о таксономической структуре галоалкалофилов прокариот, и механизмах выживания и осмоадаптации прокариот в ээкстремальных местообитаниях.
T 100 Bacillus alkalidiazotrophicus MS6, EU Bacillus arseniciselenatis E1H, EU T T T T T 51 T 99 T ES-MS-KS Paenibacillus massiliensis T7, AY Vibrio diazotrophicus ATCC33466, gi: Paenibacillus durus ATCC35681, AJ Trichodesmium erythraeum IMS101, YP 82 Cyanothece sp.CCY0110, ZP Anabaena variabilis ATCC29413, YP T T 100 Clostridium botulinum ATCC3502, YP Clostridium kluyveri DSM555, YP Desulfitobacterium hafniense DCB-2, ZP Clostridium beijerinckii NCIMB8052, YP 86 0. Alkaliphilus metalliredigens QYMF, YP Clostridium cellobioparum ATCC18532, U Рис.10. Филогенетическое дерево на основе нуклеотидных последовательностей гена nifH, показывающее положение диазотрофных клонов в накопительных культурах из содовых солончаков. Шкала=10 замен на 100 нуклеотидов.
Выводы 1. Для содовых солончаков Южной Сибири, Северо-Восточной Монголии и Египта показано наличие потенциальной азотфиксирующей активности в микроаэробных-анаэробных условиях, зависящей от степени увлажнения и глюкозы в качестве органического донора электронов. В целом величины нитрогеназной активности отрицательно коррелировали с содержанием растворимых солей и карбонатной щелочностью. Тем не менее, ряд солончаков обладал сравнительно высокой активностью при умеренных значениях щелочности и солености.
2. Культуральными и молекулярно-биологическими методами установлено, что группа грамположительных аэротолерантных бродильщиков из РНК групп 1 и 6 бацилл с низким ГЦ обуславливает диазотрофную активность содовых солончаков. Ранее способность к фиксации азота у этих бактерий не была известна.
3. Из 11 диазотрофных изолятов 10 относятся к РНК группе 1 бацилл.
Преложено описать 8 штаммов в качестве нового рода и вида “Natronobacillus azotifixans” и 2 штамма в качестве нового вида рода Amphibacillus “A.diazotrophicus”. Один штамм, относящийся к РНК группе бацилл, предложено выделить в новый вид рода Bacillus “B.alkalidiazotrophicus”.
4. Все диазотрофные бактерии, выделенные из содовых солончаков, отличаются облигатной алкалофилией, натронофилией (предпочтение соды вместо NaCl) и от умеренной (“B.alkalidiazotrophicus”) до экстремальной (изоляты группы 1) солетолерантностью. Диазотрофная активность у изученных галоалкалофилов также имела четко выраженный алкалофильный рН профиль, в то время как ее солетолерантность была значительно ниже ростовой.
5. У всех выделенных из содовых солончаков диазотрофов обнаружен ключевой функциональный ген азотфиксации nifH, который по данным филогенетического анализа образует новую ветвь среди кластера грамположительных бактерий с низким ГЦ. Результаты клонирования гена nifH в накопительных культурах подтвердили доминирование представителей РНК групп 1 и 6 в диазотрофном сообществе содовых солончаков, а также выявили присутствие облигатно анаэробных сульфидогенных клостридий в качестве минорного компонента.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Экспериментальные статьи 1) Сорокин И.Д., Кравченко И.К. Оценка потенциальной азотфиксирующей активности в почвах содового засоления //Агрохимия.
2008. №2. С. 43-49.
2) I. D. Sorokin, I. K. Kravchenko, T. P. Tourova, T. V. Kolganova, E. S.
Boulygina and D. Yu. Sorokin (2008) Bacillus alkalidiazotrophicus sp. nov., a diazotrophic, low salt-tolerant alkaliphile isolated from Mongolian soda soil//Int J Syst Evol Microbiol (accepted).
3) I. D. Sorokin, I. K. Kravchenko, E.V. Doroshenko, T. V.. Boulygina T.
P.,Tourova and D. Yu. Sorokin (2008) Nitrogen fixation in soda solonchak soils// FEMS Microb. Ecol. (submitted FEMSEC-08-03-0118).
4) I. D. Sorokin, I. K. Kravchenko, T. P. Tourova, T. V. Kolganova, E. S.
Boulygina and D. Yu. Sorokin (2008) Natronobacillus azotifixans gen. nov. sp.
nov., diazotrophic haloalkaliphile from soda solonchak soils, and reclassification of Amphibacillus tropicus as Natronobacillus tropicus comb. nov.// Int J Syst Evol Microbiol(submitted no. IJS/2008/002196).
Тезисы конференций 1) Сорокин И.Д., Дорошенко Е.В., Кравченко И.К. Азотфиксация в содовых солончаках. В сборнике Тезисы Всероссийской молодежной школы конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва:
Макс Пресс, 2005. C. 59.
2) Сорокин И.Д. Диазотрофные галоалкалофилы содовых солончаков. В сборнике: III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии».Тезисы. Москва:Макс Пресс2007.С.101.
3) Sorokin I.D., Kravchenko I.K., Doroshenko E.V., Boulygina E.S. Sorokin D.Yu., Nitrogen fixation in soda solonchak soils. Second International Conference of Environmental, Industrial and Applied Microbiology (MicroBioWorld), Sevilla, Spain, 28 Nov-1 Dec 2007. (Book of Abstracts) P. 240.