Евгений васильевич влияние трансгенного фактора роста нервов млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем

На правах рукописи

УДК 612.036:576.314.547.915.5 Муркин Евгений Васильевич Влияние трансгенного фактора роста нервов млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем Специальность 03.00.26 – молекулярная генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН Научные руководители: чл.- корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Л.И.Корочкин кандидат биологических наук Г.В.Павлова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л.П.Сащенко доктор биологических наук, профессор Ю.К.Доронин

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «12» апреля 2007 года., в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу:

119334, г.Москва, ул.Вавилова д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г.Москва, ул.Вавилова д. Автореферат разослан «_» марта 2007 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат фармацевтических наук Грабовская Л.С.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Трансплантация эмбриональной нервной ткани или клеток является одним из способов улучшения функционального дефицита, возникающего в результате гибели нейронов в центральной нервной системе (ЦНС).

Существенное значение при этом имеет жизнеспособность трансплантированных нейронов – часть пересаженных клеток отмирает в течение раннего посттрансплантационного периода. На этот процесс влияют многие факторы: неполный обмен кислорода и углекислого газа, питательных веществ и метаболитов вследствие отека, отсутствия васкуляризации и последующего дефицита трофической поддержки и ростовых факторов, а так же влияния клеточного стресса и воздействия свободных радикалов и иммунных медиаторов.

Один из возможных путей усилить жизнеспособность и дифференцировку пересаженных клеток состоит в воздействии на ткани нейротрофическими факторами, такими, например, как NGF (фактор роста нервов). Одна из возможностей экспериментального исследования этого пути состоит в использовании модельной системы – кокультивации клеток плодовой мушки D.melanogaster, трансфицированной геном ngf, со срезом мозга. Более предпочтителен метод, заключающийся в использовании для ксенотрансплантации клеток D.melanogaster, несущих в своем геноме гены нейротрофических факторов, находящихся под контролем регуляторных элементов генома D.melanogaster. Наиболее подходящим из них является промотор белка теплового шока HSP70, который позволяет влиять на экспрессию гена, стоящего под контролем этого промотора, повышением температуры до 37 С.

В этом случае нейротрофические факторы должны будут автоматически экспрессироваться в трансплантате, т.к. температура тела млекопитающих (около 37 С) будет являться активатором регуляторных элементов D.melanogaster и контролируемых ими генов.

Цель работы и задачи исследования Целью данной работы было изучение возможности применения генов нейротрофических факторов под контролем регуляторных элементов генома D.melanogaster для улучшения приживаемости ксенотрансплантата. При этом, прежде всего, необходимо было установить, будут ли жизнеспособны клетки D.melanogaster, пересаживаемые млекопитающим и как долго они смогут экспрессировать чужеродные для них белки в нетипичных для них условиях. В связи с этим, в этом исследовании, были поставлены следующие задачи: получить линию мух D.melanogaster, содержащую в геноме ген флуоресцентного белка DsRed под контролем промотора белка теплового шока HSP70 и проверить выживание её клеток при кокультивации со срезом мозга млекопитающих. После чего вывести линию мух D.melanogaster, содержащую в геноме ген фактора роста нервов (ngf) под тем же промотором, и проверить воздействие экспрессирующегося гена ngf на ксенотранстплантат при кокультивации их со срезом мозга крыс.

Научная новизна и практическая ценность работы В данной работе были получены линии мух D.melanogaster, содержащих ген красного флуоресцентного белка (DsRed) и ген фактора роста нервов (ngf) под контролем промотора белка теплового шока HSP70 D.melanogaster. Было показано, что при кокультивации со срезом мозга крыс клетки этих линий выживают и продуцируют трансгенный белок как минимум два дня. NGF, экспрессируемый клетками трансгенной линии D.melanogaster, кокультивированными со срезом мозга крыс усиливает рост и изменяет морфологию нейральной ткани (в том числе ускоряет образование связей между нервным клетками хозяина и кокультивированными клетками). Кроме того, трансгенный NGF изменяет морфологию самих клеток D.melanogaster, в которых он экспрессируется.

Работа предлагает новый метод для улучшения выживания ксенотрансплантата и образования связей между клетками донора и реципиента.

Апробация работы Материалы работы были представлены на международных конференциях «Genes, Genes Families and Isozimes» (Берлин, Германия, 2003г);

«Прогресс научной технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Украина, 2003г);

«Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine» (Хургада, Египет, 2004г);

«Прогресс в биотехнологии и нейробиологии – интегративная медицина» (Судак, Украина, 2004г.);

«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2005г) и на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Звенигород, Россия, 2005г). Публикации: на тему диссертации опубликованы две статьи в научных журналах и глава в книге.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста и содержит рисунков. Библиография включает 170 источников.

Материалы и методы, используемые в работе В данной работе были использованы полученные нами генно-инженерные конструкции на основе вектора pCaSper-hs /act/, содержащие ген флуоресцентного белка (DsRed) и ген фактора роста нервов (ngf) под контролем промотора белка теплового шока D.melanogaster (Рис. 1).

Рис. 1 Схема полученных конструкций на базе вектора pCaSper, содержащих гены DsRed и ngf под промотором белка теплового шока hsp70. DsRed – ген красного флуоресцентного белка;

ngf – ген фактора роста нервов;

hsp70 promoter – промотор белка теплового шока HSP70;

mini white – ген, ответственный за красную окраску глаз трансгенных мух;

pUC – последовательность вектора pUC-19, содержащая ген устойчивости к ампициллину;

5’P, 3’P – последовательности Р-элемента, ответственные за встраивание последовательностей, расположенных между ними, в геном мух;

Act5C polyA – сайт полиаденилирования гена актина.

Линии мух выводились по стандартным генетическим схемам (Рис. 2, Рис. 3). Для этого использовали линию Df(l) w67c23(2) (содержащая делецию гена white в Х хромосоме) и линию, несущую доминантные летали Curly (Cy-загнутые вверх крылья), Dichaete (D-Расставленные крылья), Lobe (L-Маленькие глаза), Stubble (Sb-Короткие щетинки).

Контроль наличия вставки осуществлялся методом Саузерн-блот гибридизации, контроль экспрессии осуществлялся методом Нозерн-блот гибридизации, Whole-mount – гибридизацией и Вестерн-блот гибридизацией. Флюоресценция белков DsRed и GFP наблюдалась с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus CX 41 при длине волны возбуждения 485 нм.

Рис. 2 Схема выведения линий, несущих гены DsRed и ngf под контролем промотора белка теплового шока HSP70. Ins – вставка (DsRed или ngf).

Рис. 3 Схема выведения линии, несущей гены ngf и lac Z, а также мутацию Delta, которая вызывает трансформацию вентральной нейроэктодермы в нейральном направлении.

Результаты исследований Исследование выживания клеток мух D.melanogaster, кокультивированных со срезом мозга млекопитающих с помощью флуоресцентного белка DsRed.

Для изучения возможности использования человеческих нейротрофических факторов при ксенотрансплантации, прежде всего, необходимо, установить, будут ли жизнеспособны клетки D.melanogaster, пересаживаемые млекопитающим и как долго они смогут экспрессировать чужеродные для них белки в нетипичных для них условиях. Для этого была создана конструкция на основе вектора pCaSper-hs /act/, несущая ген красного флуоресцентного белка DsRed под контролем промотора белка теплового шока. Промотор hsp70 активирует экспрессию сцепленного с ним гена при 37° С, являющейся нормальной температурой тела млекопитающих, тем самым наработка чужеродного белка должна активироваться в пересаженных клетках трансплантата, тогда как в самих мухах (культивируемых при 25° С) трансгенный белок не должен экспрессироваться. Таким образом, клетки, пересаженные в мозг млекопитающих должны экспрессировать флуоресцентный белок, что позволит их детектировать. Кроме того, наличие экспрессии флуоресцентного трансгенного белка в ксенотрансплантате, будет свидетельствовать о жизнеспособности пересаженных клеток.

Полученная конструкция методом микроинъекции была введена в эмбрионы мух линии Df (1) w67c23(2) и были выведены гомозиготная линия мух D.melanogaster, трансгенная по гену красного флуоресцентного белка DsRed под контролем промотора белка теплового шока HSP70.

С помощью Саузерн-блот и Нозерн-блот гибридизаций (Рис. 4) было показано, что в эмбрионах трансфицированных мух содержится конструкция с геном флуоресцентного белка и с этого гена при температуре 37 С идёт транскрипция мРНК.

Из пяти выведенных трансгенных линий, была взята для дальнейшей работы линия (дорожка 6).

A B Рис. 4 Молекулярный анализ трансгенных линий мух, содержащих в геноме ген DsRed под контролем промотора белка теплового шока hsp70. (A). Саузерн-блот гибридизация с ДНК-зондом к гену DsRed. (1) хромосомная ДНК из мух исходной линии Df (1) w67c23(2);

(2) хромосомная ДНК из мух линии, трансгенной по гену DsRed;

(3) положительный контроль – плазмида pDsRed1-N1, несущая ген DsRed. (B). Нозерн блот гибридизация с ДНК-зондом к гену DsRed. тотальная РНК из инкубированных 1 час при 37° С мух исходной линии Df (1) w67c23(2) (1) и мух линий, трансгенных по гену DsRed(2)-(6).

При температуре 37° С (которая является для мух D.melanogaster тепловым шоком), в эмбрионах трансгенной линии, происходит экспрессия белка DsRed, флуоресценцию которого детектировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus CX 41 при длине волны возбуждения 485 нм. (Рис. 5).

В эмбрионе трансгенной линии видна четко выраженная флуоресценция красного белка, локализованная преимущественно в мидгуте. Возможно, это связанно с тем, что клетки этого отдела обладают повышенной чувствительностью к тепловому воздействию, и в этих клетках идёт интенсивная наработка белка HSP70. В эмбрионах контрольной линии Df(1)w67c23(2) присутствует слабая, не сильно выраженная и приближающаяся по яркости к фону флуоресценция, равномерно распределённая по эмбриону.

A B Рис. 5 Экспрессия белка DsRed в развивающемся эмбрионе трансгенной линии D.melanogaster, инкубированном при температуре 37° С. (A) Контроль – исходная линия Df(1)w67c23(2);

(B) Эмбрионы линии, несущей ген DsRed под промотором hsp70.

Таким образом, была получена линия, трансгенная по гену DsRed под контролем промотора белка теплового шока. Показано, что клетки этой линии при тепловом шоке (37° С) экспрессируют трансгенный белок DsRed.

В качестве модели пересадки клеток мух D.melanogaster в мозг млекопитающих была использована кокультивация этих клеток со срезом мозга крыс.

При кокультивировании эмбриональной нейроэктодермы полученной линии с клетками мозга крысы на второй день культивации при 37 С наблюдалась флуоресценция, свидетельствующая о синтезе белка DsRed (Рис. 6). Таким образом, трансгенные клетки D.melanogaster, культивированные в нетипичных для них условиях, жизнеспособны и в них происходит экспрессия чужеродного флуоресцентного белка.

Рис. 6 Флуоресценция эмбриональной нейроэктодермы мух D.melanogaster, трансгенной по гену Ds Red. кокультивируемой со срезом головного мозга крысы.

Второй день кокультивации.

Таким образом, была получена линия, трансгенная по гену DsRed под контролем промотора белка теплового шока. Показано, что клетки этой линии, кокультивированные со срезом мозга млекопитающих выживают и продуцируют чужеродный белок DsRed как минимум два дня. Этот результат позволяет создать систему доставки нужного белка (в нашем случае нейротрофического фактора) в определённое место при ксенотрансплантации.

Исследование возможности применения фактора роста нервов, экспрессирующегося в клетках D.melanogaster, для улучшения выживания ксенотрансплантата.

По методике, аналогичной получению DsRed-трансгенной линии, была выведена линия D.melanogaster, содержащая ген ngf человека под промотором белка теплового шока HSP70. Для того чтобы получить большое количество нервных клеток, продуцирующих белок NGF человека, полученная линия мух была скрещена с линией, содержащей мутацию по гену Delta, у гомозиготных эмбрионов которой эктодерма трансформируется в нейральном направлении.

С помощью Саузерн-блот и Нозерн-блот гибридизаций (Рис. 7) было показано, что в эмбрионах трансфицированных мух содержится конструкция с геном нейротрофического фактора и с этого гена при температуре 37° С идёт транскрипция мРНК.

A B Рис. 7 Молекулярный анализ трансгенных линий мух, содержащих в геноме ген ngf под контролем промотора белка теплового шока HSP70. (A) Саузерн-блот гибридизация с ДНК-зондом к гену ngf. (1) тотальная ДНК из мух трансгенной линии;

(2) тотальная ДНК из мух линии Df (1) w67c23(2). (B) Нозерн-блот гибридизация с ДНК зондом к гену ngf. Тотальная РНК, выделенная из эмбрионов мух исходной линии Df (1) w67c23(2) (1) без теплового шока, (2) после теплового шока. Тотальная РНК, выделенная из эмбрионов мух трансгенной линии (3) без теплового шока, (4) после теплового шока.

С помощью Вестерн-блота была показана экспрессия человеческого NGF при тепловом шоке клетками мух трансгенной линии (Рис. 8). Кроме трёх линий, соответствующих собственному NGF D.melanogaster, появилась полоса, отсутствующая в контроле и соответствующая массе 32 кDa. Данная полоса соответствует NGF человека, индуцированному тепловым шоком.

Рис. 8 Результаты Вестерн-блот анализа трансгенной линии с антителами к белку NGF человека. Контроль – клеточный лизат, полученный из исходной линии, подвергнутой тепловому шоку;

NGF – клеточный лизат, полученный из линии, трансгенной по гену ngf человека.

Рис 9. Экспрессия гена ngf в эмбрионах трансгенных мух D.melanogaster при тепловом шоке. Whole-mount – гибридизация с использованием в качестве зонда ДНК гена ngf человека. (а) эмбрион исходной линии Df (1) w67c23(2) на 10-й стадии эмбриогенеза;

(б)-(д) эмбрион линии трансгенных мух на 10-й (б), 7-й (в), 8-й (г), 12-й (д) стадиях эмбриогенеза;

(е) личинка мух трансгенной линии.

С помощью Whole-mount гибридизации была определена локализация мРНК гена ngf в эмбрионах мух трансгенной линии на разной стадии развития при температуре 37° С (Рис. 9). На стадии синцитиальной и клеточной бластодермы окраска была умеренно положительной, равномерно распределённой по поверхности эмбриона. По ходу сегментации повышенная транскрипция генов была отмечена по парасегментам с формированием «тигрового» рисунка окраски. С развитием нейральных элементов у эмбрионов была обнаружена интенсивная окраска в области головного ганглия. В контрольной линии Df(1)w67c23(2) не была обнаружена гибридизация с мРНК гена ngf.

В культуре эмбриональных нервных клеток полученной линии D.melanogaster, трансгенной по гену ngf человека, обнаружена аномально большая нервная клетка с активно ветвящимся аксоном (Рис. 10).

Рис. 10 Нервная клетка трансгенной по ngf линии D.melanogaster под световым микроскопом. Культура эмбриональных нервных клеток D.melanogaster, содержащих мутацию гена Delta и ген ngf человека под промотором hsp70. Инкубация при 37° С.

По-видимому, это связанно с влиянием гиперэкспрессии человеческого фактора роста нервов, экспрессирующегося в клетке трансгенной линии при тепловом шоке, на саму хозяйскую клетку.

Культура трансгенных по гену ngf клеток D.melanogaster, инкубированная при 37° С, проявляла характерные для нервных клеток свойства (Рис. 11). Было видно явное образование отростков и связей между клетками. Клетки трансгенной линии имеют четко выраженную нейральную морфологию и активно образуют связи своими отростками с соседними клетками, тогда как в контроле (исходная линия Df(1)w67c23(2), Рис. 11а) клетки остаются недифференцированными и связи друг с другом не образуют. Вместе с предыдущим фактом (появление аномально большой нервной клетки с активно ветвящимся аксоном Рис. 10) это показывает, что чужеродный ген ngf, экспрессирующийся в клетках трансгенной линии, оказывает нейротрофический эффект на хозяйские клетки.

Рис. 11 Культура клеток линии D.melanogaster, трансгенных по гену ngf при 37° С. (а) контроль – исходная линия Df(1)w67c23(2);

(б) линия D.melanogaster трансгенная по гену ngf человека.

В результате кокультивации эмбриона мух D.melanogaster, трансгенных по гену ngf человека, со срезом мозга эмбрионов крыс было обнаружено быстрое (через 1 час) врастание отростков нервных клеток мыши в нейроэктодерму D.melanogaster, продуцирующую белок NGF. В контроле (с добавлением эмбриона Df(1)w67c23(2)) врастание отростков нервных клеток обнаруживается на 6-7-й день культивирования (Рис 12).

C.

Рис. 12 Прорастание сенсорных волокон клеток крысы в эмбриональную нейроэктодерму эмбриона линии мух D.melanogaster, трансгенной по гену ngf. (A), (B) Кокультивация эмбриона D.melanogaster, трансгенного по гену ngf, со срезом мозга крыс, клетки которого экспрессируют GFP, 1 час культивирования;

(A) при длине волны возбуждения 396 нм;

(B) при длине волны возбуждения 476 нм добавляется автофлуоресценция (голубое свечение) клеток эмбриона трансгенной линии D.melanogaster;

(C) кокультивация с эмбрионом мух исходной линии Df(1)w67c23(2).

Третий день культивирования.

На основании полученных данных мы можем сказать, что клетки D.melanogaster, инкубированные при температуре тела млекопитающих, нормально продуцируют чужеродный белок под контролем промотора белка теплового шока HSP D.melanogaster как в культуре, так и в ксенотрансплантате.

Таким образом, было показано, белок NGF человека, экспрессирующийся в клетками D.melanogaster, оказывает активное нейротрофическое влияние на собственные клетки и на клетки окружения, усиливая рост и изменяя морфологию нейральной ткани.

Полученная линия D.melanogaster, трансгенная по гену ngf, может использоваться при ксенотрансплантации для улучшения приживаемости трансплантата.

Выводы 1. Показано, что клетки D.melanogaster, инкубированные в стрессовых для них условиях, выживают как минимум два дня, при этом, чужеродный ген, находящийся под контролем промотора белка теплового шока D.melanogaster, может активироваться при температуре тела млекопитающих (37° С).

2. Показано, что в культуре эмбриональных клеток D.melanogaster, трансгенных по гену фактора роста нервов млекопитающих (NGF) под контролем промотора белка теплового шока HSP70 дрозофиллы, при температуре 37° С экспрессируется трансгенный белок, оказывающий влияние на рост и морфологию клеток, в которых он экспрессируется.

3. Показано, что NGF млекопитающих, экспрессирующийся в клетках эмбриональной нервной ткани трансгенной линии D.melanogaster при инкубировании в условиях для культивации клеток млекопитающих, оказывает влияние на окружающие нервные клетки млекопитающих, инкубированные вместе с эмбрионом трансгенной линии. При этом оказываемый эффект заключается в направленном росте отростков нейронов млекопитающих в сторону эмбриональной нервной ткани D.melanogaster с образованием контактов между отростками и клетками эмбриональной нервной ткани трансгенной линии.

4. Клетки полученной линии D.melanogaster, трансгенной по гену ngf, могут быть использованы при ксенотрансплантации для улучшения приживаемости трансплантата.

Список статей, опубликованных по теме диссертации 1. Г.В. Павлова, Е.В. Муркин, А.В. Ревищин, М.А. Александрова, Е.А. Модестова, Л.И. Корочкин (2003). Активность нейрогенов человека в стволовых клетках трансгенных линий дрозофилы. Цитология, т. 45, № 9, с. 909.

2. Pavlova G.V., Manuilova E.S., Arsen’eva E.L., Grivennikov I.A., Murkin E.V., Kanaikina N.N., Revischin A.V., Tarantul V.N., Korochkin L.I. (2005) BFP protein expression in transfected embryonic stem cells Bull. Exp. Med., Apr., 139 (4) 514- Глава в книге:

3. L.I. Korochkin, M.A. Alexandrova, G.V. Pavlova, A.V. Revischin, E.A. Modestova, O.P.

Mirochnikova, T.V. Bragina, E.V. Murkin, M.B. Evgeniev, E.A. Zelentzova, E.A.

Nikitina, E.V. Tokmacheva, A.V. Medvedeva, A.V. Popov, E.V. Savvateeva-Popova (2004). Genetic engineering methods of the regulation of stem cells differentiation.

Biotechnology and Medicine, Nova Science Publishers, ch.17, p. 119–134.

Тезисы в конференциях по теме диссертации:

4. G. Pavlova, L. Korochkin, M. Aleksandrova, V. Bashkirov, A. Revischin, O. Alexenko, E. Murkin, M. Evgeniev (2003). Hsp70 family proteins seem to facilitate allo- and xenotransplantation in the rat brain. //Genes, Genes Families and Isozimes, Berlin, p. 61.

5. Г.В. Павлова, Е.В. Муркин, А.В. Ревищин, М.А. Александрова, Е.А. Модестова, Л.И. Корочкин (2003). Активность генов человека в стволовых клетках трансгенных линий дрозофилы. //Прогресс научной технологии для здоровья человека, Феодосия, Украина, с. 113.

6. O. Mirochnikova, G. Pavlova, E. Murkin, E. Titova, T. Bragina, L. Korochkin (2004).

The synthesis of genetical constructs to transform the human stem cells. //Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine, Hurtada, Egypt, p. 111.

7. G. Pavlova, Revischin, O. Miroschnikova, E. Titova, E. Murkin, A. Enblom, M.

Sandelin, E. Kozlova, L. Korochkin (2004). The influence of donor age, nerve growth factor and cografting with Drosophila cells on survival of peripherically grafted embryonic or fetal rat dorsal root ganglia. //Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine, Hurtada, Egypt, p. 121.

8. Л.И. Корочкин, И.А. Гривенников, Е.С. Мануилова, В.З. Тарантул, А.В. Ревищин, Е.А. Титова, О.А. Мирошникова, Т.В. Брагина, Е.В. Муркин, Н.Н. Канайкина, Г.В.

Павлова (2005). //Трансформация стволовых клеток генами нейротрофических факторов. Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва, Россия, с.

64.