Углерод-концентрирующий механизм как компонент адаптации экстремально натронофильной цианобактерии ‘euhalothece natronophila’ к существованию в содовых озёрах
На правах рукописи
Самылина Ольга Сергеевна Углерод-концентрирующий механизм как компонент адаптации экстремально натронофильной цианобактерии ‘Euhalothece natronophila’ к существованию в содовых озёрах специальность 03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва, 2008
Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова и в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН в лаборатории реликтовых микробных сообществ, г. Москва.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
доктор биологических наук профессор Ивановский Руслан Николаевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор Пронина Наталия Александровна доктор биологических наук Горленко Владимир Михайлович ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Санкт-Петербургский Государственный Университет, биолого-почвенный факультет
Защита диссертации состоится «08» декабря 2008 г. в 12.00 ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН по адресу: 117312 г. Москва, Пр-т 60-летия Октября, д. 7, к. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН
Автореферат разослан «_» _ 2008 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Специфика жизни в содовых озёрах связана, в первую очередь, с гидрохимическими особенностями таких местообитаний.
Два важнейших фактора, действующие на организмы содовых озёр – это щёлочность и рН, обусловленные, соответственно, концентрацией и соотношением HCO3-/CO32--анионов.
Микроорганизмы в местообитаниях с высокой солёностью (в том числе, щёлочностью) подвержены особым стрессовым факторам, таким как ионная сила и ионный состав, что обуславливает необходимость формирования у них особых приспособительных механизмов, таких как осмоадаптация и натрий зависимая энергетика (Питрюк и др., 2004). Кроме того, важную фундаментальную проблему представляет собой организация и функционирование углерод-концентрирующего механизма у (ССМ) галоалкалофильных (натронофильных) цианобактерий из содовых озёр, поскольку эти организмы в отличие от пресноводных и морских цианобактерий обитают в принципиально отличных по содержанию неорганического углерода (Снеорг) условиях, характеризующихся экстремально высоким содержанием Снеорг. Поэтому становятся актуальными следующие вопросы. Обладают ли натронофильные цианобактерии полноценным ССМ? Каковы особенности ССМ этих организмов, отличающие его от ССМ пресноводных и морских форм? Является ли ССМ натронофильных цианобактерий важным механизмом адаптации к условиям существования? Насколько он функционально значим в условиях содовых озёр с высокой концентрацией карбонатов? Все эти вопросы на данный момент открыты.
ССМ цианобактерий в настоящее время вызывает большой интерес и активно изучается (Пронина, 2000;
Marcus, 1997;
Kaplan a. Reinhold, 1999;
Moroney et al., 2001;
Badger a. Price, 2003;
Badger et al., 2006;
Price et al., 2008), но, как правило, для исследований используются модельные штаммы цианобактерий (Badger a. Price, 2003;
Badger et al., 2006;
Price et al., 2008), которые исходно выделены из неэкстремальных мест обитания. В основном, это, пресноводные или морские нейтрофильные штаммы. Очень мало информации по функционированию ССМ у экстремофильных галоалкалофильных и натронофильных цианобактерий, хоть они довольно широко распространены в природе, а в геологическом прошлом нашей планеты, до появления эукариотических водорослей и растений, были основными первичными продуцентами (Заварзин, 2004).
В связи с этим актуальной задачей на данный момент является изучение углерод-концентрирующего механизма натронофильных цианобактерий включающего системы транспорта Снеорг внутрь клетки, карбоксисомы и карбоангидразы, обеспечивающих в совокупности клетки цианобактерий необходимым количеством Снеорг – главного субстрата для фотоавтотрофных организмов.
Цели и задачи работы. Целью данной работы было исследование экофизиологических особенностей штамма Z-M001 (‘Euhalothece natronophila’) -1 и углерод-концентрирующего механизма как возможного механизма адаптации одноклеточной экстремально натронофильной цианобактерии к жизни в карбонатных рассолах.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Определить систематическое положение штамма по Z-M морфологическим и филогенетическим признакам.
2. Исследовать экофизиологические характеристики штамма Z-M001 (‘E.
natronophila’) как экстремального натронофила.
3. Выявить наличие у ‘E. natronophila’ углерод-концентрирующего механизма (транспортных систем для Снеорг, карбоангидраз и карбоксисом) и особенности его функционирования в концентрированных карбонатных рассолах.
Научная новизна. Определено систематическое положение экстремально натронофильного штамма одноклеточной цианобактерии Z-M001, вошедшего по результатам анализа сиквенсов для гена 16S рРНК в филогенетическую группу Euhalothece (‘E. natronophila’), куда ранее входили только галофильные и галотолерантные штаммы. ‘E. natronophila’ является облигатным натронофилом. По своим эколого-физиологическим характеристикам он сопоставим с экстремально алкалофильными органотрофными натронобактериями. Это означает что в природных биотопах, характеризующихся экстремально высоким содержанием соды, эти цианобактерии совместно с экстремально алкалофильными органотрофными натронобактериями могут осуществлять полноценный цикл углерода, включающий продукционную и деструкционную фазу. Впервые показано наличие всех компонентов ССМ (транспортных систем, карбоангидраз и карбоксисом) у экстремально натронофильной цианобактерии в концентрированных карбонатных рассолах и их зависимость от концентрации Снеорг в среде культивирования. Показано наличие трёх транспортных систем, различающихся кинетическими характеристиками и оптимумами действия.
Исследована корреляция между образованием инволюционных форм ‘E.
natronophila’ и лимитированием по доступным формам Снеорг.
Научно-практическое значение. Полученные результаты важны для понимания единого принципа устройства и функционирования ССМ цианобактерий из разных местообитаний, а также для выяснения особенностей ССМ, связанных с условиями обитания. В рамках актуалистической бактериальной палеонтологии полученные данные могут быть использованы для эволюционных построений и моделирования процессов с участием реликтовых цианобактерий, происходивших в геологическом прошлом нашей планеты.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на следующих конференциях: Первая всероссийская школа молодых учёных-палеонтологов «Современная российская палеонтология:
классические и новейшие методы» (Москва, 2004), “Aquatic Ecology at the Dawn of XXI Century” (Санкт-Петербург, 2005), Всероссийский симпозиум с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005), -2 Четвёртая международная научная конференция «Вулканизм, биосфера и экологические проблемы» (Туапсе, 2006);
V Международная научно практическая конференция молодых учёных по проблемам водных экосистем «Pontus Euxinus - 2007» (Севастополь, 2007);
III международная молодёжная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007);
Международная научная конференция и VII Школа по морской биологии «Современные проблемы альгологии» (Ростов-на-Дону, 2008);
Международная конференция молодых учёных «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (Каменец-Подольский, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ ( статьи, 8 тезисов и материалов конференций), 1 статья находится в печати.
Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Литературный обзор, Объект и методы исследований (включая раздел «Обоснование выбора объекта»), Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Работа изложена на _ страницах машинописного текста, включает рисунков и таблиц;
список литературы содержит _ наименований.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Обоснование выбора объекта. В круг наших интересов вошли экстремально галофильные цианобактерии, поскольку абсолютное большинство детальных исследований ССМ цианобактерий посвящены пресноводным и морским организмам (Marcus, 1997;
Kaplan a. Reinhold, 1999;
Moroney et al., 2001;
Badger a. Price, 2003;
Badger et al., 2006;
Price et al., 2008).
Исключение представляют работы по исследованию карбоангидраз галоалкалофильных цианобактерий, проводимые группой Н. А. Прониной в ИФР им. К.А. Тимирязева РАН в сотрудничестве с лабораторией реликтовых микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (Дудоладова, 2005;
Куприянова и др., 2003, 2004). Таким образом, исходной задачей работы было выбрать цианобактерию из экстремального местообитания, наиболее интересную в плане изучения особенностей ССМ. К объекту исследования мы предъявляли следующие требования: цианобактерия должна быть экстремально галофильной и быть натронофилом, то есть обитать в насыщенных рассолах солей. Желательно, чтобы организм был максимально простым морфологически, то есть одноклеточным без выраженных слизистых капсул.
Поэтому, своё внимание мы сконцентрировали на высокоминерализованных озёрах, с концентрацией солей выше, чем в море (то есть более 35‰). Поскольку значения рН в зоне развития цианобактерий в дневные часы за счёт активного фотосинтеза могут довольно сильно сдвигаться в щелочную сторону, нам были интересны высокоминерализованные озёра как карбонатного, так и хлоридного типа.
Нами были исследованы гиперсолёные хлоридные озёра как морского, так и континентального происхождения в Крыму и аталассофильные -3 карбонатные озёра Алтайского края. В Крыму были исследованы пять озёр с общей минерализацией до 360‰ по рефрактометру в зависимости от сезона и места отбора проб, значениями рН от 7.4 до 9.9 в зависимости также от времени суток. Основным компонентом рапы является NaCl. Карбонаты присутствуют в незначительных количествах (от 0.1 до 1 г/л НСО3-) и представлены, в основном, бикарбонатом. В Алтайском крае были исследованы озёра Танатары I-VI с минерализацией до 235‰ по рефрактометру, значениями рН от 9.4 до 10.2 в зависимости от места отбора проб. Основными компонентами рапы этих озёр являются Na2CO3+NaHCO3 и NaCl.
Наиболее галофильные одноклеточные цианобактерии были обнаружены нами в гиперсолёных озёрах Крыма. Однако, в озёрах, изученных нами, концентрация НСО3- не поднималась выше 1 г/л. В наиболее же интересном Кояшском озере, где были обнаружены экстремофильные одноклеточные цианобактерии, развивающиеся непосредственно под осадком соли, карбонатная щёлочность составляла не более 0.3 г/л HCO3- (0.03%), что примерно соответствует естественной атмосферной концентрации.
В планктоне содовых озёр Танатар с высокой минерализацией одноклеточных цианобактерий нами обнаружено не было, в то время как работа с нитчатыми формами, типичными для центрально-азиатских озёр (Еленкин А.А., 1936;
Герасименко и др., 1996), представляла бы ряд дополнительных методических трудностей.
Из широко исследуемых содовых озёр, наиболее известным высокоминерализованным по NaCl и Na2CO3+NaHCO3 (вплоть до насыщения) является озеро Магади в Кении. Для этого озера характерно массовое развитие в первую очередь планктонных форм цианобактерий, нитчатых и одноклеточных (Дубинин и др., 1995). Таким образом, интересной оказалась возможность выделить экстремофильную одноклеточную планктонную цианобактерию из проб, привезённых ранее Г.А. Заварзиным из озера Магади.
Выделение экстремально алкалофильной одноклеточной цианобактерии. Объект исследования. Пробы воды с обильным развитием трихомных цианобактерий из оз. Магади были отобраны Г.А. Заварзиным в 1992 г. Первичное описание сообщества цианобактерий из этих проб дано в работе Дубинина с соавт. (1995). Этим материалом был засеян цилиндр Виноградского объёмом 1 л, содержащий бессульфатную среду, имитирующую состав воды озера и насыщенную карбонатами (200 г/л). Сообщество поддерживалась в течение нескольких лет с пополнением испаряющейся воды дистиллированной. За этот период состав биоценоза изменился, и доминирующим организмом стала одноклеточная кокковидная цианобактерия.
Такое изменение состава биоценоза согласуется с экологическим правилом Тинеманна об уменьшении биоразнообразия в экстремальных условиях с обильным развитием одного вида.
Накопительные культуры алкалофильной одноклеточной цианобактерии были получены при высеве из цилиндра Виноградского на среду с насыщением содой. Альгологически чистая культура цианобактерий была получена при -4 пересеве материала из накопительных культур на ту же среду и выделении методом разведений. Культура получила обозначение штамм Z-M001.
Определение систематического положения штамма Z-M001 по морфологическим признакам проводили с помощью определителей (Голлербах и др., 1953;
Komrek a. Anagnostidis, 1999).
Филогенетическое определение систематического положения штамма Z-M001 проводил В. Н. Акимов в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино).
Для определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма Z M001 выделение ДНК проводили фенольным методом (Ausubel et al., 1994), амплифицировали с универсальными эубактериальными праймерами 27f и 1492r почти весь ген 16S рРНК на приборе GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, США) и проводили секвенирование амплифицированного фрагмента гена 16S рРНК на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, США) в соответствии с предлагаемой фирмой инструкцией.
Для нахождения близкородственных организмов к штамму Z-M использовали банк генов центра биологической информации (NCBI – Построение филогенетического дерева http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer a. De Wachter, 1994).
Условия культивирования. Для выращивания культуры использовали стандартную среду «М» следующего состава (г/л): Na2CO3 – 100, NaCl – 50, KCl – 2, Na2SO4 – 1.4, KNO3 – 2.5, K2HPO4·3H2O – 0.5, FeCl3 – 0.0003, ЭДТА – 0.0005, 1 мл раствора микроэлементов А5 состава (г/л): H3BO3 – 2.86, MgCl2·6H2O – 1.81, ZnSO4·7H2O – 0.222, Na2MoO4·2H2O – 0.39, CuSO4·5H2O – 0.079, Co(NO3)2·6H2O – 0.0494. рН 10-10.5.
В зависимости от задач эксперимента культуру выращивали либо в плоскодонных конических колбах на 250 или 50 мл, либо в пробирках на 10 мл на шейкере при 130-140 об/мин, температуре 35 °С, освещённости 2000 люкс.
Опыты проводили в трёх повторностях.
Оптическую плотность культуры определяли при длине волны 683 нм (OD683) на спектрофотометре Hitachi 200-20.
Содержание белка в исследуемой суспензии клеток определяли, измеряя оптическую плотность культуры (OD683), и пересчитывали на содержание белка (в мкг/мл суспензии) с помощью экспериментально установленного коэффициента 70.6. Белок для этого определяли по Лоури.
Экспериментальные условия культивирования. Для выяснения зависимости урожая биомассы и морфологии клеток от осмотических характеристик и соотношения солей культуру выращивали при разных концентрациях Na2CO3 (от 0 до 200 г/л с шагом 20 г/л) и NaCl (от 0 до 100 г/л с шагом 25 г/л). Для всех вариантов устанавливали начальное значение рН 10.5.
Для изучения способности культуры расти в безнатриевой среде заменяли эквимолярно Na2CO3 и NaCl на К2CO3 и KCl. Влияние концентрации ионов натрия в среде на рост цианобактерии оценивали для трёх концентраций Na2CO3: 0.2, 0.4 и 0.6 М. В каждом варианте изменяли содержание Na+, -5 добавляя NaCl. Концентрацию Na+ определяли как суммарный натрий из Na2CO3 и NaCl. Для всех вариантов устанавливали начальное значение рН 10.5.
Для выяснения зависимости урожая биомассы и морфологии клеток от значений рН среды культуру выращивали на средах с 1 и 0.1 M общего карбоната (Na2CO3 + NaHCO3) при значениях рН 8, 9, 10 и 11 и сохранении эквимолярности сред за счёт добавления необходимого количества NaCl.
Урожай биомассы (по белку) и морфологию клеток оценивали на 7 сутки культивирования.
Для определения влияния концентрации карбоната на фотовыделение O2 и фиксацию CO2 цианобактерией изменяли его концентрацию в среде, параллельно изменяя и концентрацию NaCl с тем, чтобы сохранить общую молярность среды равную 2.8 М Na+ и избежать осмотического шока клеток.
Далее на иллюстрациях будет указываться лишь концентрация (Na2CO3+NaHCO3), подразумевая, что общая молярность среды сохраняется.
Опыты проводили с 3-суточной культурой, выращенной на стандартной среде «М» и находящейся в начале экспоненциальной фазы роста. Клетки отделяли от среды центрифугированием (15 мин, 6000g), предварительно разбавив культуру водой в 2 раза для улучшения условий осаждения. В качестве источника освещения использовали лампу накаливания.
Освещённость измеряли люксметром.
измеряли полярографически с Фотовыделение кислорода использованием электрода Кларка. Отцентрифугированные клетки ресуспендировали в среде до плотности 50-60 мкг белка/мл. Затем инкубировали суспензию 10-15 мин на свету, после чего вакуумированием удаляли избыток растворённого кислорода и помещали её в полярографическую ячейку. Между источником освещения и ячейкой устанавливали водяной фильтр, чтобы избежать нагревания суспензии и электрода во время опыта.
фиксации H14CO3- проводили в планшете для Измерение иммунологических реакций с лунками объемом 2 мл. В лунку добавляли 500 мкл среды с необходимой концентрацией NaHCO3 и NaCl и 50 мкл суспензии клеток (с плотностью около 5 мг белка/мл), ресуспендированной в 10% р-ре NaCl (1.7 М), выдерживали клетки 15 мин. на свету и начинали фиксацию добавлением 10 мкл р-ра Н14СО3- (0.04 мБк). Затем инкубировали клетки 30 мин при заданной интенсивности света. Между планшетом и источником освещения устанавливали водяной фильтр, чтобы избежать интенсивного испарения среды и перегрева клеток во время опыта. После инкубации 500 мкл суспензии из лунки отфильтровывали через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм, промывали 10%-ным р-ром NaCl, подсушивали на воздухе и помещали в сцинтилляционные флаконы с 7 мл универсальной сцинтилляционной жидкости (Эколюм).
Значение рН среды устанавливали, изменяя соотношение Na2CO3 и NaHCO3. В отдельных случаях доводили до нужного значения рН концентрированными растворами HCl, NaOH и KOH.
-6 Значение рН определяли комбинированным стеклянным электродом на рН-метре-иономере «Эксперт-001» непосредственно в среде, без разбавления образца.
Определение соотношения форм HCO3- и CO32- в средах проводили титрометрическим методом (Лурье, 1984).
Кинетические характеристики транспортных систем (KS 0,5 и Vmax) определяли, используя уравнение Лайнуивера-Бэрка.
Активность карбоангидразы (КА) определяли электрометрически по изменению концентрации Н+ в реакции гидратации диоксида углерода (Wilbur a. Andersen, 1948) с помощью рН-метра M-901 с высокочувствительным микроэлектродом и самописцем M-951 (Orion Research, США). Активность КА рассчитывали по разнице начальной скорости гидратации СО2 в контроле (неферментативная реакция) и в образце, и выражали в условных единицах Вильбура-Андерсена на мг белка.
Электрофорез и иммунодетекция. Электрофоретическое разделение белков проводили в денатурирующих условиях в 12% ПААГ, используя стандартную методику (Laemmli, 1970). Количество нанесенного белка составляло 20 мкг на дорожку геля.
Для вестерн-блот-анализа пользовались протоколом Bio-Rad Laboratories и набором стандартных реагентов. В качестве первичных антител использовали афинно-очищенные антитела к -КА из Chlamidomonas reinhardtii (cah3) и к КА из Coccomyxa sp. в качестве вторичных антител использовали антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham). Специфическое связывание визуализировали, используя хемилюминесцентные субстраты (ECL, Amersham).
Световая и трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ).
Морфологию и размеры клеток изучали в нативных препаратах («раздавленная капля») под световым микроскопом “CarlZeiss Axio Imager D1”.
Для ТЭМ клетки цианобактерий фиксировали 4% р-ром формалина на 0. М Na-P-буфере (рН 7.2-7.5). Ультратонкие срезы исследовали на трансмиссионном электронном микроскопе JEM JEOL X-100 (Япония) в ИФР им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Определение систематического положения штамма Z-M001 по морфологическим и филогенетическим характеристикам.
Культура штамма цианобактерии Z-M001 имела насыщенный зелёный цвет. Морфологически она была представлена круглыми клетками диаметром 2.7-4 мкм, как правило, одиночными или делящимися перегородкой на две дочерние клетки одинакового размера. Деление в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. В стационарной фазе отмечено образование микроколоний, состоящих из небольшого числа клеток. Активно растущие клетки либо не образуют слизь, либо имеют очень тонкий слой аморфной слизи вокруг клетки.
-7 Рис. 1.
0.02 100 Euhalothece sp. MPI N303 (AJ000712) Филогенетическое Euhalothece sp. MPI 96N304 (AJ000713) дерево, Euhalothece sp. MPI 95АH13 (AJ000710) показывающее положение штамма Клон LL15B (EF106408) Z-M001 среди Euhalothece sp. MPI 95AH10 (AJ000709) одноклеточных цианобактерий. На Клон WN-HWB-191 (DQ432359) дереве 78 Euhalothece sp. Z-M001 (EU628548) представлены также некультивируемые 100 Cyanothece sp. PCC 7418 (AJ000708) цианобактерии, Cyanothece sp. 113 (DQ243689) 100 обнаруженные в Dactylococcopsis salina PCC 8305 (AJ000711) клоновых библиотеках генов 100 Synechococcus sp. PCC 7002 (AJ000716) 16S рРНК, Microcystis aeruginosa PCC 7941 (U40340) выделенных непосредственно из Gloeothece membranacea PCC 6501 (X78680) природных Cyanothece sp. PCC 7424 (AJ000715) образцов Stanieria cyanosphaera PCC 7437 (AF132931) (DQ432359 и EF106408).
На основании анализа нуклеотидной последовательности длиной нуклеотидов для гена 16S рРНК штамма цианобактерии Z-M001, наиболее близкими культивируемыми и некультивируемыми (из клоновых библиотек) организмами, по результатам поиска в ГенБанке, оказались представители ещё неузаконенной, но широко исследуемой (Burns et al., 2004;
Garcia-Pichel et al., 1998;
Kedar et al., 2002;
Margheri et al., 1999;
Mesbah et al., 2007;
Nbel et al., 1997;
Sahl et al., 2008;
Turner et al., 2001) филогенетической группы одноклеточных кокковидных галофильных цианобактерий Euhalothece с уровнями гомологии 97-98% (рис. 1).
Ряд одноклеточных экстремально галотолерантных и галофильных цианобактерий был выделен Garcia-Pichel с соавторами (Garcia-Pichel et al., 1998) в кластер Halothece на основание филогенетических, морфологических и физиологических признаков. Субкластер Euhalothece выделен в пределах кластера Halothece как группа очень близких штаммов с различиями в нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК не более 5% (Garcia-Pichel et al., 1998). Однако, таксономическое и номенклатурное положение этих групп до сих пор остаётся неузаконенным, и название Euhalothece не включено в список узаконенных таксонов цианобактерий (http://www.cyanodb.cz/valid_genera), соответствующий требованиям как Ботанического, так и Бактериологического Кода (Komrek a. Anagnostidis, 1999;
Bergey’s Manual…, 2001).
Среди культивируемых представителей кластера Euhalothece к штамму Z M001 наиболее близки штаммы MPI 95AH13 и MPI 95AH10 (Garcia-Pichel et al., 1998). Среди некультивируемых представителей субкластера Euhalothece -8 наиболее близки организмы, представленные в клоновых библиотеках в работах (Mesbah et al., 2007;
Sahl et al., 2008).
В настоящее время известно, по крайней мере, 45 клонов и штаммов, принадлежащих субкластеру Euhalothece. Все известные штаммы Euhalothece ранее были выделены из гиперсолёных водоёмов по всему миру (Nbel et al., 1997;
Garcia-Pichel et al., 1998;
Margheri et al., 1999;
Turner et al., 2001;
Kedar et al., 2002;
Burns et al., 2004). Только четыре из них (Mesbah et al., 2007) обнаружены молекулярно-биологическими методами в природных образцах осадков щелочных гиперсолёных озёр впадины Вади-Натрун (Египет) с рН 8.5 9.8, но и в этих озёрах преобладающей солью является NaCl (до 30% в/о).
Таким образом, в субкластер Euhalothece вошли экофизиологически близкие штаммы. Все они были экстремально галотолерантными, требуя как минимум 1.5-6% NaCl и NaClопт от 6 до 25%. Штамм Euhalothece sp. Z-M001 отличается от всех изученных штаммов Euhalothece по эколого-физиологическим характеристикам, так как выделен из содового озера Магади, характерной особенностью которого является высокая (вплоть до насыщения) концентрация не только NaCl, но и Na2CO3. Чтобы подчеркнуть это отличие, штамм Z-M был назван нами ‘Euhalothece natronophila’.
По морфологическим признакам с использованием классических альгологических определителей (Голлерабах и др., 1953;
Komrek a.
Anagnostidis, 1999) штамм Z-M001 может быть определён как Synechocystis salina Wislouch 1924. По микробиологической систематике (Bergey’s Manual…, 2001), которая также основана в большой степени на морфологических особенностях организма, штамм Z-M001 можно отнести к «группе культур» Synechocystis (form-genus XIV).
Если соотносить морфологическую и филогенетическую идентификацию, то оказывается примечательным, что в субкластер Euhalothece вошли штаммы, близкие экофизиологически, но принадлежащие по ботанической классификации (Komrek a. Anagnostidis, 1999) не только к разным родам, но и разным семействам: Synechococcaceae и Xenococcaceae, а штамм Z-M относится к третьему семейству – Merismopediaceae.
Таким образом, морфологическое и филогенетическое определения систематического положения штамма Z-M001 не совпадают. Приоритетным в микробиологических исследованиях в настоящее время является филогенетическое определение, поэтому в данной работе мы придерживались именно его. В то же время, следует отметить ряд особенностей штамма Z-M (‘E. natronophila’), которые экологически выделяют его из филогенетической группы Euhalothece.
‘E. natronophila’ Экофизиологические характеристики как экстремального натронофила.
Главными факторами, имеющими значение для организмов, обитающих в содовом озере, являются общая концентрация солей, щёлочность (концентрация карбонатов), концентрация Na+ и рН. Эти параметры связаны между собой и подвержены периодическим изменениям, в частности с -9 Рис. 2. Соотношение форм К1 К % - + 2- + Снеорг в зависимости от рН:
СО2 + Н2О НСО3 + Н СО3 + 2Н сравнение теоретического распределения по уравнению Гендерсона-Хассельбаха с – СО2 (теор.) НСО реальным распределением в СО32– (среда среде «М».
60 (теор.) "М") Уравнение Гендерсона 40 2– СО Хассельбаха:
– (теор.) НСО 30 (среда [CO32-] "М") рН=рК2 + lg ——— [HCO3-] 4 5 6 7 8 9 10 рН Рис. 3. Зависимость роста белок, мкг/мл ‘E. natronophila’ от 1M Na2CO содержания карбонатов в среде. Исходное значение рН 0,7M Na2CO во всех вариантах 60 0,4M Na2CO устанавливалось 10.5;
уменьшенную концентрацию Na2CO3 компенсировали 0,1M Na2CO добавлением NaCl до конечной молярности среды 2.8 М Na+. После 13 суток во всех вариантах начинается фаза отмирания.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 время, сутки сезонными циклами распреснения и засоления. Так, при распреснении содовых водоёмов в период дождей происходит снижение концентрации бикарбоната и уменьшение буферной ёмкости среды обитания, в которой карбонат является основным буферным компонентом, что в открытых системах сопровождается также снижением значения рН за счёт гидратации атмосферного СО2:
СО2 + Н2О НСО3- + H+. Снижение буферной ёмкости, в свою очередь, приводит к тому, что изменение значений рН под действием биогенных (например, фотосинтетическая активность) факторов становится значительнее, нежели в концентрированных растворах. По литературным данным в природных условиях в сезон дождей может происходить уменьшение значения рН содовых озёр на величину до 2.5 единиц (Alcocer et al., 1999;
Oduor et al., 2003).
Кроме того, значение рН в карбонатных растворах связано с соотношением ионных форм CO32- и HCO3- (рис. 2), а также с общей солёностью среды (Сонненфельд, 1988), переставая напрямую подчиняться уравнению Гендерсона-Хассельбаха. Концентрирование рассола выражается в том, что при том же самом значении рН происходит значительное снижение концентрации - HCO3 относительно CO32. Так, при рН 10 и концентрации карбонатов 1 М в среде отсутствует CO2, а весь Снеорг представлен формами НСО3- и СО32-, из - 10 которых на долю СО32- приходится 80-90% в зависимости от общей солёности (рис. 2), и таким образом, реальная концентрация доступного для транспорта карбоната в форме НСО3- составляет всего около 100-200 mM. При рН 9.0 она составляет уже порядка 600 mM.
Таким образом, представляется весьма вероятной возможность того, что в различные периоды годового цикла алкалофильные цианобактерии содовых озёр могут оказываться в принципиально разных окружающих физико химических условиях. Нашей задачей было выяснить экофизиологические характеристики ‘E. natronophila’, отражающие особенности существования в содовых озёрах.
По кривым роста на средах с разным содержанием карбонатов (но с сохранением общей молярности среды) видно, что уменьшение концентрации карбоната в среде приводит к снижению биомассы в стационарной фазе (рис. 3).
Это позволило нам определять оптимальные условия роста по урожаю биомассы.
Как видно из рис. 4, ‘E. natronophila’ легко адаптируется к снижению рН среды обитания. При стандартной концентрации карбонатов 1 М ‘E.
natronophila’ хорошо развивается в пределах рН от 8.0 до 10.0 с максимумом при рН около 10.0. При разбавлении среды в 10 раз (0.1 M CO32-+HCO3-, 2.8 M Na+) область развития культуры сдвигается в кислую сторону с оптимумом рН при 9.0. Рост отсутствует при рН 7.2 и 11.0. Таким образом, ‘E. natronophila’ является алкалофильным организмом.
белок, мкг/мл 1М Na 2CO3+NaHCO Рис. 4. Урожай ‘E. natronophila’ на сутки при росте на средах с разным содержанием карбонатов и значениями рН.
60 0,1М Na 2CO3+NaHCO 8 9 10 рН 75 Рис. 5. Урожай биомассы ‘E.
natronophila’ на 7 сутки в матрице концентраций NaCl и карбонатов при NaCl, г/л исходном значении рН 10.5: 1) 20;
2) 2 1 4 20-40;
3) 40-60;
4) 60-80;
5) 80-100;
6) 100-120;
7) 120-130 мкг белка/мл.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Na2CO3, г/л - 11 Вместе с тем, ‘E. natronophila’ является облигатным натронофилом. По урожаю биомассы в матрице концентраций Na2CO3 (0-200 г/л) и NaCl (0- г/л) установлено, что оптимальной для роста является весьма обширная область концентраций с общей минерализацией от 130 до 230 г/л Na2CO3+NaCl (рис. 5, №5-7). При максимальных концентрациях эти величины близки к значениям, при которых происходит кристаллизация солей рапы.
Организм облигатно нуждается в карбонатах: рост культуры отсутствует в средах без добавления карбонатов (то есть при содержании, равновесном с атмосферным СО2) даже при поддержании необходимого значения рН и эквимолярности среды по Na+ за счёт добавления NaCl. Максимально высокий урожай был получен при 180 г/л Na2CO3 в отсутствие Cl-. В лабораторной культуре клетки ‘E. natronophila’ в пересыщенном растворе с осадком троны непосредственно на кристаллах) способны оставаться (находясь жизнеспособными в течение полугода, давая хороший рост при последующем пересеве, что говорит о способности ‘E. natronophila’ по крайней мере, переживать сезоны пересыщения рассола и выпадения кристаллов троны, сохраняя способность к активному росту. Эти данные свидетельствуют о том, что ‘E. natronophila’ является экстремально натронофильной цианобактерией.
Рост ‘E. natronophila’ облигатно зависит от содержания ионов Na+ в среде, и в безнатриевой среде невозможен. Так, замена Na2CO3 и NaCl на К2CO3 и КCl приводила к отсутствию роста, который в этих условиях начинался только при добавлении 0.7-1 М NaCl в среду, причём минимальная концентрация Na+, при которой начинался рост культуры, зависела от концентрации карбонатов в среде. При [CO32-] = 0.2 М рост начинается при [Na+] = 0.81 M, а при [CO32-] = 0.6 М роста не было вплоть до 1.13 М Na+, и начинался он только при 1.56 M Na+ (рис. 6). Вероятно, это связано с участием натрия в процессе конверсии энергии на цитоплазматической мембране и/или натрий-зависимым транспортом неорганического углерода.
Диапазон концентраций натрия, оптимальных для роста (рис. 5), широкий и составляет 1.94-4.26 М Na+. Слабый рост был и при наибольшей использованной нами минерализации среды 200 г/л Na2CO3 + 100 г/л NaCl (рис.
5), что соответствует 5.5 М Na+.
Рис. 6. Влияние ионов Na+ на рост ‘E.
natronophila’ при разных белок, мкг/мл концентрациях карбонатов в среде.
0, Концентрация Na+ определялась как 30 суммарный натрий из Na2CO3 и NaCl.
0,4 2 20 CO3, M 0, 0,4 0,8 1,2 1, + Na, M - 12 Содовые водоёмы представляют собой эфемерные образования, для которых характерен переменный режим со значительными сезонными колебаниями концентраций неорганических солей. Тем не менее, в них развиваются автономные микробные сообщества с замкнутым циклом углерода. Типичной моделью развития микробных сообществ, принятой в литературе, является следующая. Опреснение озера происходит в сезон дождей, и тогда в нём идёт обильное развитие первичных продуцентов – планктонных и бентосных цианобактерий. Вторичными продуцентами в содовых озёрах являются аноксигенные фототрофы (АФБ), среди которых доминируют виды Ectothiorhodospira и представители семейства Chromatiaceae. По отношению к составу и концентрации солей большинство АФБ, выделенных из содовых озёр, относятся к галофилам и галоалкалофилам, реже – к галотолерантам и натронофилам (Горленко, 2007).
Согласно данной модели, с наступлением сухого сезона развитие цианобактерий подавляется засолением. Кроме того, возможна конкуренция с одноклеточными зелёными водорослями, такими как Chlorella minutissima и Dunaliella viridis, которые способны развиваться в концентрированных рассолах. В этот период происходит интенсивное развитие органотрофных микроорганизмов, осуществляющих деструкционную фазу развития биоты (Труды…, 2007;
Заварзин, 1993). Эти микроорганизмы представлены анаэробными экстремально натронофильными бактериями (целлюлозолитиками и сахаролитиками, а также вторичными анаэробами).
Из оз. Магади выделены натронофильные и галоалкалофильные сахаролитические облигатные и факультативные анаэробы, облигатно нуждающиеся в карбонат-ионах, способные развиваться при 3 М Na+ и выше, и приспособленные, таким образом, к существованию в условиях периодически пересыхающих содовых водоёмов или их частей (Жилина, 2001а). Это такие организмы, как например, Halonatronum saccharophilum ([Na+]опт = 1.4-2.3 M, [Na+]макс = 2.9 M), ([Na+]опт = 0.67-3.1 M, Amphibacillus fermentum [Na+]макс = 3.3 M), A. tropicus ([Na+]опт = 1.0-1.87 M, [Na+]макс = 3.6 M) и др.
(Жилина, 2001а,б).
Экофизиологические особенности ‘E. natronophila’ свидетельствуют о том, что эта цианобактерия приспособлена к жизни в насыщенных и пересыхающих карбонатных рассолах вплоть до выпадения твёрдой фазы. Таким образом, ‘E.
natronophila’ представляет собой облигатную экстремально натронофильную цианобактерию с оптимумами развития в концентрированных рассолах карбоната натрия. В природных условиях это может означать развитие цианобактерий и их активное функционирование как первичных продуцентов в содовых озёрах также и в засушливые периоды, одновременно с органотрофными микроорганизмами, осуществляющими деструкционную фазу.
Углерод-концентрирующий механизм (ССМ) ‘E. natronophila’.
CCM цианобактерий включает следующие компоненты: 1) системы транспорта (ТС) Снеорг внутрь клетки;
2) системы конверсии форм Снеорг – - 13 карбоангидразы (КА);
3) карбоксисомы. Чтобы определить наличие и функционирование ССМ у ‘E. natronophila’ в концентрированных карбонатных рассолах, где концентрация Снеорг значительно превосходит таковую в пресных и морских водах, нам необходимо было показать, во-первых, наличие всех трёх компонентов ССМ, а во-вторых, зависимость их функционирования (или количества) от изменения концентрации рассола.
1. Транспортные системы для Снеорг у ‘E. natronophila’.
Урожай биомассы коррелирует со скоростью фиксации СО2 в зависимости от концентрации карбонатов (рис. 7). Это указывает на то, что основной причиной снижения биомассы, по-видимому, является снижение способности клеток к ассимиляции СО2.
Поглощение карбонатов клетками цианобактерий осуществляется, как правило, при участии нескольких ТС, имеющих разные оптимумы рН (Kaplan a.
Reinhold, 1999;
Badger et al., 2006). Транспорт Cнеорг мы измеряли по скорости фиксации H14CO3- и коррелирующему с ней фотовыделению О2 в зависимости от рН (рис. 8). Эти процессы в клетках цианобактерий связаны напрямую, поэтому оба метода должны давать сходные и взаимоподтверждающие белок, мкг/мл мкмоль HCO3 /(мин? белка) мг 160 0, 140 0, Рис. 7. Соотношение скорости 120 0, фиксации СО2 (1) и урожая клеток ‘E.
100 0, natronophila’ на 8 сутки (2) при 80 0, разных концентрациях карбонатов.
60 0, Измерения проводили при рН 10.
40 0, 20 0, 0 0,0 0,5 1,0 1, Na2CO3+NaHCO3, M 14 - (б) (a) О2, нмоль/(мин·мг мкмоль H CO3 /(мин*мг белка) белка) TC II 140 TC II 0, TC I TC I TC III 120 TC III 0, 1 0, 60 0, 0, 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11, 8 8,5 9 9,5 10 10,5 pH pH Рис. 8. Скорость фотовыделения кислорода (а) и фиксации бикарбоната (б) клетками ‘E.
natronophila’ в зависимости от значения рН. TC – транспортная система. 1 – 1 М Na2CO3+NaHCO3, 2 – 0.1 М Na2CO3+NaHCO3.
- 14 результаты. Ранее было показано, что внутриклеточное значение рН у алкалофильных цианобактерий стабильно даже при значительном сдвиге рН среды (Куприянова и др., 2003). Таким образом, изменение значения рН в среде не должно заметно влиять на внутриклеточные метаболические процессы, а в первую очередь должно сказываться на процессах в околоклеточном пространстве и на транспорте карбоната, осуществляемого через транспортные системы, локализованные в цитоплазматической мембране клеток.
Измерение скорости фотовыделения кислорода и фиксации СО2 в зависимости от рН клетками ‘E. natronophila’ выявило, что эти два процесса осуществляются в границах рН, соответствующих границам роста цианобактерии в стандартной и разбавленной среде, и имеют три чётко выраженных оптимума (рис. 4 и 8). Это указывает на наличии у ‘E.
natronophila’, по крайней мере, трёх ТС для карбонатов. Наименее щелочной пик TC I свидетельствует о наличии ТС с оптимумом действия при рН 8.5 (рис.
9). ТС II поддерживает транспорт карбонатов при средних значениях рН с оптимумом активности в области рН 9.4-9.5, TC III – при более высоких с оптимумом действия при рН 9.9-10.2.
Обнаруженные транспортные системы различаются не только оптимумом рН но также сродством к субстрату и отношением к интенсивности света.
Кинетические характеристики ТС I, II и III в интактных клетках, определённые по уравнению Лайнуивера-Бэрка, оказались следующими (рис. 9 и 10): ТС I с максимумом при рН 8.5 имеет KS 0.5 0.8-1 mМ т. е. обладает наиболее высоким сродством к карбонатам. ТС II с максимумом при рН 9.4-9.5 обладает средним сродством к карбонатам (KS 0.5 13-17 mМ), а ТС III – низким (KS 0.5 600- mМ).
мкмоль H14CO3-/(мин*мг белка) 0, 0, Рис. 9. Скорость ассимиляции бикарбоната 0, клетками ‘E. natronophila’ в зависимости от его 0, мкмоль H14CO3-/(мин*мг белка) концентрации при 0, значении рН 8.5-9 и 0,004 0, освещённости 9 клюкс.
ТС I – область действия TC I, 0, 0,003 TC II – область действия ТС II.
0, Опыт поставлен на клетках, 0,002 0, TC I выращенных при 0.15 М 0, Na2CO3+NaHCO3 в среде и 0,001 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 рН 9.0.
Na2CO3 + NaHCO3, mM 0, 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 2, Na2CO3+NaHCO3, mM - 15 мкмоль НСО3-/(мин·мг белка) мкмоль НСО3-/(мин·мг белка) (б (а) 0, 0, 0, 0, 0, 0, TC III 0, 0, TC II 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1, 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1, Na2CO3+NaHCO3, Na2CO3+NaHCO3, M Рис. 10. Скорость ассимиляции бикарбоната клетками ‘E. natronophila’ в зависимости от его концентрации при освещённости 9 клюкс: а) рН 9.3, – область действия ТС II;
б) рН 10.5, – область действия ТС III. Опыт поставлен на клетках, выращенных при 1 М Na2CO3+NaHCO3 в среде и рН 10.
мкмоль НCO3 /(мин*мг белка) 0,07 pH 9, 1 M Na2CO 0, pH 9, Рис. 11. Скорость ассимиляции 0,15 M Na2CO 0, бикарбоната клетками ‘E.
pH 10, natronophila’ в зависимости от 0, 1 M Na2CO освещённости, значения рН и 0, концентрации карбоната.
pH 10, Сплошная линия – ТС II, 0,02 0,15 M Na2CO пунктирная линия – TC III.
0, 0, 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 освещённость, клюкс Кроме того, ТС II и ТС III различаются по отношению к интенсивности света. Насыщение по свету для ТС III происходит при более низкой освещённости, нежели для TC II (рис. 11). Увеличение освещённости в 15 раз (от 2 до 30 клюкс) приводит к увеличению фиксации меченого бикарбоната при рН 10.5 (ТС III) в 1.9±0.2 раз, а при рН 9.3 (TC II) – в 3.6±0.7 раз.
Исследуемая цианобактерия является представителем натронофильной микрофлоры озера Магади, которое характеризуется молярными концентрациями карбонатов (вплоть до насыщения), тогда как в пресноводных и морских экосистемах их содержание не превышает 2 mМ. Поэтому в таких экосистемах цианобактерии для обеспечения эффективной работы рибулозобисфосфаткарбоксилазы синтезируют до 5 транспортных систем, с различным сродством к Снеорг (КS 0.5). Как правило, транспортные системы с высокой субстратной специфичностью у пресноводных и морских цианобактерий индуцибельны и синтезируются при снижении концентрации карбонатов в среде до уровня ниже 40 мкМ, поддерживая скорость - 16 Табл. 1. Сравнение транспортных систем для бикарбоната у экстремально алкалофильной цианобактерии ‘E. natronophila’.
ТС I ТС II TC III Характеристика рНопт 8.5 9.4-9.5 9.9-10. Насыщение при освещённости н/д 10 клюкс 10 клюкс Концентрация карбонатов для Vmax, М ок. 0.002 0. Vmax, мкмоль HCO3 /(мин·мг белка) н/д 0.014-0.025 0.035-0. KS 0.5, mM 0.8-1 13-17 600- н/д – нет данных поступления карбонатов в клетки на уровне, достаточном для эффективного функционирования рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Badger et al., 2006).
Результаты, представленные на рисунках 8-11 показывают, что транспорт карбонатов в клетки ‘E. natronophila’ осуществляется при участии, по крайней мере, трёх транспортных систем. Они различаются по оптимуму рН и кинетическим характеристикам (табл. 1). Одинаковый характер зависимости фотовыделения кислорода при 1 и 0.1 М карбонатов в среде (рис. 8б), по видимому, свидетельствует о том, что все три ТС у ‘E. natronophila’ являются конститутивными.
Следует отметить, что обнаруженные нами транспортные системы у ‘E.
natronophila’ радикально отличаются от исследованных ранее транспортных систем пресноводных и морских цианобактерий сродством к переносимому субстрату (табл. 1). Для ‘E. natronophila’ сродство (КS 0.5) транспортных систем к субстрату в интактных клетках существенно ниже и колеблется в пределах от 1 mM (TCI) до 800 mМ (ТСIII), т.е может быть на три порядка ниже, чем у пресноводных и морских цианобактерий, где эта величина (КS 0.5) колеблется в пределах от 1 до 350мкМ (Badger et al., 2006;
Price et al., 2008). Очевидно, это является следствием того, что для содовых озёр содержание неорганического углерода в среде на несколько порядков выше, чем в пресноводных и морских местообитаниях, где основным источником бикарбоната является находящийся в равновесии с атмосферным СО2.
Наличие трёх различных транспортных систем у натронофильной цианобактерии предположительно объясняется тем, что обитателям содовых местообитаний, в особенности эфемерных водоёмов, приходится сталкиваться с колебаниями концентрации карбонатов и рН при сезонных опреснениях в дождливые периоды. В период максимального опреснения значение концентрация карбонатов снижается и как следствие рН среды может сдвигаться в сторону подкисления (Alcocer et al., 1999;
Oduor et al., 2003). В этот период основными транспортными системами становятся ТС I, обладающие более низкими оптимумами рН (8,5 – 9,0) и более высоким сродством к субстрату, чем ТC II и III. Максимальное распреснение может наблюдаться как в озере в целом, так и в отдельных его частях – лагунах или в поверхностном слое, из-за медленного смешивания дождевой пресной и озёрной концентрированной воды во время дождя. В засушливый период концентрация карбонатов в озере повышается, что сопровождается - 17 повышением значения рН. В таких условиях более эффективной становится ТС II и, затем, ТС III в период максимального засоления (табл. 1).
2. Карбоангидразы (КА) и карбоксисомы у ‘E. natronophila’.
Карбоангидраза – это цинксодержащий фермент, участвующий в разных стадиях работы СО2-концентрирующего механизма – поглощении, предотвращении утечки и внутриклеточном преобразовании Снеорг.
Специфической реакцией, которую осуществляет КА, является обратимая гидратация углекислого газа по следующему уравнению:
H+ + HCO3-.
СO2 + H2O Интактные клетки ‘E. natronophila’, выращенные при 1 М карбонатов в среде, обладают довольно низкой (на уровне разрешения используемого метода измерения) КАА в сравнении с другими цианобактериями содовых озёр (табл.
2). Кроме того, карбоангидразная активность целых клеток ‘E. natronophila’ не изменяется в зависимости от выращивания клеток на высоких (1 М) или низких (0.1 М) концентрациях карбонатов. Это может быть интерпретировано как отсутствие внеклеточной КА ‘E. natronophila’, как и у гидрогенотрофного сульфатредуктора Desulfonatronum lacustre со сходной активностью интактных клеток (Питрюк и др., 2006;
табл. 2). Физиологическую роль внеклеточных КА цианобактерий в настоящее время сводят к стабилизации околоклеточного значения рН и предотвращению утечки СО2 из клеток по градиенту рН путём конверсии его в НСО3-, который является субстратом для транспортных систем (Kupriyanova et al., 2007). В то же время значимость этих функций в содовых рассолах требует дальнейшего подтверждения, поскольку такие рассолы являются концентрированными и сильными буферными системами со щелочными значениями рН, что должно обеспечивать, с одной стороны, Табл. 2. Карбоангидразная активность (КАА) интактных клеток ‘E. natronophila’ в сравнении с другими микроорганизмами содовых озёр Условия культивирования КАА, Организм у.е./мг Лит. ист-к Концентрация белка карбонатов в рН среде 1 М Na2CO3 0.025-0.28 Собственные 10. ‘Euhalothece 0.1 М Na2CO3 10-10.5 0.05-0.227 данные natronophila’ Rhabdoderma lineare 0.16 М NaHCO3 9.5-9.8 2.41±0.19 Dudoladova et al., 0.16 М NaHCO3 9.5-10.2 Куприянова и др., 5±0. Microcoleus chthonoplastes 0.03 М Na2CO3 Питрюк и др., 9.5 0. Desulfonatronum + lacustre 0.12 М NaHCO (на водороде) - 18 стабильность рН околоклеточного пространства, а с другой – быстрое химическое превращение вышедшего из клетки СО2 в НСО3-. Таким образом, отсутствие внеклеточной КА у ‘E. natronophila’ представляется естественным и связанным с экологическими особенностями местообитания и условиями культивирования.
Однако, как свидетельствует результаты вестерн-блот анализа с антителами к цитозольной КА из Coccomyxa sp., КА обнаруживается после разрушения клеток, что свидетельствует о наличии внутриклеточной карбоангидразы у ‘E. natronophila’. Она относится к классу -карбоангидраз (рис. 12в), которая у цианобактерий (в частности, у одноклеточной алкалофильной цианобактерии Rhabdoderma lineare из оз. Магади) локализована на внутриклеточных мембранах (Дудоладова, 2005). -КА, обнаруженная ранее в гликокаликсе и околоклеточном пространстве у R.
lineare (Дудоладова и др., 2004) и алкалофильного штамма Microcoleus chthonoplastes (Куприянова и др., 2004), у ‘E. natronophila’ не выявлена (рис.
12б).
Уменьшение содержания карбонатов в среде выражается в синтезе дополнительных белков в клетках ‘E. natronophila’, что хорошо видно на общем белковом электрофорезе (рис. 13а). Как оказалось, одним из белков, содержание которого заметно увеличивается уже при концентрации Na2CO 0.8 М, является -КА (рис. 13б), что коррелирует с биогенезом карбоксисом.
При понижении концентрации карбонатов до 0.5 М уже на вторые сутки инкубирования начинается образование карбоксисом в клетках ‘E.
natronophila’, а на третьи сутки оно становится массовым (рис. 14б), что соответствует началу экспоненциальной фазы роста культуры (рис. 4). В контрольных клетках, выращенных на 1 М Na2CO3, карбоксисомы присутствуют в небольших количествах, как правило, от 0 до 2 карбоксисом на срез клетки (рис. 14а).
Рис. 12. Идентификация КА в клетках ‘E. natronophila’, выращенных при концентрации Na2CO3 в среде 1М и рН 10-10.5: а) белковый профиль;
б) вестерн-блот анализ с антителами к -КА Chlamidomonas reinhardtii (anti-Cah3);
в) вестерн-блот анализ с антителами к -КА Coccomyxa sp. (anti--Coccomyxa). Chl - Chlamidomonas reinhardtii, Euh, Euhal - ‘E.
natronophila’.
- 19 Рис. 13. Зависимость содержания -КА в клетках ‘E. natronophila’ от концентрации карбонатов в среде культивирования на 3 сутки: а) белковые профили (в лунки добавлено по 20 мкг белка суммарного гомогената);
б) вестерн-блот анализ с антителами к -КА Coccomyxa sp. (в лунки добавлено по 45 мкг белка суммарного гомогената). Мет - метчик.
а б Рис. 14. Карбоксисомы в клетках ‘E. natronophila.’ а) 1 М Na2CO3. В этих условиях карбоксисом, как правило, мало (0-2 на клетку) и они не достаточно контрастны, что, видимо, связано с их составом, но, тем не менее, легко опознаются по угловатой (часто гексагональной) форме;
б) 0.5 М Na2CO3. Карбоксисомы выделены пунктирными областями.
Таким образом, обнаруженная в клетках ‘E. natronophila’ -КА, как и у других цианобактерий, по всей видимости, ассоциирована с карбоксисомами и выполняет функцию конверсии НCO3 в СО2 обеспечивая активность локализованной в этих структурах рибулозобисфосфаткарбоксилазы.
3. Функционирование углерод-концентрирующего механизма и полиморфизм ‘E. natronophila’.
Присутствие и карбонатная зависимость ТС, КА и карбоксисом в клетках ‘E. natronophila’, говорит о наличии и функциональной значимости ССМ у экстремально натронофильной цианобактерии. Кинетические характеристики исследованных транспортных систем, поведение системы КА и карбоксисом при уменьшении концентрации карбонатов в среде указывают на то, что клетки ‘E. natronophila’ в содовых озёрах в разных фазах засоления и опреснения - 20 в б а Рис. 15. Морфология клеток ‘E. natronophila’, выращенных в разных условиях: а) 1 М Na2CO3 и рН 10;
б) 0.1 М Na2CO3 и рН 10;
в) 0.1 М Na2CO3 и рН 9. Масштаб: риска – 5 мкм.
могут находиться в условиях лимитирования по доступным формам Снеорг, когда требуется активация ССМ. Взаимодействие ТС, различающихся рНопт и КS 0.5, обуславливает транспорт бикарбоната в клетки ‘E. natronophila’ в количествах, необходимых для нормального функционирования.
Если же возникают условия, неоптимальные для работы ТС, то клетки ‘E.
natronophila’ преобразуются в инволюционные. Эти изменения устойчивые и имеют чёткую корреляцию с доступностью нужного количества бикарбоната и способностью транспортировать его в клетку. Так, при рН около 10 и концентрации общего карбоната более 0.8 М клетки типичные круглые, до мкм в диаметре (рис. 15а). Это область оптимальных условий для функционирования ТС II и ТС III (табл. 1), которые, взаимодействуя, обеспечивают клетки необходимым количеством бикарбоната. При уменьшении концентрации карбонатов в среде до 0.1 М (рН 10), клетки ‘E.
natronophila’ преобразуются в инволюционные – вытянутые утолщённые палочки неправильной формы размером до 10-17-(23) х 3,5-4 мкм (рис. 15б).
Вероятная причина этих изменений в том, что ни одна из ТС не может полноценно функционировать в этих условиях: ТС III лимитирована по субстрату, а ТС I и ТС II находятся в неоптимальных значениях рН, и соответственно не могут обеспечить клетки достаточным количеством Cнеорг.
Если же при той же концентрации карбонатов в среде (0.1 М) установить значение рН 9, увеличив тем самым относительное содержание НСО3- и создав оптимальные условия для функционирования ТС II и TC I, то клетки ‘E.
natronophila’ сохраняют в целом нормальную морфологию (рис. 15в).
Изучение закономерностей и причин формирования инволюционных форм важно, так как таксономическую принадлежность цианобактерий, особенно в гидробиологических исследованиях, до сих пор традиционно определяют по морфологическим характеристикам. В этом отношении накоплен очень большой материал (Голлербах и др., 1953;
Komrek a. Anagnostidis, 1999).
Поэтому зависимость морфологии культур цианобактерий от экологических условий представляет большую ценность для интерпретации описаний in situ.
Как было показано для трёх монокультур натронофильных цианобактерий их морфологическое разнообразие при изменении солевого состава среды, может выходить за пределы принятых морфородов (Дубинин и др., 1995).
Морфологическая изменчивость штамма Z-M001 также настолько велика, что в разных условиях может приводить к разным вариантам определения.
Выращенный в разных условиях штамм Z-M001 может быть определён морфологически как виды трёх разных родов (Synechococcus, Synechocystis, - 21 Rhabdoderma). Учитывая все эти особенности, следует осторожно подходить к идентификации одноклеточных цианобактерий in situ, когда нет возможности сделать генетический анализ, или, во всяком случае, специально оговаривать условия, при которых цианобактерии были обнаружены.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Экстремально галоалкалофильные микроорганизмы вызывают живой интерес для изучения, поскольку должны обладать уникальными свойствами, обусловленными условиями местообитаний. Активно исследуются механизмы осмоадаптации и энергообеспечения (Питрюк и др., 2004) таких микроорганизмов. Определённые успехи достигнуты в изучении галоалкалофильных цианобактерий содовых озёр: их разнообразия и экофизиологии (Дубинин и др., 1995;
Герасименко и др., 1996), рН-гомеостаза и системы КА (Куприянова и др., 2003;
Dudoladova et al., 2004, 2007). В то же время основная масса исследований, посвящённых ССМ цианобактерий, производится с использованием модельных пресноводных или морских штаммов (Badger a. Price, 2003;
Badger et al., 2006;
Price et al., 2008). Таким образом, вопрос об организации и механизме работы ССМ экстремофильных натронофильных цианобактерий остаётся не решённым до конца.
В результате данной работы мы пришли к выводу, что экстремофильные натронофильные цианобактерии, такие как ‘E. natronophila’, развивающиеся в концентрированных карбонатных рассолах при щелочных значениях рН, обладают полноценным ССМ, имеющим структуру и принципы функционирования, аналогичные таковым у изученных пресноводных и морских штаммов. Однако, в отличие от последних характеристики отдельных компонентов ССМ изменены. В основном это касается кинетических характеристик ТС. Сродство транспортных систем к неорганическому углероду у ‘E. natronophila’ значительно ниже, чем у пресноводных и морских штаммов, что обусловлено экстремально высоким содержанием карбонатов в характерных для них местообитаниях. Кроме того, ССМ ‘E. natronophila’ включает три транспортные системы для НСО3-, что позволяет этим цианобактериям расти и поддерживать жизнеспособность в изменяющихся условиях, характерных для эфемерных содовых озер.
ССМ натронофильных цианобактерий является важным механизмом адаптации к условиям существования в содовых озёрах, поскольку гидрохимические параметры озера подвержены периодическим изменениям, в частности с сезонными циклами опреснения и засоления. При этом изменяется общая концентрация солей, а следовательно, концентрация Na+, карбонатов и рН. Несколько различных транспортных систем обуславливают адаптацию ‘E.
natronophila’ к изменяющимся условиям среды, обеспечивая клетку необходимым количеством неорганического углерода, который является главным субстратом для синтеза клеткой необходимых органических соединений.
- 22 ВЫВОДЫ 1. На основании анализа нуклеотидной последовательности для гена 16S рРНК штамм алкалофильной цианобактерии Z-M001 был отнесён к субкластеру Euhalothece и назван ‘Euhalothece natronophila’, чтобы подчеркнуть экологическое отличие от всех известных ранее штаммов субкластера.
2. ‘E. natronophila’ представляет собой облигатную экстремально натронофильную цианобактерию с оптимумами развития в концентрированных рассолах карбоната натрия (1.7 M Na2CO3+NaHCO3, 1.5-2.4М Na+, рН 10-10.5) и приспособленную, таким образом, к существованию в пересыхающем рассоле вплоть до начала выпадения твёрдой фазы. В природных условиях это может обуславливать развитие цианобактерий и активное функционирование их как продуцентов в засушливые периоды.
3. В клетках ‘E. natronophila’ выявлены все компоненты углерод концентрирующего механизма: транспортные системы, карбоангидразы и карбоксисомы, количество и функционирование которых зависит от концентрации карбонатов в среде.
4. Транспорт Снеорг в клетки ‘E. natronophila’ обеспечивается, по крайней мере, тремя транспортными системами с различными свойствами: ТС I с рНопт 8.5 и KS 0.5 0.8-1 mМ;
ТС II с рНопт при 9.4-9.5 и KS 0.5 13-17 mМ;
ТС III с рНопт при 9.9-10.2 и KS 0.5 600-800 mМ. Взаимодействие этих транспортных систем обуславливает способность клеток ‘E. natronophila’ функционировать в различные периоды годовых циклов содового озера.
- 23 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:
Экспериментальные статьи:
1. Миходюк О.С., Герасименко Л.М., Шадрин Н.В., 2004. Отклик гидроэкосистемы Бакальской косы (Крым) на климатические изменения: донные цианобактерии. Морський екологiчний журнал, Т. III, №4, с. 41.
2. Миходюк О.С., Орлеанский В.К., Шадрин Н.В., Герасименко Л.М., 2005. Современные циано-бактериальные маты как аналоги биоценозов докембрия. В сб. «Современная палеонтология: классические и новейшие методы», под ред. А.Ю. Розанова, А.В.
Лопатина, П.Ю. Пархаева, М., ПИН РАН, 15-28.
3. Миходюк О.С., Ивановский Р.Н., Заварзин Г.А., 2008. Транспортные системы для карбоната у экстремально натронофильной цианобактерии Euhalothece sp.
Микробиология, 77, №4, 465-471.
4. Миходюк О.С., Герасименко Л.М., Акимов В.Н., Ивановский Р.Н., Заварзин Г.А., 2008.
Экофизиология и полиморфизм одноклеточной экстремально натронофильной цианобактерии Euhalothece sp. Z-M001 из озера Магади. Микробиология, 77, №6, 805 813.
5. Шадрин Н.В., Миходюк О.С., Найданова О.Г., Волошко Л.Н., Герасименко Л.М., 2009.
Донные цианобактерии соленых озер Крыма. В сб.: «Микроводоросли Черного моря:
разнообразие, проблемы сохранения и биотехнологического использования».
Севастополь, Изд-во «Экоси-гидрофизика», в печати.
Тезисы и материалы конференций:
1. Mikhodyuk O.S., 2005. Diversity and production of cyanobacterial communities in saline lakes.
“Aquatic Ecology at the Dawn of XXI Century” Book of Abstracts (3-7 October), St Petersburg, p. 64.
2. Миходюк О.С., Герасименко Л.М., 2005. Циано-бактериальные сообщества солёных озёр Крыма: разнообразие и сезонность развития. Материалы всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы», 21-24 декабря, М., Изд-во «Макс-Пресс», с. 57.
3. Герасименко Л.М., Миходюк О.С., 2006. Микробные сообщества экстремальных мест обитания. Сборник материалов четвёртой международной научной конференции «Вулканизм, биосфера и экологические проблемы», Туапсе, 65-66.
4. Миходюк О.С., Герасименко Л.М., Шадрин Н.В., 2007. Сравнительная характеристика разнообразия донных цианобактерий в минеральных озёрах Крыма и Алтая. Тезисы V Международной научно-практической конференции молодых учёных по проблемам водных экосистем «Pontus Euxinus - 2007», 24-27 сентября, Севастополь, Изд-во «ЭКОСИ-Гидрофизика», 59-61.
5. Миходюк О.С., Ивановский Р.Н., Герасименко Л.М., 2007. Экофизиология экстремально алкалофильной цианобактерии Euhalothece sp. из озера Магади (Кения). Тезисы III международной молодёжной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», 22-23 ноября, М., Изд-во «Макс-Пресс», 78-80.
6. Самылина О.С., 2008. К вопросу об идентификации одноклеточных цианобактерий содовых озёр. Материалы международной научной конференции и VII Школы по морской биологии «Современные проблемы альгологии» (9-13 июня, г. Ростов-на-Дону).
Изд-во ЮНЦ РАН, 313-316.
7. Самылина О.С., 2008. Полиморфизм одноклеточной экстремально натронофильной цианобактерии «Euhalothece natronophila». Матерiали мiжнародно конференцi молодих учених «Актуальнi проблеми ботанiки та екологi» (13-16 серпня, Кам’янець Подiльский), Кив, 31-32.
8. Самылина О.С., 2008. Разнообразие фототрофных сообществ высокоминерализованных озёр. Матерiали мiжнародно конференцi молодих учених «Актуальнi проблеми ботанiки та екологi» (13-16 серпня, Кам’янець-Подiльский), Кив, 32-33.
- 24