Молекулярно–генетическое исследование псориаза
На правах рукописи
ГАЛИМОВА ЭЛЬВИРА САФУАНОВНА МОЛЕКУЛЯРНО–ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПСОРИАЗА 03.00.15- генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
УФА-2008 2
Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Бахтиярова Клара Закиевна ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович ФГУП «ГосНИИ генетика» Институт общей генетики РАН
Ведущая организация:
им. Н.И.Вавилова
Защита диссертации состоится « 24 » декабря 2008 г. в « » часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71.
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН, по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте Института биохимии и генетики: http://www.anrb.ru/molgen/dissov.html
Автореферат разослан « 24 » ноября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Псориаз – один из наиболее распространенных хронических воспалительных дерматозов, характеризующийся гиперпролиферацией эпидермиса и нарушением кератинизации [Скрипкин Ю.К., 2005]. Известно, что псориазом страдают 0,3-7 % населения во всем мире [Campalani et al., 2005]. Согласно последним данным Международной Организации Псориаза, 125 миллионов людей в мире имеют псориаз. Псориаз представляет собой системный процесс с выраженными функциональными и морфологическими изменениями ряда органов и систем организма.
Приблизительно у 15-40% больных псориазом развивается псориатический артрит, приводящий нередко к инвалидизации. В связи со значительной распространенностью заболевания, хроническим и тяжелым течением, несовершенством имеющихся методов лечения, неясностью этиологии и патогенеза, проблема псориаза является одной из актуальных в медицине.
В настоящее время признана точка зрения, согласно которой псориаз является Т клеточно-опосредованным заболеванием с преобладанием Th1 цитокинового профиля.
Аутоиммунные изменения характеризуются первичным вовлечением в процесс Т лимфоцитов и вторичной активацией и пролиферацией кератиноцитов [Bowcock et al., 2005]. Псориаз – многофакторное заболевание, на развитие которого влияют как генетические факторы, так и факторы внешней среды. Генетические факторы доминируют над средовыми, о чем свидетельствуют высокие значения коэффициента наследуемости псориаза [Bowcock et al., 2005].
Проведенные исследования выявили ассоциацию и сцепление 19 геномных локусов с псориазом, при этом максимальный LOD-балл был получен для локуса PSORS1 в хромосомном регионе 6р21.3 главного комплекса гистосовместимости (MHCI), где идентифицировано 10 генов – HLA-C, HCG27, OTF-8, TCF19, HCR, SPR1, CDSN, SEEK1, STG, HCG22 [Nair et al., 2006]. Кроме того, возможно участие в формировании предрасположенности к псориазу генов, расположенных за пределами MHCI: гены цитокинов (факторы некроза опухоли – TNFА и TNFВ и ряд интерлейкинов, в частности, IL1,семейство генов IL10, IL23), ген CTLA4, семейство генов S100 [Bowcock et al., 2005].
При молекулярно-генетических исследованиях любого многофакторного признака принципиально важным является учет этнической принадлежности обследованных лиц [Bishop, Sham, 2000]. Генетическая структура этноса включает сумму частот самых разных генов, а частота того или иного генотипа является результатом отбора по какому либо признаку, зависящему от социально-демографических, климатических и прочих факторов.
Идентификация специфичных генов, вовлеченных в патогенез псориаза, будет способствовать формированию фундаментальных представлений о генетических, иммунных и патогенетических аспектах псориаза. И как следствие, понимание генетических механизмов развития заболевания имеет существенное значение для определения подходов к профилактике псориаза в отягощенных семьях и для разработки оптимальных и эффективных методов терапии.
В соответствии с вышеизложенным были поставлены цель и задачи исследования.
изучение роли генов главного комплекса Цель исследования – гистосовместимости и генов семейства Толл-подобных рецепторов в формировании предрасположенности к псориазу.
Задачи исследования Провести у больных псориазом и здоровых индивидов:
1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов Cw гена HLA-C, G305A, C307T, C325T, T477C, G1723T, A1911G, C2327G гена HCR, C1243T гена CDSN и G308A гена TNFA главного комплекса гистосовместимости (MHC).
2. Анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA с риском развития псориаза у индивидов с учетом этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития болезни.
3. Анализ неравновесия по сцеплению между полиморфными локусами генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA.
4. Анализ ассоциаций гаплотипов полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA с псориазом.
5. Оценку роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к псориазу.
6. Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA с риском развития псориаза в семьях с повторными и множественными случаями псориаза с помощью теста на неравновесную передачу.
7. Исследование полиморфных вариантов генов семейства Toll-подобных рецепторов TLR с использованием SNPlex платформы (Applied Biosystems).
Научная новизна исследования. Впервые создан банк ДНК больных псориазом и здоровых индивидов четырех этнических групп, проживающих на территории России – русских, татар, башкир и хакасов, общей численностью 1222 индивида. Впервые проведен молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA у больных псориазом и здоровых индивидов. Определены генетические маркеры риска развития заболевания у индивидов с учетом этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития псориаза и оценена роль взаимодействия изученных генов в формировании предрасположенности к псориазу. Выявлен гаплотип по полиморфным локусам генов PSORS1, ассоциированный с риском развития псориаза у лиц русской, татарской и хакасской этнической принадлежности. Получены данные об ассоциации полиморфных вариантов генов PSORS1 с риском развития псориаза в семьях с повторными и множественными случаями псориаза. Впервые проведено исследование 48 полиморфных вариантов генов семейства Toll-подобных рецепторов – TLR (1-10) с использованием SNPlex платформы (Applied Biosystems) и установлено, что полиморфные варианты генов TLR3 и TLR7 маркируют повышенный риск развития псориаза у лиц русской и татарской этнической принадлежности.
Научно – практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к псориазу.
Получены новые данные о влиянии исследуемых ДНК-локусов на риск развития псориаза у индивидов с учетом этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития болезни. В клинической практике тестирование полиморфных вариантов генов-кандидатов псориаза может быть применено для определения подходов к профилактике псориаза в отягощенных семьях и для разработки оптимальных и эффективных методов терапии. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития псориаза. Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских высших образовательных учреждениях, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация диссертации. Результаты исследования были представлены на ежегодных международных конференциях Европейского общества генетиков человека (Прага, 2005;
Амстердам, 2006;
Ницца, 2007;
Барселона, 2008), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), 5 Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), ежегодных международных конгрессах Европейской Академии дерматологии и венерологии (Родос, 2006;
Венна, 2007;
Париж, 2008), школе-семинаре «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007).
Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнены в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», РФФИ № 07-04-12045офи и РГНФ № 08-06-84605 А/У.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК.
Работа изложена на 157 страницах Структура и объем диссертации.
машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка (включает 170 работ отечественных и зарубежных авторов).
Диссертация иллюстрирована 26 рисунками и 37 таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы исследования. В работе использованы образцы ДНК индивидов, из них – 552 больных псориазом, состоящих на учете и находящихся на стационарном лечении в Республиканских кожно-венерологических диспансерах г.Уфа, г.Сибай, г.Кумертау Республики Башкортостан, г.Краснодар и г.Абакан, г.Черногорск Республики Хакасия в 2004-2008 гг. Выборку больных составили неродственные между собой пациенты в возрасте от 3 до 80 лет русской, татарской, башкирской и хакасской этнической принадлежности. Клиническое обследование проведено врачами отделений, которое включало в себя сбор жалоб и анамнеза, физикальные, лабораторные и инструментальные методы диагностики. В диагностике псориатического артрита использовалось рентгенографическое исследование суставов и позвоночника, а также анализ крови для определения ревматоидного фактора в крови пациента и исключения ревматоидного артрита. Контрольная группа была сформирована из 670 здоровых неродственных индивидов, соответствующих выборке больных по возрасту, полу и этнической принадлежности.
Методы исследования. ДНК была выделена из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew C. et al., 1984). Анализ полиморфных ДНК-локусов MHC проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с последующим электрофорезом в 7% полиакриламидном геле и визуализацией в проходящем УФ-свете после окрашивания гелей бромистым этидием. Генотипирование 48 SNPs генов семейства Toll-подобных рецепторов было осуществлено с использованием SNPlex платформы согласно протоколу (SNPlex Genotyping System 48-plex Protocol) компании Applied Biosystems. SNPlex технология основана на методе лигирования синтетических олигонуклеотидных зондов (OLA). Электрофоретический анализ меченных однонитевых фрагментов ДНК провели на автоматическом секвенаторе ABI 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems).
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Genepop 3.3 [Raymond and Rousset, 1995], «Statistic for Windows 6.0» (StatSoft), MS Excel 2003 (Microsoft) и RxC (Rows x Columns) [Roff D., Bentzen P., 1989]. При сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и здоровых лиц применялся критерий 2, точный критерий Фишера и критерий 2 с поправкой Йетса для таблиц сопряженности 2x2. Силу ассоциаций генотипических характеристик c риском развития псориаза оценивали по значениям показателя отношения шансов (odds ratio, OR) [Schlesselman J., 1982]. При оценке неравновесия по сцеплению каждой пары локусов использовался коэффициент D' [Lewontin, 1984], рассчитанный в программе EMLD и 2LD. Величины коэффициента D' неравновесия по сцеплению были визуализированы графически с помощью программы GOLD [Abecasis G. and Cookson W., 2000]. Для реконструкции гаплотипов и оценки их частот применяли программы Chaplin 1.2.2 [Epstein M. and Satten G., 2003] и Zaykin [Zaykin, 2002]. При анализе межгенных взаимодействий использовали метод GMDR [Lou, 2007]. Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA с риском развития псориаза в семьях с повторными и множественными случаями псориаза провели с помощью теста на неравновесную передачу [Spielman R., 1993]. Данные SNPlex генотипирования анализировали с помощью программы Genemapper 3.7. (Applied Biosystems).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов HLA-C, HCR и CDSN хромосомного региона PSORS1 (6р21.3) и TNFA с развитием псориаза Анализ ассоциации полиморфного локуса Cw6 гена HLA-C с псориазом. Было показано, что некоторые аминокислотные замены в полиморфных участках молекул HLA-C могут влиять на структурные изменения, значимые для образования «карманов», в которых связываются определенные презентируемые пептиды [Nair et al., 2006]. Эти изменения могут полностью нарушать правильное связывание конкретного пептида, препятствуя его успешной презентации, а также влиять на корректное физиологическое распознавание комплекса «пептид-молекула HLA» Т-клетками.
При сравнении распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса Cw6 гена HLA-C между группой больных псориазом и контрольной выборкой в целом, с учетом этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития болезни выявлены достоверно значимые различия (рис.1).
80 OR=4. OR=4. больные 40 OR=3.8 контроль Cw6-/Cw6- Cw6+/Cw6- Cw6+/Cw6+ Cw6- Cw6+ Рис. 1. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса Cw6 гена HLA-C у больных псориазом и здоровых доноров в целом В группе больных псориазом отмечено статистически достоверное увеличение частоты гомозиготного генотипа HLA-Cw6+/Cw6+, на долю которого приходилось 17.2% по сравнению с контрольной группой, где частота данного генотипа достигала лишь 5.07% (2=45.92, p0.000). Установлено, что аллель HLA-Cw6+ маркирует повышенный риск развития псориаза в изученных группах (рис.1).
Анализ ассоциаций полиморфных локусов G305A, C307T, C325T, T477C, Ген HCR кодирует белок, G1723T, A1911G, C2327G гена HCR с псориазом.
участвующий в иммунной регуляции кожи. Установлено, что SNPs в кодирующих последовательностях гена HCR изменяют вторичную структуру белка HCR, что может сказаться на его биохимических свойствах, и, следовательно, привести к модуляции функционирования белкового продукта и развитию псориатического фенотипа [Asumalahti et al., 2002].
При сравнении распределения частот аллелей и генотипов вышеуказанных полиморфных локусов гена HCR между группой больных псориазом и контрольной выборкой в целом, c учетом этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития болезни выявлены достоверно значимые различия (р0.001).
Исключение составил полиморфный локус HCR-G305A гена HCR, который не показал существенную ассоциацию с псориазом (р0.05).
Выявлен более высокий риск развития псориаза у русских с гомозиготным HCR 1723*T/1723*T генотипом (OR=4.96, 95%CI 2.14-11.9), у татар с гомозиготным HCR 325*T/325*T генотипом (OR=5.83, 95%CI 1.50-6.41), у башкир с гомозиготным HCR 1723*T/1723*T генотипом (OR=4.94, 95%CI 1.66-15.69) и у хакасов с гетерозиготным HCR-325*C/325*T генотипом (OR=5.42, 95%CI 2.47-12.01) (рис. 2).
OR=5. больные OR=4.94 контроль OR=5. OR=4. русские татары башкиры хакасы 1723*T/1723*T 325*T/325*T 1723*T/1723*T 325*C/325*T Рис. 2. Распределение частот генотипов полиморфных локусов гена HCR у лиц разной этнической принадлежности Аллель HCR-325*T является маркером более высокого риска развития заболевания у больных вульгарным псориазом и I типом заболевания (OR=3.9 и OR=4.3, p=0.0005, соответственно), аллель HCR-1723*T – у больных псориатическим артритом и II типом заболевания (OR=3.21 и OR=3.07, p=0.0005).
Анализ ассоциаций полиморфного локуса C1243T гена CDSN с псориазом. Ген S (CDSN), кодирующий белок корнеодесмозин, экспрессируется в эпидермальных кератиноцитах гранулярного слоя эпидермиса. Предполагается, что полиморфный вариант C1243T может быть важным в развитии псориатического фенотипа за счет модуляции уровня экспрессии и изменения стабильности мРНК CDSN гена и, видимо, отвечает за развитие процесса повреждающего шелушения, характерного для псориаза [Ahnini et al, 1999]. Установлена ассоциация аллеля 1243*С и гомозиготного генотипа 1243*С/С гена CDSN с вульгарным псориазом и началом развития заболевания до лет (OR=1.62, 95%CI 1.3-1.9, p=0.0005 и OR=1.68, 95%CI 1.3-2.04, p=0.0005, соответственно) (рис.3).
OR=1.79 OR=1.56 OR=1.62 OR=1. больные контроль русские 1243*C татары 1243*C вульгарный 40лет псориаз 1243*C 1243*C/1243*C Рис. 3. Распределение частот аллеля 1243*С и генотипа 1243*С/С полиморфного локуса C1243T гена CDSN в изученных группах Аллель 1243*С гена CDSN маркирует риск развития псориаза у индивидов русской и татарской этнической принадлежности (OR=1.79, 95%CI 1.4-2.3 и OR=1.56, 95%CI 1.04-2.3, соответственно).
Анализ ассоциаций полиморфного локуса G308A гена TNFA с псориазом.
Гиперплазия кератиноцитов может быть обусловлена дисбалансом цитокинов, ростовых факторов и их рецепторов, отвечающих за эпидермальную пролиферацию. На линиях В– клеток человека показано, что полиморфизм в положении -308 промоторного участка гена TNFА, характеризующийся заменой гуанина на аденин, ассоциирован с повышенной экспрессией гена in vitro: присутствие аллеля А связано с повышенной продукцией цитокина по сравнению с аллелем G [Wilson A., 1997].
Сопоставление распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса G308A гена TNFA между группой больных псориазом и контрольной выборкой в целом, с учетом этнической принадлежности, клинических форм и возраста начала развития болезни не выявило достоверно значимых различий (р0.05).
2. Анализ неравновесия по сцеплению между парами маркеров генов HLA-C, HCR и CDSN хромосомного региона PSORS1 и TNFA главного комплекса гистосовместимости (MHC) Одной из причин ассоциации может быть неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом болезни. Неравновесное сцепление предполагает, что ассоциированный аллель находится на предковой хромосоме в непосредственной близости от причинного гена болезни, и эта связь не была нарушена рекомбинациями за время существования популяции. Мы провели анализ неравновесия по сцеплению между парами маркеров генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA в выборках больных псориазом и здоровых индивидов в целом и с учетом этнической принадлежности. При оценке неравновесия по сцеплению каждой пары локусов использовался коэффициент D' [Lewontin, 1984], рассчитанный в программе EMLD и 2LD. Величины коэффициента D' неравновесия по сцеплению были визуализированы графически с помощью программы GOLD. Цвета соответствуют степеням неравновесия по сцеплению между маркерами:
красный цвет указывает на максимальные значения D', тогда как синий – на минимальные значения D' (рис. 4). Анализ неравновесия по сцеплению в выборках больных и здоровых доноров в целом выявил, что все аллели 305*A, 307*T, 325*T, 477*C, 1723*T, 1911*G, 2327*G гена HCR находятся в сильном неравновесии по сцеплению как между собой (D'0.51), так и аллелем Cw6+ гена HLA-C (D'0.53). При этом показано единственное сниженное значение D' между HLA-Cw6+ и HCR-477*C (D'=0.24, r=0.002) (рис. 4).
Рис. 4. График неравновесного сцепления между полиморфными локусами генов TNFA, HLA-C, HCR и CDSN в группах больных псориазом и здоровых индивидов в целом В то же время величина неравновесия по сцеплению для других пар аллелей Cw6+/CDSN-1243*С, HCR-307*T/CDSN-1243*С, HCR-325*T/CDSN-1243*С и HCR 1723*T/CDSN-1243*С была высокой (D'0.37), а между аллелями HCR-477*C/CDSN 1243*С, HCR-1911*G/CDSN-1243*С и HCR-2327*G/CDSN-1243*С – низкой (D'0.20).
Тем самым можно предположить прошедшие hot-spot рекомбинации между генами HLA C и HCR с одной стороны, HCR и CDSN – с другой стороны. Видимо, также прошедшие рекомбинации снизили выраженность ассоциации аллелей 477*C, 1911*G и 2327*G гена HCR с псориазом (OR=1.50, OR=1.9 и OR=2.8). Наши результаты согласуются с данными, которые были получены международным консорциумом при исследовании 419 семей с псориазом из шести популяций [Asumalahti et al., 2002] и учеными из Великобритании [Capon et al., 2003].
3. Реконструкция и анализ гаплотипов полиморфных локусов генов HLA-C, HCR и CDSN хромосомного региона PSORS1 (6р21.3) Анализ гаплотипов обладает огромным потенциалом для точного и эффективного выявления генов наследственной предрасположенности к многофакторным заболеваниям. В ассоциативных исследованиях рекомбинации между маркерными SNPs и аллелями, причинно связанными с заболеваниями, будут «размывать» неравновесие по сцеплению между ними, и снижать выраженность ассоциации [Воевода М.И., 2006]. С другой стороны, гаплотипы, которые, например, определяются двумя SNPs маркерами, фланкирующими аллель ассоциированный с заболеванием, с большей вероятностью останутся сцепленными с этим аллелем, чем каждый из SNP по отдельности. Важно также и то, что многие расположенные рядом SNPs могут встречаться в составе одного гаплотипа благодаря неравновесию по сцеплению. В связи с этим для идентификации таких гаплотипов можно генотипировать только часть SNPs, так называемые SNPs, маркирующие гаплотип. Данный подход позволяет существенно сократить временные и материальные затраты на генотипирование и соответственно уменьшить число независимых переменных в анализе.
На основе генотипических данных больных псориазом и здоровых индивидов по полиморфным локусам Cw6 гена HLA-C, C307T, C325T, T477C, G1723T, A1911G, C2327G гена HCR, C1243T гена CDSN были реконструированы гаплотипы и оценены их частоты с помощью двух программ Chaplin 1.2.2 и Zaykin. Показано, что рисковый гаплотип 255 ассоциирован с риском развития псориаза у больных русской, татарской и хакасской этнической принадлежности (OR=7.6 95%CI 4.0-14.9, OR=5.05 95%CI 1.8-14, OR=3.3 95%CI 1.3-8.2, соответственно, p0.05). Гаплотипы 16, 17, 20, 21 маркируют пониженный риск развития псориаза у лиц русской, татарской и хакасской этнической принадлежности. Гаплотип повышенного риска характеризуется одновременным присутствием всех рисковых аллелей полиморфных локусов генов HLA-C, HCR и CDSN (табл. 1), что может быть обусловлено, прежде всего, высокими значениями неравновесия по сцеплению аллеля HLA-Cw6+ с аллелями 307*T, 325*T, 477*C, 1723*T, 1911*G, 2327*G гена HCR и с аллелем 1243*С гена CDSN (D'0.51). При этом аллели, между которыми наблюдается низкие значения неравновесия по сцеплению (D'0.20) тоже входят в состав этого рискового гаплотипа. Протективные гаплотипы 20 и 21 отличаются друг от друга аллелями полиморфного локуса С1243Т гена CDSN: первый содержит протективный аллель CDSN-1243*Т (OR=0.5, 95%CI 0.43-0.71), а второй – аллель повышенного риска развития псориаза CDSN-1243*С (OR=1.79, 95%CI 1.39 2.29). Интересно отметить, что альтернативный аллель Cw6- гена HLA-C состоит во всех протективных гаплотипах и во всех из них инвариантными являются аллели Cw6- гена HLA-C и 307*C, 325*C, 1723*G, 2327*C гена HCR.
Таблица Распределение частот рисковых и протективных гаплотипов полиморфных локусов генов HLA-C, HCR и CDSN у больных псориазом и здоровых индивидов русской, татарской и хакасской этнической принадлежности CDSN-C1243T HCR-C2327G HCR-A1911G HCR-G1723T HCR-C307T HCR-C325T HCR-T477C Гаплотипы HLA-Cw Контроль Больные 2 (p) N=297 N=273 OR(95%CI) pj pi русские 20 Cw6- C C C G G C T 0.078 0.034 0.4 (0.17-0.9) 4.5(0.034) 21 Cw6- C C C G G C C 0.146 0.069 0.4 (0.23-07) 9.14(0.005) 255 Cw6+ T T C T G G C 0.045 0.263 7.6 (4.0-14.9) 51.2(0.005) татары Cw6- C C C G A C T 0.182 0.063 0.27(0.09-0.7) 6.9(0.0094) 255 Cw6+ T T C T G G C 0.056 0.217 5.05 (1.8-14) 11.8(0.0013) хакасы 17 Cw6- C C C G A C C 0.1240 0.0389 0.1(0.06-0.8) 4.7(0.030) 21 Cw6- C C C G G C C 0.2382 0.0783 0.2 (0.04-0.7) 6.1(0.014) 255 Cw6+ T T C T G G C 0.1164 0.3001 3.3 (1.3-8.2) 7.15(0.0083) Примечание здесь и далее: N – объем выборки;
n – численности групп;
pj – частота гаплотипа у здоровых доноров;
pi – частота гаплотипа у больных. Значения OR с вероятностью p0.05 были приняты как статистически значимые.
Полученные данные свидетельствуют о спорной роли гена CDSN в патогенезе псориаза, а достоверно значимая ассоциация с псориазом аллеля CDSN-1243*С, возможно, обусловлена неравновесием по сцеплению с аллелем HLA-Cw6+ и прошедшими рекомбинациями с рисковыми аллелями предполагаемого причинного гена.
4. Анализ роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к псориазу В большинстве случаев наследственная предрасположенность формируется специфической комбинацией аллелей нескольких генов, вносящих вклад в развитие или модификацию клинических проявлений болезни. Участие нескольких генов в генетическом контроле может иметь форму их аддитивного действия, либо один из генов окажется главным, остальные будут иметь модифицирующее влияние. Мы провели оценку роли межгенных взаимодействий в формировании генетической предрасположенности к псориазу с помощью метода GMDR, который позволяет выстроить оптимальную модель межгенных и ген-средовых взаимодействий на основе анализа неодинаковых по числу выборок неродственных индивидов, одновременного анализа множества полиморфных вариантов генов, выбора комбинации локусов, предрасполагающих к развитию заболевания, и расчета уровня значимости их взаимодействия. В результате исследования межгенных взаимодействий полиморфных локусов Cw6 гена HLA-C, G305A, C307T, C325T, T477C, G1723T, A1911G, C2327G гена HCR, C1243T гена CDSN и G308A гена TNFA в общей выборке больных псориазом и здоровых индивидов показано, что практически все изученные локусы достоверно взаимодействуют друг с другом. В общей выборке определена основная модель из комбинации трех ДНК-локусов: HLA-Cw6, HCR-G1723T и HCR-С2327G, взаимодействие которых возможно предрасполагает к развитию псориаза (p0.0001) (рис. 5).
Повышенный риск Пониженный риск Пустая ячейка Рис. 5. Сочетания генотипов полиморфных локусов генов HLA-C и HCR повышенного и пониженного риска развития псориаза в изученных выборках в целом. Левый столбик – больные псориазом, правый – здоровые индивиды.
Обнаружено 15 комбинаций генотипов повышенного риска развития заболевания, из которых ассоциированными с развитием псориаза оказались следующие сочетания:
HLA*Cw6+/Cw6+-HCR*1723T/T-HCR*2327G/G (OR= 7.49, 95%CI 3.13-17.95, p0.0000);
HLA*Cw6-/Cw6+-HCR*1723G/T-HCR*2327C/G (OR=6.22, 95%CI 3.21-12.04, p0.0005);
HLA*Cw6+/Cw6+-HCR*1723G/T-HCR*2327C/G (OR=4.52, 95%CI 2.13-9.55, p0.0000);
HLA*Cw6+/Cw6+-HCR*1723G/T-HCR*2327G/G, HLA*Cw6+/Cw6+-HCR*1723G/T HCR*2327С/G и HLA*Cw6-/Cw6+-HCR*1723T/T- HCR*2327G/G (OR=inf. p0.0000).
Рис. 6. Сочетания полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA, приводящих к формированию наследственной предрасположенности к псориазу в изученных выборках в целом.
Проведенный анализ показал значительные ген-генные взаимодействия между локусами HLA-Cw6, HCR-C307T, HCR-C325T, HCR-G1723T, HCR-C2327G и подтвердил полученные нами результаты анализа ассоциаций данных локусов с развитием псориаза (рис. 6) Таким образом, можно предположить, что в формировании наследственной предрасположенности к псориазу основную роль играет взаимодействие полиморфных вариантов генов HLA-C и HCR.
5. Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA с псориазом в семьях К группе «семейных» (family-based) тестов на сцепление и ассоциацию относится тест на неравновесие при передаче (TDT – transmission disequilibrium test). TDT был впервые предложен Spielman и коллегами в 1993 г. при анализе сцепления маркерных аллелей с сахарным диабетом типа 1. Тест сводится к сравнению частот альтернативных аллелей у больных потомков гетерозиготных родителей: если один из аллелей существенно чаще встречается у больных потомков, это свидетельствует о его ассоциации с заболеванием [Spielman et al., 1993]. Для выполнения этого теста используются пары родитель – больной ребенок. Среди других подобных тестов TDT обладает самой высокой способностью определения сцепления или ассоциации. Другим преимуществом теста является то, что его разрешающая сила практически не зависит от тестируемой модели наследования при анализе сцепления. Наиболее эффективен TDT при анализе аддитивной модели наследования.
Нами проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA с риском развития псориаза в 18 семьях с повторными и множественными случаями псориаза с помощью теста на неравновесную передачу. Выявлено значительное нарушение равновесия в передаче аллеля Cw6+ гена HLA-C, что приводит к выводу о существовании ассоциации с псориазом (табл. 2).
Таблица Результаты анализа TDT теста полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA Аллели TDT p Cw6+ 1.5 0. 0.13 0. 305*A 0.8 0. 307*T 0.9 0. 325*T 0.35 0. 477*C 0.6 0. 1723*T 0.41 0. 1911*G 0.53 0. 2327*G 0.33 0. 1243*С 0.001 0. 308*A При анализе остальных полимофных локусов генов HCR, CDSN и TNFA мы не получили достоверных значений, а значит не обнаружили нарушения равновесия связи аллелей 305*A, 307*T, 325*T, 477*C, 1723*T, 1911*G, 2327*G гена HCR, аллеля 1243*С гена CDSN, аллеля 308*A гена TNFA с псориазом (табл. 2).
Полученные нами результаты согласуются с данными зарубежных семейных исследований, где также показана ассоциация с псориазом для аллеля Cw6+ гена HLA-C [Asumalahti et al., 2002;
Nair et al., 2006].
Таким образом, анализ ассоциаций с риском развития псориаза полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, CDSN и TNFA в 18 семьях с повторными и множественными случаями псориаза с помощью теста на неравновесную передачу подтвердил, что возможно, ген HLA-C влияет на формирование предрасположенности к заболеванию в семьях.
6. Анализ ассоциаций 48 полимофных вариантов генов семейства Toll подобных рецепторов – TLR (1-10) Толл-подобные рецепторы – класс клеточных рецепторов с одним трансмембранным фрагментом, которые распознают консервативные структуры микроорганизмов, активируют клеточный иммунный ответ и играют ключевую роль во врожденном иммунитете. В настоящее время известно 10 клеточных ТЛР, распознающих бактерии, вирусы, грибы и др. патогены человека. Толл-подобные рецепторы активируются различными лигандами, которые, главным образом, являются структурными компонентами бактерий, вирусов и грибов. SNPs в генах регуляторных молекул начальных этапов развития воспалительной реакции в ряде случаев обусловливает нарушения, которые приводят к изменениям количественных показателей функционирования, что сказывается на развитии и исходе инфекционных, воспалительных и иммунопатологических процессов.
Учитывая возможное участие в механизмах иммунопатогенеза псориаза полиморфных вариантов генов семейства TLR (1-10), мы провели генотипирование SNPs генов семейства TLR (1-10) с использованием SNPlex платформы Applied Biosystems).
При сравнении выборок больных псориазом и контрольной группы в целом обнаружены статистически значимые различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs4862632 гена TLR3 (p0.001) (рис.7).
rs4862632 A выборка в целом OR=1. rs4862632 A русские OR=2. rs4862632 AA русские OR=3.15 больные татары rs179008 T OR=1. татары rs179020 A OR=1.79 татары OR=1. rs12013728 G 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Рис. 7. Маркеры повышенного риска развития псориаза полиморфных локусов генов TLR3 и TLR7 в исследованных выборках В группе больных псориазом отмечено статистически достоверное увеличение частоты гомозиготного генотипа АА (rs4862632) гена TLR3, на долю которого приходилось 76% по сравнению с контрольной группой, где частота данного генотипа составила 65% (2=45.92, p0.004). Было выявлено, что аллель А (rs4862632) гена TLR маркирует повышенный риск развития псориаза в изученной выборке (OR=1.65, 95%CI 1.18-2.32).
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs4862632 гена TLR3 у больных псориазом и контрольной группе русской этнической принадлежности обнаружил достоверные различия (p0.001) (рис.7).
Установлена ассоциация аллеля А и генотипа АА (rs4862632) гена TLR3 с развитием псориаза у индивидов русской этнической принадлежности (OR=2.7, 95%CI 1.3-5.5 и OR=3.1, 95%CI 1.8-8.0).
При сравнении выборок больных псориазом и контрольной группы татарской этнической принадлежности обнаружены статистически значимые различия по распределению частот аллелей полиморфных локусов rs179008, rs179020, rs гена TLR7 (p0.001). Аллель Т (rs179008) гена TLR7 (22.9%) у больных псориазом татарской этнической принадлежности определялся достоверно чаще, чем в контрольной группе (13.6%). Относительный риск развития псориаза у лиц, имеющих аллель Т(rs179008), составил 1.9 (95%CI 1.08-3.3). Аллель А (rs179020) гена TLR7 достоверно чаще встречался у больных псориазом (31.5%) по сравнению со здоровыми индивидами (20.5%) (OR=1.79, 95%CI 1.12-2.8). Также, было показано, что аллель G (rs12013728) гена TLR7 является маркером повышенного риска развития псориаза у индивидов татарской этнической принадлежности (OR=1.90, 95%CI 1.26-2.8) (рис.7).
Таким образом, была установлена ассоциация полиморфных вариантов генов семейства Toll-подобных рецепторов с развитием псориаза: аллеля А и генотипа АА (rs4862632) гена TLR3 у индивидов русской этнической принадлежности, аллелей Т (rs179008), А (rs179020) и G (rs12013728) гена TLR7 у индивидов татарской этнической принадлежности.
Резюмируя вышеизложенные результаты, можно заключить, что полиморфные варианты генов PSORS1 могут занимать определенное место не только в структуре механизмов определения фенотипических вариантов псориаза (вульгарного псориаза и псориатического артрита) у больных, но и играть важную роль в формировании предрасположенности к развитию псориаза. Изученные полиморфные маркеры генов семейства Toll-подобных рецепторов (генов TLR3 и TLR7) могут рассматриваться в качестве возможных маркеров генетической предрасположенности к псориазу.
ВЫВОДЫ 1. Позитивный аллель Сw6, генотипы Сw6+/Сw6+ и Сw6+/Сw6- гена HLA-C являются маркерами повышенного риска развития псориаза во всех изученных этнических группах.
2. Обнаружена ассоциация с псориазом аллелей 307*Т, 325*T, 1723*Т, 1911*G, 2327*G и генотипов 307*Т/T, 325*C/T, 325*T/T, 1723*C/T, 1723*T/T, 2327*C/G, 2327*G/G гена HCR во всех изученных этнических группах.
3. Установлена ассоциация аллеля 1243*С гена CDSN с псориазом у индивидов русской и татарской этнической принадлежности, аллеля 1243*С и гомозиготного генотипа 1243*С/С гена CDSN с вульгарным псориазом и началом развития заболевания до 40 лет.
4. Показано, что все аллели гена HCR находятся в сильном неравновесии по сцеплению как между собой (D'0,51), так и с аллелем Cw6+ гена HLA-C (D'0,53), за исключением локуса Т477С гена HCR. Выявлены области пониженного неравновесия по сцеплению между генами HLA-C и HCR, HCR и CDSN.
5. Определен гаплотип HLA-Cw6+/HCR-307*T/HCR-325*T/HCR-477*C/HCR 1723*T/HCR-1911*G/HCR-2327*G/CDSN1243*C, ассоциированный с развитием псориаза у индивидов русской, татарской и хакасской этнической принадлежности.
6. Показано, что в формировании генетической предрасположенности к развитию псориаза лежит взаимодействие полиморфных вариантов генов HLA-C и HCR:
HLA-Cw6, HCR-C307T, HCR-C325T, HCR-G1723T, HCR-C2327G.
7. Выявлено значительное нарушение равновесия в передаче позитивного аллеля Сw6 гена HLA-C (TDT=1.5, p=0.001) в семьях с повторными и множественными случаями псориаза.
8. Установлена ассоциация полиморфных вариантов генов семейства Toll-подобных рецепторов с развитием псориаза: аллеля А и генотипа АА (rs4862632) гена TLR3 у индивидов русской этнической принадлежности, аллелей Т(rs179008), А (rs179020) и G (rs12013728) гена TLR7 у лиц татарской этнической принадлежности.
Список публикаций по теме диссертации 1. Э. С. Галимова, В. Л. Ахметова, Э. К. Хуснутдинова. Молекулярно-генетические основы предрасположенности к псориазу. Генетика. Т. 44. №5. 2008. С. 594-605.
2. Э. С. Галимова, В. Л. Ахметова, Б. Б. Юнусбаев, Б. Г. Латыпов, З. З. Султанова, Л.
Р. Газизова, Р. З. Галина, В. М. Котюшев, М. Х. Кызласова, Е. Е. Шушеначева, Э.
К. Хуснутдинова. Гаплотипический анализ локуса PSORS1 у больных псориазом в России. Медицинская генетика. № 2. С. 26-31.
3. Э.С. Галимова, В.Л.Ахметова, Э.К.Хуснутдинова. Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов HLA-C, HCR, MTHFR с развитием псориаза в России. // Сборник тезисов ”Генетика в России и мире, посвящённой 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН”. Москва. 2006. С.42.
4. Galimova E.S, Akhmetova V.L., Khusnutdinova E. HLA-C gene association with psoriasis vulgaris in Russian population // 8th International Meeting On Human Genome Variation and Complex Genome Analysis. Hong Kong. 2006. V.12. P.102.
5. Galimova E.S., Akhmetova V.L., Khusnutdinova E.K. Investigation of HLA-C, HCR and MTHFR genes polymorphisms in Russian patients with psoriasis // 15th Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology. Greece. 2006. P. 6. Galimova E.S., Akhmetova V.L., Khusnutdinova E.K. The analysis of association of polymorphisms in HLA-C, HCR and MTHFR genes with development of psoriasis in Bashkortostan // Abstracts of the European Human Genetics Conference. Amsterdam.
2006. V.324. P.1024.
7. E.Galimova, V.Akhmetova, E.Khusnutdinova.. HLA-C and HCR genes association with psoriasis in Russian populations // 16th Congress European Academy of Dermatology and Venereology. Vienna, Austria.. 2007. P. 8. E. Galimova, V. Akhmetova, E. Khusnutdinova. Association of PSORS1 with psoriasis in Russian populations // Abstracts of the European Human Genetics Conference. Nice, France. 2007. P. 9. Э. С. Галимова, В. Л. Ахметова, З. З. Султанова, Л. Р. Газизова, Э. К.
Хуснутдинова. Генетический анализ HLA-C, HCR и CDSN генов главного комплекса гистосовместимости у больных псориазом в России // 5 Всемирный конгресс по иммунопатологии и аллергии. Москва. 2007. С. 10. Э. С. Галимова, В. Л. Ахметова, Б. Б. Юнусбаев, Э. К. Хуснутдинова.
Гаплотипический анализ полиморфных локусов главного комплекса гистосовместимости MHC I у больных псориазом // Биомика-наука 21 века.
Школа-семинар молодых ученых УФНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. Уфа. 2007. С. 11. E.Galimova, V.Akhmetova, L.Gazizova, Z.Sultanova, E.Shushenacheva, M.Kizlasova, E.Khusnutdinova. Haplotype associations of the MHC with psoriasis vulgaris in Russian patients // Abstracts of the European Human Genetics Conference. Barcelona, Spain..
2008. V. 16. P. 12. E.Galimova, V.Akhmetova, E.Khusnutdinova.. HLA-C and HCR genes association with psoriasis in Russian populations // 17th Congress European Academy of Dermatology and Venereology. Paris. France. 2008. P. Список сокращений и обозначений MHC – Главный комплекс гистосовместимости;
TLR – Толл-подобный рецептор;
SNP – Однонуклеотидный полиморфизм;
GMDR – Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction;
PSORS1 – Локус предрасположенности к псориазу 1;
TDT – Тransmission disequilibrium test;
ПЦР – Полимеразная цепная реакция;
ПДРФ – Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов;
OR (odds ratio) – Показатель соотношение шансов;
CI, confidence interval – 95% доверительный интервал;
р – Вероятность;
Галимова Эльвира Сафуановна Молекулярно-генетическое исследование псориаза 03.00.15 – генетика Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Подписано в печать 20.11.08 г. Формат 60х84 1/16.
Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 120 экз. Заказ 205.
Гарнитура «TimesNewRoman». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО.
Объем 0,9 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-