Нитритрезистентные бактерии рода halomonas в процессах аноксического культивирования
На правах рукописи
СЕМЕНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА НИТРИТРЕЗИСТЕНТНЫЕ БАКТЕРИИ РОДА HALOMONAS В ПРОЦЕССАХ АНОКСИЧЕСКОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 03.00.23 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2009
Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии Учрежде ния Российской академии наук Института биологии Уфимского научного центра РАН (ИБ УНЦ РАН)
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Усанов Николай Глебович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Киреева Наиля Ахняфовна доктор биологических наук, профессор Чернов Владислав Моисеевич
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отде ления РАН (г. Пермь)
Защита диссертации состоится 24 апреля 2009 года в 14.00 часов на за седании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 69.
Тел. (347) 235-62-47 E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Россий ской академии наук Института биологии Уфимского научного центра РАН и на официальном сайте http://www.anrb.ru/inbio/sovet.html
Автореферат разослан 20 марта 2009 г.
Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент Р.В.Уразгильдин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Промышленные биотехнологические процессы, основанные на использовании микроорганизмов, практически всегда связаны с их куль тивированием, осуществляемым различными способами. Одним из ос новных требований, предъявляемых к микробным технологиям, является создание асептических условий, при одновременной подаче и дисперги ровании в питательной среде свежих порций стерильного кислорода (воздуха) в сочетании с отводом отработанного газа (Kane, 1993;
McNeil and Harvey, 2008;
Schallmey et al., 2004). Реализация этого требования возможна лишь при использовании сложного технологического оборудо вания и сопряжена с высокими энергетическими и экономическими за тратами. Одним из путей их снижения является использование методов анаэробного культивирования, осуществляемых, например, при фермен тации облигатно анаэробных бактерий или микроорганизмов, обладаю щих бродильным типом метаболизма, архей, дрожжей (Morris, 1994;
Stal and Moezelaar, 1997). Недостатком биотехнологий данного типа являются их сравнительно низкие скорость и эффективность. Вместе с тем, извест ны микроорганизмы, обладающие аэробным типом дыхания, и, одновре менно, способные к энергетическому метаболизму при наличии в пита тельной среде других окислителей, например, нитратов, перхлоратов (Stal and Moezelaar, 1997;
Straub et al., 2000;
Zumft, 1992). Процессы их ферментации относятся к аноксическим и применяются, главным обра зом, в технологии очистки сточных вод, при этом скорость деления кле ток приближается к уровню аэрируемого культивирования (Casella and Payne, 1996;
Stepanov and Korpela, 1997). Присутствие NaNO3 в среде устраняет необходимость стерильной аэрации и диспергирования возду ха, что приводит к соответствующему снижению затрат. Вместе с тем, для получения высоких конечных концентраций биомассы в аноксиче ских процессах требуются значительные стартовые концентрации окис лителя в среде, например, нитратов. С другой стороны, восстановление нитратов микроорганизмами до газообразного азота происходит с обра зованием и промежуточным накоплением в среде токсичных нитритов, способных ингибировать рост рабочей культуры в очень низких концен трациях – 0,05 - 0,1% NaNO2 (Chung et al., 2004). Таким образом, исполь зование метаболизма полной денитрификации в классическом варианте не целесообразно из-за низких результирующих концентраций клеток.
Сравнительно недавно (Усанов с соавт., 2002, 2003) обнаружены алкало галотолерантные микроорганизмы, относящиеся к роду Halomonas (Vree land et al., 1980), устойчивые к высоким концентрациям нитритов и осу ществляющие активную денитрификацию NO3- и NO2- до газообразного азота. Представляется вероятным и возможным их использование в каче стве базовых культур (хостов) для генетической модификации, что по зволит осуществлять их культивирование без применения аэрации возду хом, заменив его адекватными концентрациями NaNO3. Можно предпо ложить, что вследствие высокой токсичности нитрита, который неизбеж но будет накапливаться в среде, подобные системы будут устойчивы к контаминации. В этом случае процесс культивирования можно будет осуществлять в биореакторах упрощенного типа, представляющих собой герметичную емкость с устройством для термостатирования, снабжен ных маломощной циркуляционной мешалкой, что, в свою очередь, при ведет к значительному снижению капитальных, эксплуатационных и энергетических затрат.
Цель исследования Выделение и изучение нитритрезистентных бактерий рода Halo monas для процессов аноксической ферментации и получения рекомби нантных белков в условиях неингибированного нитратного и нитритного дыхания.
Задачи исследования 1. Выделить из природных ниш обитания культуры денитрифи цирующих бактерий, способные к активному аноксическому росту на минимальных субстратах (цитрат натрия) в присутствии высоких кон центраций нитратов и нитритов, определить их таксономическое поло жение с использованием современных методов сравнительного филоге нетического анализа структуры 16S рРНК.
2. Изучить физиологические и биохимические свойства, а также денитрифицирующую активность выделенных штаммов, их устойчи вость к высоким концентрациям токсичных нитритов, выявить перспек тивные рабочие изоляты бактерий, способных к активному аноксическо му дыханию.
3. Подобрать модельный вектор, кодирующий зеленый флуорес центный белок, и провести трансформацию одного из активных изолятов рекомбинантной ДНК, испытать его в режиме периодической и проточ ной ферментации.
4. Изучить поведение культур наиболее активных денитрифика торов в моделях технологии очистки образцов питьевой воды из под земных источников, загрязненной анионами нитратов и нитритов.
Научная новизна Впервые обнаружены два типа акцепции нитрит анионов, исполь зуемых в качестве единственного акцептора электронов при росте куль тур денитрификаторов рода Halomonas в средах с высокой щелочностью (pH9) – диффузия и активный транспорт.
Для обозначения предположительно новой группы денитрифика торов, способных к активной акцепции NO2-, предложен термин “нитри тофильные” культуры.
Определены полные последовательности гена 16S рРНК для изолятов галомонад, проведена реконструкция моделей филогенетиче ских древ и определено их положение в роду Halomonas.
Подобраны условия трансформации культуры рода Halomonas sp.
IB-G4 плазмидой рHS15G2, несущей ген зеленого флуоресцентного бел ка (GFP), в результате чего получены 4 клона трансформантов.
Впервые проведена трансформация денитрификаторов рода Halomonas рекомбинантной ДНК без использования хелперной плазми ды.
Качественно показана экспрессия плазмиды в хосте в процессе аноксического культивировании трансформанта G4.4 в условиях неинги бированного нитратного и нитритного дыхания.
Практическая значимость Создана коллекция штаммов Halomonas, развивающихся в анок сических условиях на минимальном субстрате (цитрате), способных к одновременному активному росту и денитрификации в присутствии вы соких концентраций нитрита натрия (до 8% масс.).
Полные последовательности генов 16S рРНК пяти культур депо нированы в базе данных EMBL (European Molecular Biology Labora tory)/GenBank и доступны в сети Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) под номерами AM490135, AM490136, AM490137, AM490138, AM490139.
Установлены кинетические параметры аноксического культиви рования штамма Halomonas sp. IB-G4 в присутствии нитрата или нитрита в качестве единственного акцептора электронов – максимальная удельная скорость роста на нитрате max = 0,8 ч-1, на нитрите max = 0,9 ч-1.
Показана принципиальная возможность и перспективность при менения нитритофильных галомонад в процессах тонкой очистки питье вой воды, загрязненной анионами нитратов и нитритов.
Апробация работы Материалы диссертации представлены на ряде научных форумов:
межвузовской научно-технической конференции «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» (Уфа, 2006), XIV Ме ждународной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), межрегиональной школе конференции «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2007), III Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Ура ла» (Оренбург, 2007), региональной конференции молодых ученых с ме ждународным участием «Современные проблемы экологии, микробиоло гии и иммунологии» (Екатеринбург – Пермь, 2007), II Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008).
Конкурсная поддержка работы Исследования поддержаны грантом Республики Башкортостан молодым ученым и молодежным научным коллективам «Экономически эффективные системы для получения рекомбинантных белков на основе нитритофильных бактерий рода Halomonas» (№ 21 от 28.01.2008);
гран том Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно технической сфере «Новая парадигма ферментации» (№ ГР 01200850086) по программе «Участник молодежного научно-инновационного конкур са» («У.М.Н.И.К.»).
Публикации По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 1 – в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикаций материалов канди датских работ.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспери ментальной части, изложения результатов, выводов, приложений и спи ска цитируемой литературы, содержащего 241 ссылку. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 17 таб лиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Микроорганизмы. Объектами исследования служили галоалка лофильные нитриттолерантные бактерии рода Halomonas из коллекции Института биологии УНЦ РАН, а также вновь выделенные из природных мест обитания изоляты.
Скрининг и культивирование. Выделение из почвенных образ цов нитритрезистентных бактерий, предположительно относящихся к роду Halomonas, осуществляли методом накопительных культур в ана эробных условиях на селективных средах с последующим пассажирова нием для получения чистой культуры. Селективные среды, обозначенные GF (CGF), имели следующий состав, г/л: дрожжевой экстракт – 10 (цит рат натрия – 15), KH2PO4 – 4, Na2CO3 – 2, NaCl – 10, NaNO2 – 20;
рН 9,2 – 9,4. Дальнейшее исследование полученных культур проводили на анало гичных питательных средах при температуре 30 – 37°С. Аноксический рост культур изучали в специальных стеклянных пробирках с завинчи вающимися крышками, заполненных до верха питательной средой.
Аэробное культивирование проводили в конических колбах объемом мл на воздушно-термостатируемых качалках типа УВМТ-12-250 при скорости перемешивания 150 – 200 об/мин.
Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры кле ток исследовали с помощью фазовой оптической и сканирующей зондо вой микроскопии на микроскопах Carl Zeiss (Германия) и Solver Pro-M (NT-MDT, г. Зеленоград, Россия).
Фенотипическая характеристика. Изучение физиолого биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов проводи ли, руководствуясь требованиями к описанию новых групп бактерий се мейства Halomonadaceae (Arahal et al., 2007), а также методами, описан ными в руководствах: «Определитель бактерий Берджи» (1997), «Методы общей бактериологии» (Герхардт и др., 1984), «Практикум по микробио логии» (Нетрусов и др., 2005).
Филогенетический анализ. Выделение ДНК проводили методом фенольной экстракции (Wilson, 2001). Последовательности 16S рРНК ге нов (1463 – 1507 п.о.) были получены методом ПЦР, с использованием концевых праймеров 16SF27 и 16SR1512 и реакционной смеси, содер жащей стандартные концентрации дНТФ и Taq-полимеразы (Fermentas, Литва) и ДНК-матрицу. Полимеразную реакцию проводили в амплифи каторе MasterCycler Personal (Eppendorf, Германия). Секвенирование гена 16S рРНК проводили на секвенаторе Perkin-Elmer ABI PRISMTM 373 с использованием универсальных для большинства прокариот праймеров.
Анализ полученных последовательностей штаммов IB-NN3-2c, IB-O18, IB-O7-1, IB-O7-6, IB-G4 и построение филогенетических древ были вы полнены с помощью программ BioEdit (Hall, 2007) и TREECON (Van de Peer and De Wachter, 1994).
Трансформация плазмидной ДНК. Для трансформации штамма Halomonas sp. IB-G4 использовали плазмидный вектор pHS15G2, любез но предоставленный профессором Constantin Drainas (University of Io annina Department of Chemistry Biochemistry Lab, Греция). Трансформа цию проводили методом электропорации в электропораторе MicroPulser (Bio-Rad, США). Компетентные клетки подвергали действию электриче ского импульса напряжением 2,5 кВ в течение 5 мсек. Напряженность электрического поля составила 12,5 кВ/см.
Ферментация. Аноксическое культивирование рабочего штамма галомонад проводили в непрерывном и периодическом режиме в стек лянном реакторе с рабочим объемом 160 мл, оборудованном магнитной мешалкой (60 – 100 об/мин), насосами подачи стерильной питательной среды и отбора культуральной жидкости, рубашкой для поддержания по стоянной температуры, а также патрубком для отвода образующегося азота.
Определение анионного состава. Качественный и количествен ный анализ анионного состава образцов воды и культуральной жидкости проводили методом высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭФ) на приборе АКИ «Нанофор 01» (г. Санкт-Петербург, Россия), в кварцевом капилляре длиной l = 75 см, внутренний диаметр dвн = 70 мкм;
при рабочем напряжении 11 кВ;
детектирование – непрямое в ультра фиолетовой области с длиной волны = 254 нм;
буферный раствор – хроматный электролит (5 мМ оксида хрома (VI), 20 мМ диэтаноламина, 1,65 мМ N-цетил-N,N,N-триметиламмония бромида). Статистически дос товерная чувствительность метода по нитрит аниону составляла 0,5 мг/л.
Статистическая обработка экспериментальных данных. Ста тистическую обработку результатов экспериментов проводили стандарт ными методами дисперсионного и корреляционного анализа с помощью программы Microcal Origin 7.5 Pro.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение из природных источников нитритрезистентных культур рода Halomonas, их морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика Скрининг денитрифицирую щих бактерий, предположительно от носящихся к роду Halomonas, прово дили методом накопительных культур на жидких щелочных средах в ана эробных условиях. Фактором селек ции служил NaNO2, вносимый в пита тельную среду в качестве акцептора электронов в концентрации 2% масс.
Накопительные культуры инкубиро вали при 37С, 48 ч. Пробы, демонст рирующие активное образование газо образного азота, высевали на щелоч ной питательный агар. Было обследо- Рисунок 1. Клетки нитритрези вано 24 природных образца, включав- стентной культуры Halomonas ших пробы чернозема (Челябинская и sp. IB-G4.
Кировская обл.), песка и литорального грунта с прибрежных зон Красного и Черного морей, ила со дна содовых и соленых озер (Республика Бурятия и Оренбургская обл.), почвы, ото бранные в районах горячих источников (Республика Бурятия и Камчат ка). Всего были выделены 21 денитрифицирующий изолят: 10 на богатой Таблица 1. Сравнительная фенотипическая характеристика некоторых нитритрезистентных изолятов, классических видов рода Halomonas (H. elongata, H. variabilis) и денитрифицирующих галомонад, имеющих наиболее высокое сродство по 16S рРНК (H. desiderata, H. halodenitrificans) H. halo IB-NN3- H. elonga- H. vari- H. desid Характеристика IB-I6 IB-G4 IB-O7-6 IB-O18 IB-O7-1 denitrifi ta1 abilis1 erata 2c cans палоч- палоч- палоч Морфология палочки палочки палочки палочки палочки палочки палочки ки ки ки Подвижность + + + + + + + + + – Пигментация беж. прозрач. бел. бел. беж. бел. бел. беж. беж. беж.
Окраска по Граму – – – – – – – – – – Факульт. анаэроб + + + + + + + – + + Каталаза + + + + + + НД НД + НД Восстановление + + + + + + + – + + NO3- до NO2 Денитрификация + + + + + + – – + + + Потребность в Na, М 0,001 0,051 0,068 0,204 0,034 0,034 НД НД + НД Диапазон рН 6,5-11,5 7,0-11,5 7,0-11,5 7,0-10,5 7,0-11,5 6,5-11,5 5-10 6-9 7-11 5- Температура, С 6-50 6-48 6-48 6-45 6-48 6-45 4-45 15-37 10-48 5- Концентрация 0-18 0,1-18 0,2-15 1-18 0-20 0-20 0-20 1-25 0-18 3- NaCl, %, рН 9, Примечание. НД – нет данных;
+ положительная реакция;
– отрицательная реакция.
По литературным данным (Arahal et al., 2002;
Berendes et al., 1996;
Mata et al., 2002).
накопительной среде (субстрат – дрожжевой экстракт) и 11 на мини мальном субстрате (с цитратом натрия). Полученные штаммы были объ единены в коллекцию нитритрезистентных денитрификаторов и исполь зованы для дальнейшей работы. Все культуры коллекции представляли собой грамотрицательные факультативно анаэробные подвижные палоч ки размером (0,71,0)(1,52,5) мкм (рис. 1), проявлявшие каталазную и оксидазную активность, не сбраживавшие сахара, активно окислявшие спирты, органические кислоты и другие соединения в аноксических ус ловиях в присутствии 1 – 3% NaNO2/ NaNO3 в качестве единственного акцептора электронов. Одновременно все культуры являлись умеренны ми галофилами (рост до 20% NaCl) и нуждались в Na+ для роста (исклю чение составил штамм IB-I6). Температурный интервал и диапазон рН для роста большинства изолятов составляли соответственно + 6 + 48 С и рН 7,0 11,5. Некоторые биохимические и культуральные свойства выделенных нами нитритрезистентных культур и некоторых типовых штаммов рода Halomonas представлены в таблице 1. Учитывая совокуп ность культурально-морфологических и физиолого-биохимических при знаков, все вновь выделенные бактерии предварительно были отнесены к роду Halomonas (Bergey's Manual, 2005;
Mata et al., 2002).
Денитрифицирующая активность нитритрезистентных галомонад Известно, что содержание NaNO2 в нейтральных средах (как и NaNO3, из которого образуется нитрит) ограничено концентрацией 1,5 – 3 г/л (Гильванова и Усанов, 2003;
Chung et al., 2004). В отличие от из вестных денитрификаторов, полученные нами культуры галомонад обла дали устойчивостью и способностью к восстановлению сравнительно высоких концентраций нитрита натрия. Максимум содержания NaNO2 в средах, на которых наблюдался рост наших изолятов, варьировал в пре делах от 30 до 80 г/л (табл. 2), при оптимуме 10 – 15 г/л.
В процессе определения минимального порога концентрации нитрита, как единственного акцептора электронов, было обнаружено, что 13 изолятов способны к аноксическому росту и денитрифиции в щелоч ных условиях даже при низких концентрациях NaNO2 (до 0,2 г/л). Все они восстанавливали это соединение до концентраций, не детектируемых методами ВЭКЭФ. Вместе с тем, также были определены 8 изолятов, не способных к росту при содержании нитрита в среде менее 0,2 – 1,0 г/л (табл. 2), но развивающихся при наличии более высоких концентраций этого окислителя. Наиболее требовательным к концентрации нитрита в среде оказался штамм IB-O7-6, восстанавливающий NaNO2 лишь при его концентрациях в питательных средах выше 2,6 г/л.
Скорость денитрификации для каждой культуры определяли дву мя методами: по объему газообразных продуктов (главным образом, N2), Таблица 2. Рост культур Halomonas sp. в условиях денитрификации Диапазон Диапазон концентра- Остаточный концентра- Остаточный Штамм Штамм ций NaNO2, нитрит, г/л ций NaNO2, нитрит, г/л г/л;
рН 9,4 г/л;
рН 9, J1 0,1 – 50 0 O7-1 0,1 – 80 O7-2c 0,1 – 80 Ar4 1 – 50 0, O4c 0,1 – 80 559 1 – 80 1, I6 0,1 – 50 0 O18-1c 1 – 80 0, G4 0,1 – 80 0 NN2c 0,1 – 30 NN5c 0,1 – 80 O7-1d 1 – 80 0, O7-5 0,1 – 80 0 NN3-1c 0,5 – 50 0, NN3-2c 0,1 – 80 O7-6 3 – 50 2, S1c 0,1 – 50 O18 0,5 – 80 0, S9c 0,1 – 30 O18-3 0,2 – 30 0, SL3c 0,1 – 80 Остаточная концентрация нитрит анионов в КЖ после окончания роста культуры.
выделявшихся в результате денитрификации нитрита натрия в заданный промежуток времени и с помощью ВЭКЭФ. В первом случае опыты вы полняли в 10 мл стерильных медицинских шприцах, в которые помещали 2 мл инокулированной питательной среды с 10 г/л NaNO2 и инкубирова ли при 37°С. Объем выделившегося газа фиксировали по выдвижению штока. Параметры образования газов различными штаммами представ лены в таблице 3.
С целью количественной оценки динамики денитрификации ис пользовали метод ВЭКЭФ, с помощью которого в процессе аноксическо го роста культуры IB-G4 через равные интервалы времени определяли остаточную концентрацию нитрит анионов в среде. Скорость восстанов ления нитрита в благоприятных условиях достигала 5,5 мМ NO2-/л среды в час, что в несколько раз превышало известные значения (Chung et al., 2004;
Francis and Mankin, 1977).
На основе полученных данных выявлены штаммы, отличавшиеся высокой скоростью денитрификации нитрита (или нитрата) натрия. Для более подробного изучения процесса аноксического культивирования, а также в качестве предполагаемого хоста для генетической модификации был выбран штамм Halomonas sp. IB-G4. Эта культура активно развива лась на средах, содержащих до 80 г/л NaNO2, и обладала высокой скоро стью денитрификации, протекавшей до недетектируемых методом ВЭКЭФ концентраций.
Таблица 3. Динамика образования газообразных продуктов культурами Halomonas sp. в результате осуществления нитритного дыхания Скорость Скорость Максималь- Максималь газообразо- газообразо Штамм ный объем Штамм ный объем вания, вания, газа, мл газа, мл мл/сут мл/сут 1,0 4, 1,6 3,6 O7- J 0,8 4, Ar4 1,0 2 O7-2c 1,2 2,8 1,0 3, 559 O4c 1,0 3,4 1,1 3, I6 O18-1c 1,6 3,7 1,3 4, G4 NN2c 1,0 2,6 1,0 3, O7-1d NN5c 1,1 3,3 0,9 3, O7-5 NN3-1c 1,5 3,1 1,4 4, O7-6 NN3-2c 0,9 3, 1,7 3,8 S1c O 1,1 2,1 0,5 3, O18-3 S9c 0,5 4, SL3c Филогенетическая позиция нитритрезистентных бактерий Согласно полученным данным анализа секвенированных после довательностей гена 16S рРНК все наши культуры входят в -подгруппу протеобактерий и принадлежат к роду Halomonas. Филогенетические взаимоотношения изолятов нитриттолерантных бактерий с другими га ломонадами представлены в виде древа на рисунке 2. Обнаружено, что выделенные нами культуры располагаются в третьей группе галомонад “ungrouped Halomonas” (Arahal et al., 2002). Уровень сходства последова тельностей 16S рРНК изучаемых изолятов внутри этой выборки находил ся в пределах 92,5 – 98,4%. Ближайшим родственником для наших штаммов оказался Halomonas desiderata (Berendes et al., 1996) с уровнем сходства последовательностей 98 – 98,4%.
Получение рекомбинантного штамма Halomonas sp. IB-G для аноксического культивирования Для создания модельной системы синтеза рекомбинантного белка мы использовали плазмидный вектор pHS15G2 (Douka et al., 2001), не сущий ген внутриклеточного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Се лектирующим признаком при скрининге трансформантов служила ус тойчивость к антибиотикам – стрептомицину и ампициллину. В качестве хоста использовали рабочий штамм Halomonas sp. IB-G4, чувствитель ный к ампициллину и стрептомицину в концентрациях выше 40 мкг/мл.
Рисунок 2. Филогенетическая позиция нитритрезистентных культур Halomonas (III группа Halomonas по Arahal et al., 2002).
Были получены 4 клона трансформантов, которые обозначены как IB-G4.4, IB-G4.5, IB-G4.6, IB-G4.7. После трансформации клоны выра щивали аноксически на питательной среде GF. Экспрессию GFP наблю дали после инкубации суточной культуры трансформантов при 4 С в те чение 24 часов. Зеленый флуорес центный белок экстрагировали из биомассы 3,5 М раствором хлорида натрия и регистрировали интенсив ность флуоресценции на спектроф- луориметре СМ – 2203 (г. Минск) (рис. 3). Пик флуоресценции клеточ- ного экстракта установлен в области = 475 нм, что соответствовало из лучению мутантного флуоресцент ного белка, так называемого GFP (Patterson et al., 1997).
Наличие плазмиды в клетках трансформантов установлено как при аэробном культивировании, так и в аноксических условиях. Для это Рисунок 3. Спектры поглоще го культуры трансформантов выра ния (1) и флуоресценции кле щивали аэробно и в условиях денит точного экстракта клона Halo рификации на питательной среде GF monas sp. IB-G4.4 (2) и пита при температуре 37С. Биомассу су тельной среды LB2 (3).
точных культур лизировали, полу ченную тотальную ДНК разделяли электрофорезом в 0,8% геле агарозы.
Плазмидная ДНК pHS15G2 обнаруживалась в клетках всех трансформан тов независимо от условий культивирования (рис. 4).
Рисунок 4. Результаты гель электрофореза лизатов транс формированных клеток: 1 – ДНК маркер, 2 - 5 – примеры трансформантов Halomonas sp.
IB-G4 аэробных условиях роста, 6 - 9 – то же в аноксических условиях, 10 – контроль (плазмидный вектор pHS15G2).
На примере GFP доказана возможность создания генетически мо дифицированных штаммов денитрифицирующих галомонад для эффек тивного синтеза рекомбинантных белков в условиях аноксической фер ментации.
Определение основных параметров аноксического культивирования Для определения наиболее эффективного состава питательной среды для аноксического культивирования нами исследована интенсив ность роста рабочего штамма Halomonas sp. IB-G4 при различном соче тании концентраций (% масс.) субстрата (S) и акцептора электронов (N).
В качестве источника углерода использовали дрожжевой экстракт, а ис точником кислорода служил нитрат натрия. В ходе опыта «анаэробные» пробирки, заполненные стерильной средой GF с различным соотношени ем S:N, одновременно инокулировали 12-ти часовой культурой галомо над и инкубировали при 37С. Во время экспоненциальной фазы роста культуры измеряли оптическую плотность КЖ (OD600). Через 7 – 10 су ток инкубации определяли остаточное содержание нитратов и нитритов в КЖ методом ВЭКЭФ. По результатам эксперимента установлено, что ко личество восстанавливаемого азота практически не зависит от исходной концентрации нитрата, а изменяется только при увеличении содержания субстрата (рис. 5). При этом, было также отмечено, что увеличение кон центрации дрожжевого экстракта выше 2% масс. уже не влияет на сте пень восстановления NO3-. В эксперименте было установлено, что наи лучшие условия культивирования достигаются при соотношении донора и акцептора электронов S:N = 1:1.
Культивирование рабочего штамма на питательных средах с раз личным количеством субстрата и акцептора, но при постоянном соотно шении S:N = 1:1 позволило определить близкие к оптимальным концен трации дрожжевого экстракта и NaNO3, которые составили Sopt = 1% масс. и Nopt = 1% масс. соответственно (рис. 6). В этих условиях достига Редуцируемый азот (N), % масс.* Рисунок 5. Зависимость количе 1, ства восстанавливаемого нитрата 1, (N) культурой Halomonas sp. IB 1, G4 от содержания источника уг 1, лерода (S) в среде культивирова 0, ния в условиях денитрификации.
0, * Концентрация оксианионов 0, азота в пересчете на NaNO3.
0, 0, 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5, Дрожжевой экстракт (S), % масс.
лись стабильность системы анок Остаточный азот, %масс.* сического роста, достаточно высо кая оптическая плотность культу ральной жидкости и полная утили зация нитрат и нитрит анионов.
Оптимизацию условий OD ферментации по температуре, рН, 1 присутствию молекулярного ки слорода проводили на основе оп 0 0 ределения продолжительности 2 3 Cубстрат (S ), % масс. лаг-фазы. В эксперименте одно Рисунок 6. Зависимость оптиче- временно была задействована се ской плотности и содержания ос- рия вариантов условий культиви таточного азота в КЖ от концен- рования. В качестве четырех фак трации субстрата при культивиро- торов варьирования были выбра вании Halomonas sp. IB-G4 на сре- ны: температура, рН, концентра ция сульфида натрия, количество де c соотношением S:N = 1:1.
вносимого инокулята (табл. 4).
Содержание остальных компонентов ферментационной среды было по стоянным. Анализ результатов, представленных в таблице 4, показал, что крайне негативно на скорости роста рабочего штамма сказывается откло нение температуры и рН среды культивирования от нормальных для это го штамма значений. Внесение сульфида натрия для снижения редокс потенциала питательной среды практически не оказывало влияния на рост бактерий. Положительное воздействие на снижение продолжитель ности лаг-фазы оказывало увеличение количества вносимого инокулята до 10% об.
Таблица 4. Выбор оптимальных параметров аноксического культивиро вания штамма Halomonas sp. IB-G Факторы варьирования Оптическая Продолжи Номер плотность Темпе Na2S, Инокулят, тельность КЖ через опыта ратура, рН лаг-фазы, ч.
% масс. % об. часов роста С 1 (контроль) 37 9,5 0 1 6 0, 2 30 9,5 0 1 10 0, 3 45 9,5 0 1 14 0, 4 37 10 0 1 9 0, 5 37 10,5 0 1 12 0, 6 37 9,5 0,005 1 6 0, 7 37 9,5 0,01 1 5,5 0, 8 37 9,5 0,015 1 5,5 0, 9 37 9,5 0,02 1 6 0, 10 37 9,5 0 5 2,5 1, 11 37 9,5 0 10 2 2, В результате проведенных экспериментов были выявлены наи лучшие значения показателей аноксического культивирования рабочего штамма Halomonas sp. IB-G4 на питательной среде с дрожжевым экс трактом в качестве источника углерода и с нитратом натрия в качестве единственного акцептора электронов, обеспечивающие наименьшую продолжительность лаг-фазы и наибольшую интенсивность роста и де нитрификации. Этому соответствовали следующие параметры: концен трация дрожжевого экстракта 1% масс., концентрация нитрата натрия 1% масс., рН = 9,5, температура 37С, количество инокулята 10% об.
Периодическое и непрерывное культивирование рабочего штамма в аноксических условиях Процесс аноксической ферментации рабочего штамма проводили на лабораторной установке для аноксического культивирования. Для сравнения скоростей роста и развития нитритрезистентных галомонад в аэробных и в аноксических условиях провели параллельную фермента цию штамма Halomonas sp. IB-G4 в условиях эффективной аэрации и де нитрификации. Для проведения процесса использовали параметры и со став питательной среды, представленные в предыдущем разделе. Про должительность опыта составила 28 ч. Рост культуры и аэробно, и в ус ловиях денитрификации протекал одинаково активно (рис. 7). Только на первых этапах в развитии аноксиче Аэробная культура ской культуры наблюдалась довольно OD 4,0 Аноксическая культура 3, длинная лаг-фаза, что связано с при 3, сутствием молекулярного кислорода в 2, среде ферментера. В дальнейшем, ак 2, 1, тивно образующийся в результате де 1, нитрификации азот вытеснил воздух, 0, 0, что обеспечило эффективный рост 0 5 10 15 20 25 аноксической культуры с высокой Время, ч.
Рисунок 7. Кривые роста пе- удельной скоростью. Результаты экс риодической культуры Halo- перимента, выполненного без аэрации, monas sp. IB-G4 в условиях впервые продемонстрировали воз аэробного и аноксического можность достижения технологиче ских показателей аноксической фер культивирования.
ментации, в частности, скоростей рос та и концентрации биомассы, сопоставимых с аналогичными показателя ми, достигаемыми при использовании методов аэробного культивирова ния.
Для определения максимальной удельной скорости роста (max) рабочего штамма в условиях аноксической ферментации провели куль тивирование в непрерывном режиме. При скоростях разбавления (D) близких к критическим значениям, когда скорость вымывания клеток превышает скорость прироста, можно достичь максимальной удельной скорости роста культуры max. В этих условиях D max. Во время OD Непрерывное аноксическое культивирование Halomonas sp. IB-G аноксического роста скорость разбав- Максимальная удельная скорость роста = 0,9 час - max 3, ления увеличивали постепенно, 3, вплоть до начала вымывания культу- 2, 2, ры из ферментера. На графике этот 1, момент хорошо заметен по перелому 1, кривой оптической плотности (рис. 0, 8). Последнее значение D перед пол- 0, 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1, ным исчезновением клеток из среды, Скорость разбавления, об./час обеспечивавшее стабильное развитие Рисунок 8. Определение макси культуры, соответствует максималь- мальной удельной скорости рос ной удельной скорости роста штамма та рабочего штамма с NO2- в ка в данных условиях. При росте на бо- честве акцептора электронов.
гатой питательной среде с нитритом в качестве акцептора электронов рабочий штамм Halomonas sp. IB-G4 дос тигал max = 0,9 ч-1 (рис. 8).
Изучение транспорта нитрит анионов внутрь клеток алкалофильных денитрификаторов Принято считать, что нитрит поступает в клетки бактерий через цитоплазматическую мембрану посредством диффузии в форме прото нированной азотистой кислоты (HNO2) (Moir, Wood, 2001). Её концен трацию в среде, содержащей нитрит натрия, можно вычислить по урав нению Хендерсона-Хассельбаха (1):
lg([HNO2]) = lg([NaNO2]) + pKa – pH, (1) где [HNO2] – концентрация протонированной азотистой ки слоты, М;
[NaNO2] – концентрация нитрита натрия, М;
рКa=3,3 – константа диссоциации HNO2;
рН – водородный потенциал.
Анализ этого уравнения позволяет сделать вывод о наличии об ратной зависимости, связывающей концентрацию протонированной азо тистой кислоты с величиной рН среды. Так для условий pH = 6,8 и [NaNO2] 0,1 M концентрация протонированной азотистой кислоты со ставит [HNO2] = 3,110-5 M, а при pH = 9,8 и прочих равных условиях ве личина [HNO2] снижается на три порядка. Это позволяет, во-первых, объяснить факт активного аноксического роста алкалофильных галомо над на средах с высокими концентрациями нитритов, а, во-вторых, при знать модель пассивного диффузного транспорта вполне состоятельной.
Вместе с тем необходимо отме Концентрация NaNO2, г/л 1 - Halomonas sp. IB-G тить, что аноксическое развитие 2 - Halomonas sp. IB-O7- 8 многих галомонадных изолятов из нашей коллекции происходило в щелочных средах (рН = 9,6) и при очень низких исходных кон центрациях нитрита (1,5 – 3 мМ), внесенного в качестве единст 0 12 34 5 6 венного акцептора электронов.
Время, сут. Также нами было обнаружено Рисунок 9. Динамика денитрифика- практически полное исчезнове ции штаммами галомонад с актив- ние нитрит анионов из среды ным (1) и диффузионным (2) типом культивирования при росте большинства нитритрезистент акцепции нитрит анионов.
ных штаммов Halomonas в усло виях денитрификации, что необъяснимо с точки зрения диффузии (табл.
2). Указанные факты позволяют предположить наличие активного типа акцепции нитрит анионов некоторыми галомонадами, выявляющегося в щелочных условиях.
Изучение динамики денитрификации у двух изолятов нашей кол лекции методом ВЭКЭФ впервые позволило показать четкие различия между «классическими» денитрификаторами и культурами, активно ак цептирующими нитриты (рис. 9). Развитие ряда культур сопровождалось практически полным исчезнове нием NO2- из среды культивиро Скорость разбавления D = 0,9 час - вания (штамм IB-G4 на рис. 9), в Время культивирования 12 суток, рН = 9, OD6002, то время как часть изолятов не 2, была способна утилизировать нитрит натрия при его концен 1, трации ниже 2,6 г/л (штамм IB 1, O7-6 на рис. 9). Для изучения ди намики потребления нитрита ис 0, пользовали питательную среду 0, GF, содержавшую нитрит натрия 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 в концентрации 10 г/л (pH 9,2 – Концентрация NaNO2, г/л 9,4).
Рисунок 10. Непрерывное аноксическое Дополнительным доказа культивирование нитритофильного штам тельством обнаруженного факта ма Halomonas sp. IB-G4 при снижающихся может служить культивирование концентрациях нитрита натрия.
штамма Halomonas sp. IB-G4 на Пунктирной линией показана возможная установке для аноксической зависимость плотности культуральной ферментации в непрерывном ре жидкости от концентрации нитрита при диффузионном типе акцепции NOB2 P.
PB жиме с нитритом в качестве единственного акцептора электронов (рис.
10). Культивирование вели при максимальной удельной скорости роста штамма, равной 0,9 ч-1, с постепенным снижением концентрации нитрита натрия в питательной среде. Продолжительность непрерывного роста бактерий составила 12 суток. При этом оптическая плотность КЖ в фер ментере оставалась практически неизменной независимо от содержания в среде нитрита натрия, что было бы невозможно при диффузионном типе акцепции NO2-. В последнем случае интенсивность роста должна была бы изменяться прямо пропорционально концентрации нитрита в питатель ной среде (показано пунктиром, рис. 10).
Таким образом, полученные данные на метаболическом уровне подтверждают возможность существования в клетках бактерий активно го способа транслокации NO2-, осуществляемой, возможно, по принципу симпорта с протонами или ионами Na+. При этом отсутствие остаточных концентраций нитрита в среде культивирования и стабильный рост при пониженном содержании нитрита на средах с высокой щелочностью мо жет служить четким физиологическим признаком для отделения денит рификаторов, активно акцептирующих этот анион. Учитывая потенци альную токсичность NO2-, бактерии, резистентные к очень высоким кон центрациям нитрита и активно использующие этот анион для энергети ческих нужд, могут быть обозначены как нитритофильные.
Применение нитритофилов для тонкой денитрификации питьевой воды Современная экологическая ситуация характеризуется тем, что количество водоемов и рек с водой, пригодной для питья, катастрофиче ски уменьшается, и это утверждение, к сожалению, справедливо для ре гионов, богатых пресными гидроресурсами, в частности, таких, как Баш кортостан. Проведенные нами анализы показали, что в зоне хозяйствен ной деятельности человека пресная вода не только рек, но и артезианских скважин, колодцев, родников почти всегда содержит нитраты и нитриты в концентрациях, превышающих ПДК (полученные данные не приводят ся). Согласно СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к каче ству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана ис точников» предельно допустимые концентрации нитратов составляют мг/л, нитритов – 3 мг/л. Существующие способы глубокой очистки воды, например, от нитритов, концентрации которых даже незначительно пре вышают предельно допустимые (~ 5-7 мг/л), многостадийны и довольно сложны (Shockley et al., 2007;
Tartakovsky et al., 2003). Применение нит ритофильных галомонад позволит значительно упростить и удешевить очистные технологии. Биохимический процесс очистки можно осуществ лять одностадийно, и необходимым условием является лишь добавление в среду требуемых количеств Концентрация азота, мг/л окисляемого субстрата. Техниче- Нитрат (NO3- ) ским результатом процесса явля- 70 Нитрит (NO2- ) ется удаление из загрязненной воды даже следовых количеств NO2, что пока достигается лишь комплексными физико- химическими методами. Для денитрификации об- 0 5 10 15 20 разца воды из артезианской сква- Время, сут жины, загрязненной нитрат и Рисунок 11. Денитрификация нитрит анионами, мы использова- воды из артезианской скважины ли штамм Halomonas sp. IB-I6, культурой Halomonas sp. IB-I6.
отличавшийся от других культур ростом в наиболее широком диапазоне рН, отсутствием потребности в ионах Na+, а также обладавший активным типом акцепции нитрит анио нов и нитритрезистентностью до 50 г/л NaNO2. Процесс вели при темпе ратуре 28 – 30С. В качестве органического субстрата добавляли дрож жевой экстракт в количестве, адекватном содержанию нитратного и нит ритного азота. О высокой эффективности денитрификации свидетельст вует снижение концентрации оксианионов азота до предела детекции, определяемого чувствительностью прибора для ВЭКЭФ (рис. 11).
ВЫВОДЫ 1. По строению 16S рРНК выделенные нитритрезистентные де нитрифицирующие Halomonas spp. образуют обособленную, филогене тически компактную группу, близкую к Halomonas desiderata со степе нью гомологии 98 – 98,4%.
2. Нитритрезистентный штамм Halomonas sp. IB-G4 характеризу ется высокой скоростью роста и денитрификации, генетической стабиль ностью, отсутствием патогенности и устойчивостью к контаминации и представляет собой наиболее перспективный объект для генетической модификации.
3. Впервые показана экспрессия рекомбинатного белка (GFP) в условиях неингибированного аноксического роста на щелочной среде с – 1,5% нитрита натрия с использованием в качестве хост-культуры де нитрифицирующего штамма Halomonas sp. IB-G4, а в качестве вектора – плазмиды pHS15G2.
4. Скорость роста и концентрация биомассы в условиях периоди ческой и непрерывной аноксической ферментации денитрифицирующего штамма Halomonas sp. IB-G4 сопоставимы с аналогичными показателя ми, достигаемыми при использовании методов аэробного культивирова ния той же культуры.
5. Обнаружены два типа акцепции NO2- галоалкалотолерантными штаммами Halomonas sp., предполагающие наличие активной и пассив ной систем транслокации этого токсичного аниона внутрь клетки. Нит ритрезистентные денитрификаторы с активным типом акцепции нитрита обозначены как «нитритофильные».
6. Культуры Halomonas sp., обладающие системами активной ак цепции NO2-, являются основой для новых перспективных технологий глубокой очистки воды от нитратов и нитритов.
БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Е.А.Гильвано вой за постоянное внимание и помощь в работе. Свою искреннюю благо дарность автор выражает сотрудникам Института биохимии и генетики УНЦ РАН – д.б.н., проф. А.В.Чемерису, к.б.н. Р.Р.Гарафутдинову, к.б.н.
Р.Т.Матниязову;
сотрудникам Института органической химии УНЦ РАН – к.х.н. С.С.Остахову, И.О.Осиной;
заведующему Центральной научно исследовательской лабораторией БГМУ, д.м.н., проф. В.В.Сперанскому за исчерпывающие консультации и методическую помощь в проведении исследований. Автор искренне благодарит всех сотрудников лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН за постоянную поддержку в процессе выполнения работы. Автор искренне благодарен профессору Constantin Drainas University of Ioannina Department of Chemistry Biochem istry Lab (Греция) за любезно предоставленные образцы плазмид pRK2013, pHS15, pHS15G1 и pHS15G2.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Семёнова Е.А., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Глубокая одностадий ная очистка питьевой воды от нитратов и нитритов при помощи бак терий рода Halomonas // Вестник Оренбургского государственного университета.– 2007.– №75.– С. 313 – 316.
2. Семёнова Е.А., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Подбор состава пита тельных сред для бактерий рода Halomonas // Межвузовская научно техническая конференция «Актуальные проблемы технических, ес тественных и гуманитарных наук», 27 – 28 апреля 2006 г., Уфа / Изд-во УГНТУ.– Уфа, 2006.– С. 357- 3. Семёнова Е.А. Активный транспорт нитрита у некоторых штаммов Halomonas // Международная конфернция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007»;
секция «Биология»;
11 – 14 ап реля 2007 г., Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет.– М.: МАКС Пресс, 2007.– С. 117 – 118.
4. Семёнова Е.А Новые принципы ферментации микроорганизмов // БИОМИКА – НАУКА XXI ВЕКА;
Материалы школы-семинара;
Уфа, 9 – 15 сентября 2007 г.–Уфа, 2007.– С. 118 – 120.
5. Семёнова Е.А., Гильванова Е.А. Алкалофильные нитритофилы группы Halomonas // Современные проблемы экологии, микробио логии и иммунологии: Материалы региональной конференции мо лодых ученых с международным участием, 29 ноября – 1 декабря 2007 г., Екатеринбург – Пермь / Институт экологии и генетики мик роорганизмов УрО РАН.– Пермь, 2007.– С. 101 – 103.
6. Семёнова Е.А. Новая парадигма ферментации // Материалы II Меж дународной Школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», Уфа, 3 – 7 декабря 2007 г.– Уфа: Изд-во БГПУ, 2007.– С. 107 – 108.
7. Семёнова Е.А., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Экологическое состоя ние подземных вод в условиях антропогенного загрязнения: про блемы и перспективы микробиологической очистки от нитратов и нитритов // материалы Междунар. науч. конф. «Проблемы биоэколо ги и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)», Саранск, – 18 мая 2008 г.– Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2008.– С. 423 – 425.
8. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-G4 // EMBL Nucleotide Sequence Database.– 2007. – Accession number AM490139.
9. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-O7-1 // EMBL Nucleotide Sequence Database.– 2007.– Accession number AM490137.
10. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-O7-6 // EMBL Nucleotide Sequence Database.– 2007.– Accession number AM490138.
11. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-O18 // EMBL Nucleotide Sequence Database.– 2007.– Accession number AM490136.
12. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-NN3-2c // EMBL Nucleotide Sequence Database.– 2007.– Accession number AM490135.